KR100876531B1 - 신규 버콜데리아 멀티보란스 ｌｇ ３１－３ 균주, 이로부터생산되는 아미다제 및 상기 아미다제를 이용한 라세미혼합물의 광학분할하는 방법 - Google Patents

신규 버콜데리아 멀티보란스 ｌｇ ３１－３ 균주, 이로부터생산되는 아미다제 및 상기 아미다제를 이용한 라세미혼합물의 광학분할하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 버콜데리아 멀티보란스 균주, 이로부터 생산되는 아미다제(amidase) 및 상기 아미다제(amidase)를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할(optical resolution) 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 버콜데리아 멀티보란스 LG 31-3(Burkholderia multivorans LG 31-3) 균주, 입체선택적 기질 특이성을 가진 아미다제(amidase) 및 상기 아미다제를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 버콜데리아 멀티보란스 LG 31-3 균주(KCTC 10920BP)로부터 생산되는 아미다제는 상온 및 상압의 효소반응 조건하에서 라세미 혼합물을 용이하게 광학분할할 수 있어 단일 이성질체를 높은 광학순도로 제조할 수 있다.
아미다제, 버콜데리아 멀티보란스, 광학분할, (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid

Description

신규 버콜데리아 멀티보란스 ＬＧ ３１－３ 균주, 이로부터 생산되는 아미다제 및 상기 아미다제를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할하는 방법 {Novel Burkholderia multivorans ＬＧ ３１－３, Amidase Produced from the Same and Method for Resolution of Racemic Mixture Using the Same}
도 1a는 에스펜발러레이트(esfenvalerate) [(S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyrate]의 화학식이고, 도 1b는 본 발명의 LG 31-3 균주에서 생성된 아미다제를 이용한 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide의 가수분해 반응의 도식이다.
도 2는 본 발명의 LG 31-3 균주에서 생성된 아미다제를 이용한 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide 가수분해 반응의 시간에 따른 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 LG 31-3 균주에서 생성된 아미다제의 SDS-PAGE에 의한 분자량을 측정한 사진이다. 도 3a 및 3b는 각각 이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography: IEC)와 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatography: GFC) 이후의 fraction의 SDS-PAGE를 결과를 나타낸 것이고, 도 3c는 GFC를 수행한 이후에도 순수한 단백질을 얻을 수 없어서 native gel을 수행한 것이다.
도 4는 본 발명의 LG 31-3 균주에서 생성된 아미다제를 트립신(trypsin) 처리 후, 생성된 펩타이드를 역상 HPLC(reverse-phase HPLC)에 의해 분리한 크로마토그램이다.
본 발명은 신규 버콜데리아 멀티보란스 균주, 이로부터 생산되는 아미다제(amidase) 및 상기 아미다제(amidase)를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할(optical resolution) 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 버콜데리아 멀티보란스 LG 31-3(Burkholderia multivorans LG 31-3) 균주, 입체선택적 기질 특이성을 가진 아미다제(amidase) 및 상기 아미다제를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할 방법에 관한 것이다.
약학 및 농화학 분야에서 화합물들은 점점 복잡해지고 있고, 화합물 내에 하나 또는 그 이상의 부제탄소를 가진 화합물들의 수는 날로 증가하고 있다. 상기 화합물들의 시판 제품들에는 라세미 혼합물로서 판매되는 것들이 있다. 그러나 많은 경우에 있어서, 라세미 혼합물 중 하나의 광학활성체만이 생물학적 활성을 나타내고, 다른 광학활성체는 무활성이거나 포유동물 또는 환경에 유해함이 보고되고 있다. 그러므로, 목적하는 유일한 이성질체를 합성할 수 있는 생물학적 및/또는 화학적 기술들이 필요하다. 현재 라세미 혼합물 중 하나의 광학활성체만을 합성·분할할 수 있는 생물학적 및/또는 화학적 기술로는 비대칭 합성, 거울상 이성질체 의 농축방법 또는 효소를 이용한 유기화합물의 입체특이적 합성에 관한 연구가 최근 전세계적으로 진행되고 있으며, 그 중에서도 아미다제를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할에 대한 연구가 많이 보고되고 있다.
최근 라세미 혼합물 중 많은 관심이 집중되고 있는 에스펜발러레이트(esfenvalerate) [(S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyrate]는 라세미체인 펜발러레이트(fenvalerate) 키랄형태로서 이들 화합물의 생물학적 활성은 대체로 (S)형 이성질체에 기인한다(도 1a).
에스펜발러레이트(esfenvalerate) 합성에 사용되는 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid는 다양한 방법에 의해 합성되어 질 수 있다. 광학활성물질 (R)- 또는 (S)-(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid를 제조하는 방법 중의 하나로는 라세미 혼합물에 광학활성 분할제(resolving agent)로서 광학적으로 순수한 아민(예를 들어, (R)- 또는 (S)-phenylethylamine)을 첨가하여 분리하는 광학분할기술(optical resolution)이 있다. 그러나 상기 광학활성 분할제는 가격이 비싸고 공정이 복잡하다는 문제점이 있다.
또한, (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid 를 합성하기 위한 하나의 방법으로서, 에스터를 출발물질로 하여 리파아제(lipase) 또는 에스터라제(esterase)를 이용하거나 입체이성질체 선택성을 가지는 니트릴 히드라타제 (nitrile hydratase)를 이용하는 방법 (Fallon et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 47:156, 1997)이 있다.
한편, 특정 라세미 혼합물을 광학분할하기 위하여 에스테라아제(esterase), 아미다제(lipase) 및 프로테아제(protease) 등의 효소를 이용하여 선택적으로 거울상 이성질체를 가수분해시키는 방법들이 알려져 왔다. 예를 들어, 라세미 메틸-2-클로로프로피오네이트(Methyl-2-chloropropionate)를 Candida r㎍osa 유래의 리파아제를 이용하여 가수분해하는 방법이 알려져 있다(Dahod & Siuta-Mangano, Biotech. Bioeng., 30:995, 1987). 또한, 정제된 Candida r㎍osa 유래의 아미다제를 이용하여 (R)-2-(4-히드록시페녹시) 프로피온산를 합성하는 것이 보고되었다 (WO 1990/15146).
라세미 혼합물의 광학분할에 효소를 이용하는 것은 매우 효과적일 수는 있지만, 어떠한 라세미체에 대해 효소 분할이 가능한지를 확인하는 것과, 특정 라세미체의 분할에 어떠한 효소가 특별히 효과적인지를 확인하는 것은 매우 어려운 일이다. 예를 들어, 미국특허 제5,928,933호는 라세미 4-옥소-1,2-피롤리딘디카르복실산 디알킬 에스테르의 광분할을 위하여 프로테아제, 아미다제 및 에스테라아제 중에서 선택된 44 가지 효소에 대해 반응 특이성을 실험하였고, 그 중 한 종류의 효소만이 95%의 광학순도를 나타냄을 보이고 있다. 이와 같이, 사용하는 효소의 종류 및 기질의 화학적 구조 등에 의해 이성질체의 선택성 및 광학순도(%ee)가 달라지므로, 지속적인 연구를 통해 기질에 적합한 조합을 찾아내는 것이 무엇보다도 중요하다.
한편, 본 발명에서 광학분할의 대상으로 삼고 있는 라세미 혼합물인 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide에 대하여, 그것의 광학분할에 아미다제를 이용한 예는 아직까지 알려지지 않았다. 기존의 효소를 이용한 광학분할 은 주로 prop류의 제초제의 중간물질인 aryloxypropionic acid의 합성, profen류의 항염증제의 중간물질인 arylpropionic acid의 합성에만 국한되었고, (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide의 광학분할에 효소를 사용한 예가 없다.
한편, 아미다제(amidase)는 카르보실산 아미드를 가수분해하는 효소로서 효소분류 체계에서 E.C.3.4.에 해당한다. 지금까지 보고된 아미다제는 Corynebacterium, Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium, Rhodococcus, Alcaligenes 등과 같은 미생물에 널리 존재하는 것으로 알려지고 있다. 이러한 아미다제는 보통 유도발현되는 효소인 경우가 많고 기질 특이성은 미생물 균주마다 독특한 성질을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Martinkova & Kren, Biocat . Biotrans., 20:73, 2002). 특히 Pseudomonas putida ATCC 12633유래의 아미다제는 DSM사(네델란드)에 의해 채택된 방법으로 D, L-아미산 아미드를 출발물질로 하여 D-아미노산 혹은 L-아미노산을 합성하는 방법이다 (Sonke et al., Stereoselective Biocatalysis, p23-58, 2000, Patel, R.N. ed., Marcel Dekker). 예를 들어, L-phenylglycinamide를 입체선택적으로 D-phenylglycinamide와 L-phenylglycine을 가수분해하는 유용한 효소로 보고되고 있다 (Hermes et al., Appl . Environ. Microbiol., 59:4330, 1993). 그러나 아직도 기질 특이성이 100% 확보되지 않았고 보다 경제적이며 기존의 아미다제에 의해 전환되지 않은 기질에 작용할 수 있는 신규한 아미다제가 요구되고 있다.
이에 당업계에서는 광학분할에 사용될 수 있는 신규 아미다제 및 상기 아미다제를 생성할 수 있는 신규 균주의 발견 및 개발 및 이를 이용한 라세미 혼합물의 광학분할 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
이에 본 발명자들은 광학분할에 사용될 수 있는 효소를 생성할 수 있는 신규 균주를 개발하고자 예의 노력한 결과, 광범위한 지역의 토양들과 하천 및 각종 폐수 등으로부터 수많은 미생물들로부터, 특정한 라세미체를 입체선택적으로 가수분해하는 아미다제를 생산하는 버콜데리아 멀티보란스 LG 31-3을 분리하였고, 상기 균주가 (S)-입체 이성질체를 선택적으로 가수분해하는 아미다제를 생산함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 주된 목적은 아미다제(amidase) 생성능을 가지는 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans) LG 31-3(KCTC 10920BP)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 버콜데리아 멀티보란스 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 아미다제의 제조방법 및 입체선택적 기질 특이성을 가지는 아미다제(amidase)을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 버콜데리아 멀티보란스 균주, 상기 균주의 세포 파쇄물 또는 제4항의 아미다제(amidase) 존재하에 라세미 혼합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 라세미 혼합물의 광학분할(optical resolution) 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아미다제(amidase) 생성능을 가지는 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans) 균주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans) LG 31-3(KCTC 10920BP) 임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 버콜데리아 멀티보란스 균주를 배양한 다음, 상기 배양된 균주로부터 아미다제(amidase)를 회수하는 것을 특징으로 하는 아미다제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 서열번호 1의 N 말단 아미노산 서열을 가지며, 입체선택적 기질 특이성을 가지는 아미다제(amidase)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 2의 내부 아미노산 서열을 포함하는 아미다제(amidase)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 버콜데리아 멀티보란스 균주, 상기 균주의 세포 파쇄물 또는 제4항의 아미다제(amidase) 존재하에 라세미 혼합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 라세미 혼합물의 광학분할(optical resolution) 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 라세미 혼합물은 하기 화학식 1로 표시되는 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide인 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure 112007026772229-pat00001
본 발명은 또한 상기 버콜데리아 멀티보란스 균주, 상기 균주의 세포 파쇄물 또는 상기 아미다제(amidase) 존재하에 화학식 1로 표시되는 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide를 광학분할하는 것을 특징으로 하는 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 라세미 혼합물의 광학분할에 사용될 수 있는 입체선택적 기질 특이성을 가진 아미다제를 생산하는 미생물을 얻기 위하여, 전국 각지의 논밭 토양, 공단 주위의 토양 및 폐수처리장의 폐수 등으로부터 다양한 종류의 순수한 균주들을 분리하였고, 이들 균주들과 기타 보유하고 있는 균주들을 대상으로 확인실험을 수차례 반복하였다.
이들 균주들을 화학식 1의 화합물 ((R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide, fenvaleramide, FAA)을 질소원으로 함유한 액체 최소(minimal) 배지에서 30℃로 배양하여, 균주가 성장하는 시험관액을 FAA가 함유된 고체 최소 배지에서 배양하였다. 상기 배지에서 성장한 콜로니는 FAA를 분해하는 것으로 판단하여 다시 순수배양한 다음, HPLC에 의해 시간에 따른 출발물질의 전환율이 50%정도에 이르는 콜로니를 선별하여(100% 선택성일 때, 50% 전환율), 아미다제를 생성하는 균주들을 순수분리하였다.
상기와 같은 방법으로 얻어진 균주들을 FAA가 유도제로 함유된 복합 액체 배지(배지 D)에서 진탕 배양하고 원심분리한 다음, 인산 완충용액에 다시 현탁하였다. 그 중 일부를 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide 반응용 액에 혼합하여 30℃로 반응시킨 다음, 그 반응물을 HPLC로 분석(C-18 Optimapak, RStech)하여 (R),(S)-N-(2,6-디메틸페닐) 알라닌 메틸 에스테르의 가수분해능을 확인하였다. 가수분해능이 확인된 50여 균주 중 입체선택적 가수분해능을 가진 아미다제를 생산하는 균주들을 분리하기 위하여, Chiral-HPLC로 분석[컬럼: Chiral AGP ChromTech(Congleton, UK), 용매: Na2HPO4 수용액 (10mM pH 6.0)/에탄올 =95/5 vol%, 유속: 0.9㎖/min, 230nm, (S)-acid 8.0min, (R)-acid 6.0min, (S)-amide 20min, (R)-amide 16min)하여 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide에 대해 입체선택적 가수분해능을 가진 균주들을 분리하였다.
상기 분리된 균주들 중 입체선택적 가수분해능이 우수한(전환율 > 35%, S/R 선택성 > 60/1 LG 31-3 균주를 비롯한 10개의 균주를 선택하여 그 특성을 조사하였다. 그 중 입체선택성이 가장 우수한(39% 전환율, S/R 선택성 99/1) LG 31-3 균주를 대사지문법(Biolog)에 의해 동정하기 위해서, Biolog 사의 95가지 탄소원을 입힌 그램 음성용 96웰 마이크로 플레이트를 사용하였다. 대사지문법은 96웰 마이크로 플레이트에 함유된 탄소원을 접종된 세포가 호흡함으로써 산화시키고, 웰에 함유된 테트라졸리움(tetrazolium) 염료는 환원이 되면서 보라색을 형성하는 원리를 이용한 방법이다. 상기 96웰 마이크로 플레이트에 미리 배양한 분리균 현탁액을 접종하여 배양시켜 분리균의 95가지 탄소원에 대한 기질 이용능과 산화능을 측정한 결과를 Biolog 사의 동정용 프로그램에 입력하여 동정한 결과, 본 발명의 균주는 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans)로 동정되었다 (표 3). 상기 균 주를 "Burkholderia multivorans LG 31-3"으로 명명하고, 이를 2006년 3월 13일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KRIBB) 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 "KCTC 10920BP"로 기탁하였다.
상기와 같은 방법으로 얻어진 전세포와 조효소액을 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide에 반응시키고, 50% 이하의 전환율에서 HPLC와 GC로 분석하여 입체선택성을 결정하였다. 본 발명에 따른 아미다제는 암모늄설페이트 (NH4)2SO4 농도가 0-60 체적%에서 침전된 분획에서 활성을 조사하였다.
본 발명에서 제공되는 아미다제는 N-말단 아미노산 서열이 서열번호 1이고, 내부에 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아미다제를 제공한다. 상기 아미다제의 DNA 유전자의 분리는 기존에 알려진 아미다제의 아미노산 서열을 면밀히 분석하여 잘 보존되는 영역(conserved region)에 기초하여 제작한 프라이머(primer)를 이용하여, PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭한 단편을 통해 획득하였다. 상기 아미다제는 상기 균주에서도 생산될 수 있으나 대장균이나 효모, 바실러스등과 같은 숙주 시스템에 아미다제 유전자가 도입된 재조합 단백질로도 생산되어 사용될 수 있다. 또한 상기 아미다제는 유리효소나 특정 담체에 고정화된 형태, 혹은 CLEC(cross-linked enzyme crystals), CLEA(cross-linked enzyme aggregates)형태로도 사용될 수 있다.
상기 균주들에서 생산되는 아미다제는 상기 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide의 광학분할 이외에 기타 라세미 혼합물의 광학분할에도 선택적으 로 사용될 수 있을 것으로 기대되며, 이들 내용 또한 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 정의되어야 한다.
상기 신규 균주가 생산하는 아미다제는 라세미 혼합물의 특정 라세미체에 대해 입체선택적 기질 특이성을 가지는 것으로 확인되었다. 본 발명자들의 실험에 따르면, 상기 아미다제는 화학식 1로 표시되는 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide를 광학분할 할 수 있다. 즉, 상기 아미다제는 상온 및 상압의 반응조건에서 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide 중 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide만을 선택적으로 가수분해하여 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid을 생산한다 (도 1b). 이렇게 얻어진, (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid는 (S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl alcohol과 반응하여 생물화학적 활성을 가지는 Esfenvalerate를 얻을 수 있다(도 1a). 상기 에스테르 반응은 당업계에 공지되어 있어, 당업자에게 자명한 사항이므로 그에 대한 설명은 본 명세서에서 생략한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 버콜데리아 멀티보란스 속 LG 31-3 균주(KCTC 10920BP)로부터 생산되는 아미다제를 이용하여, 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide를 용이하게게 광학분할하여, 단일 이성질체 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid를 높은 광학순도로 제조하는 방법에 대해서만 기재하였으나, 상기 균주들에서 생산되는 아미다제는 상기 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide의 광학분할 이외에 기타 라세미 혼합물의 광학분할에도 선택적으로 사용될 수 있는 것 역시 당업계에서 통산의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 아미다제 생성균들의 분리
전국 각지의 논밭의 토양, 공단 주위의 토양, 하천, 폐수 처리장의 폐수 등을 멸균 용액(0.1M potassium phosphate buffer pH 7.2)에 희석하여, 화학식 1의 화합물 FAA(fenvaleramide)가 유일한 질소원으로 함유된 최소배지 SFAA배지(FAA 2g, 포도당 2g, K2HPO4 7g, KH2PO4 3g, MgSO4-7H2O 0.1g, sodium citrate 0.5g, 비타민 용액 10㎖, 미량원소 용액 5㎖/ℓ, pH 7.0, 표 1 참조)를 제조하였다.
상기 제조된 배지를 121℃에서 15분간 멸균하였고, 비타민용액과 미량원소 용액, MgSO4-7H2O은 따로 여과하여 배지에 첨가하였다. 상기 배지가 함유된 시험관에 멸균 용액으로 희석된 폐수 등을 접종한 다음, 35℃에서 200rpm으로 배양하며 탁도를 육안으로 관찰하였다. 시험관 내에서 미생물의 성장이 보이는 시험관을 선별하고, 이를 SFAA 액체 배지에 1.5% agar를 첨가한 고체 배지에 도말한 다음, 35℃에서 정치배양하며 콜로니를 형성하는 균을 200여종 확보하였다.
미량원소 용액 비타민용액
성분 함량(/L) 성분 함량(/L)
Na2B4O7·10H2O 100mg Thiamin·HCl 4mg
CoCl2·6H2O 20mg Riboflabin 2mg
CuSO4·6H2O 10mg Pentothecic acid 4mg
NiCl·H2O 10mg Pyridoxin.HCl 4mg
Na2MoO4·2H2O 10mg p-aminobenzoicc acid 4mg
CaCl·2H20 10mg Nicotinic acid 4mg
MnSO4·5H2O 100mg Inositol 20mg
FeSO4·7H2O 200mg Biotin(0.02% sol) 100㎕
실시예 2: 아미다제 생산과 전세포 (whole cell) 반응
실시예 1에서 분리된 아미다제 생산 균주들 중에 SFAA 9-4, MC 12-1(media C 12-1), SFAA 12-5, SFAA 31-1, LG 31-3, A118-2 균주의 stock에서 single colony를 FAA가 2g/ℓ농도로 첨가된 복합배지 D(K2HPO4 10g, NaH2PO4 5g, NaCl 0.5g, CaCl2-2H2O 0.02g, (NH4)2SO4 3.5g, yeast extract 0.5g, MgSO4-7H2O 0.3g, 포도당 4g, 미량원소용액 10㎖/ℓ, pH 7.5)에 200㎖에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 다음, 배양액을 원심분리하고, 상등액과 cell pellet을 분리하여, cell pellet을 25㎖ 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)용액에 현탁하였다. 휴지세포반응(resting cell biotransformation)은 세포 현탁액 3㎖와 FAA 반응용액 30㎕(농도 211.2mg/2㎖ 메탄올)를 혼합하여 반응성을 테스트하였다.
생성된 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid와 반응물 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide를 RP-HPLC 분석(아세토니트릴/물 = 7/3)을 통하여 전환율을, Chiral-HPLC를 통해 S/R 선택성을 분석하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2는 휴지세포를 이용한 FAA 전환율과 선택성을 나타낸 것이다.
* HPLC 분석조건
Chiral-HPLC로 분석[컬럼: Chiral AGP ChromTech(Congleton, UK), 용매: Na2HPO4 수용액(10mM pH 6.0)/에탄올 =95/5 vol%, 유속: 0.9㎖/min, 230nm, (S)-acid 8.0min, (R)-acid 6.0min, (S)-amide 20min, (R)-amide 16min]
균주 SFAA 9-4 MC 12-1 SFAA 12-5 SFAA 31-1 LG 31-3 A118-2
전환율 (%) 41 39 36 35 39 31
S/R선택성(* eep) 97.9 97.9 97.8 97.5 98.0 96.7
* eep = [(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid-(R)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid] / [(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid + (R)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid]]로 정의된다.
또한, 상기와 같은 방법으로 라세미체 (R),(S)-MAP에 대해서도 반응을 시행하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, LG 31-3 균주는 39% 전환율에서, (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide로부터 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid로의 S/R선택성은 98.0% eep 였다. 이러한 사실로부터, LG 31-3 균주가 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide로부터 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide를 선택적으로 가수분해하여 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid를 생성하는 아미다제를 생산한다는 것을 확인할 수 있었다. 도 1b는 본 발명의 LG 31-3 균주에서 생성된 아미다제를 이용한 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide의 가수분해 반응을 나타낸 것이다.
실시예 3: 균주의 동정
실시예 2에서 입체선택적 기질 특이성을 보이는 아미다제를 생산하는 LG 31-3 균주에 대해, Biolog 사의 95가지 탄소원을 입힌 그램 음성용 96웰 마이크로 플레이트를 사용하여, 기질 이용능을 측정하였다(표 3). 표 3은 대사지문법에 의한 결과를 나타낸 것이다.
Figure 112007026772229-pat00002
그 결과 표 3에 나타난 바와 같이, LG 31-3 균주는 버콜데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans )로 동정되었다. 본 발명자들은 상기 "Burkholderia multivorans LG 31-3" 균주를 2006년 3월 13일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KRIBB) 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 "KCTC 10920BP"로 기탁하였다.
실시예 4: 아미다제의 부분정제와 조효소반응
LG 31-3 균주를 실시예 2와 같은 성분의 배지(5㎖)에서 배양한 다음, 1.5ℓ에서 5개의 flask에서 배양(150rmp, 30℃)하였다. 배양액 중, FAA가 50% 전환되었을 때(24시간 배양) 원심분리하여 36.1g(wet weight)의 cell pellet을 얻었고, 이를 50mM potassium phosphate 완충용액(완충용액 A, pH 7.2, 1mMDTT, 1mM EDTA함유) 200㎖에 재현탁하였다. 상기 재현탁한 세포용액을 Bead beater(Biospec사)로 파쇄한 다음, 5000rpm으로 15min동안 원심분리한 다음 상등액을 조효소액으로 확보하였다.
조효소액 중에 존재하는 프로테아제에 의해 아미다제가 분해되지 않도록, 상기 상등액에 암모늄셀페이트 가루를 첨가한 다음 4℃로 유지하면서, 포화농도 35, 55 및 75%에서 각각 분획하였고, 완충용액에서 투석, MWCO 12,000)한 다음, Bradford 방법을 이용하여, 단백질의 농도를 측정하였다. 또한, 암모늄셀페이트 침전액을 조효소액으로하고, FAA를 기질로 하여 반응시켰다. 조효소액을 달리하면서 FAA stock solution(422mg/10㎖ 메탄올) 10㎕와 50mM Tris-HCl(pH 7.8)을 첨가하여 1㎖으로 맞춘 다음 반응시켰다. 각각의 시료를 시간을 달리하여 100㎕ 채취하고, 반응의 종결을 위해 1M H3PO4 50㎕ 첨가하고 850㎕ 아세토니트릴을 첨가한 다음, RP-HPLC 분석을 하였다 (도 2). 그 결과, 35%에서만 전환이 일어났으며, 도 2에 나타난 바와 같이, 첨가하는 조효소액이 증가할수록 초기반응속도는 증가하였다. 그러나, 전환율이 50%가 되면 반응속도가 현저히 줄어드는 것으로 보아, 본 발명에 따른 아미다제는 입체선택성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: 아미다제의 분리 정제
실시예 4의 35% 암모늄설페이트 침전용액을 PD-10을 이용하여 desalting한 후 YM10 막을 이용하여 농축하였고, Mono Q HR 5/5를 이용하여, 다음과 같은 조건으로 이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography: IEC)를 수행하였다.
* Ion Exchange Chromatography(IEC) 조건
완충용액 A: 50mM potassium phosphate (1mMDTT, 1mM EDTA 함유), pH7.2
완충용액 B: 50mM potassium phosphate (1mMDTT, 1mM EDTA 함유), 1M KCl, pH 7.2
Elution 조건: 초기 10㎖ 완충용액 A, Linear gradient: 100% 완충용액 B 50㎖
이온 교환 크로마토그래피를 수행한 다음, 1M ammonium sulfate를 첨가한 2.0㎖를 시료와, Phenyl sepharose HR 5/5를 이용하여, 다음과 같은 조건으로 소수성 상호반응 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography:HIC)를 수행하였다.
* Hydrophobic Interaction Chromatography:HIC) 조건
완충용액 A: 50mM potassium phosphate (1mMDTT, 1mM EDTA 함유), pH7.2, 1M ammonium sulfate
완충용액 B: 50mM potassium phosphate (1mMDTT, 1mM EDTA 함유), pH 7.2
Elution 조건: 초기 20min 완충용액 A, Linear gradient 완충용액 B 72㎖ 0.2㎖/min)
상기 소수성 상호반응 크로마토그래피를 수행한 다음, Superose 12 HR 10/30을 이용하고, elution은 50mM potassium phosphate(1mMDTT, 1mM EDTA함유, pH 8.0) 조건으로 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatography: GFC)를 수행하였다. 도 3a 및 3b는 각각 IEC와 GFC 이후의 fraction의 SDS-PAGE 그림이다. 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, GFC를 수행한 이후에도 순수한 단백질을 얻을 수 없어서 native gel을 수행하였다.
IEC를 수행한 후에, 아미다제 활성이 있는 분획 16㎕와 dye solution 84㎕를 혼합하여 SDS 없는 전개용액으로 전개한 뒤 lane 별로 절단한 다음, staining을 하고 band가 관찰된 위치를 잘라내어(7개) 잘게 부순 다음, 3일 동안 5℃에서 보관하였다. 상등액 500㎕를 50mM Tris-HCl(pH 7.8) 500㎕를 첨가하고, 10㎕ FAA stock solution을 첨가하였다. 반응이 관찰된 band 3 및 4를 다시 SDS-PAGE(denatured)를 수행하였으며, 50kDa의 아미다제가 순수하게 분리되었음을 확인하였다(도 3c).
실시예 6: N-말단 및 내부 아미노산 분석
실시예 5에서 GFC를 수행한 후의 시료를 SDS-PAGE를 통해 분리한 뒤 PVDF막에 blotting하였다 (CAPS buffer pH 11.0). 분자량이 50kDa의 시료를 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다.
또한, 아미다제의 내부서열을 알기 위해서 IEC 후의 활성이 있는 부분의 분획을 trypsin(Roche, modified for sequencing, -COOH 잔기가 lysine 또는 arginine인 경우)으로 처리하였다. 활성이 있는 분획 100㎕와 trypsin 용액 10㎕(1㎍/㎕농도, 50mM potassium phosphate, 1mM Mercaptoethanol, 1mM EDTA 함유, pH 8.0)를 혼합하고 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응액 50㎕를 RP-HPLC (1㎖/min, 210nm, Capcell Pak 4.9x300mm, 용매조건 solvent A: 0.1% TFA water, solvent B: 0.1% TFA acetonitrile, linear gradient 100% solvent B 60min)를 이용하여 분리한 다음, 31.6분 및 37.2분 분획을 농축한 다음, N-말단 아미노산 분석을 수행하였다 (도 4). 그 결과, 31.7분 분획의 경우, 상기의 SDS-PAGE 후 blotting한 N-말단 아미노산 서열과 동일하였으며, 그 결과는 서열번호 1과 같았다. 또한, 37.2분 분획의 경우는 서열번호 2와 같았다.
[N-말단 아미노산 서열] 서열번호 1: TTLGSLTLTEARHALRREF
[내부 아미노산 서열] 서열번호 2: VTRPVRLALPRTTFWRGLAADVDALAQQA
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 신규한 버콜데리아 멀티보란스 속 LG 31-3 균주(KCTCX 10920BP) 및 균주로부터 생산되는 입체선택적 기질 특이성을 가진 아미다제(amidase)를 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 버콜데리아 멀티보란스 속 LG 31-3 균주(KCTC 10920BP)로부터 생산되는 아미다제를 이용할 경 우, 상온 및 상압의 효소반응 조건하에서 라세미 혼합물인 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide을 손쉽게 광학분할하여, 단일 이성질체인 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid를 높은 광학순도로 제조할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> LG CHEM. LTD. <120> Novel Burkholderia multivorans LG 31-3, Amidase Produced from the Same and Method for Resolution of Racemic Mixture Using the Same <150> KR10200631323 <151> 2006-04-06 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 1 Thr Thr Leu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Glu Ala Arg His Ala Leu Arg 1 5 10 15 Arg Glu Phe <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Burkholderia sp. <400> 2 Val Thr Arg Pro Val Arg Leu Ala Leu Pro Arg Thr Thr Phe Trp Arg 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ala Asp Val Asp Ala Leu Ala Gln Gln Ala 20 25

Claims (8)

  1. 아미다제(amidase) 생성능을 가지는 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans) LG 31-3(KCTC 10920BP) 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 버콜데리아 멀티보란스 균주를 배양한 다음, 상기 배양된 균주로부터 아미다제(amidase)를 회수하는 것을 특징으로 하는 아미다제의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 버콜데리아 멀티보란스 균주 또는 상기 균주의 세포 파쇄물 존재하에 라세미 혼합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 라세미 혼합물의 광학분할(optical resolution) 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 라세미 혼합물은 하기 화학식 1로 표시되는 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide인 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure 112007026772229-pat00003
    [화학식 1]
  8. 제1항의 버콜데리아 멀티보란스 균주 또는 상기 균주의 세포 파쇄물 존재하에 화학식 1로 표시되는 라세미 (R),(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyramide를 광학분할하는 것을 특징으로 하는 (S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyric acid의 제조방법.
    Figure 112008080739885-pat00011
    [화학식 1]
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