JP5169244B2 - 新規還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規還元酵素およびそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、および該組換えベクターで形質転換された形質転換体等に関する。本発明はまた、新規還元酵素、または、該形質転換体を用いた光学活性アルコールである光学活性なマンデル酸化合物等の製造法に関する。
光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物は医農薬等の製造において有用な化合物であり、これまでに不斉還元試薬を用いる製造方法等が提案されているが、特許文献１の方法では、光学純度を高めるために反応後にさらなる再結晶等が行なわれており、非特許文献１の反応においても、反応の光学収率は必ずしも十分なものとは言えない。また微生物等を用いてオルト位に置換基を有する立体的に込み入った環境にあるフェニルグリオキシル酸化合物のケト基を還元し光学活性なマンデル酸化合物に不斉還元する方法はこれまで知られていない。
オルト位に置換基を有するフェニルグリオキサル酸化合物を良好な光学収率で光学活性なマンデル酸化合物に還元する方法を提供する。
本発明は、オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して工業的に有利に対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミド若しくはエステル化合物を製造することのできるタンパク質、当該タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡと略記する。）、当該ＤＮＡを含む形質転換体、当該ＤＮＡから該タンパク質を製造する方法および当該タンパク質を用いて、オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を製造する方法を提供する。
即ち、本発明は、
１．下記ａ）からｄ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｂ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡの塩基配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｃ）ｉ)配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｄ）配列番号２で示される塩基配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするＤＮＡ；
３．前項１又は２記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター；
４．前項２記載のＤＮＡ又は前項３記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載のＤＮＡを保有することを特徴とする形質転換体；
８．前項３記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記a)〜ｅ）のいずれかの特徴を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
ｂ）ｉ)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｃ）ｉ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｄ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０．前項１記載のＤＮＡ及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター；
１１．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１０記載の組換えベクター；
１２．グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質がバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項1１記載の組換えベクター；
１３．前項１０〜１２記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１４．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１５．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１６．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを保有することを特徴とする形質転換体；
１７．前項９記載のタンパク質、または、前項４〜７、１３〜１６のいずれかに記載の形質転換体、またはその処理物をプロキラルなカルボニル化合物と反応させることを特徴とする光学活性なアルコール化合物の製造方法；
１８．プロキラルなカルボニル化合物がオルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミドもしくはエステル化合物であり、対応する光学活性なアルコール化合物が光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物である前項１７に記載の製造方法；
１９．オルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミドもしくはエステル化合物が式（１）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいアルコキシ基を表し、Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基を表す。）
で示される化合物であり、光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物が、式（２）：
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ意味を表し、＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子である。）
で示される光学活性化合物である前項１８記載の製造方法；
２０．ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1(FERM BP-10785)；等を提供するものである。
１．下記ａ）からｄ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｂ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡの塩基配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｃ）ｉ)配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｄ）配列番号２で示される塩基配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするＤＮＡ；
３．前項１又は２記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター；
４．前項２記載のＤＮＡ又は前項３記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載のＤＮＡを保有することを特徴とする形質転換体；
８．前項３記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記a)〜ｅ）のいずれかの特徴を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
ｂ）ｉ)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｃ）ｉ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｄ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０．前項１記載のＤＮＡ及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター；
１１．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１０記載の組換えベクター；
１２．グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質がバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項1１記載の組換えベクター；
１３．前項１０〜１２記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１４．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１５．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１６．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを保有することを特徴とする形質転換体；
１７．前項９記載のタンパク質、または、前項４〜７、１３〜１６のいずれかに記載の形質転換体、またはその処理物をプロキラルなカルボニル化合物と反応させることを特徴とする光学活性なアルコール化合物の製造方法；
１８．プロキラルなカルボニル化合物がオルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミドもしくはエステル化合物であり、対応する光学活性なアルコール化合物が光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物である前項１７に記載の製造方法；
１９．オルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミドもしくはエステル化合物が式（１）：
で示される化合物であり、光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物が、式（２）：
で示される光学活性化合物である前項１８記載の製造方法；
２０．ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1(FERM BP-10785)；等を提供するものである。
本発明によれば、医農薬またはその製造中間体等として有用な光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物を良好な光学純度で製造することができる。
まず、本発明ＤＮＡについて説明する。
本発明ＤＮＡは、オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物に不斉還元する能力を有する微生物、例えば、ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株(FERM-BP 10785)などのステノトロフォモナス属に属する微生物から得ることができる。本発明のＤＮＡは、かかる天然のＤＮＡであってもよく、又はかかる天然のＤＮＡに以下に説明するような方法で変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出されたＤＮＡであってもよい。
ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７８５の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成１９年２月２１日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、２４時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．７〜０．８×１.５〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陰性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：淡黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁スムーズ
コロニーの隆起：レンズ状
透明度 ：不透明
３．生理学的性質
（１） カタラーゼ：陽性
（２） オキシダーゼ：陰性
（３） ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas rhizophila）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。国際塩基配列データベースを用いたＢＬＡＳＴ検索においても、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属由来１６ＳリボゾームＤＮＡと高い相同性を示した。
１．コロニー形態（３０℃、２４時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．７〜０．８×１.５〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陰性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：淡黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁スムーズ
コロニーの隆起：レンズ状
透明度 ：不透明
３．生理学的性質
（１） カタラーゼ：陽性
（２） オキシダーゼ：陰性
（３） ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ステノトロフォモナス・リゾフィラ（Stenotrophomonas rhizophila）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。国際塩基配列データベースを用いたＢＬＡＳＴ検索においても、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属由来１６ＳリボゾームＤＮＡと高い相同性を示した。
以上の菌学的性質により、本菌はステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）と同定された。
本発明ＤＮＡにおいて「配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。
具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するＤＮＡ等があげられる。
かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。配列相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。
かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。配列相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。
本発明のＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製することができる。
ステノトロフォモナス・エスピー（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）等のステノトロフォモナス属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明のＤＮＡを調製することができる。
ステノトロフォモナス・エスピー（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）等のステノトロフォモナス属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明のＤＮＡを調製することができる。
また、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本発明のＤＮＡを調製することができる。
該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持する条件が挙げられる。
なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側、及び／又は３’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
また、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明のＤＮＡを調製することができる。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、pKK223-3（Pharmacia社製）などが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡは、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明のＤＮＡを調製することができる。
上記のようにして調製されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換えベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、pKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
上述のようにして得られるＤＮＡが、オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物、典型的にはそのアミド若しくはエステル化合物（例えば、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド）を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物、典型的にはそのアミド若しくはエステル化合物（例えば、（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド）を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで該形質転換体の培養物をオルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物（例えば、当該化合物のアミド若しくはエステル化合物、その具体例としては、例えば、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド）に作用させる。反応生成物中の対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物（例えば、そのアミド若しくはエステル化合物、具体的には、例えば、（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド）の量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
本発明ＤＮＡを宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明ＤＮＡとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを宿主細胞に導入する。
ここで、「機能可能な形で」とは、該ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明ＤＮＡが、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができ、ステノトロフォモナス・エスピーにおいて本発明ＤＮＡの発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを前述のようなベクターに組み込んでなる組換えベクターを宿主細胞に導入する。尚、ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ＤＮＡ又は本発明組換えベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Rhodococcus属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ＤＮＡ又は本発明組換えベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ＤＮＡ又は本発明組換えベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
該形質転換体が本発明ＤＮＡを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
次に本発明タンパク質について説明する。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。
本発明タンパク質は、例えば、本発明ＤＮＡを保有する形質転換体を培養することにより製造することができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明ＤＮＡとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
本発明ＤＮＡを保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐHは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本発明ＤＮＡを保有する形質転換体の培養物から本発明タンパク質を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明タンパク質を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを不斉還元して（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを優先的に生産する能力を指標にして選抜すればよい。
次に、本発明の形質転換体およびその処理物は、プロキラルなカルボニル化合物である式（１）で示されるオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物（例えば、そのエステルもしくはアミド化合物）を、不斉還元して、光学活性なアルコール化合物である式（２）で示される光学活性なオルト置換マンデル酸化合物（例えば、そのアミドもしくはエステル化合物）を製造するのに用いることができる。
式（１）のオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物、及び、式（２）のオルト置換マンデル酸化合物において、Ｒ１で表される置換基について以下説明する。
Ｒ１で表される置換されていてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基の他に、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などＣ１−６のアルキルアミノ基が例示される。また、置換されていてもよいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基およびオクチルオキシ基などのＣ1-8のアルコキシ基を挙げることができる。
次にＲ２で表される置換基について以下説明する。
Ｒ２で表される置換されていてもよいＣ1-8のアルキル基におけるC1-8のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基およびオクチル基などが例示される。
かかるＣ１−８のアルキル基の置換基としては、置換されていても良いアルコキシ基および置換されていてもよいアリールオキシ基が例示される。
Ｒ２で表される置換されていてもよいアルコキシアルキル基としては、例えば、メトキシメチル基、メトキシエチル基、メトキシプロピル基、メトキシブチル基、メトキシペンチル基、メトキシヘキシル基、メトキシヘプチル基、メトキシオクチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、エトキシプロピル基、エトキシブチル基、エトキシペンチル基、エトキシヘキシル基、エトキシヘプチル基、エトキシオクチル基、プロポキシメチル基、プロポキシエチル基、プロポキシプロピル基、プロポキシブチル基、プロポキシペンチル基、プロポキシヘキシル基、プロポキシヘプチル基、プロポキシオクチル基、ブトキシメチル基、ブトキシエチル基、ブトキシプロピル基、ブトキシブチル基、ブトキシペンチル基、ブトキシヘキシル基、ブトキシヘプチル基、ブトキシオクチル基等のＣ1-4のアルコキシ基で置換されたＣ1-8のアルキル基が例示される。
置換されていてもよいアリールオキシ基としては、式（３）：
（式中、Ａ、ＢおよびＣは、同一又は互いに相異なり、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アルキルアミノアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルコキシ基で置換されていてもよいアラルキル基、ハロゲン原子およびアルコキシ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいアリール基、アルキルチオ基、アミノ基、アルキルアミノ基を表す。）
で表されるアリールオキシ基が例示される。
Ｒ１で表される置換されていてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基の他に、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などＣ１−６のアルキルアミノ基が例示される。また、置換されていてもよいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基およびオクチルオキシ基などのＣ1-8のアルコキシ基を挙げることができる。
次にＲ２で表される置換基について以下説明する。
Ｒ２で表される置換されていてもよいＣ1-8のアルキル基におけるC1-8のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基およびオクチル基などが例示される。
かかるＣ１−８のアルキル基の置換基としては、置換されていても良いアルコキシ基および置換されていてもよいアリールオキシ基が例示される。
Ｒ２で表される置換されていてもよいアルコキシアルキル基としては、例えば、メトキシメチル基、メトキシエチル基、メトキシプロピル基、メトキシブチル基、メトキシペンチル基、メトキシヘキシル基、メトキシヘプチル基、メトキシオクチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、エトキシプロピル基、エトキシブチル基、エトキシペンチル基、エトキシヘキシル基、エトキシヘプチル基、エトキシオクチル基、プロポキシメチル基、プロポキシエチル基、プロポキシプロピル基、プロポキシブチル基、プロポキシペンチル基、プロポキシヘキシル基、プロポキシヘプチル基、プロポキシオクチル基、ブトキシメチル基、ブトキシエチル基、ブトキシプロピル基、ブトキシブチル基、ブトキシペンチル基、ブトキシヘキシル基、ブトキシヘプチル基、ブトキシオクチル基等のＣ1-4のアルコキシ基で置換されたＣ1-8のアルキル基が例示される。
置換されていてもよいアリールオキシ基としては、式（３）：
で表されるアリールオキシ基が例示される。
式（３）におけるＡ、ＢもしくはＣで表される置換基について以下説明する。
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などのＣ1-4アルキル基が例示される。
アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、クロチル基などのＣ2-4のアルケニル基が例示される。
アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロパルギル基、ブチニル基などＣ2-4のアルキニル基が例示される。
シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などＣ3-6のシクロアルキル基が例示される。
シクロアルケニル基としては、例えば、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などのＣ5-6のシクロアルケニル基が例示される。
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基などのＣ1-4のアルコキシ基が例示される。
ハロゲン化アルキル基としては、例えば、トルフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジフロオロメチル基、クロロメチル基、２−ブロモエチル基、１，２−ジクロロプロピル基などＣ１−３のハロアルキル基が例示される。
ヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、１−，２−ヒドロキシエチル基などのヒドロキシ置換のＣ１−２アルキル基が例示される。
アルコキシアルキル基としては、例えば、メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基などＣ1-2アルコキシの置換Ｃ1-2アルキル基が例示される。
アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、１−，２−アミノエチル基等のモノアミノ置換のＣ１−２アルキル基、もしくはジアミノ置換のＣ1-２アルキル基が例示される。
アルキルアミノアルキル基としては、例えば、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、ジエチルアミノメチル基などモノ（C1-2）アルキルアミノ置換のＣ１−２アルキル基、もしくはジ（C1-2）アルキルアミノ置換のＣ1-２アルキル基が例示される。
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が例示される。
アルコキシ基で置換されていてもよいアラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、４−メトキシベンジル基などのＣ1-2のアルコキシ基で置換されていてもよいＣ7-8アラルキル基が例示される。
ハロゲン原子およびアルコキシ基から選ばれる基で置換されていてもよいアリール基としては、例えば、２−，３−，４−クロロフェニル基、２−，３−，４−メチルフェニル基、２−，３−，４−メトキシフェニル基、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などのハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子）およびＣ1-2アルコキシ基から選ばれる基で置換されていてもよいＣ6-10のアリール基が例示される。
アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基等のＣ1-３のアルキルチオ基が例示される。
アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などＣ１−６のアルキルアミノ基等が例示される。
かかる置換されていても良いアリールオキシ基を有する式（１’）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいアルコキシ基を表し、Ａ、ＢおよびＣは、同一又は互いに相異なり、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アルキルアミノアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルコキシ基で置換されていてもよいアラルキル基、ハロゲン原子およびアルコキシ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいアリール基、アルキルチオ基、アミノ基、アルキルアミノ基を表す。）
で示されるオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物からは、式（２’）：
（式中、Ｒ１、Ａ、ＢおよびＣは前記と同じ意味を表し、＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表される化合物が得られる。
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などのＣ1-4アルキル基が例示される。
アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、クロチル基などのＣ2-4のアルケニル基が例示される。
アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロパルギル基、ブチニル基などＣ2-4のアルキニル基が例示される。
シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などＣ3-6のシクロアルキル基が例示される。
シクロアルケニル基としては、例えば、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などのＣ5-6のシクロアルケニル基が例示される。
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基などのＣ1-4のアルコキシ基が例示される。
ハロゲン化アルキル基としては、例えば、トルフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジフロオロメチル基、クロロメチル基、２−ブロモエチル基、１，２−ジクロロプロピル基などＣ１−３のハロアルキル基が例示される。
ヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、１−，２−ヒドロキシエチル基などのヒドロキシ置換のＣ１−２アルキル基が例示される。
アルコキシアルキル基としては、例えば、メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基などＣ1-2アルコキシの置換Ｃ1-2アルキル基が例示される。
アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、１−，２−アミノエチル基等のモノアミノ置換のＣ１−２アルキル基、もしくはジアミノ置換のＣ1-２アルキル基が例示される。
アルキルアミノアルキル基としては、例えば、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、ジエチルアミノメチル基などモノ（C1-2）アルキルアミノ置換のＣ１−２アルキル基、もしくはジ（C1-2）アルキルアミノ置換のＣ1-２アルキル基が例示される。
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が例示される。
アルコキシ基で置換されていてもよいアラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、４−メトキシベンジル基などのＣ1-2のアルコキシ基で置換されていてもよいＣ7-8アラルキル基が例示される。
ハロゲン原子およびアルコキシ基から選ばれる基で置換されていてもよいアリール基としては、例えば、２−，３−，４−クロロフェニル基、２−，３−，４−メチルフェニル基、２−，３−，４−メトキシフェニル基、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などのハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子）およびＣ1-2アルコキシ基から選ばれる基で置換されていてもよいＣ6-10のアリール基が例示される。
アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基等のＣ1-３のアルキルチオ基が例示される。
アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などＣ１−６のアルキルアミノ基等が例示される。
かかる置換されていても良いアリールオキシ基を有する式（１’）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいアルコキシ基を表し、Ａ、ＢおよびＣは、同一又は互いに相異なり、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アミノアルキル基、アルキルアミノアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルコキシ基で置換されていてもよいアラルキル基、ハロゲン原子およびアルコキシ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいアリール基、アルキルチオ基、アミノ基、アルキルアミノ基を表す。）
で示されるオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物からは、式（２’）：
で表される化合物が得られる。
式（１）および（１’）の化合物としては、Ｒ１で表される置換されていてもよいアミノ基としては、メチルアミノ基が、置換されていてもよいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、あるいは、エトキシ基が好ましい。また、Ｒ２で表される置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基としては、メチル基が好ましく、置換されていてもよいアルコキシアルキル基としては、例えば、メトキシメチル基が、また、置換されていてもよいアリールオキシアルキル基としては、例えば、ジメチルフェノキシメチル基が好ましく、さらに詳しくは、２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド、２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド、または、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−オキソ酢酸メチルが例示される。
本発明の方法では、かかるオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物を基質とした場合は、式（２）もしくは式（２’）の化合物が得られ、具体的な化合物としては、それぞれ２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸エチル、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸エチル、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、または、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸メチルの光学活性体が得られる。
本発明の方法では、かかるオルト置換フェニルグリオキサル酸化合物を基質とした場合は、式（２）もしくは式（２’）の化合物が得られ、具体的な化合物としては、それぞれ２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸エチル、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸エチル、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド、または、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸メチルの光学活性体が得られる。
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記す。）等の補酵素の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
上記方法における反応は、例えば、水、オルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミド若しくはエステル化合物（例えば、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド）、及び、ＮＡＤＰＨを、本発明タンパク質あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
反応の終点は、例えば、反応液中のオルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミド若しくはエステル化合物（例えば、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド）の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
反応液からのオルト置換の光学活性なマンデル酸のアミド若しくはエステル化合物（例えば、（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド）の回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
具体的な形態としては、例えば、本発明ＤＮＡを保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物としては、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
尚、本発明ＤＮＡを保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明タンパク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
また、本発明の光学活性なオルト置換マンデル酸アミド若しくはエステル化合物の製造方法はＮＡＤＰＨ等の補酵素の存在下に行われ、当該オルト置換フェニルグリオキサル酸アミド若しくはエステル化合物（例えば、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド）は、不斉還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＰＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤＰ+は、ＮＡＤＰ+を還元型（ＮＡＤＰＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＰＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）、または、ＮＡＤＰ+を還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す）、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
また、ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また該酵素をもつ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
さらに、本発明のオルト置換の光学活性マンデル酸アミドもしくはエステル化合物の製造方法では、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+、または、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、または、ＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者ＤＮＡを宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者ＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者ＤＮＡを別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方のＤＮＡまたは両者ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者ＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者ＤＮＡに連結して組換えベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換えベクターを構築してもよい。
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
参考例１ （染色体ＤＮＡの調製）
２本の５００ｍｌフラスコに培地（水１００ｍｌにグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．３ｇ、肉エキス０．３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０５ｇを溶解し、２ＮのＨＣｌでｐＨを６に調整したもの）をそれぞれ１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株(FERM-BP 10785)の培養液をそれぞれ０．３ｍｌずつ加え、３０℃で２４時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心し（８０００rpm、４℃、１０分）、生じた沈殿を集めた。この沈殿を０．８５％食塩水５０ｍｌで洗浄して、３．５ｇの湿菌体を得た。
参考例１ （染色体ＤＮＡの調製）
２本の５００ｍｌフラスコに培地（水１００ｍｌにグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．３ｇ、肉エキス０．３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０５ｇを溶解し、２ＮのＨＣｌでｐＨを６に調整したもの）をそれぞれ１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株(FERM-BP 10785)の培養液をそれぞれ０．３ｍｌずつ加え、３０℃で２４時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心し（８０００rpm、４℃、１０分）、生じた沈殿を集めた。この沈殿を０．８５％食塩水５０ｍｌで洗浄して、３．５ｇの湿菌体を得た。
上記の菌体から、QIAprep Genomic-tip System (Qiagen社製)を用いて染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ａ）と記す。）を得た。
実施例１ （本発明ＤＮＡの取得及びその解析）
（１）本発明タンパク質の調製
参考例と同様の条件で調製したステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株(FERM-BP 10785)の湿菌体約７．５ｇを、１ｍＭになるようにＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を添加した２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁しマルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．1ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。得られた破砕液にプロタミン硫酸を３８ｍｇ添加後、遠心分離（８０００rpm、４℃、１０分）し、上清をさらにフィルター（０．４５μｍ）ろ過し、遠心上清液約８ｍｌを得た。同様な操作を繰り返し実施し、遠心上清液約４０ｍｌを得た。
（１）本発明タンパク質の調製
参考例と同様の条件で調製したステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株(FERM-BP 10785)の湿菌体約７．５ｇを、１ｍＭになるようにＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を添加した２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁しマルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．1ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。得られた破砕液にプロタミン硫酸を３８ｍｇ添加後、遠心分離（８０００rpm、４℃、１０分）し、上清をさらにフィルター（０．４５μｍ）ろ過し、遠心上清液約８ｍｌを得た。同様な操作を繰り返し実施し、遠心上清液約４０ｍｌを得た。
得られた遠心上清液から約１０ｍｌをアフィニティー相互作用クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＢｌｕｅＨＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したリン酸カリウム緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→１．０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．５〜０．８Ｍの画分２ｍｌを得た。同様な操作を繰り返し実施し、活性画分約１０ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に、バッファー交換した。これをイオン交換クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→０．５Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２Ｍの活性画分２ｍｌを得た。同様な操作を繰り返し実施し、活性画分約６ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。この濃縮液をゲル濾過カラム［Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）］し、還元酵素活性を有する画分として分子量約３５０００ダルトンの溶出画分１ｍｌ（以下、活性画分（Ａ）と記す。）を得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に、バッファー交換した。これをイオン交換クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→０．５Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２Ｍの活性画分２ｍｌを得た。同様な操作を繰り返し実施し、活性画分約６ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。この濃縮液をゲル濾過カラム［Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）］し、還元酵素活性を有する画分として分子量約３５０００ダルトンの溶出画分１ｍｌ（以下、活性画分（Ａ）と記す。）を得た。
尚、クロマトグラフィー等で得られた画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３ｍｇ、クロマトグラフィー等により得られた溶出画分０．２ｍｌ、ＮＡＤＰＨ９ｍｇ、酢酸ブチル０．１５ｍｌ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌを混合し、３０℃で１８時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析測定を行なった。２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの残存量、および（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの生成量から還元酵素活性を求めた。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（２）本発明タンパク質由来の部分ペプチドが有するアミノ酸配列の解析
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを切り取った。このゲルを洗浄後、トリプシンを処理し、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、移動層：Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸水）、Ｂ液（０．０９％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）、Ａ／Ｂ＝１００／０→０／１００の濃度勾配）により分取した。分取した各画分の中から２個の画分につきアミノ酸配列をプロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）により決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号３、または、配列番号４に示す。
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを切り取った。このゲルを洗浄後、トリプシンを処理し、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、移動層：Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸水）、Ｂ液（０．０９％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）、Ａ／Ｂ＝１００／０→０／１００の濃度勾配）により分取した。分取した各画分の中から２個の画分につきアミノ酸配列をプロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）により決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号３、または、配列番号４に示す。
（３）本発明ＤＮＡ由来の部分塩基配列の解析（その１）
配列番号３で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、配列番号４で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号３で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、配列番号４で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号５、および、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡ（Ａ）を鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用した。)
[反応液組成]
染色体ＤＮＡ（Ａ）溶液 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
enz.expandHiFi (5U/μl) 0.5μl
超純水 35.7μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約６００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
染色体ＤＮＡ（Ａ）溶液 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
enz.expandHiFi (5U/μl) 0.5μl
超純水 35.7μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約６００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
上記の約６００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen社製ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキット使用）、得られたライゲーション液でE．coli TOP10F'を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、Ｘ−ｇａｌと記す）４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列番号７に示す塩基配列を決定した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、Ｘ−ｇａｌと記す）４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列番号７に示す塩基配列を決定した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
（４）本発明ＤＮＡ由来の部分塩基配列の解析（その２）
配列番号７で示される塩基配列を基に配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、および、配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、配列番号７で示される塩基配列を基に配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、および、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号７で示される塩基配列を基に配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、および、配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。また、配列番号７で示される塩基配列を基に配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、および、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号８、および配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡ（Ａ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ処理した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで自己ライゲーションさせたＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。また、配列番号１０、および配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡ（Ａ）を制限酵素ＥｃｏＲＶ処理した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで自己ライゲーションさせたＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ（Ａ）処理溶液 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
enz.expandHiFi (5U/μl) 0.5μl
超純水 35.7μl
染色体ＤＮＡ（Ａ）処理溶液 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
enz.expandHiFi (5U/μl) 0.5μl
超純水 35.7μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行った結果、配列番号８、および配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲを行った結果、約６００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。また、配列番号１０、および配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲを行った結果、約１３００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
上記の約６００ｂｐ、または約１３００ｂｐのＤＮＡ断片をｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキット使用）、そのライゲーション液でE．coli TOP10F'を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。得られた塩基配列を基にステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1株(FERM-BP 10785)が有する２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを不斉還元して（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを優先的に生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）を決定した。さらに配列番号２をもとに該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を決定した。
なお、配列番号１と配列番号３、または配列番号４を比較したところ、配列番号３、または配列番号４で示されるアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部分と一致することがわかった。
なお、配列番号１と配列番号３、または配列番号４を比較したところ、配列番号３、または配列番号４で示されるアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部分と一致することがわかった。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
実施例２ （本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その１））
（１）本発明ベクターの調製
配列番号２に示される塩基配列を基に配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、および、配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
（１）本発明ベクターの調製
配列番号２に示される塩基配列を基に配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、および、配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１３で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、前記染色体ＤＮＡ（Ａ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ（Ａ）溶液 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
enz.expandHiFi (5U/μl) 0.5μl
超純水 35.7μl
染色体ＤＮＡ（Ａ）溶液 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
enz.expandHiFi (5U/μl) 0.5μl
超純水 35.7μl
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとXbaIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出した６つのプラスミドに前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴｒｃＲｓと記す。）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとXbaIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出した６つのプラスミドに前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴｒｃＲｓと記す。）
（２）本発明形質転換体の調製及び還元反応例
プラスミドｐＴｒｃＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．２ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（９ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、１５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．１２ｇを得た。得られた湿菌体に、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド１．５ｍｇ、ＮＡＤＰＨ６．９ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌ、グルコース２．７ｍｇ、酢酸ブチル０．０７５ｍｌを混合し、３０℃で２３時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの量に対して２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは９７．９％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
プラスミドｐＴｒｃＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．２ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（９ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、１５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．１２ｇを得た。得られた湿菌体に、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド１．５ｍｇ、ＮＡＤＰＨ６．９ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌ、グルコース２．７ｍｇ、酢酸ブチル０．０７５ｍｌを混合し、３０℃で２３時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの量に対して２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは９７．９％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学純度測定条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ
移動相：ヘキサン：２−プロパノール＝９：１
分析時間：５０分
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ
移動相：ヘキサン：２−プロパノール＝９：１
分析時間：５０分
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
実施例３ （本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その２））
（１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
Bacillus megaterium IFO12108株を滅菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養し、菌体０．４ｇを得た。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記す。）を精製した。
（２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載されたBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素の配列をもとに配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを合成した。
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用い、前記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
（１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
Bacillus megaterium IFO12108株を滅菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養し、菌体０．４ｇを得た。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記す。）を精製した。
（２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載されたBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素の配列をもとに配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを合成した。
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに用い、前記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
［反応液組成］
染色体DNA（Ｂ）原液 1μl
dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl
10xbuffer(with MgCl) 5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.375μl
超純水 41.725μl
染色体DNA（Ｂ）原液 1μl
dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl
10xbuffer(with MgCl) 5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.375μl
超純水 41.725μl
［PCR反応条件］
上記組成に反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間) -72℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間)-72℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。
上記組成に反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間) -72℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間)-72℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行った結果、約９５０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
得られたＰＣＲ反応液とInvitrogen社製ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットＶｅｒ．Ｅとを用いて、ＰＣＲによって得られた約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。次いで培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドの一部を制限酵素（EcoRI）で消化し、電気泳動することにより、該プラスミドには約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記す。）
次に、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果を配列番号１６に示す。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いてプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
次に、配列番号１６で示される塩基配列を基に配列番号１７および配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号１７および配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
得られたＰＣＲ反応液とInvitrogen社製ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットＶｅｒ．Ｅとを用いて、ＰＣＲによって得られた約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地にＸ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌを塗布し、そこに得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。次いで培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドの一部を制限酵素（EcoRI）で消化し、電気泳動することにより、該プラスミドには約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記す。）
次に、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果を配列番号１６に示す。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いてプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。
次に、配列番号１６で示される塩基配列を基に配列番号１７および配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号１７および配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)
［反応液組成］
染色体DNA（Ｂ）原液 1μl
dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl
10xbuffer(with MgCl) 5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.375μl
超純水 41.725μl
染色体DNA（Ｂ）原液 1μl
dNTP(各2.5mM-mix) 0.4μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.75μl
10xbuffer(with MgCl) 5μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.375μl
超純水 41.725μl
［PCR反応条件］
上記組成に反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間) -72℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間)-72℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドには４つのプラスミドに前記約８００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴｒｃＧＤＨと記す。）
上記組成に反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、97℃（2分間）に加熱した後、97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間) -72℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(１５秒間)-55℃(３０秒間)-72℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回、さらに72℃で7分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドには４つのプラスミドに前記約８００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴｒｃＧＤＨと記す。）
（３）本発明ベクターの調製
配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、プラスミドｐＴｒｃＲｓを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、プラスミドｐＴｒｃＲｓを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)
［反応液組成］
プラスミドｐＴｒｃＲｓ 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase 0.5μl (2.5U)
超純水 35.7μl
プラスミドｐＴｒｃＲｓ 2μl
dNTP(各2.5mM-mix) 1μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl) 10μl
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase 0.5μl (2.5U)
超純水 35.7μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＴｒｃＧＤＨを２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）で二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
それぞれの酵素消化されたＤＮＡ断片をT4 DNAリガーゼでライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーから６コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をBamHIとXbaIの2種類の制限酵素で二重消化した後、電気泳動することによって、取り出したプラスミドは全て目的とする約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した（以下、このプラスミドを以下プラスミドｐＴｒｃＧＳＲｓと記す）。
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃（９０秒間）のサイクルを１０回、次いで９４℃(１０秒間)‐６５℃(３０秒間)‐７２℃(１分間＋５秒/サイクル)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＴｒｃＧＤＨを２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）で二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
それぞれの酵素消化されたＤＮＡ断片をT4 DNAリガーゼでライゲーションし、そのライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーから６コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をBamHIとXbaIの2種類の制限酵素で二重消化した後、電気泳動することによって、取り出したプラスミドは全て目的とする約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した（以下、このプラスミドを以下プラスミドｐＴｒｃＧＳＲｓと記す）。
（４）本発明形質転換体の調製及び還元反応例
プラスミドｐＴｒｃＧＳＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．２ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．１ｇを得た。得られた湿菌体に、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３ｍｇ、ＮＡＤＰ＋１．８ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌ、グルコース２．８ｍｇ、テトラヒドロフラン０．１５ｍｌを混合し、３０℃で２４時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの量に対して２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは９６．８％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
プラスミドｐＴｒｃＧＳＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．２ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．１ｇを得た。得られた湿菌体に、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３ｍｇ、ＮＡＤＰ＋１．８ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌ、グルコース２．８ｍｇ、テトラヒドロフラン０．１５ｍｌを混合し、３０℃で２４時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの量に対して２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは９６．８％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学純度測定条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ
移動相：ヘキサン：２−プロパノール＝９：１
分析時間：５０分
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ
移動相：ヘキサン：２−プロパノール＝９：１
分析時間：５０分
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
実施例４ (本発明形質転換体の還元反応例（その３）)
プラスミドｐＴｒｃＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、１５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．１ｇを得た。得られた湿菌体に、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−オキソ酢酸メチル３ｍｇ、ＮＡＤＰＨ１３．５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌ、酢酸ブチル０．１５ｍｌを混合し、３０℃で２４時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−オキソ酢酸メチルの量に対して２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸メチルは２８．８％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸メチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
プラスミドｐＴｒｃＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、１５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．１ｇを得た。得られた湿菌体に、２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−オキソ酢酸メチル３ｍｇ、ＮＡＤＰＨ１３．５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌ、酢酸ブチル０．１５ｍｌを混合し、３０℃で２４時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−オキソ酢酸メチルの量に対して２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸メチルは２８．８％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−２−ヒドロキシ酢酸メチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学純度測定条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ
移動相：ヘキサン：２−プロパノール＝９：１
分析時間：５０分
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈ
移動相：ヘキサン：２−プロパノール＝９：１
分析時間：５０分
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
実施例５ （本発明タンパク質の諸性質）
（１）本発明タンパク質の調製
プラスミドｐＴｒｃＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×８）に接種し、振盪培養した（３７℃、１３．５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約５．４ｇを得た。湿菌体約５．４ｇを、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに懸濁しマルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．1ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。得られた破砕液を遠心分離（８０００rpm、４℃、１０分）し、上清をさらにフィルター（０．４５μｍ）ろ過し、遠心上清液約１８ｍｌを得た。得られた遠心上清液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮し、約４ｍｌの遠心上清濃縮液を得た。
得られた遠心上清濃縮液約４ｍｌをアフィニティー相互作用クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＢｌｕｅＨＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したリン酸カリウム緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→１．２Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．０１〜０．３４Ｍの画分約６ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に、バッファー交換した。これをイオン交換クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→０．５Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２Ｍの活性画分２ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。この濃縮液をゲル濾過カラム［Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）］し、還元酵素活性を有する画分として分子量約３２２００ダルトンの溶出画分１ｍｌ（以下、活性画分（C）と記す。）を得た。
尚、クロマトグラフィー等で得られた画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３ｍｇ、クロマトグラフィー等により得られた溶出画分０．２ｍｌ、ＮＡＤＰＨ９ｍｇ、酢酸ブチル０．１５ｍｌ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌを混合し、３０℃で１８時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析測定を行なった。２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの残存量、および（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの生成量から還元酵素活性を求めた。
（１）本発明タンパク質の調製
プラスミドｐＴｒｃＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×８）に接種し、振盪培養した（３７℃、１３．５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約５．４ｇを得た。湿菌体約５．４ｇを、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに懸濁しマルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．1ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。得られた破砕液を遠心分離（８０００rpm、４℃、１０分）し、上清をさらにフィルター（０．４５μｍ）ろ過し、遠心上清液約１８ｍｌを得た。得られた遠心上清液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮し、約４ｍｌの遠心上清濃縮液を得た。
得られた遠心上清濃縮液約４ｍｌをアフィニティー相互作用クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＢｌｕｅＨＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したリン酸カリウム緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→１．２Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．０１〜０．３４Ｍの画分約６ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に、バッファー交換した。これをイオン交換クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０→０．５Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、還元酵素活性を有する画分として塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２Ｍの活性画分２ｍｌを得た。
この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、および、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。この濃縮液をゲル濾過カラム［Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ７．０）］し、還元酵素活性を有する画分として分子量約３２２００ダルトンの溶出画分１ｍｌ（以下、活性画分（C）と記す。）を得た。
尚、クロマトグラフィー等で得られた画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３ｍｇ、クロマトグラフィー等により得られた溶出画分０．２ｍｌ、ＮＡＤＰＨ９ｍｇ、酢酸ブチル０．１５ｍｌ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌを混合し、３０℃で１８時間攪拌した。その後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析測定を行なった。２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの残存量、および（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの生成量から還元酵素活性を求めた。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＤＳ Ａ−２１２
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（２）本発明タンパク質の酵素化学的性質
活性画分（C）を用いて本発明タンパク質の酵素化学的性質について調べた。
（１）作用
ＮＡＤＰＨを補酵素として２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドに作用して、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドへと還元した。
（２）至適ｐＨ
作用至適ｐＨを調べるためにｐＨ５．５〜ｐＨ１０におけるベンゾイルギ酸エチル還元活性を測定した。緩衝液として１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．５〜８）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７〜９）、および１００ｍＭＴｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅバッファー（ｐＨ９〜１０）を用いた。ベンゾイルギ酸エチルに対する還元活性は各種緩衝液に基質ベンゾイルギ酸エチルを終濃度１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．５ｍＭになるように溶解し、さらに精製した本発明タンパク質（活性画分（C））を添加して、３０℃で１分間反応を行なった際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を１ｕｎｉｔと定義した。その結果、至適ｐＨは７．０であった。
（３）基質特異性
１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に基質となるカルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを０．５ｍＭとなるようにそれぞれ溶解した。これに精製した本発明タンパク質（活性画分（C））を適当量添加し、３０℃で５分間反応を行なった。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これをベンゾイルギ酸エチルに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表１に示した。
活性画分（C）を用いて本発明タンパク質の酵素化学的性質について調べた。
（１）作用
ＮＡＤＰＨを補酵素として２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドに作用して、光学純度１００％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−（２−（２，５−ジメチルフェノキシメチル）フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドへと還元した。
（２）至適ｐＨ
作用至適ｐＨを調べるためにｐＨ５．５〜ｐＨ１０におけるベンゾイルギ酸エチル還元活性を測定した。緩衝液として１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．５〜８）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７〜９）、および１００ｍＭＴｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅバッファー（ｐＨ９〜１０）を用いた。ベンゾイルギ酸エチルに対する還元活性は各種緩衝液に基質ベンゾイルギ酸エチルを終濃度１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．５ｍＭになるように溶解し、さらに精製した本発明タンパク質（活性画分（C））を添加して、３０℃で１分間反応を行なった際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を１ｕｎｉｔと定義した。その結果、至適ｐＨは７．０であった。
（３）基質特異性
１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に基質となるカルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを０．５ｍＭとなるようにそれぞれ溶解した。これに精製した本発明タンパク質（活性画分（C））を適当量添加し、３０℃で５分間反応を行なった。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これをベンゾイルギ酸エチルに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表１に示した。
実施例６ (本発明形質転換体の還元反応例（その４）)
（１）２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルの合成
テトラヒドロフラン５０ｇとマグネシウム７．３ｇの混合液中に２−ブロモトルエンを４．４ｇ添加し、マグネシウムを活性化した。４０℃まで昇温し、２−ブロモトルエン４５ｇのテトラヒドロフラン（１３０ｇ）溶液を滴下し、２−ブロモトルエンの消失を確認するまで滴下した。その後、室温まで冷却しGrignard試薬を調製した。
シュウ酸ジエチル８３ｇのトルエン（１７０ｇ）溶液を−４０℃以下まで冷却した。上記で調製したGrignard試薬を−４０℃以下で滴下した後、さらに−４０℃で２時間保温した。反応混合物中に、１０％硫酸を２３４ｇ添加後、有機層を回収した。得られた有機層を水１３４ｇで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、さらに高真空下蒸留、シリカゲルカラム精製し、３３．１ｇの２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．４１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、２．６１（ｓ、３Ｈ）、４．３９−４．４７（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．７０（ｍ、４Ｈ）
（２）２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの合成
（１）で得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル１８．１ｇとトルエン７２ｇ、メタノール３６ｇを混合し、２５℃に保温しながら、４０％メチルアミン水溶液を２３．２ｇ添加し、２５℃で１時間保温した。その後、水を３６．２ｇ添加した後、有機層を回収した。５％塩酸１４３ｇ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３６ｇ、水３６ｇでそれぞれ洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、さらにシリカゲルカラム精製し、１１．４ｇの２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．４８（ｓ、３Ｈ）、２．９６（ｄ、Ｊ＝５．１３Ｈｚ、３Ｈ）、７．１（６ｓ、１Ｈ）、７．２５−７．９３（ｍ、４Ｈ）
（３）本発明形質転換体を用いた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの不斉還元
プラスミドｐＴｒｃＧＳＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、１５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．５ｇを得た。反応管に２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３０ｍｇ、前記の湿菌体約０．５ｇ、ＮＡＤＰ＋３０ｍｇ、グルコース４５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）５ｍｌを添加し、攪拌速度１０００ｒｐｍで３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応液に酢酸エチルを５ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を留去し、油状の２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを２２．５ｍｇ得た。得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ２．３７（Ｓ、３Ｈ）、２．７９（ｄ、Ｊ＝４．９６Ｈｚ、３Ｈ）、３．８７（１Ｈ）、５．１５（Ｓ、１Ｈ）、６．２１（Ｓ、１Ｈ）、７．１５−７．２６（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は１００％e.e.（溶出時間：２２．５分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１６．０分
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：１８．５分、２２．４分
（１）２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルの合成
テトラヒドロフラン５０ｇとマグネシウム７．３ｇの混合液中に２−ブロモトルエンを４．４ｇ添加し、マグネシウムを活性化した。４０℃まで昇温し、２−ブロモトルエン４５ｇのテトラヒドロフラン（１３０ｇ）溶液を滴下し、２−ブロモトルエンの消失を確認するまで滴下した。その後、室温まで冷却しGrignard試薬を調製した。
シュウ酸ジエチル８３ｇのトルエン（１７０ｇ）溶液を−４０℃以下まで冷却した。上記で調製したGrignard試薬を−４０℃以下で滴下した後、さらに−４０℃で２時間保温した。反応混合物中に、１０％硫酸を２３４ｇ添加後、有機層を回収した。得られた有機層を水１３４ｇで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、さらに高真空下蒸留、シリカゲルカラム精製し、３３．１ｇの２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．４１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、２．６１（ｓ、３Ｈ）、４．３９−４．４７（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．７０（ｍ、４Ｈ）
（２）２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの合成
（１）で得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル１８．１ｇとトルエン７２ｇ、メタノール３６ｇを混合し、２５℃に保温しながら、４０％メチルアミン水溶液を２３．２ｇ添加し、２５℃で１時間保温した。その後、水を３６．２ｇ添加した後、有機層を回収した。５％塩酸１４３ｇ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３６ｇ、水３６ｇでそれぞれ洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、さらにシリカゲルカラム精製し、１１．４ｇの２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．４８（ｓ、３Ｈ）、２．９６（ｄ、Ｊ＝５．１３Ｈｚ、３Ｈ）、７．１（６ｓ、１Ｈ）、７．２５−７．９３（ｍ、４Ｈ）
（３）本発明形質転換体を用いた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの不斉還元
プラスミドｐＴｒｃＧＳＲｓを用いてE．coli HB101を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、１５時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約０．５ｇを得た。反応管に２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド３０ｍｇ、前記の湿菌体約０．５ｇ、ＮＡＤＰ＋３０ｍｇ、グルコース４５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）５ｍｌを添加し、攪拌速度１０００ｒｐｍで３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応液に酢酸エチルを５ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を留去し、油状の２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを２２．５ｍｇ得た。得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ２．３７（Ｓ、３Ｈ）、２．７９（ｄ、Ｊ＝４．９６Ｈｚ、３Ｈ）、３．８７（１Ｈ）、５．１５（Ｓ、１Ｈ）、６．２１（Ｓ、１Ｈ）、７．１５−７．２６（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は１００％e.e.（溶出時間：２２．５分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１６．０分
２−（２−メチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：１８．５分、２２．４分
実施例７ (本発明形質転換体の還元反応例（その５）)
基質として２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを用いること以外は実施例６（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルを２６．５ｍｇ得た。得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ１．２１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、２．４３（Ｓ、３Ｈ）、３．５６（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３−４．２９（ｍ、２Ｈ）、５．３５（Ｓ、１Ｈ）、７．１５−７．３０（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は９９％e.e.（溶出時間：１３．３分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルは２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：８．９分
２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１１．６分、１３．３分
基質として２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを用いること以外は実施例６（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルを２６．５ｍｇ得た。得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ１．２１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）、２．４３（Ｓ、３Ｈ）、３．５６（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３−４．２９（ｍ、２Ｈ）、５．３５（Ｓ、１Ｈ）、７．１５−７．３０（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は９９％e.e.（溶出時間：１３．３分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルは２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：８．９分
２−（２−メチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１１．６分、１３．３分
実施例８ (本発明形質転換体の還元反応例（その６）)
（１）２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルの合成
２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液５９．８ｇを６０℃に昇温させ、o−ブロモベンジルブロマイド７０.４ｇとメタノール７０.４ｇの混合液を滴下し、６０℃で２時間保温した。室温にまで冷却後、トルエン２１１ｇと水２１１ｇを添加して攪拌し、分液後有機層を回収した。水層をトルエン２１１ｇにて３回抽出し、回収有機層と水２１１ｇを加えて、洗浄後、濃縮し、５５．３ｇの１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンを得た。
テトラヒドロフラン４６．４ｇとマグネシウム５．４ｇの混合液中に１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンを４.６ｇ添加し、マグネシウムを活性化した。４０℃まで昇温し、１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼン４１．７ｇのテトラヒドロフラン（１３９ｇ）溶液を滴下し、１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンの消失を確認するまで滴下した。その後、室温まで冷却しGrignard剤を調製した。
シュウ酸ジエチル６４．４ｇのトルエン（１７７ｇ）溶液を−４０℃以下まで冷却した。上記で調製したGrignard剤を−４０℃以下で滴下した後、さらに−４０℃で４時間保温した。反応混合物中に、１０％硫酸を２１１ｇ添加後、有機層を回収した。得られた有機層を水１３３ｇで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、シリカゲルカラム精製し、さらに高真空下蒸留にて、３８．５ｇの２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．４１（ｔ、Ｊ＝７．０８Ｈｚ、３Ｈ）、３．４４（ｓ、３Ｈ）、４．４１（ｑ、２Ｈ）、４．７５（ｓ、２Ｈ）、７．５５−７．６９（ｍ、４Ｈ）
（２）２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの合成
（１）で得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル２８．３ｇとトルエン１０９ｇ、メタノール５４．４ｇを混合し、２５℃に保温しながら、４０％メチルアミン水溶液を２８．６ｇ添加し、２５℃で２時間保温した。その後、水を５４．４ｇ添加した後、トルエンを８０ｇ追加し、静置後有機層を回収した。５％塩酸１７８ｇ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５４．４ｇ、水５４．４ｇでそれぞれ洗浄した後、エバポレータ-にて濃縮し、１２．０ｇの２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．９５（ｄ、Ｊ＝５．１４Ｈｚ、３Ｈ）、３．２８（ｓ、３Ｈ）、４．６６（ｓ、２Ｈ）、７．０４（ｓ、１Ｈ）、７．３６−７．７２（ｍ、４Ｈ）
（３）本発明形質転換体を用いた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの不斉還元
基質として２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを用いること以外は実施例６（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを１９．５ｍｇ得た。得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ２．７７（ｄ、Ｊ＝４．８５Ｈｚ、３Ｈ）、３．４７（Ｓ、３Ｈ）、４．３８（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．８１（Ｓ、１Ｈ）、５．２３（Ｓ、１Ｈ）、７．１６（Ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．４３（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は１００％e.e.（溶出時間：２０．３分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１８．５分
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：２０．４分、２１．０分
（１）２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルの合成
２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液５９．８ｇを６０℃に昇温させ、o−ブロモベンジルブロマイド７０.４ｇとメタノール７０.４ｇの混合液を滴下し、６０℃で２時間保温した。室温にまで冷却後、トルエン２１１ｇと水２１１ｇを添加して攪拌し、分液後有機層を回収した。水層をトルエン２１１ｇにて３回抽出し、回収有機層と水２１１ｇを加えて、洗浄後、濃縮し、５５．３ｇの１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンを得た。
テトラヒドロフラン４６．４ｇとマグネシウム５．４ｇの混合液中に１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンを４.６ｇ添加し、マグネシウムを活性化した。４０℃まで昇温し、１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼン４１．７ｇのテトラヒドロフラン（１３９ｇ）溶液を滴下し、１−メトキシメチル−２−ブロモベンゼンの消失を確認するまで滴下した。その後、室温まで冷却しGrignard剤を調製した。
シュウ酸ジエチル６４．４ｇのトルエン（１７７ｇ）溶液を−４０℃以下まで冷却した。上記で調製したGrignard剤を−４０℃以下で滴下した後、さらに−４０℃で４時間保温した。反応混合物中に、１０％硫酸を２１１ｇ添加後、有機層を回収した。得られた有機層を水１３３ｇで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレータ-にて濃縮後、シリカゲルカラム精製し、さらに高真空下蒸留にて、３８．５ｇの２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．４１（ｔ、Ｊ＝７．０８Ｈｚ、３Ｈ）、３．４４（ｓ、３Ｈ）、４．４１（ｑ、２Ｈ）、４．７５（ｓ、２Ｈ）、７．５５−７．６９（ｍ、４Ｈ）
（２）２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの合成
（１）で得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル２８．３ｇとトルエン１０９ｇ、メタノール５４．４ｇを混合し、２５℃に保温しながら、４０％メチルアミン水溶液を２８．６ｇ添加し、２５℃で２時間保温した。その後、水を５４．４ｇ添加した後、トルエンを８０ｇ追加し、静置後有機層を回収した。５％塩酸１７８ｇ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５４．４ｇ、水５４．４ｇでそれぞれ洗浄した後、エバポレータ-にて濃縮し、１２．０ｇの２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．９５（ｄ、Ｊ＝５．１４Ｈｚ、３Ｈ）、３．２８（ｓ、３Ｈ）、４．６６（ｓ、２Ｈ）、７．０４（ｓ、１Ｈ）、７．３６−７．７２（ｍ、４Ｈ）
（３）本発明形質転換体を用いた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドの不斉還元
基質として２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドを用いること以外は実施例６（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドを１９．５ｍｇ得た。得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ２．７７（ｄ、Ｊ＝４．８５Ｈｚ、３Ｈ）、３．４７（Ｓ、３Ｈ）、４．３８（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．８１（Ｓ、１Ｈ）、５．２３（Ｓ、１Ｈ）、７．１６（Ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．４３（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は１００％e.e.（溶出時間：２０．３分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミドは２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミドをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−オキソ−アセトアミド：１８．５分
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−Ｎ−メチル−２−ヒドロキシ−アセトアミド：２０．４分、２１．０分
実施例９ (本発明形質転換体の還元反応例（その７）)
基質として２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを用いること以外は実施例６（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルを２７．６ｍｇ得た。得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ１．２１（ｔ、Ｊ＝７．０９Ｈｚ、３Ｈ）、３．３９（Ｓ、３Ｈ）、４．１６−４．２６（ｍ、２Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝６．３６Ｈｚ、２Ｈ）、５．３９（Ｓ、１Ｈ）、７．３１−７．３７（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は１００％e.e.（溶出時間：１３．６分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルは２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：９．３分
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１２．８分、１３．６分
基質として２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルを用いること以外は実施例６（３）に記載の方法と同じ方法にて反応を実施した。その結果、油状の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルを２７．６ｍｇ得た。得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルの1Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） σ１．２１（ｔ、Ｊ＝７．０９Ｈｚ、３Ｈ）、３．３９（Ｓ、３Ｈ）、４．１６−４．２６（ｍ、２Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝６．３６Ｈｚ、２Ｈ）、５．３９（Ｓ、１Ｈ）、７．３１−７．３７（ｍ、４Ｈ）
得られた２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルに２−プロパノールを１０％含むヘキサンを添加し、下記条件で液体クロマトグラフィーによる光学純度分析に供試した結果、光学純度は１００％e.e.（溶出時間：１３．６分）であった。
なお、ラセミ体の２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチルは２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチルをメタノール中でＮａＢＨ４にて還元して合成した。
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２３０ｎｍ
溶出時間
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−オキソ酢酸エチル：９．３分
２−（２−メトキシメチル−フェニル）−２−ヒドロキシ−酢酸エチル：１２．８分、１３．６分
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配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
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配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
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配列番号１４
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配列番号１５
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配列番号１７
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配列番号１８
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配列番号５
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配列番号６
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配列番号１５
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配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
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本発明によれば、光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を容易に得ることができる。
Claims (20)
- 下記ａ）〜ｄ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｂ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡの塩基配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミド若しくはエステル化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｃ）ｉ)配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミドもしくはエステル化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミド若しくはエステル化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｄ）配列番号２で示される塩基配列。 - 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１記載のＤＮＡとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするＤＮＡ。
- 請求項１又は２記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター。
- 請求項２記載のＤＮＡ又は請求項３記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
- 請求項１記載のＤＮＡを保有することを特徴とする形質転換体。
- 請求項３記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 下記ａ）〜ｅ）のいずれかアミノ酸配列からなるタンパク質。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
ｂ）ｉ)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｃ）ｉ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｄ）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、かつ、ii)オルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物を不斉還元して対応する光学活性なオルト置換のマンデル酸化合物を生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。 - 請求項１記載のＤＮＡ及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター。
- 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項１０記載の組換えベクター。
- グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質がバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項1１記載の組換えベクター。
- 請求項１０〜１２記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１３記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１３記載の形質転換体。
- 請求項１記載のＤＮＡ及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを保有することを特徴とする形質転換体。
- 請求項９記載のタンパク質、または、請求項４〜７、１３〜１６のいずれかに記載の形質転換体、またはその処理物をプロキラルなカルボニル化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
- プロキラルなカルボニル化合物がオルト置換のフェニルグリオキサル酸化合物のアミドもしくはエステル化合物であり、対応する光学活性なアルコール化合物が光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物である請求項１７に記載の製造方法。
- オルト置換のフェニルグリオキサル酸のアミドもしくはエステル化合物が式（１）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアミノ基、または置換されていてもよいアルコキシ基を表し、Ｒ２は置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基を表す。）
で示される化合物であり、光学活性なオルト置換のマンデル酸のアミドもしくはエステル化合物が、式（２）：
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ意味を表し、＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子である。）
で示される光学活性化合物である、請求項１８に記載の製造方法。 - ステノトロフォモナス・エスピー（Stenotrophomonas sp.）SC-1(FERM BP-10785)
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