JP6460106B2 - 酸化酵素、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの利用 - Google Patents

酸化酵素、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの利用 Download PDF

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Description

本発明は、酸化酵素、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを利用したα−アミノ酸化合物等の製造法に関する。
α-アミノ酸化合物は、農林水産分野、食品分野、医療分野及び美容分野等において多彩な用途に用いられている。例えば、メチオニンは、動物用飼料添加物として利用されている。当該化合物を製造するには、アクロレインとメチルメルカプタンとを反応させて３−メチルチオプロピオンアルデヒドにし、これをさらに青酸、アンモニア及び二酸化炭素と反応させて５−（２−メチル−メルカプトエチル）−ヒダントイン（メチオニンヒダントイン）にする。最終的にこれをアルカリにより加水分解してアルカリ金属メチオニン酸塩にし、次いで酸、例えば硫酸又は炭酸を用いて中和することによってメチオニンを遊離させる（例えば、特許文献１等参照）。
特開昭５５−１０２５５７号公報
上記製造法は、青酸及びアクロレインをＣ１−又はＣ３−構成要素として使用するが、これらの原料化合物の取り扱いには充分な管理やそれに適合する設備等が必要である。そこで、例えば、メチオニン等のα-アミノ酸化合物の新たな製造法の開発が期待されている。
本発明は、
項１．下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
（A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチド(A)と記すこともある。）；
項２．前記アミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用頻度を大腸菌のコドン使用頻度に合わせるように選択されたコドンを含む改変された(altered)塩基配列を有する前項１記載のポリヌクレオチド；
項３．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１または２記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
項４．前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター（以下、本発明組換えベクター(A)と記すこともある。）；
項５．前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は前項４記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
項６．宿主細胞が微生物または大腸菌である前項５記載の形質転換体；
項７．前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換体；
項８．宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを組込む工程を含む組換えベクターの製造方法；
項９．前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前項４記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含む形質転換体の製造方法；
項１０．下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
（B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチド(B)と記すこともある。）；
項１１．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１０記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
項１２．前項１０または１１記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター（以下、本発明組換えベクター(B)と記すこともある。）；
項１３．前項１０または１１記載のポリヌクレオチド又は前項１２記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
項１４．宿主細胞が微生物または大腸菌である前項１３記載の形質転換体；
項１５．前項１０または１１記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換体；
項１６．宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１０または１１記載のポリヌクレオチドを組込む工程を含む組換えベクターの製造方法；
項１７．前項１０または１１記載のポリヌクレオチドまたは前項１２記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含む形質転換体の製造方法；
項１８．前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと前項１０または１１記載のポリヌクレオチドとを含有する組換えベクター（以下、本発明組換えベクター(AB)と記すこともある。）；
項１９．α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドをさらに含む前項１８記載の組換えベクター（以下、本発明組換えベクター(ABC)と記すこともある。）；
項２０．α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質がロイシン脱水素酵素である前項１９記載の組換えベクター；
項２１．α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列が、下記（C1）から（C3）のいずれかのアミノ酸配列：
（C1）配列番号７で示されるアミノ酸配列、
（C2）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（C3）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
である前項１９または２０記載の組換えベクター；
項２２．前項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
項２３．宿主細胞が微生物または大腸菌である前項２２記載の形質転換体；
項２４．ｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド、
ｉｉ）前項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）前項１０または１１記載のポリヌクレオチド；
を保有する形質転換体；
項２５．下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
（A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
を有するタンパク質（以下、本発明タンパク質(A)と記すこともある。）；
項２６．下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
（B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
を有するタンパク質（以下、本発明タンパク質(B)と記すこともある。）；
項２７．（１）下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
（A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
を有するタンパク質と、
下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
（B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
を有するタンパク質とのいずれか又は両者を、
α−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させて、対応するα−オキソカルボン酸化合物を得る工程、及び
（２）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質を、工程（１）で得られたα−オキソカルボン酸化合物に作用させて、対応するL−α−アミノ酸化合物を得る工程、
を含むL−α−アミノ酸化合物の製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
項２８．α−ヒドロキシカルボン酸化合物が含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物であり、対応するα−オキソカルボン酸化合物が含硫α−オキソカルボン酸化合物であり、対応するL−α−アミノ酸化合物が含硫L−α−アミノ酸化合物であり、工程（１）においてα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるタンパク質が、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力を少なくとも有するタンパク質である前項２７記載の製造方法；
項２９．含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物が式（１）：
Figure 0006460106
式中、Ｒ１は水素又は置換されていてもよい炭素数１−８のアルキル基を表す；
で示される化合物であり、含硫α−オキソカルボン酸化合物が、式（２）：
Figure 0006460106
式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す；
で示される化合物であり、含硫L−α−アミノ酸化合物が、式（３）：
Figure 0006460106
式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す；
で示される化合物である、前項２８記載の製造方法；
項３０．α−ヒドロキシカルボン酸化合物がα−ヒドロキシ−イソカプロン酸であり、対応するα−オキソカルボン酸化合物がα−オキソ−イソカプロン酸であり、対応するL−α−アミノ酸化合物がL−ロイシンであり、工程（１）においてα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるタンパク質が、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力を少なくとも有するタンパク質である前項２７記載の製造方法；
項３１．α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質がロイシン脱水素酵素である前項２７から３０のいずれか一項に記載の製造方法；
項３２．α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列が、下記（C1）から（C3）のいずれかのアミノ酸配列：
（C1）配列番号７で示されるアミノ酸配列、
（C2）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（C3）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
である前項２７から３１のいずれか一項に記載の製造方法；
項３３．工程（１）においてα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される前項２７から３２のいずれか一項に記載の製造方法；
項３４．前記形質転換体が、前項5、6、７、１３、１４、１５、２２、２３または２４のいずれか一項に記載の形質転換体である前項３３記載の製造方法；
項３５．α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される前項２７から３４のいずれか一項に記載の製造方法；
項３６．前記形質転換体が、前項２２、２３または２４のいずれか一項に記載の形質転換体である前項３５記載の製造方法；
項３７．工程（１）が、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型に変換する能力を有するタンパク質の存在下で行われる前項２７から３６のいずれか一項に記載の製造方法；
項３８．還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型に変換する能力を有するタンパク質がα−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力をさらに有するタンパク質である前項３７記載の製造方法；
項３９．還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型に変換する能力を有するタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される前項３７または３８記載の製造方法；
項４０．工程（２）が、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質の存在下で行われる前項２７から３９のいずれか一項に記載の製造方法；
項４１．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がα−ヒドロキシカルボン酸化合物を酸化して対応するα−オキソカルボン酸化合物に変換する能力をさらに有するタンパク質である前項４０に記載の製造方法；
項４２．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される前項４０または４１記載の製造方法；及び
項４３．工程（１）と工程（２）とが一つの反応系で行われる前項２７から４２のいずれか一項に記載の製造方法；
等を提供するものである。
本発明により、酸化酵素、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを利用した、メチオニン、ロイシン等のα-アミノ酸化合物の製造法等を提供することが可能となる。
本発明において、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、改変しようとするアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。部位特異的変異導入法としては、例えば、Ｏｌｆｅｒｔ Ｌａｎｄｔ ら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３ １ Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．ａｎｄ Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ ７７ ５１ １９８９）等の方法や、Ｍｕｔａｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（タカラバイオ社製）、ＴａＫａＲａ Ｌａ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等の市販キットを利用する方法を挙げることができる。
アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、改変しようとするアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してランダムに変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、当該ポリヌクレオチドの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、或いはポリメラーゼの反応を促進させるMg２＋の濃度を通常よりも増加させた反応条件でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。
「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列又は塩基配列間の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のアミノ酸配列又は塩基配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。
本発明において、目的とするポリヌクレオチドの供給源となる微生物は天然から分離してもよいし、菌株保存機関から購入することにより入手することもできる。
このような微生物を入手できる菌株保存機関として、例えば、下記の菌株保存機関を挙げることができる。
１．IFO（Institute of Fermentation Osaka：財団法人醗酵研究所）コレクション
現在は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（NBRC）に移管されている。微生物の入手に際してはNBRCに購入を申し込めばよく、購入申込には例えばNBRCのホームページにアクセスすればよい。
２．ATCC（American Type Culture Collection）
住商ファーマインターナショナル株式会社 ATCC事業グループを通じて入手可能であり、微生物の購入に際しては、例えば当該グループのホームページにアクセスすればよい。ATCCから微生物を直接購入してもよい。
３．JCM（理化学研究所微生物系統保存施設 (Japan Collection of Microorganisms, JCM)
現在は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター (RIKEN BRC) 微生物材料開発室に移管されている。微生物の入手に際しては当該機関に購入を申し込めばよく、例えば当該機関のホームページのカルチャーコレクションに関するサイトにアクセスすればよい。
４．IAMカルチャーコレクション
現在は、IAMカルチャーコレクション保存菌株のうち、細菌、酵母、糸状菌については独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（JCM）に、微細藻類については独立行政法人 国立環境研究所微生物系統保存施設（NIES）に移管されている。微生物の入手に際してはこれらの機関に購入を申し込めばよく、例えばこれらの機関のホームページのカルチャーコレクションに関するサイトにアクセスすればよい。
目的とするポリヌクレオチドをクローニングするために、染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
上記いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、上記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（ＧＥヘルスケア社商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
このように調製されたメンブレンを用いて、プローブのハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer DNA Labeling Kit（タカラバイオ社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System（ＧＥヘルスケア社製）等を用いることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０から９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５から９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１から１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０から２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０から０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０から２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２から６５℃で１から４時間保温する。
次いで、例えば、４５０から９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５から９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１から１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０から２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０から０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4から２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０から２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２から６５℃で１２から２０時間保温する。
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５から３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５から３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１から１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２から６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から、目的とするポリヌクレオチドを調製することができる。
目的とするポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと前記ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを調製し、これを宿主細胞に導入する。
ここで、「機能可能な形で接続されてなる」とは、目的とするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、当該ポリヌクレオチドが、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。
微生物で機能可能なプロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーターもしくはT7ファージのプロモーター、または、tacプロモーター、trcプロモーターもしくはT7lacプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。
目的とするポリヌクレオチド、又は、宿主細胞において機能可能なプロモーターと前記ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドをベクターに組み込むことにより、組換えベクターを作製することができる。用いられるベクターとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをコードするベクターを挙げることができる。宿主細胞が大腸菌である場合に利用可能なベクターとしては、pUC119（タカラバイオ社製）、pTV118N（タカラバイオ社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（ＧＥヘルスケア社製）、pKK223-3（ＧＥヘルスケア社製）、pET−22ｂ（ノバジェン社製）、pET−15ｂ（ノバジェン社製）等が挙げられる。ベクターとして、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
本発明において使用される形質転換体は、目的とするポリヌクレオチド、宿主細胞において機能可能なプロモーターと前記ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド、または、これらポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを宿主細胞に導入することにより、製造することができる。
宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Rhodococcus属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
ポリヌクレオチド又は組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法を適用することができ、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
目的とするポリヌクレオチド又は組換えベクター等が導入された形質転換体は、例えば、上述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜することができる。
得られた形質転換体が目的とするポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
本発明において使用される形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１から３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のナトリウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１から３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１から５％（ｗ／ｖ）程度である。
tacプロモーター、trcプロモーター、T7lacプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換体の場合には、目的とするタンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。lacUV5プロモーターの支配下にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれたバクテリオファージDE3の溶原菌（λDE3 lysogen）に、T7ファージプロモーターと目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドが導入されてなる形質転換体を培養する場合にも、目的とするタンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、ＩＰＴＧを培地に少量加えてもよい。
形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５℃から約４０℃である。培地のｐHは約６から約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日間から約５日間が好ましい。
目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有し当該目的とするタンパク質を産生する形質転換体、例えば、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体、の培養物から目的とするタンパク質を精製する方法としては、タンパク質の精製において使用される通常の方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、目的とするタンパク質を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用される担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもGEヘルスケア社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
目的とするタンパク質が、そのアミノ末端又はカルボキシ末端領域に、連続する数残基のヒスチジンが付加されたタンパク質である場合は、金属キレートアフィニティカラムを用いて、当該タンパク質を精製することができる。目的とするタンパク質がグルタチオンSトランスフェラーゼと融合されたタンパク質として産生される場合は、グルタチオンSトランスフェラーゼモノクローナル抗体カラムを用いてこれを精製することができる。
本発明において使用される「形質転換体の処理物」としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。形質転換体抽出物としては、無細胞抽出液、形質転換体から調製された粗精製タンパク質又は精製タンパク質、及び、これらの固定化物が挙げられる。固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、又は、イオン交換樹脂等に目的とするタンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、又は、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に目的とするタンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生きた形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方が、製造設備の制限が少ないという点では好ましい。形質転換体の死滅化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ目的とするタンパク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留や汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
本発明ポリヌクレオチド(A)は、下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
（A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
をコードする。
本発明タンパク質(A)は、上記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列を有する。
本発明ポリヌクレオチド(A)がコードするアミノ酸配列または本発明タンパク質(A)のアミノ酸配列において、配列番号３で示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換または付加等（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）である。前記「付加」には、配列の端へのアミノ酸の付加のみならず、配列中へのアミノ酸の挿入も含まれる。かかるアミノ酸の改変としては、例えば、(a)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失、(b)前記タンパク質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異によって生じるアミノ酸の欠失、置換または付加、または、(c)人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換または付加を挙げることができる。
改変されるアミノ酸の数は、改変が生じた上記アミノ酸配列を有するタンパク質が、改変前のタンパク質と同様の能力、即ち２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力とα−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を発揮することのできる範囲内の数であれば良い。
本発明ポリヌクレオチド(A)がコードするアミノ酸配列の（A3）または本発明タンパク質(A)のアミノ酸配列の（A3）における「複数のアミノ酸」としては、例えば、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは４８個のアミノ酸が挙げられる。
アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への保存的置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
アミノ酸の付加としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端への、連続する6残基程度のヒスチジンを含む７残基程度から２５残基程度のアミノ酸の付加を挙げることができる。より具体的には、タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端への、配列番号４４で示されるアミノ酸配列の付加や、タンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端への、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の付加を挙げることができる。
本発明ポリヌクレオチド(A)がコードするアミノ酸配列の（A2）または本発明タンパク質(A)のアミノ酸配列の（A2）における「８５％以上の配列同一性」としては、例えば８５、９０、９５、９８または９９％以上の配列同一性が挙げられる。
本発明ポリヌクレオチド(A)がコードするアミノ酸配列または本発明タンパク質(A)のアミノ酸配列において、「配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることにより、配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドと塩基対合によるハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなポリヌクレオチドをいう。
上記のポリヌクレオチドとしては、具体的には、配列番号４または１３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号４または１３で示される塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、配列番号４または１３で示される塩基配列と９０％、９５％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドがあげられる。
本発明ポリヌクレオチド(A)がコードするアミノ酸配列の（A5）または本発明タンパク質(A)のアミノ酸配列の（A5）の具体例を以下に挙げる：
(A5-1)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列V１０９Iと記すこともある。）；
(A5-2)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列Ｇ１９１Ｄと記すこともある。）；
(A5-3)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列Ｑ２４６Ｒと記すこともある。）；
(A5-4)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換及び１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列V１０９I／Ｇ１９１Ｄと記すこともある。）；
(A5-5)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列V１０９I／Ｑ２４６Ｒと記すこともある。）；
(A5-6)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒと記すこともある。）；及び
(A5-7)ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列V１０９I／Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒと記すこともある。）。
改変アミノ酸配列V１０９I／Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒの具体例としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号６で示される塩基配列を挙げることができる。
本発明ポリヌクレオチド(A)は、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたポリヌクレオチドであっても、このクローニングされたポリヌクレオチドの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるポリヌクレオチドであっても、化学合成されたポリヌクレオチドであってもよい。
本発明ポリヌクレオチド(A)は、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸を対応するα−オキソカルボン酸に酸化する能力を有する微生物、具体的には、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）ATCC55564株などのアクロモバクター属に属する微生物から得ることができる。
例えば、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）等のアクロモバクター属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅して本発明ポリヌクレオチド(A)を調製することができる。
上記のＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側又は３’末端側又はその両方には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。
例えば、上記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。
上記のＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を94℃で2分間保温した後、９４℃で１０秒間次いで６５℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒間の保温サイクルを１０回行い、次いで、９４℃で１０秒間次いで６５℃で３０秒間次いで７２℃で１分と５秒間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で７分間保持する条件が挙げられる。
上記ＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の５’末端の約１４塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドや、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅して本発明ポリヌクレオチド(A)を調製することができる。
本発明ポリヌクレオチド(A)は、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、上述の条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
本発明ポリヌクレオチド(A)は、その塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、目的とする塩基配列を有する核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
上記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列をコードするコドンとして、大腸菌におけるコドン使用頻度に合わせるようにコドンを選択することによって塩基配列を設計し、設計された塩基配列からなるポリヌクレオチドを化学合成することにより、本発明ポリヌクレオチド(A)を調製することもできる。
具体的には例えば、発現させる微生物細胞（例えば、大腸菌）におけるコドン使用頻度に近いコドン使用頻度となるように、配列番号３で示されるアミノ酸配列に含まれる各々のアミノ酸に対応するコドンを選択し、目的とするアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。大腸菌等におけるコドン使用頻度の情報は、例えば、当業者に公知のＤＮＡデータベース（GenBank、EMBL、DDBJ等）を利用して得ることができる。
以下、具体的な手順を示す。
目的とするアミノ酸配列に含まれる各アミノ酸の個数を求める。ポリヌクレオチドを発現させる微生物細胞のコドンの平均出現頻度に最も近くなるように、上記で求めた個数のアミノ酸について使用するコドンを割り当てる。同一コドンがなるべく連続しないように、それぞれのコドンの使用順番をつける。Ｎ末端側のアミノ酸から順番に、各アミノ酸について決定した順番通りにコドンを選び、そのアミノ酸残基のコドンと仮決定する。これらの手順を繰り返しＣ末端までの全アミノ酸のコドンを仮決定し、最後に終止コドンを配置する。仮決定されたコドンからなる塩基配列について、微生物細胞において遺伝子の転写を阻害する塩基配列や、以降の操作で使用する制限酵素が認識する塩基配列が存在しないことを確認する。このような塩基配列が存在した場合には、この塩基配列にかかるコドンを別の部分で使用したコドンと交換する。このような塩基配列設計の際に、後の操作のために適当な制限酵素が認識する塩基配列を５’末端側および３’末端側に付加しておくことが好ましい。
このようにして設計された塩基配列を有するポリヌクレオチドの合成は、PCRを用いた長鎖DNA合成法を用いて行うことができる（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、95−100頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、1997年7月1日刊行）（以下、本法をＡｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ法と記すこともある）。当該方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してDNAを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の３’末端に約10bpから約12bpの相補鎖又はオーバーラップを持つように合成され、互いのプライマーを鋳型としてＤＮＡ合成を行う。プライマーの全長としては、例えば、約60merから約100mer等を挙げることができる。好ましくは、例えば、約80merから約100mer等が挙げられる。
これらオリゴヌクレオチドプライマーを順番にＰＣＲ反応により結合することにより、目的の塩基配列を有するＤＮＡを得る。得られたＤＮＡを常法に従いクローニングベクターに導入し、クローニングする。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで確認し、目的の塩基配列を有するポリヌクレオチドが得られたことを確認する。このようにして、例えば、配列番号１３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを人工合成して、本発明ポリヌクレオチド(A)を得ることができる。
本発明ポリヌクレオチド(B)は、下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
（B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
をコードする。
本発明タンパク質(B)は、上記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列を有する。
本発明ポリヌクレオチド(B)がコードするアミノ酸配列または本発明タンパク質(B)のアミノ酸配列において、配列番号１で示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換または付加等（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）である。前記「付加」には、配列の端へのアミノ酸の付加のみならず、配列中へのアミノ酸の挿入も含まれる。かかるアミノ酸の改変としては、例えば、(a)配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失、(b)前記タンパク質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異によって生じるアミノ酸の欠失、置換または付加、または、(c)人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換または付加を挙げることができる。
改変されるアミノ酸の数は、改変が生じた上記アミノ酸配列を有するタンパク質が、改変前のタンパク質と同様の能力、即ち２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力とα−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を発揮することのできる範囲内の数であれば良い。
本発明ポリヌクレオチド(B)がコードするアミノ酸配列の（B3）または本発明タンパク質(B)のアミノ酸配列の（B3）における「複数のアミノ酸」としては、例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１５、もしくは１７個のアミノ酸が挙げられる。
アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への保存的置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
アミノ酸の付加としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端への、連続する6残基程度のヒスチジンを含む７残基程度から２５残基程度のアミノ酸の付加を挙げることができる。より具体的には、タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端への、配列番号４４で示されるアミノ酸配列の付加や、タンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端への、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の付加を挙げることができる。
本発明ポリヌクレオチド(B)がコードするアミノ酸配列の（B2）または本発明タンパク質(B)のアミノ酸配列の（B2）における「９５％以上の配列同一性」としては、例えば、９５、９８または９９％以上の配列同一性が挙げられる。
本発明ポリヌクレオチド(B)がコードするアミノ酸配列または本発明タンパク質(B)のアミノ酸配列において、「配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることにより、配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドと塩基対合によるハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなポリヌクレオチドをいう。
上記のポリヌクレオチドとしては、具体的には、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２で示される塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、配列番号２で示される塩基配列と９５％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドがあげられる。
本発明ポリヌクレオチド(B)は、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたポリヌクレオチドであっても、このクローニングされたポリヌクレオチドの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるポリヌクレオチドであっても、化学合成されたポリヌクレオチドであってもよい。
本発明ポリヌクレオチド(B)は、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸を対応するα−オキソカルボン酸に酸化する能力を有する微生物、具体的には、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）ATCC55564株などのアクロモバクター属に属する微生物から得ることができる。
例えば、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）等のアクロモバクター属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅して本発明ポリヌクレオチド(B)を調製することができる。
上記のＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側又は３’末端側又はその両方には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。
例えば、上記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。
上記のＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を94℃で2分間保温した後、９４℃で１０秒間次いで６５℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒間の保温サイクルを１０回行い、次いで、９４℃で１０秒間次いで６５℃で３０秒間次いで７２℃で１分と５秒間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で７分間保持する条件が挙げられる。
上記ＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の５’末端の約１４塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅して本発明ポリヌクレオチド(B)を調製することができる。
本発明ポリヌクレオチド(B)は、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、上述の条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
本発明ポリヌクレオチド(B)は、その塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、目的とする塩基配列を有する核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
上記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列をコードするコドンとして、大腸菌におけるコドン使用頻度に合わせるようにコドンを選択することによって塩基配列を設計し、設計された塩基配列からなるポリヌクレオチドを化学合成することにより、本発明ポリヌクレオチド(B)を調製することもできる。
具体的には例えば、発現させる微生物細胞（例えば、大腸菌）におけるコドン使用頻度に近いコドン使用頻度となるように、配列番号１で示されるアミノ酸配列に含まれる各々のアミノ酸に対応するコドンを選択し、目的とするアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。
上述のようにして調製されたポリヌクレオチドは「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
上述のようにして調製されたポリヌクレオチドの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
上述のようにして調製されたポリヌクレオチドが、α−ヒドロキシカルボン酸（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）を酸化して対応するα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸又はα−オキソ−イソカプロン酸）に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
上述のようにして得られるポリヌクレオチドを、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。得られた形質転換体の培養物をα−ヒドロキシカルボン酸（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）に作用させる。反応生成物中の対応するα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸又はα−オキソ−イソカプロン酸）の量を分析することにより、得られたポリヌクレオチドが目的とする能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
本発明ポリヌクレオチド(A)又は本発明ポリヌクレオチド(B)を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと、本発明ポリヌクレオチド(A)又は本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを調製し、これを宿主細胞に導入する。
微生物で機能可能なプロモーターとしては、上述のような、大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。アクロモバクター・デニトリフィカンスにおいて本発明ポリヌクレオチド(A)又は本発明ポリヌクレオチド(B)の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
本発明ポリヌクレオチド(A)、又は、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドをベクターに組み込むことにより、本発明組換えベクター(A)を作製することができる。
本発明ポリヌクレオチド(B)、又は、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドをベクターに組み込むことにより、本発明組換えベクター(B)を作製することができる。
ｉ）本発明ポリヌクレオチド(A)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；と、
ｉｉ）本発明ポリヌクレオチド(B)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；とをベクターに組み込むことにより、本発明組換えベクター(AB)を作製することができる。
本発明組換えベクター(AB)は、α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質（以下、本タンパク質(C)と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドをさらに含有することもできる。
例えば、
ａ）本発明ポリヌクレオチド(A)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；と、
ｂ）本発明ポリヌクレオチド(B)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
と、
ｃ）本タンパク質(C)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
とをベクターに組み込むことにより、本発明組換えベクター(ABC)を作製することができる。
α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質としては、アミノ酸脱水素酵素やアミノトランスフェラーゼが挙げられる。アミノ酸脱水素酵素としては、具体的には、アラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素及びフェニルアラニン脱水素酵素を挙げることができ、ロイシン脱水素酵素を好ましく挙げることができる。
α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する上記タンパク質として、より具体的には、Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素、及び、前記ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列において、１１３番目のアラニンがグリシンに変換されたアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列である。
配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号４２で示されるアミノ酸配列において、１１３番目のアラニンがグリシンに変換されたアミノ酸配列である。
α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列としては、具体的には、下記（C1）から（C3）のいずれかのアミノ酸配列：
（C1）配列番号７で示されるアミノ酸配列、
（C2）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
（C3）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
を挙げることもできる。
本タンパク質(C)の上記アミノ酸配列において、配列番号７で示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換または付加等である。前記「付加」には、配列の端へのアミノ酸の付加のみならず、配列中へのアミノ酸の挿入も含まれる。かかるアミノ酸の改変としては、例えば、(a)配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失、(b)前記タンパク質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異によって生じるアミノ酸の欠失、置換または付加、または、(c)人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換または付加を挙げることができる。
改変されるアミノ酸の数は、改変が生じた上記アミノ酸配列を有するタンパク質が、α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を発揮することのできる範囲内の数であれば良い。本タンパク質(C)の上記アミノ酸配列の（C3）における「複数のアミノ酸」としては、例えば、２、３、４、５、６、７、１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、３６もしくは４０個のアミノ酸が挙げられる。
アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への保存的置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
アミノ酸の付加としては、例えば、アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端への、連続する6残基程度のヒスチジンを含む約２０残基のアミノ酸の付加を挙げることができる。より具体的には、タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端への、配列番号４４で示されるアミノ酸配列の付加や、タンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端への、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の付加を挙げることができる。
本タンパク質(C)の上記アミノ酸配列の（C2）における「９０％以上の配列同一性」としては、例えば９０、９５、９８または９９％以上の配列同一性が挙げられる。
α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチド(C)と記すこともある。）は、例えば、α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する微生物、例えば、Bacillus sphaericus IFO3525株などのバシラス属に属する微生物から得ることができる。
Bacillus sphaericus IFO3525株などのバシラス属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は、配列番号４２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド等を増幅して本ポリヌクレオチド(C)を調製することができる。
例えば、配列番号４２で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号４３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの増幅用プライマーとして、配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する。配列番号４２で示されるアミノ酸配列の１１３番目のアラニンをグリシンに変換するための変異導入用プライマ−として、配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する。
上記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを増幅する。増幅されたポリヌクレオチドをベクターに組み込んで、配列番号４３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを得る。得られた組換えベクターを鋳型として、配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行い、得られたPCR産物をDpn Iで処理した後、大腸菌に導入する。得られた形質転換体が保有する組換えベクターの塩基配列を分析し、目的のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列、すなわち、配列番号４２で示されるアミノ酸配列において１１３番目のアラニンがグリシンへ置換されたアミノ酸配列（配列番号７で示されるアミノ酸配列）、をコードするポリヌクレオチドを得る。配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号８で示される塩基配列が挙げられる。
本ポリヌクレオチド(C)は、その塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、目的とする塩基配列を有する核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
上記（C1）から（C3）のいずれかのアミノ酸配列をコードするコドンとして、大腸菌におけるコドン使用頻度に合わせるようにコドンを選択することによって塩基配列を設計し、設計された塩基配列からなるポリヌクレオチドを化学合成することにより、本ポリヌクレオチド(C)を調製することもできる。
本ポリヌクレオチド(C)を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ポリヌクレオチド(C)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを調製し、これを宿主細胞に導入する。
微生物で機能可能なプロモーターとしては、上述のような、大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。Bacillus sphaericusなどのバシラス属に属する微生物において本ポリヌクレオチド(C)の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
上述のようにして調製されたポリヌクレオチドが、α−オキソカルボン酸化合物（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸又はα−オキソ−イソカプロン酸）をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物（例えば、L−メチオニン又はＬ−ロイシン）に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
上述のようにして得られるポリヌクレオチドを、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。得られた形質転換体の培養物をα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸又はα−オキソ−イソカプロン酸）に作用させる。反応生成物中の対応するL−α−アミノ酸（例えば、L−メチオニン又はＬ−ロイシン）の量を分析することにより、得られたポリヌクレオチドが目的とする能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
本発明ポリヌクレオチド(A)、本発明ポリヌクレオチド(B)もしくは本ポリヌクレオチド(C)、または、これらポリヌクレオチドの１以上を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入することにより、形質転換体を製造することができる。
宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Rhodococcus属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
上述のようにして、本発明ポリヌクレオチド(A)、又は、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより、本発明ポリヌクレオチド(A)、又は、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを保有する形質転換体を得ることができる。かかる形質転換体としては、外来の上記ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体、すなわち、外来の上記ポリヌクレオチドを染色体上に保有する形質転換体を挙げることもできる。
本発明ポリヌクレオチド(B)、又は、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより、本発明ポリヌクレオチド(B)、又は、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを保有する形質転換体を得ることができる。かかる形質転換体としては、外来の上記ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体、すなわち、外来の上記ポリヌクレオチドを染色体上に保有する形質転換体を挙げることもできる。
上述のようにして、
ａ）本発明ポリヌクレオチド(A)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；と、
ｂ）本発明ポリヌクレオチド(B)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
と、
ｃ）本タンパク質(C)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
とを宿主細胞に導入することにより、
ａ）本発明ポリヌクレオチド(A)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(A)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；と、
ｂ）本発明ポリヌクレオチド(B)、もしくは、宿主細胞において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチド(B)とが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
と、
ｃ）本タンパク質(C)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド；
とを保有する形質転換体を得ることができる。
上記ａ）のポリヌクレオチド、ｂ）のポリヌクレオチド及びｃ）のポリヌクレオチドは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよいし、これらのうち１以上が同じベクター上に組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよい。１以上のポリヌクレオチドを単一のベクターに組み込む場合は、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を目的とするポリヌクレオチドのそれぞれに連結してベクターに組み込んでもよいし、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして目的とするポリヌクレオチドを発現させるようにベクターに組み込んでもよい。上記ａ）のポリヌクレオチド、ｂ）のポリヌクレオチド及びｃ）のポリヌクレオチドのいずれか、又は、これらのうち１以上が、宿主細胞の染色体上に保有されてもよい。
本発明タンパク質(A)は、例えば、本発明ポリヌクレオチド(A)を保有する形質転換体を培養し本発明タンパク質(A)を発現させることにより、製造することができる。
本発明タンパク質(B)は、例えば、本発明ポリヌクレオチド(B)を保有する形質転換体を培養し本発明タンパク質(B)を発現させることにより、製造することができる。
本タンパク質(C)は、例えば、本ポリヌクレオチド(C)を保有する形質転換体を培養し本タンパク質(C)を発現させることにより、製造することができる。
本発明ポリヌクレオチド(A)、本発明ポリヌクレオチド(B)又は本ポリヌクレオチド(C)を保有する形質転換体の培養物から本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)又は本タンパク質(C)を精製する方法としては、タンパク質の精製において使用される通常の方法を適用することができる。
本発明タンパク質(A)を含む画分及び本発明タンパク質(B)を含む画分は、例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸を酸化して２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸を優先的に生産する能力又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸を酸化してα−オキソ−イソカプロン酸を優先的に生産する能力を指標にして選抜することができる。
本タンパク質(C)を含む画分は、例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸をアミノ化してL−メチオニンを優先的に生産する能力又はα−オキソ−イソカプロン酸をアミノ化してL−ロイシンを優先的に生産する能力を指標にして選抜することができる。
本発明製造方法は、
（１）本発明タンパク質(A)と本発明タンパク質(B)とのいずれか又は両者を、α−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させて、対応するα−オキソカルボン酸化合物を得る工程、及び
（２）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質を、工程（１）で得られたα−オキソカルボン酸化合物に作用させて、対応するL−α−アミノ酸化合物を得る工程、
を含む、L−α−アミノ酸化合物の製造方法である。
上記α−ヒドロキシカルボン酸化合物としては、式（４）：
R２−CH（OH）COOH （４）
式中、Ｒ２は水素であるか、炭素数１−１０の線状、分岐鎖状もしくは環式のアルキル基であるか、置換基のアミド、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミド、ジアルキルアミド、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシルもしくはアルコキシカルボニルを有する炭素数１−１０の線状もしくは分岐鎖状のアルキル基であるか、または、１H−イミダゾリル基、フェニル基、３’−インドリル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基もしくはｐ−アルコキシフェニル基であり、前記置換基に含まれるアルキル及びアルコキシの炭素数はそれぞれ１−３である；
で示されるα−ヒドロキシカルボン酸が挙げられる。
上記L−α−アミノ酸化合物としては、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−システイン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、L−ヒスチジン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−アラニン、グリシン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン及びL−バリンが挙げられ、好ましくは、L−アラニン、グリシン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニンまたはL−バリンが挙げられる。
上記α−ヒドロキシカルボン酸化合物として、好ましくは、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸をあげることができ、対応するα−オキソカルボン酸化合物としては、α−オキソ−イソカプロン酸を挙げることができ、対応するL−α−アミノ酸化合物としては、L−ロイシンを挙げることができる。
上記α−ヒドロキシカルボン酸化合物として、好ましくは、含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物を挙げることもでき、対応するα−オキソカルボン酸化合物としては、含硫α−オキソカルボン酸化合物を挙げることができ、対応するL−α−アミノ酸化合物としては、含硫L−α−アミノ酸化合物を挙げることができる。
上記含硫α−ヒドロキシカルボン酸としては、式（１）：
Figure 0006460106
式中、Ｒ１は水素又は置換されていてもよい炭素数１−８のアルキル基を表す；
で示される含硫α−ヒドロキシカルボン酸が例示される。
上記式（１）で示される含硫α−ヒドロキシカルボン酸に、本発明タンパク質(A)と本発明タンパク質(B)とのいずれか又は両者を作用させて得られる含硫α−オキソカルボン酸化合物としては、式（２）：
Figure 0006460106
式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す；
で示される含硫α−オキソカルボン酸が例示される。
上記式（２）で示される含硫α−オキソカルボン酸に、本タンパク質(C)を作用させて得られる含硫L−α−アミノ酸化合物としては、式（３）：
Figure 0006460106
で示される含硫L−α−アミノ酸が例示される。
式（１）の含硫α−ヒドロキシカルボン酸、式（２）の含硫α−オキソカルボン酸、および、式（３）の含硫L−α−アミノ酸において、Ｒ１で表される置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基におけるＣ１−８のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基およびオクチル基が例示される。
式（１）で示される含硫α−ヒドロキシカルボン酸としては、具体的には例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（エチルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（プロピルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（ブチルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（ペンチルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（ヘキシルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（ヘプチルチオ）酪酸、２−ヒドロキシ−４−（オクチルチオ）酪酸を挙げることができる。
式（２）で示される含硫α−オキソカルボン酸としては、具体的には例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（エチルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（プロピルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（ブチルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（ペンチルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（ヘキシルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（ヘプチルチオ）酪酸、２−オキソ−４−（オクチルチオ）酪酸を挙げることができる。
式（３）で示される含硫L−α−アミノ酸としては、具体的には例えば、２−アミノ−４−（メチルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（プロピルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（ブチルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（ペンチルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（ヘキシルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（ヘプチルチオ）酪酸、２−アミノ−４−（オクチルチオ）酪酸を挙げることができる。
Ｒ１で表される置換されていてもよいＣ１−８のアルキル基としては、メチル基が好ましく、式（１）で示される含硫α−ヒドロキシカルボン酸としては、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸が好ましく例示される。
本発明製造方法の工程（１）において、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸を基質とした場合は、工程（１）においてα−オキソ−イソカプロン酸が得られ、工程（２）においてＬ−ロイシンが得られる。
本発明製造方法の工程（１）において、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸を基質とした場合は、工程（１）において２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸が得られ、工程（２）においてＬ−メチオニンが得られる。
本発明製造方法の工程（１）において、本発明タンパク質(A)及び本発明タンパク質(B)はそれぞれ、種々の形態で、α−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるための反応系に提供され得る。本発明タンパク質(A)及び本発明タンパク質(B)はそれぞれ、精製されたタンパク質の形態で本発明製造方法の工程（１）の反応系に提供されてもよいし、当該タンパク質を産生する微生物又は該微生物の処理物に含まれる形態で前記反応系に提供されてもよい。「微生物の処理物」とは、上述の「形質転換体の処理物」と同様に調製されたものを意味する。本発明タンパク質(A)及び本発明タンパク質(B)はそれぞれ、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で上記反応系に提供されてもよい。
本発明タンパク質(A)をα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるために、具体的には、例えば、本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(A)の固定化物、本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなり本発明タンパク質(A)を産生する形質転換体の培養物、又は、前記形質転換体の処理物を、本発明製造方法の工程（１）の反応系に提供することができる。
本発明タンパク質(B)をα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるために、具体的には、例えば、本発明タンパク質(B)、本発明タンパク質(B)の固定化物、本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなり本発明タンパク質(B)を産生する形質転換体の培養物、又は、前記形質転換体の処理物を、本発明製造方法の工程（１）の反応系に提供することができる。
本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物と、本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物とが、本発明製造方法の工程（１）の反応系に提供されてもよい。本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドと本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドとの両者が同一の宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が、上記反応系に提供されてもよい。本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドと本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよいし、同じベクター上に組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよい。両ポリヌクレオチドを単一のベクターに組み込む場合は、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を両ポリヌクレオチドのそれぞれに連結してベクターに組み込んでもよいし、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして両ポリヌクレオチドを発現させるようにベクターに組み込んでもよい。本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドと本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドのいずれか、又は、両方が、宿主細胞の染色体上に保有されてもよい。
本発明製造方法の工程（１）は、通常、水及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記すこともある。）等の補酵素の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタンや、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩、又は、これらの混合物が挙げられる。
本発明製造方法の工程（１）においては、水に加えて有機溶媒を反応系に共存させることもできる。用いられる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、及びこれらの混合物が挙げられる。
本発明製造方法の工程（１）においては、共役系として補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）が利用されるため、通常、反応系に補酵素（ｃｏｅｎｚｙｍｅ）を添加するとよい。添加される補酵素としては、例えば、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）や、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と記すこともある。）を挙げることができる。反応系内における補因子の量は、通常、基質であるα−ヒドロキシカルボン酸化合物の量と等モルかまたはそれ以上であり、反応開始時に添加しておくのが好ましい。
本発明製造方法の工程（１）において、α−ヒドロキシカルボン酸化合物（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−ヒドロキシカルボン酸又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）の酸化反応の進行に伴い、反応液中のＮＡＤ+は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記すこともある。）に変換される。変換により生じたＮＡＤＨは、ＮＡＤＨを酸化型（ＮＡＤ+）に変換する能力を有するタンパク質を作用させることにより元のＮＡＤ+に戻すことができるので、上記工程（１）の反応系内には、ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をさらに存在させてもよい。上記工程（１）の反応系内に、ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をさらに存在させる場合には、反応系内における補因子の量は、通常、触媒量でよく、基質であるα−ヒドロキシカルボン酸化合物の量と等モルかまたはそれ以下である。
ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、リンゴ酸脱水素酵素等の有機酸脱水素酵素、還元酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、又は、NADH酸化酵素が挙げられる。アミノ酸脱水素酵素としては、本タンパク質(C)を挙げることができ、より具体的には、Bacillus属に属する微生物のロイシン脱水素酵素を挙げることができる。
ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質がNADH酸化酵素である場合には、反応系内にFAD等を共存させることにより、該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にFAD等を加えてもよい。ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質がNADH酸化酵素である場合には、反応液中の酸素が消費され、過酸化水素に変換される。変換により生じた過酸化水素は、過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質により元の分子状酸素に戻すことができるので、上記工程の反応系内に、過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をさらに共存させてもよい。過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、カタラーゼが挙げられる。
ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質や過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質はそれぞれ、精製されたタンパク質もしくはその固定化物の形態で本発明製造方法の工程（１）の反応系に提供されてもよいし、当該タンパク質を産生する微生物又は該微生物の処理物に含まれる形態で前記反応系に提供されてもよい。「微生物の処理物」とは、上述の「形質転換体の処理物」と同様に調製されたものを意味する。例えば、ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が上記反応系に提供されてもよい。過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が上記反応系にさらに提供されてもよい。
ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物と、過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物とが、上記反応系に提供されてもよい。
ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの両者が同一の宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が、上記反応系に提供されてもよい。ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよいし、同じベクター上に組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよい。両ポリヌクレオチドを単一のベクターに組み込む場合は、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を両ポリヌクレオチドのそれぞれに連結してベクターに組み込んでもよいし、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして両ポリヌクレオチドを発現させるようにベクターに組み込んでもよい。ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれか、又は、両方が、宿主細胞の染色体上に保有されてもよい。
本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチド、本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチド、ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、過酸化水素を分子状酸素に変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選ばれる２以上のポリヌクレオチドが同一の宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が、上記反応系に提供されてもよい。
本発明製造方法の工程（１）における反応は、例えば、水、α−ヒドロキシカルボン酸化合物（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）及びＮＡＤ+を、本発明タンパク質(A)と本発明タンパク質(B)とのいずれかもしくは両者又はそれらを産生する形質転換体又はそれらの処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒やカタラーゼ等を含有する反応液を、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができ、通常ｐＨ約３から約１０の範囲である。反応温度は適宜選択することができ、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常約０℃から約６０℃の範囲である。
α−ヒドロキシカルボン酸化合物（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−ヒドロキシカルボン酸又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）の酸化反応の進行に伴い、反応液中のＮＡＤ+はＮＡＤＨに変換される。よって、上記工程（１）の反応系内に、ＮＡＤＨをＮＡＤ+に変換する能力を有するタンパク質が含まれない場合には、例えば、反応液中のＮＡＤＨの単位時間当たりの増加量、即ち、増加速度を測定することにより、前記酸化反応の進行をモニターすることができる。
反応の終点は、例えば、反応液中のα−ヒドロキシカルボン酸化合物（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）の量を液体クロマトグラフィー等により分析することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができ、通常約０．５時間から約１０日間の範囲である。
反応液からのα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸化合物又はα−オキソ−イソカプロン酸）の回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等と組み合わせて行うことにより、目的とする化合物を精製する方法が挙げられる。
本発明製造方法の工程（１）で得られたα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸化合物又はα−オキソ−イソカプロン酸）を、反応液から精製または部分精製した後、工程（２）に供することができる。工程（１）の反応液を工程（２）の反応液に添加することにより、工程（１）で得られたα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸化合物又はα−オキソ−イソカプロン酸）を工程（２）に供することもできる。
本発明製造方法の工程（２）において、本タンパク質(C)は、種々の形態で、α−オキソカルボン酸化合物に作用させるための反応系に提供され得る。本タンパク質(C)は、精製されたタンパク質の形態で上記工程（２）の反応系に提供されてもよいし、当該タンパク質を産生する微生物又は該微生物の処理物に含まれる形態で前記反応系に提供されてもよい。「微生物の処理物」とは、上述の「形質転換体の処理物」と同様に調製されたものを意味する。本タンパク質(C)は、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で上記反応系に提供されてもよい。
本タンパク質(C)をα−オキソカルボン酸化合物に作用させるために、具体的には、例えば、本タンパク質(C)、本タンパク質(C)の固定化物、本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなり本タンパク質(C)を産生する形質転換体の培養物、又は、前記形質転換体の処理物を、上記工程（２）の反応系に提供することができる。
本発明製造方法の工程（２）は、通常、水、アンモニウムイオン及びＮＡＤＨ等の補酵素の存在下に行われる。
この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタンや、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩、又は、これらの混合物が挙げられる。
本発明製造方法の工程（２）においては、水に加えて有機溶媒を反応系に共存させることもできる。用いられる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、及びこれらの混合物が挙げられる。
本発明製造方法の工程（２）においては、アミノ基供与体としてアンモニウムイオンが利用されるため、通常、反応系にアンモニウム塩化合物が添加される。添加されるアンモニウム塩化合物としては、例えば、硫酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等を挙げることができる。反応系内におけるアンモニウムイオンの量は、通常、基質であるα−オキソカルボン酸化合物の量と等モルかまたはそれ以上であり、反応開始時に添加しておくのが好ましい。
本発明製造方法の工程（２）においては、共役系として補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）が利用されるため、通常、反応系に補酵素（ｃｏｅｎｚｙｍｅ）を添加するとよい。添加される補酵素としては、例えば、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドや、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記すこともある。）を挙げることができる。反応系内における補因子の量は、通常、基質であるα−オキソカルボン酸化合物の量と等モルかまたはそれ以上であり、反応開始時に添加しておくのが好ましい。
本発明製造方法の工程（２）において、α−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸又はα−オキソ−イソカプロン酸）の還元的アミノ化反応の進行に伴い、反応液中のＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+は、ＮＡＤ+を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質を作用させることにより元のＮＡＤＨに戻すことができるので、上記工程（２）の反応系内には、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をさらに存在させてもよい。上記工程（２）の反応系内に、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をさらに存在させる場合には、反応系内における補因子の量は、通常、触媒量でよく、基質であるα−オキソカルボン酸化合物の量と等モルかまたはそれ以下である。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、蟻酸脱水素酵素やリンゴ酸脱水素酵素等の有機酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、又は、アミノ酸脱水素酵素が挙げられる。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質は、精製されたタンパク質もしくはその固定化物の形態で本発明製造方法の工程（２）の反応系に提供されてもよいし、当該タンパク質を産生する微生物又は該微生物の処理物に含まれる形態で前記反応系に提供されてもよい。「微生物の処理物」とは、上述の「形質転換体の処理物」と同様に調製されたものを意味する。ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が上記反応系に提供されてもよい。
本発明製造方法の工程（２）において、本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物と、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物とが、α−オキソカルボン酸化合物に作用させるための反応系に提供されてもよい。
本発明製造方法の工程（２）において、本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドとＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの両者が同一の宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が、前記反応系に提供されてもよい。本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドとＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよいし、同じベクター上に組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよい。両ポリヌクレオチドを単一のベクターに組み込む場合は、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を両ポリヌクレオチドのそれぞれに連結してベクターに組み込んでもよいし、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして両ポリヌクレオチドを発現させるようにベクターに組み込んでもよい。本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドとＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれか、又は、両方が、宿主細胞の染色体上に保有されてもよい。
本発明製造方法の工程（２）における反応は、例えば、水、アンモニウム塩化合物、ＮＡＤＨ、α−オキソカルボン酸化合物（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸化合物又はα−オキソ−イソカプロン酸）、本タンパク質(C)又はそれを産生する形質転換体若しくはその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒やＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質等を含有する反応液を、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができ、通常ｐＨ約３から約１０の範囲である。反応温度は適宜選択することができ、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常約０℃から約６０℃の範囲である。
反応の終点は、例えば、反応液中のα−オキソカルボン酸化合物（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸化合物又はα−オキソ−イソカプロン酸）の量を液体クロマトグラフィー等により分析することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができ、通常約０．５時間から約１０日間の範囲である。
反応液からのL−α−アミノ酸（例えば、L−メチオニン等の含硫L−α−アミノ酸又はL-ロイシン）の回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液のろ過、晶析、有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等と組み合わせて行うことにより、目的とする化合物を精製する方法が挙げられる。
本発明製造方法の工程（１）と工程（２）とを、一つの反応系で行うこともできる。
この場合、本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)は、それぞれ種々の形態で上記反応系に提供され得る。
本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)は、精製されたタンパク質の形態で上記反応系に提供されてもよいし、これらタンパク質を産生する微生物又は該微生物の処理物に含まれる形態で上記反応系に提供されてもよい。
本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)は、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で上記反応系に提供されてもよい。
例えば、本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物と、本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物とのいずれか又は両者と、本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物とが、上記反応系に提供されてもよい。本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドと本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドとのいずれか又は両者と、本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドとが同一の宿主細胞に導入されてなる形質転換体又はその処理物が、上記反応系に提供されてもよい。本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドと本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチドとのいずれか又は両者と、本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよいし、同じベクター上に組み込まれて宿主細胞へ導入されてもよい。複数のポリヌクレオチドを単一のベクターに組み込む場合は、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を上記ポリヌクレオチドのそれぞれに連結してベクターに組み込んでもよいし、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして上記ポリヌクレオチドを発現させるようにベクターに組み込んでもよい。本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチド、本発明タンパク質(B)をコードするポリヌクレオチド及び本タンパク質(C)をコードするポリヌクレオチドのいずれか、又は、２以上が、宿主細胞の染色体上に保有されてもよい。
本発明製造方法の工程（１）と工程（２）とを一つの反応系で行う場合の反応は、上述の本発明製造方法の工程（２）の反応に準じた反応液及び反応条件にて行うことができる。
工程（１）におけるα−ヒドロキシカルボン酸化合物（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−ヒドロキシカルボン酸又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）の酸化反応の進行に伴い、反応液中のＮＡＤ+はＮＡＤＨに変換される。工程（２）におけるα−オキソカルボン酸（例えば、２−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−オキソカルボン酸又はα−オキソ−イソカプロン酸）の還元的アミノ化反応の進行に伴い、反応液中のＮＡＤＨはＮＡＤ+に変換される。よって、本発明製造方法の工程（１）と工程（２）とを一つの反応系で行うと、補酵素（ＮＡＤ+及びＮＡＤＨ）を触媒量にてリサイクルすることができる。
反応の終点は、例えば、反応液中のα−ヒドロキシカルボン酸化合物（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸等の含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物又はα−ヒドロキシ−イソカプロン酸）の量を液体クロマトグラフィー等により分析することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができ、通常約０．５時間から約１０日間の範囲である。
反応液からのL−α−アミノ酸（例えば、L−メチオニン等の含硫L−α−アミノ酸又はL-ロイシン）の回収は、上述の本発明製造方法の工程（２）の場合と同様に行うことができる。
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって限定されるものではない。
参考例１（染色体ＤＮＡの調製）
２本の５００ｍｌ容フラスコに培地（水１００ｍｌにグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．３ｇ、肉エキス０．３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０５ｇを溶解し、２ＮのＨＣｌでｐＨを６に調整したもの）をそれぞれ１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに、同組成の培地中で３０℃にて４８時間振盪培養したアクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）ATCC55564株の培養液をそれぞれ０．３ｍｌずつ加え、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、生じた沈殿を集めた。得られた沈殿を０．８５％食塩水５０ｍｌで洗浄して、３．５ｇの湿菌体を得た。
得られた菌体から、QIAprep Genomic-tip System (Qiagen社製)を用いて染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ａ）と記す。）を得た。
実施例１（本発明ポリヌクレオチド(A)及び本発明ポリヌクレオチド(B)、これらをそれぞれ含む組換えベクター、並びに当該ベクターを保有する形質転換体の作製）
（１）プライマー合成
配列番号９から１２で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。
Figure 0006460106
（２）本発明ポリヌクレオチド(B)を含む組換えベクター
配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、上記染色体ＤＮＡ（Ａ）を鋳型にして下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
染色体ＤＮＡ（Ａ）溶液 1.5μl
dNTP(各2mMのmixture) 10μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.3μl
2xbuffer 25μl
KOD-FX(1U/μl、東洋紡社製) 1μl
超純水 11.9μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700）にセットし、94℃にて2分間保温した後、９８℃にて１０秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温サイクルを３０回行った後、４℃で保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．１ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NdeI及びXhoIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐＥＴ−２２ｂ（ノバジェン社製）を制限酵素NdeI及びXhoIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NdeI及びXhoIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．１ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらプラスミドのうちの１つが保有する約１．１ｋｂの挿入ＤＮＡの塩基配列を分析したところ、当該ＤＮＡが配列番号２で示される塩基配列を有することが判明した。このプラスミドをｐＥＴ７７４と名付けた。配列番号２で示される塩基配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする。プラスミドｐＥＴ７７４は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（３）本発明ポリヌクレオチド(A)を含む組換えベクター
配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、上記染色体ＤＮＡ（Ａ）を鋳型にして、Expand High Fidelity PCR System（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いた下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
染色体DNA（A）溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.4μl
5xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで65℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで70℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NdeI及びXhoIを加えて、ＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．０ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐＥＴ−２２ｂ（ノバジェン社製）を制限酵素NdeI及びXhoIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NdeI及びXhoIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．０ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらプラスミドのうちの１つが保有する約１．０ｋｂの挿入ＤＮＡの塩基配列を分析したところ、当該ＤＮＡが配列番号４で示される塩基配列を有することが判明した。このプラスミドをｐＥＴ４３と名付けた。配列番号４で示される塩基配列は配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする。プラスミドｐＥＴ４３は、配列番号３で示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
実施例２（本発明タンパク質(A)及び本発明タンパク質(B)の調製、並びに当該タンパク質を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造）
（１）本発明タンパク質(B)
プラスミドｐＥＴ７７４を用いてE．coli BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地８００ｍｌに接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を得た。この湿菌体約４．９ｇを、０．５M NaClと５ｍMイミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）（以下、バインディングバッファーと記すこともある。）４０mlに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、遠心上清液約２８ｍｌを得た。
得られた遠心上清液の約10mlを流速５ml/minでアフィニティカラム（HisTrap HP、ゲルベッド５ml、GEヘルスケア社製）にアプライした。このカラムに約２５mlのバインディングバッファーを流速５ml/minで流して非吸着タンパク質を溶出させた。その後、流速を維持したまま、０．５M NaClと２９．７５mM イミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）約３５mlを流して、非吸着タンパク質および低吸着タンパク質を溶出させた。
次いで、47.5ml流す間にイミダゾール濃度を２９．７５mMから500mMに増やすグラジエント溶出により吸着タンパク質を溶出させ、イミダゾール濃度が１２０ｍＭから２７０mM付近の画分２５ｍｌを分取した。得られた画分をAmicon Ultra-15（ミリポア社製)に供して脱塩濃縮および0.5M Tris-HCl（pH9）へのバッファー交換を行い、約２mlの精製酵素液（40gタンパク質/L）を得た。得られた精製酵素液の2倍希釈液0.31mlと、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩（東京化成社製）５０ｍｇ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0４ｍｌ、硫酸アンモニウム４０ｍｇ、及びロイシン脱水素酵素（和光純薬社製）６０Uとを混合し、３０℃で２４時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩の量に対してL−メチオニンは３５．３％生成していることがわかった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
（２）本発明タンパク質(A)
プラスミドｐET４３を用いてE．coli BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地８００ｍｌに接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を得た。この湿菌体約５．２ｇを、０．５MのNaClと５ｍMイミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）（即ち、バインディングバッファー）４０mlに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、遠心上清液約２８ｍｌを得た。
得られた遠心上清液の約10mlを流速５ml/minでアフィニティカラム（HisTrap HP、ゲルベッド５ml、GEヘルスケア社製）にアプライした。このカラムに約２５mlのバインディングバッファーを流速５ml/minで流して非吸着タンパク質を溶出させた。その後、流速を維持したまま、０．５M NaClと２９．７５mM イミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）約３５mlを流して、非吸着タンパク質および低吸着タンパク質を溶出させた。
次いで、47.5ml流す間にイミダゾール濃度を２９．７５mMから500mMに増やすグラジエント溶出により吸着タンパク質を溶出させ、イミダゾール濃度が１２０から２７０mM付近の画分２５ｍｌを分取した。得られた画分をAmicon Ultra-15（ミリポア社製)に供して脱塩濃縮および0.5M Tris-HCl（pH9）へのバッファー交換を行い、約２mlの精製酵素液（9gタンパク質/L）を得た。得られた精製酵素液0.62mlをAmicon Ultra-15（ミリポア社製)にて2倍濃縮した。得られた0.31mlの濃縮液と、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩（東京化成社製）５０ｍｇ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0４ｍｌ、硫酸アンモニウム４０ｍｇ、及びロイシン脱水素酵素（和光純薬社製）６０Uとを混合し、３０℃で２４時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩の量に対してL−メチオニンは３６．９％生成していることがわかった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
（３）本発明タンパク質(A)及び本発明タンパク質(B)
実施例２（１）で調製された精製酵素液（40gタンパク質/L）の2倍希釈液0.31mlと実施例２（２）で調製された精製酵素液（9gタンパク質/L）の2倍濃縮液0.31mlとを混合し、Amicon Ultra-15（ミリポア社製)にて2倍濃縮した。得られた酵素液0.31mlと、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩（東京化成社製）５０ｍｇ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0４ｍｌ、硫酸アンモニウム４０ｍｇ、及びロイシン脱水素酵素（和光社製）６０Uとを混合し、３０℃で３時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩の量に対してL−メチオニンは４７．０％生成していることがわかった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
実施例３（本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター及び当該ベクターを保有する形質転換体の作製、並びに、本タンパク質(C)の調製）
（１）本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
Bacillus sphaericus IFO3525株を滅菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養し、菌体０．４ｇを得た。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記す。）を精製した。
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239−247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素をコードする塩基配列をもとに、配列番号１４で示される塩基配列（GCCATGGAAATCTTCAAGTATATGG）を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５で示される塩基配列（GGGCCCGGGTTAACGGCCGTTCAAAATATT）を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを合成する。
配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを用い、上記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして、Expand High Fidelity PCR System（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
染色体DNA（Ｂ）溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 0.4μl
プライマー(4pmol/μl) 2μl
5xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 35.1μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて20秒間次いで55℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを２５回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．１ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NcoI及びSmaIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（ＧＥヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びSmaIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoIとXbaIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．1ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrcLDと名付けた。
（２）本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239−247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素をコードする塩基配列を基にして、前記酵素の１１３番目のアラニンをグリシンに置換するための変異導入プライマ−として、配列番号１６で示される塩基配列（GTCGCTATATTACCGGTGAAGATGTTG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号１７で示される塩基配列（CAACATCTTCACCGGTAATATAGCGAC）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例３（１）に記載の組換えベクタ−ｐＴｒｃLDを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐＴｒｃLDのDNA溶液 ０．４μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．８μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで５５℃にて１分間次いで６８℃にて５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体の各々からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。配列番号８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐTrcLD(A113G)と名付けた。配列番号８で示される塩基配列は配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードする。
（３）本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
（３−１）塩基置換のための部位特異的変異導入
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239−247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素をコードする塩基配列を基にして、９９３番目のアデニンをシトシンに置換するための変異導入プライマ−として、配列番号１８で示される塩基配列（GATAGTATTCCAACCTATGTTGCGGC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号１９で示される塩基配列（GCCGCAACATAGGTTGGAATACTATC）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。
配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例３（２）に記載の組換えベクタ−ｐＴｒｃLD(A113G)を鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐＴｒｃLD(A113G)のDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrcLD(A113G)ndと名付けた。
（３−２）本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素をコードする塩基配列を基にして、配列番号２０で示される塩基配列（GGGCATATGGAAATCTTCAAGTATATGG）を有するオリゴヌクレオチドプライマー（センスプライマー）と、配列番号２１で示される塩基配列（GGATCCTTAACGGCCGTTCAAAATATT）を有するオリゴヌクレオチドプライマー（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号２１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを用い、実施例３（３−１）に記載の組換えベクターｐTrcLD(A113G)ndを鋳型にして、Expand High Fidelity PCR System(ロシュ・ダイアグノスティック社製)を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrcLD(A113G)ndのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで55℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで60℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．１ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NdeI及びBamHIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐET−１５ｂ（ノバジェン製）を制限酵素NdeI及びBamHIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NdeI及びBamHIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。４つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．１ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。このようにして得られるプラスミドは、組換えベクターｐTrcLD(A113G)ndにコードされるロイシン脱水素酵素のアミノ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む２０アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４４：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis）が付加されたタンパク質を発現可能なように設計されている。得られたプラスミドのうちの１つをｐETLD(A113G)と名付けた。
（４）本タンパク質(C)
組換えベクターｐETLD(A113G)を用いてE．coli BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地８００ｍｌに接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、約６ｇの湿菌体を得た。この湿菌体約６ｇを、０．５MのNaClと５ｍMイミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）（即ち、バインディングバッファー）４０mlに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、遠心上清液約２５ｍｌを得た。
得られた遠心上清液の約１０ｍｌを、流速5ml/minでアフィニティカラム（HisTrap HP、ゲルベッド5ml、GEヘルスケア社製）にアプライした。このカラムに約25mlのバインディングバッファーを流速5ml/minで流して非吸着タンパク質を溶出させた。その後、流速を維持したまま、０．５M NaClと２９．７５mM イミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）約35mlを流して、非吸着タンパク質および低吸着タンパク質を溶出させた。次いで、47.5ml流す間にイミダゾール濃度を２９．７５mMから500mMに増やすグラジエント溶出により吸着タンパク質を溶出させ、イミダゾール濃度が160ｍMから443mM付近の画分３０ｍｌを分取した。得られた画分をAmicon Ultra−15（ミリポア社製)に供して、脱塩濃縮および0.5M Tris−HCl（pH9）へのバッファー交換を行い、約２mlの画分（32.6gタンパク質/L）を得た。この画分を以下、ロイシン脱水素酵素（A113G）精製酵素液と記す。
実施例４（本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造）
実施例２（１）で調製された精製酵素液（40gタンパク質/L）の2倍希釈液0.31mlと実施例２（２）で調製された精製酵素液（9gタンパク質/L）の2倍濃縮液0.31mlとを混合し、Amicon Ultra-15（ミリポア社製)にて2倍濃縮した。得られた酵素液0.31mlと、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩（東京化成社製）５０ｍｇ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0４ｍｌ、硫酸アンモニウム４０ｍｇ、及び実施例３（４）で調製されたロイシン脱水素酵素（A113G）精製酵素液（32.6gタンパク質/L）0.15ｍｌとを混合し、３０℃で１時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸のカルシウム塩の量に対してL−メチオニンは４９．９％生成していることがわかった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
実施例５（本発明ポリヌクレオチド(A)、本発明組換えベクター(ABC)、及び当該ベクターを保有する形質転換体の作製）
（１）本発明ポリヌクレオチド(A)を含有する組換えベクター
配列番号１３で示される塩基配列の５‘末端に塩基配列ccatggct、３’末端に塩基配列ggatccが、それぞれ付加された塩基配列を有する二本鎖DNAを調製する。配列番号１３で示される塩基配列は配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする。
調製された約１．０ｋｂの二本鎖ＤＮＡを制限酵素NcoI及びBamHIにより二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（GEヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びBamHIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli JM１０９株を形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoIとBamHIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．０ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。得られたプラスミドの塩基配列を決定し、目的とする塩基配列を有するプラスミドをｐTrc４３SCと名付けた。
（２）本発明組換えベクター(ABC)
（２−１）本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 239−247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素の塩基配列を基にして、５６１番目のグアニンをアデニンに置換するための変異導入プライマ−として、配列番号２２で示される塩基配列（CGTAGCTTACAAACTTTGCGAGTATTTAC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号２３で示される塩基配列（GTAAATACTCGCAAAGTTTGTAAGCTACG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号２２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例３の（３）に記載のプラスミドｐTrcLD(A113G)ndを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrcLD(A113G)ndのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrcLD(A113G)ndｈｄと名付けた。
（２−２）本発明ポリヌクレオチド(B)を含有する組換えベクター
配列番号２４で示される塩基配列（CCATGGCTATGAAAAAGCTCTCCATCGCCC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号２５で示される塩基配列（CAAGCTTGCTAGCCTTCGTGCGGCAGGGCTTC）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とをプライマーに用いて、実施例１（２）に記載のプラスミドｐET７７４を鋳型にして下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐET７７４のDNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mMのmixture) 10μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.3μl
2xbuffer 25μl
KOD-FX(1U/μl、東洋紡社製) 1μl
超純水 11.9μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700）にセットし、94℃にて2分間保温した後、９８℃にて１０秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温サイクルを３０回行った後、４℃で保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．１ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NcoI及びHindIIIを加えて、ＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（GEヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びHindIIIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoI及びHindIIIより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．１ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrc７７４NHと名付けた。
（２−３）本発明ポリヌクレオチド(B)及び本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
配列番号２６で示される塩基配列（CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号２７で示される塩基配列（GCTGCAGCCTAGCCTTCGTGCGGCAGGGCTTC）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを用いて、実施例５（２−２）に記載のプラスミドｐTrc７７４NHを鋳型にして下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc７７４NHのDNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mMのmixture) 10μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.3μl
2xbuffer 25μl
KOD-FX(1U/μl、東洋紡社製) 1μl
超純水 11.9μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700）にセットし、94℃にて2分間保温した後、９８℃にて１０秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温サイクルを３０回行った後、４℃で保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．１ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素BamHI及びPstIを加えて、ＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
実施例５（２−１）に記載のプラスミドｐTrcLD(A113G)ndｈｄを制限酵素BamHI及びPstIにより二重消化させ、酵素消化されたプラスミドＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素BamHI及びPstIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．１ｋｂのＤＮＡがプラスミドｐTrcLD(A113G)ndｈｄに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrcLD(A113G)/774と名付けた。
（２−４）本発明ポリヌクレオチド(A)、本発明ポリヌクレオチド(B)及び本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
配列番号２８で示される塩基配列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号２９で示される塩基配列（CAAGCTTGTTAGCCACGGGCTTCCCACACC）で示されるオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とをプライマーに用いて、実施例５（１）に記載のプラスミドｐTrc４３SCを鋳型にしてExpand High Fidelity PCR System(ロシュ・ダイアグノスティック社製)を用いた下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで65℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで70℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素PstI及びHindIIIを加えて、ＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．０ｋｂのＤＮＡを精製した。
実施例５（２−３）に記載のプラスミドｐTrcLD(A113G)/774を制限酵素PstI及びHindIIIにより二重消化させ、酵素消化されたプラスミドＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素PstI及びHindIIIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．０ｋｂのＤＮＡがプラスミドｐTrcLD(A113G)/774に挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrcLD(A113G)/774/43SCと名付けた。
実施例６（本発明組換えベクター(ABC)を保有する形質転換体の処理物を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造）
プラスミドｐTrcLD(A113G)/774/43SCを用いてE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を得た。この湿菌体約０．８ｇを0.5M Tris-HClバッファー（pH9）５ｍｌに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、遠心上清液（２８ｇタンパク質/L）約３．５ｍｌを得た。
得られた遠心上清液の0.３４mlをAmicon Ultra-15（ミリポア社製)にて3.4倍濃縮した。得られた濃縮遠心上清液0.1ml、アンモニア水を用いpH9に調製した２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸（東京化成社製）の４０％水溶液を０．３５ｍｌ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0５ｍｌ、及び硫酸アンモニウム２０ｍｇを混合し、３０℃で１時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。９３．５ｇ/LのL−メチオニンが生成していることがわかった。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸の量に対してL−メチオニン収率は３０．４％であった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
実施例７（本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター及び当該ベクターを保有する形質転換体の作製）
（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
（１−１）
配列番号３０で示される塩基配列（CCATATGTCTCAAAAACCAAAAATCATCG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号３１で示される塩基配列（ACTCGAGGCCACGGGCTTCCCACACCTGCG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）を合成する。配列番号３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、実施例５の（１）に記載のプラスミドｐTrc４３SCを鋳型にしてExpand High Fidelity PCR System（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いた下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで55℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで60℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NdeI及びXhoIを加えて、ＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．０ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐET−２２ｂ（ノバジェン製）を制限酵素NdeI及びXhoIにより二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE.coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NdeI及びXhoIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。４つのプラスミドにおいて、それぞれ約１．０ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐET４３SCcHisと名付けた。プラスミドｐET４３SCcHisは、配列番号３で示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（１−２）
配列番号３２で示される塩基配列（GCCATGGCTATGTCTCAAAAACCAAAAATC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号３３で示される塩基配列（GGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）を合成する。配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３３で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、実施例７（１−１）に記載のプラスミドｐET４３SCcHisを鋳型にしてExpand High Fidelity PCR System（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いた下記反応液でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐET４３SCcHisのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで55℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで60℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NcoI及びBamHIを加えて、ＤＮＡを二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（ＧＥヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びBamHIにより二重消化させ、酵素消化されたＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE.coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoI及びBamHIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。４つのプラスミドにおいて、前記約１．０ｋｂのＤＮＡが挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrc４３SCcHisと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHisは、配列番号３で示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（２）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列を基にして、325番目のグアニンをアデニンに置換するための変異導入プライマ−として、配列番号３４で示される塩基配列（CGCTGTTGCTGATATTACCATCGGCCTG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号３５で示される塩基配列（CAGGCCGATGGTAATATCAGCAACAGCG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号１３に示される塩基配列における325番目のグアニンのアデニンへの置換は、配列番号３で示されるアミノ酸配列における１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換をもたらす。
配列番号３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（１−２）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHisを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHisのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-g325aと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-g325aは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（３）改変アミノ酸配列Ｇ１９１Ｄを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列を基にして、572番目のグアニンをアデニンに置換するための変異導入プライマ−として、配列番号３６で示される塩基配列（GGCGGCATACGTCGATCGTGACGAGCTG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号３７で示される塩基配列（CAGCTCGTCACGATCGACGTATGCCGCC）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号１３に示される塩基配列における572番目のグアニンのアデニンへの置換は、配列番号３で示されるアミノ酸配列における１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換をもたらす。
配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（１−２）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHisを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHisのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-g572aと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-g572aは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（４）改変アミノ酸配列Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列を基にして、737番目のアデニンをグアニンに置換するための変異導入プライマ−として、配列番号３８で示される塩基配列（GCAGCACTGGTACGGGCACTGCGCTCTG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号３９で示される塩基配列（CAGAGCGCAGTGCCCGTACCAGTGCTGC）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号１３に示される塩基配列における737番目のアデニンのグアニンへの置換は、配列番号３で示されるアミノ酸配列における２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換をもたらす。
配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（１−２）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHisを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHisのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-a737gと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-a737gは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（５）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉ／Ｇ１９１Ｄを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列における572番目のグアニンをアデニンに変換するための変異導入プライマ−である、配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（２）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHis-g325aを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHis-g325aのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-g325a/g572aと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/g572aは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換及び１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（６）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉ／Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列における737番目のアデニンをグアニンに変換するための変異導入プライマ−である、配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（２）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHis-g325aを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHis-g325aのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-g325a/a737gと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/a737gは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（７）改変アミノ酸配列Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列における737番目のアデニンをグアニンに変換するための変異導入プライマ−である、配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（３）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHis-g572aを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHis-g572aのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-g572a/a737gと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-g572a/a737gは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（８）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉ／Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
配列番号１３に示される塩基配列における737番目のアデニンをグアニンに変換するための変異導入プライマ−である、配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例７（５）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/g572aを鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572aのDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ

上記組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて５．５分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737gと名付けた。プラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737gは、配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換を有する改変(altered)アミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
実施例８（本発明タンパク質(A)の熱安定性評価）
（１）
プラスミドｐTrc４３SCcHis、ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a、ｐTrc４３SCcHis-g325a/a737g、または、プラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737gを用いてE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地２０ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液を遠心分離し、約０．１ｇの湿菌体を得た。湿菌体それぞれ約０．１ｇを、０．５MのNaClと５ｍMイミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）（即ち、バインディングバッファー）１mlにそれぞれ懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を１３０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、それぞれ遠心上清液約０．７ｍｌを得た。
得られたそれぞれの遠心上清液に約０．３ｍｌのバインディングバッファーを追加して約１mlとした後、これをアフィニティカラム（HisTrap HP、ゲルベッド1ml、GEヘルスケア社製）にアプライした。このカラムに約3mlのバインディングバッファーを流して非吸着タンパク質を溶出させた。その後、０．５M NaClと５００mM イミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）約２mlを流して、それぞれの吸着タンパク質を溶出させ、溶出液を集めた。それぞれの溶出液約2mlをAmicon Ultra-15（ミリポア社製)に供して脱塩濃縮及び0.5M Tris-HCl（pH9）へのバッファー交換を行い、それぞれ約0.4mlの精製酵素液を得た。それぞれの精製酵素液のタンパク質濃度を測定した。ｐTrc４３SCcHis導入形質転換体からの精製酵素液のタンパク質濃度は３．１gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a導入形質転換体からのそれは２．５gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a/a737g導入形質転換体からのそれは３．１gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737g導入形質転換体からのそれは３．２gタンパク質/Lであった。
得られた精製酵素液をそれぞれ０．４５ｇタンパク質/Lになるように希釈し、得られた希釈酵素液0.06mlを41℃で30分間熱処理した後、4℃に冷却した。得られた酵素液0.０４５mlと０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0５５ｍｌとを混合し、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸カルシウム（東京化成社製）が４７ｍM、ＮＡＤ＋が３．２ｍMとなるよう添加して、３０℃で保温した。前記反応液の吸光度を３４０ｎｍの波長で10秒ごとに約10分間測定した。1分間に１μmolのNAD+を還元させる酵素量を１Uとして、酵素活性を求めた。対照として、熱処理を行わなかった希釈酵素液を用いて同様に反応を行い、反応液の吸光度を測定し、酵素活性を求めた。熱処理を行わなかった希釈酵素液を用いた反応での酵素活性を１００％として、熱処理した希釈酵素液の残存活性を算出した。結果を表２に示す。
Figure 0006460106
（２）
プラスミドｐTrc４３SCcHis、ｐTrc４３SCcHis-g325a、ｐTrc４３SCcHis-g572a、ｐTrc４３SCcHis-a737g、ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a、ｐTrc４３SCcHis-g572a/a737g、ｐTrc４３SCcHis-g325a/a737g、または、プラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737gを用いてE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地２０ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液を遠心分離し、約０．１ｇの湿菌体を得た。湿菌体それぞれ約０．１ｇを、０．５MのNaClと５ｍMイミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）（即ち、バインディングバッファー）１mlにそれぞれ懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を１２０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、それぞれ遠心上清液約０．７ｍｌを得た。
得られたそれぞれの遠心上清液に約０．３ｍｌのバインディングバッファーを追加して約１mlとした後、これをアフィニティカラム（HisTrap HP、ゲルベッド1ml、GEヘルスケア社製）にアプライした。このカラムに約3mlのバインディングバッファーを流して非吸着タンパク質を溶出させた。その後、０．５M NaClと５００mM イミダゾールとを含む２０ｍMリン酸バッファー（pH７．４）約２mlを流して、それぞれの吸着タンパク質を溶出させ、溶出液を集めた。それぞれの溶出液約2mlをAmicon Ultra-15（ミリポア社製)に供して脱塩濃縮及び0.5M Tris-HCl（pH9）へのバッファー交換を行い、それぞれ約0.4mlの精製酵素液を得た。それぞれの精製酵素液のタンパク質濃度を測定した。ｐTrc４３SCcHis導入形質転換体からの精製酵素液のタンパク質濃度は２．３gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a導入形質転換体からのそれは２．９gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g572a導入形質転換体からのそれは２．９gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-a737g形質転換体からのそれは４．２gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a導入形質転換体からのそれは２．１gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g572a/a737g導入形質転換体からのそれは３．３gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a/a737g導入形質転換体からのそれは２．６gタンパク質/L、ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737g導入形質転換体からのそれは２．７gタンパク質/Lであった。
得られた精製酵素液をそれぞれ０．４５ｇタンパク質/Lになるように希釈し、得られた希釈酵素液0.06mlを40.5℃で30分間熱処理した後、4℃に冷却した。得られた酵素液0.０４５mlと０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）0.0５５ｍｌとを混合し、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸カルシウム（東京化成社製）が４７ｍM、ＮＡＤ＋が３．２ｍMとなるよう添加して、３０℃で保温した。前記反応液の吸光度を３４０ｎｍの波長で10秒ごとに約10分間測定した。1分間に１μmolのNAD+を還元させる酵素量を１Uとして、酵素活性を求めた。対照として、熱処理を行わなかった希釈酵素液を用いて同様に反応を行い、反応液の吸光度を測定し、酵素活性を求めた。熱処理を行わなかった希釈酵素液を用いた反応での酵素活性を１００％として、熱処理した希釈酵素液の残存活性を算出した。結果を表３に示す。
Figure 0006460106
実施例９（本発明組換えベクター(ABC)及び当該ベクターを保有する形質転換体の作製）（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する本発明組換えベクター(ABC)
（１−１）本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 239−247に記載されたBacillus sphaericus IFO3525株由来のロイシン脱水素酵素の塩基配列を基にして、５６１番目のグアニンをアデニンに変換するための変異導入プライマ−として、配列番号２２で示される塩基配列（CGTAGCTTACAAACTTTGCGAGTATTTAC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号２３で示される塩基配列（GTAAATACTCGCAAAGTTTGTAAGCTACG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。
配列番号２２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマ−に用いて、実施例３の（３−２）に記載のプラスミドｐETLD(A113G)を鋳型にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた以下の反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐETLD(A113G)のDNA溶液 １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
センスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
アンチセンスプライマ−（５０μＭ） ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに含まれる） ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ （上記Ｋｉｔに含まれる） １μｌ
超純水 ４１．２μｌ
［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、サーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００）にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃にて50秒間次いで６０℃にて１分間次いで６８℃にて６．８分間の保温サイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
得られたＰＣＲ反応液に、ＤｐｎＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに含まれる）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。
得られた形質転換体からプラスミドを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定した。設計どおりの変異が導入されていることが確認されたプラスミドをｐETLD(A113G)ｈｄと名付けた。
プラスミドｐETLD(A113G)ｈｄに制限酵素NcoI及びBamHIを加えて、当該プラスミドＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（ＧＥヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びBamHIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE.coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoI及びBamHIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。４つのプラスミドにおいて、約１．１ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrcLD(A113G)nhと名付けた。プラスミドｐTrcLD(A113G)nhは、配列番号７で示されるアミノ酸配列のアミノ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む２０アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４４：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（１−２）本発明ポリヌクレオチド(B)を含有する組換えベクター
配列番号２４で示される塩基配列（CCATGGCTATGAAAAAGCTCTCCATCGCCC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号４０で示される塩基配列（GCTGCAGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）で示されるオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とをプライマーに用い、実施例１の（２）に記載のプラスミドｐET７７４を鋳型にして、下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
プラスミドｐET７７４のDNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mMのmixture) 10μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.3μl
2xbuffer 25μl
KOD-FX(1U/μl、東洋紡社製) 1μl
超純水 11.9μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700）にセットし、94℃にて2分間保温した後、９８℃にて１０秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温サイクルを３０回行った後、４℃で保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約1.1kｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NcoI及びPstIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約1.1kｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（ＧＥヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びPstIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoIとPstIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、約1.1kｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrc７７４chNPと名付けた。プラスミドｐTrc７７４chNPは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（１−３）本発明ポリヌクレオチド(B)及び本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
配列番号２６で示される塩基配列（CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号４０で示される塩基配列（GCTGCAGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）で示されるオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とをプライマーに用いて、実施例９（１−２）に記載のプラスミドｐTrc７７４chNPを鋳型にして、下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc７７４chNPのDNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mMのmixture) 10μl
プライマー(50pmol/μl) 各0.3μl
2xbuffer 25μl
KOD-FX(1U/μl、東洋紡社製) 1μl
超純水 11.9μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700）にセットし、94℃にて2分間保温した後、９８℃にて１０秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温サイクルを３０回行った後、４℃で保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．１ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素BamHI及びPstIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．１ｋｂのＤＮＡを精製した。
実施例９（１−１）に記載のプラスミドｐTrcLD(A113G)nhを制限酵素BamHI及びPstIにより二重消化させ、酵素消化されたプラスミドＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素BamHIとPstIとにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、約１．１ｋｂのＤＮＡがプラスミドｐTrcLD(A113G)nhに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをプラスミドｐTrcLD(A113G)nh/774chと名付けた。
（１−４）本発明ポリヌクレオチド(A)を含有する組換えベクター
配列番号３２で示される塩基配列（GCCATGGCTATGTCTCAAAAACCAAAAATC）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と、配列番号４１で示される塩基配列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とを合成する。配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、実施例７の（１−１）に記載のプラスミドｐET４３SCcHisを鋳型にして、Expand High Fidelity PCR System(ロシュ・ダイアグノスティック社製)を用いた下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐET４３SCcHisのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで55℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで60℃にて３０秒間次いで72℃にて１．５分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素NcoI及びHindIIIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．０ｋｂのＤＮＡを精製した。
プラスミドベクターｐTrc99A（ＧＥヘルスケア社製）を制限酵素NcoI及びHindIIIにより二重消化させ、酵素消化されたベクターＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE.coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から１０コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素NcoI及びHindIIIにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。４つのプラスミドにおいて、約１．０ｋｂのＤＮＡが上記ベクターに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrc43SCchNHと名付けた。プラスミドｐTrc43SCchNHは、配列番号３で示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に、連続する６残基のヒスチジンを含む８アミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号４５：LeuGluHisHisHisHisHisHis）が付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を発現可能なように設計されている。
（１−５）本発明ポリヌクレオチド(A)、本発明ポリヌクレオチド(B)及び本ポリヌクレオチド(C)を含有する組換えベクター
配列番号２８で示される塩基配列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号４１で示される塩基配列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とをプライマーに用いて、実施例９（１−４）に記載のプラスミドｐTrc43SCchNHを鋳型にして、Expand High Fidelity PCR System(ロシュ・ダイアグノスティック社製)を用いた下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc43SCchNHのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで65℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで70℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素PstI及びHindIIIを加えて、ＤＮＡ断片を二重消化させ、酵素消化された約１．０ｋｂＤＮＡを精製した。
実施例９（１−３）に記載のプラスミドｐTrcLD(A113G)nh/774chを制限酵素PstI及びHindIIIにより二重消化させ、酵素消化されたプラスミドＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素PstIとHindIIIとにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した６つのプラスミドにおいて、約１．０ｋｂのＤＮＡがプラスミドｐTrcLD(A113G)nh/774chに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドの１つをｐTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCchと名付けた。
（２）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉ／Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する本発明組換えベクター(ABC)
配列番号２８で示される塩基配列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）を有するオリゴヌクレオチド（センスプライマー）と配列番号４１で示される塩基配列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）とをプライマーに用い、実施例７の（８）に記載のプラスミドｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737gを鋳型にして、Expand High Fidelity PCR System(ロシュ・ダイアグノスティック社製)を用いた下記反応液組成でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737gのDNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mMのmixture) １μl
プライマー(20pmol/μl) 各0.４μl
５xbuffer(with MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超純水 36.7μl
上記組成の反応液が入った容器をサーマルサイクラー（PERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400）にセットし、94℃にて2分間保温した後、94℃にて１５秒間次いで65℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを１０回行い、次いで、94℃にて１５秒間次いで70℃にて３０秒間次いで72℃にて１分間の保温サイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持した。
その後、上記ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した。約１．０ｋｂのＤＮＡのバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に制限酵素PstI及びHindIIIを加えてＤＮＡを二重消化させ、酵素消化された約１．０ｋｂのＤＮＡを精製した。
実施例９（１−５）に記載のプラスミドｐTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCchを制限酵素PstI及びHindIIIにより二重消化させ、酵素消化された約６．４ｋｂのプラスミドＤＮＡを精製した。
これらの精製されたＤＮＡを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地２ｍｌに接種し、試験管中で３７℃、１７時間振盪培養した。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を制限酵素PstIとHindIIIとにより二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。６つのプラスミドにおいて、約１．０ｋｂのＤＮＡが上記約６．４ｋｂのプラスミドＤＮＡに挿入されていることが確認された。これらのプラスミドのうちの１つをｐTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCMchと名付けた。
実施例１０（本発明組換えベクター(ABC)を保有する形質転換体の処理物を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造）
（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する本発明組換えベクター(ABC)を保有する形質転換体
プラスミドｐTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCchを用いてE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地２０ｍｌに接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を得た。この湿菌体約０．１ｇを0.5M Tris-HClバッファー（pH9）１ｍｌに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、遠心上清液約０．７ｍｌを得た。
得られた遠心上清液の0.1ml、アンモニア水を用いpH9に調製した２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸（東京化成社製）の４０％水溶液を０．４ｍｌ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、及び硫酸アンモニウム２０ｍｇを混合し、３０℃で１８時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。８５．１ｇ/LのL−メチオニンが生成していることがわかった。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸の量に対してL−メチオニン収率は２１．５％であった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
（２）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉ／Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)をコードするポリヌクレオチドを含有する本発明組換えベクター(ABC)を保有する形質転換体
プラスミドｐTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCMchを用いてE．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有する滅菌ＬＢ培地２０ｍｌに接種し、３０℃、１５時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を得た。この湿菌体約０．１ｇを0.5M Tris-HClバッファー（pH9）１ｍｌに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）及びガラスビーズ（０．1ｍｍΦ）を用いて、２５００ｒｐｍにて２０分間破砕処理した。得られた破砕液を８０００rpm、４℃にて１０分間遠心分離し、遠心上清液約０．７ｍｌを得た。
得られた遠心上清液の0.1ml、アンモニア水を用いpH9に調製した２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸（東京化成社製）の４０％水溶液を０．４ｍｌ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、及び硫酸アンモニウム２０ｍｇを混合し、３０℃で２時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。８２．５ｇ/LのL−メチオニンが生成していることがわかった。反応に用いた２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸の量に対してL−メチオニン収率は２０．８％であった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
実施例１１（本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造）
（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造
実施例２（１）で調製された本発明タンパク質(B)の精製酵素液（40gタンパク質/L）の２倍希釈液0.1mlと、実施例２（２）で調製された本発明タンパク質(A)の精製酵素液（9gタンパク質/L）の2倍濃縮液0.1mlと、実施例３（４）で調製されたロイシン脱水素酵素（A113G）精製酵素液（32.6gタンパク質/L）の2倍希釈液0.1mlとを混合し、Amicon Ultra-15（ミリポア社製)にて濃縮し、0.1mlの精製酵素混合液を得た。得られた精製酵素混合液０．１ｍｌ、アンモニア水を用いpH9に調製したDL‐α‐ヒドロキシイソカプロン酸（ACROS ORGANICS社製）の４０％水溶液を０．１ｍｌ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）０．３ｍｌ、及び硫酸アンモニウム２０ｍｇを混合し、３０℃で１８時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。反応に用いたDL‐α‐ヒドロキシイソカプロン酸の量に対してL−ロイシンは６０．９％生成していることがわかった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
（２）改変アミノ酸配列Ｖ１０９Ｉ／Ｇ１９１Ｄ／Ｑ２４６Ｒを有する本発明タンパク質(A)、本発明タンパク質(B)及び本タンパク質(C)を用いたＬ−α−アミノ酸化合物の製造
実施例２（１）で調製された本発明タンパク質(B)の精製酵素液（40gタンパク質/L）の２．５倍希釈液0.1mlと、実施例８（１）でｐTrc４３SCcHis-g325a/g572a/a737g形質転換体から調製された本発明タンパク質(A)の精製酵素液（3.2gタンパク質/L）の４．５倍濃縮液0.1mlと、実施例３（４）で調製されたロイシン脱水素酵素（A113G）精製酵素液（32.6gタンパク質/L）の2倍希釈液0.1mlとを混合し、Amicon Ultra-15（ミリポア社製)にて濃縮し、0.1mlの精製酵素混合液を得た。得られた精製酵素混合液０．１ｍｌ、アンモニア水を用いpH9に調製したDL‐α‐ヒドロキシイソカプロン酸（ACROS ORGANICS社製）の４０％水溶液を０．１ｍｌ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ９．０）０．３ｍｌ、及び硫酸アンモニウム２０ｍｇを混合し、３０℃で１８時間振とうした。この反応液につき下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析を行った。反応に用いたDL‐α‐ヒドロキシイソカプロン酸の量に対してL−ロイシンは８８．０％生成していることがわかった。
（含量分析条件）
カラム：UNISON UK−C18(４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、３μｍ)
移動相：50mM リン酸を含む１２mＭ １−ヘプタンスルホン酸ナトリウム水溶液(Ａ液)とアセトニトリル(B液)をＡ液（％）：Ｂ液（％）＝９０：１０の割合で混合
流量：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３７℃
検出：２１０ｎｍ
本発明によれば、酸化酵素、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを利用した、メチオニン、ロイシン等のα-アミノ酸化合物の製造法等が提供可能となる。
［配列表フリ−テキスト］
配列番号９−１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド
配列番号１４−４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４−４５
設計されたアミノ酸配列

Claims (43)

  1. 下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
    （A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
    （A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１、２，３，４，５，６，７、または１０のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    をコードするポリヌクレオチド。
  2. 前記アミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用頻度を大腸菌のコドン使用頻度に合わせるように選択されたコドンを含む改変された塩基配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。
  3. 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１または２記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  5. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項４記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
  6. 宿主細胞が微生物または大腸菌である請求項５記載の形質転換体。
  7. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換体。
  8. 宿主細胞内で複製可能なベクターに、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを組込む工程を含む組換えベクターの製造方法。
  9. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含む形質転換体の製造方法。
  10. 下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
    （B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
    （B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１、２，３，４，５，６，７，８，１０，１２，１５あるいは１７のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    をコードするポリヌクレオチド。
  11. 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１０記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド。
  12. 請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  13. 請求項１０または１１記載のポリヌクレオチド又は請求項１２記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
  14. 宿主細胞が微生物または大腸菌である請求項１３記載の形質転換体。
  15. 請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドを保有する形質転換体。
  16. 宿主細胞内で複製可能なベクターに、請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドを組込む工程を含む組換えベクターの製造方法。
  17. 請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含む形質転換体の製造方法。
  18. 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドとを含有する組換えベクター。
  19. α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドをさらに含む請求項１８記載の組換えベクター。
  20. α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質がロイシン脱水素酵素である請求項１９記載の組換えベクター。
  21. α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列が、下記（C1）から（C3）のいずれかのアミノ酸配列：
    （C1）配列番号７で示されるアミノ酸配列、
    （C2）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （C3）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列において１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、３６あるいは４０ のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    である請求項１９または２０記載の組換えベクター。
  22. 請求項１８から２１のいずれか一項に記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
  23. 宿主細胞が微生物または大腸菌である請求項２２記載の形質転換体。
  24. ｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、または、当該ポリヌクレオチドと宿主細胞内において機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド、
    ｉｉ）請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、及び
    ｉｉｉ）請求項１０または１１記載のポリヌクレオチド；
    を保有する形質転換体。
  25. 下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
    （A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
    （A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１、２，３，４，５，６，７、または１０のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    を有するタンパク質。
  26. 下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
    （B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
    （B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１、２，３，４，５，６，７，８，１０，１２，１５あるいは１７のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    を有するタンパク質。
  27. （１）下記（A1）から（A5）のいずれかのアミノ酸配列:
    （A1）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
    （A2）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （A3）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１、２，３，４，５，６，７、または１０のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （A4）ｉ）配列番号４または１３で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （A5）ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１０９番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９１番目のグリシンのアスパラギン酸への置換及び２４６番目のグルタミンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を有する改変アミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    を有するタンパク質と、
    下記（B1）から（B4）のいずれかのアミノ酸配列:
    （B1）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
    （B2）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、
    （B3）ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１、２，３，４，５，６，７，８，１０，１２，１５あるいは１７のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （B4）ｉ）配列番号２で示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力と、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力とのいずれか又は両者を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    を有するタンパク質とのいずれか又は両者を、α−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させて、対応するα−オキソカルボン酸化合物を得る工程、及び
    （２）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質を、工程（１）で得られたα−オキソカルボン酸化合物に作用させて、対応するL−α−アミノ酸化合物を得る工程、
    を含むL−α−アミノ酸化合物の製造方法。
  28. α−ヒドロキシカルボン酸化合物が含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物であり、対応するα−オキソカルボン酸化合物が含硫α−オキソカルボン酸化合物であり、対応するL−α−アミノ酸化合物が含硫L−α−アミノ酸化合物であり、工程（１）においてα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるタンパク質が、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体を酸化して対応する2−オキソ−４−（メチルチオ）酪酸誘導体に変換する能力を少なくとも有するタンパク質である請求項２７記載の製造方法。
  29. 含硫α−ヒドロキシカルボン酸化合物が式（１）：
    Figure 0006460106
    式中、Ｒ１は水素又は置換されていてもよい炭素数１−８のアルキル基を表す；
    で示される化合物であり、含硫α−オキソカルボン酸化合物が、式（２）：
    Figure 0006460106
    式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す；
    で示される化合物であり、含硫L−α−アミノ酸化合物が、式（３）：
    Figure 0006460106
    式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す；
    で示される化合物である、請求項２８記載の製造方法。
  30. α−ヒドロキシカルボン酸化合物がα−ヒドロキシ−イソカプロン酸であり、対応するα−オキソカルボン酸化合物がα−オキソ−イソカプロン酸であり、対応するL−α−アミノ酸化合物がL−ロイシンであり、工程（１）においてα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるタンパク質が、α−ヒドロキシ−イソカプロン酸誘導体を酸化して対応するα−オキソ−イソカプロン酸誘導体に変換する能力を少なくとも有するタンパク質である請求項２７記載の製造方法。
  31. α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質がロイシン脱水素酵素である請求項２７から３０のいずれか一項に記載の製造方法。
  32. α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列が、下記（C1）から（C3）のいずれかのアミノ酸配列：
    （C1）配列番号７で示されるアミノ酸配列、
    （C2）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、または
    （C3）ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列において１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、３６あるいは４０のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、ｉｉ）α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
    である請求項２７から３１のいずれか一項に記載の製造方法。
  33. 工程（１）においてα−ヒドロキシカルボン酸化合物に作用させるタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される請求項２７から３２のいずれか一項に記載の製造方法。
  34. 前記形質転換体が、請求項5、6、７、１３、１４、１５、２２、２３または２４のいずれか一項に記載の形質転換体である請求項３３記載の製造方法。
  35. α−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力を有するタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される請求項２７から３４のいずれか一項に記載の製造方法。
  36. 前記形質転換体が、請求項２２、２３または２４のいずれか一項に記載の形質転換体である請求項３５記載の製造方法。
  37. 工程（１）が、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型に変換する能力を有するタンパク質の存在下で行われる請求項２７から３６のいずれか一項に記載の製造方法。
  38. 還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型に変換する能力を有するタンパク質がα−オキソカルボン酸化合物をアミノ化して対応するL−α−アミノ酸化合物に変換する能力をさらに有するタンパク質である請求項３７記載の製造方法。
  39. 還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型に変換する能力を有するタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される請求項３７または３８記載の製造方法。
  40. 工程（２）が、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質の存在下で行われる請求項２７から３９のいずれか一項に記載の製造方法。
  41. 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質がα−ヒドロキシカルボン酸化合物を酸化して対応するα−オキソカルボン酸化合物に変換する能力をさらに有するタンパク質である請求項４０に記載の製造方法。
  42. 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質が、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体若しくはその処理物に含まれる形態で反応系に提供される請求項４０または４１記載の製造方法。
  43. 工程（１）と工程（２）とが一つの反応系で行われる請求項２７から４２のいずれか一項に記載の製造方法。
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