CN106661571B - 氧化酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了：编码SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列的多核苷酸，具有SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列的蛋白质，以及包含使本发明蛋白质与α‑羟基羧酸化合物作用获得对应的α‑氧代羧酸化合物的步骤（1）、以及使具有将α‑氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L‑α‑氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤（1）中得到的α‑氧代羧酸化合物作用得到对应的L‑α‑氨基酸化合物的步骤的L‑α‑氨基酸化合物的制备方法等。

Description

氧化酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用
技术领域
本发明涉及氧化酶、编码该氧化酶的多核苷酸、以及利用它们的α-氨基酸化合物等的制备方法。
背景技术
α-氨基酸化合物在农林水产领域、食品领域、医疗领域及美容领域等中用于多种用途。例如，甲硫氨酸用作动物用饲料添加剂。在制备该化合物时，使丙烯醛和甲硫醇反应生成3-甲硫基丙醛，再使3-甲硫基丙醛与氢氰酸、氨和二氧化碳反应生成5-（2-甲基-巯基乙基）-乙内酰脲（甲硫氨酸乙内酰脲）。最后，将5-（2-甲基-巯基乙基）-乙内酰脲通过碱水解生成碱金属甲硫氨酸盐，随后通过用酸例如硫酸或碳酸中和使甲硫氨酸游离（例如，参见专利文献1等）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 : 特开昭55-102557号公报。
发明内容
发明要解决的课题
上述制备方法使用氢氰酸和丙烯醛作为C1或C3构成要素，但这些原料化合物的处理需要充分的管理和与其相适合的设备等。因此，期望开发例如甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的新的制备方法。
解决课题的手段
本发明提供下列：
第1项．编码下述（A1）至（A5）中的任一氨基酸序列的多核苷酸（下文也称为本发明多核苷酸(A)）：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A4）i）与由SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（A5）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
第2项．前述第1项记载的多核苷酸，其具有包含以使得编码前述氨基酸序列的核苷酸序列的密码子使用频率匹配大肠杆菌的密码子使用频率的方式选择的密码子的改变的核苷酸序列；
第3项．在宿主细胞内可发挥功能的启动子与前述第1或2项记载的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
第4项．含有前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸的重组载体（下文也称为本发明重组载体(A)）；
第5项．将前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸或前述第4项记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体；
第6项．前述第5项记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌；
第7项．拥有前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸的转化体；
第8项．重组载体的制备方法，其包含在可在宿主细胞内复制的载体中整合前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸的步骤；
第9项．转化体的制备方法，其包含将前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸或前述第4项记载的重组载体导入宿主细胞的步骤；
第10项．编码下述（B1）至（B4）中的任一氨基酸序列的多核苷酸（下文也称为本发明多核苷酸(B)）：
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（B3）i）在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（B4）i）与由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
第11项．在宿主细胞内可发挥功能的启动子与前述第10项记载的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
第12项．含有前述第10或11项记载的多核苷酸的重组载体（下文也称为本发明重组载体(B)）；
第13项．将前述第10或11项记载的多核苷酸或前述第12项记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体；
第14项．前述第13项记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌；
第15项．拥有前述第10或11项记载的多核苷酸的转化体；
第16项．重组载体的制备方法，其包含在可在宿主细胞内复制的载体中整合前述第10或11项记载的多核苷酸的步骤；
第17项．转化体的制备方法，其包含将前述第10或11项记载的多核苷酸或前述第12项记载的重组载体导入宿主细胞的步骤；
第18项．含有前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸和前述第10或11项记载的多核苷酸的重组载体（下文也称为本发明重组载体(AB)）；
第19项．前述第18项记载的重组载体，进一步包含编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸（下文也称为本发明重组载体(ABC)）；
第20项．前述第19项记载的重组载体，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质是亮氨酸脱氢酶；
第21项．前述第19或20项记载的重组载体，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（C1）至（C3）中的任一氨基酸序列：
（C1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（C2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（C3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第22项．将前述第18至21项中任一项记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体；
第23项．前述第22项记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌；
第24项．转化体，其拥有：
i）具有编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
ii）前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸；和
iii）前述第10或11项记载的多核苷酸；
第25项．具有下述（A1）至（A5）中的任一氨基酸序列的蛋白质（下文也称为本发明蛋白质(A)）：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A4）i）与由SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（A5）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
第26项．具有下述（B1）至（B4）中的任一氨基酸序列的蛋白质（下文也称为本发明蛋白质(B)）：
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（B3）i）在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（B4）i）与由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
第27项．L-α-氨基酸化合物的制备方法（下文也称为本发明制备方法），其包含：
（1）使具有下述（A1）至（A5）中任一氨基酸序列的蛋白质和具有下述（B1）至（B4）中的任一氨基酸序列的蛋白质中的任一或两者与α-羟基羧酸化合物作用，得到对应的α-氧代羧酸化合物的步骤：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A4）i）与由SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（A5）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（B3）i）在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（B4）i）与由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
和
（2）使具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤（1）中得到的α-氧代羧酸化合物作用，得到对应的L-α-氨基酸化合物的步骤；
第28项．前述第27项记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是含硫α-羟基羧酸化合物，对应的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物，对应的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物，步骤（1）中与α-羟基羧酸化合物作用的蛋白质是至少具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质；
第29项．前述第28项记载的制备方法，其中：
含硫α-羟基羧酸化合物是式（1）所示化合物：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基；
含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义；
含硫L-α-氨基酸化合物是式（3）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义；
第30项．前述第27项记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是α-羟基-异己酸，对应的α-氧代羧酸化合物是α-氧代-异己酸，对应的L-α-氨基酸化合物是L-亮氨酸，步骤（1）中与α-羟基羧酸化合物作用的蛋白质是至少具有将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力的蛋白质；
第31项．前述第27至30项中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质是亮氨酸脱氢酶；
第32项．前述第27至31项中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（C1）至（C3）中的任一氨基酸序列：
（C1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（C2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（C3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第33项．前述第27至32项中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）中与α-羟基羧酸化合物作用的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第34项．前述第33项记载的制备方法，其中前述转化体是前述第5、6、7、13、14、15、22、23或24项中任一项记载的转化体；
第35项．前述第27至34项中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第36项．前述第35项记载的制备方法，其中前述转化体是前述第22、23或24项中任一项记载的转化体；
第37项．前述第27至36项中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）在具有将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成氧化型的能力的蛋白质的存在下进行；
第38项．前述第37项记载的制备方法，其中具有将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成氧化型的能力的蛋白质是进一步具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质；
第39项．前述第37或38项记载的制备方法，其中具有将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成氧化型的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第40项．前述第27至39项中任一项记载的制备方法，其中步骤（2）在具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质的存在下进行；
第41项．前述第40项记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质是进一步具有将α-羟基羧酸化合物氧化转换成对应的α-氧代羧酸化合物的能力的蛋白质；
第42项．前述第40或41项记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；和
第43项．前述第27至42项中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）和步骤（2）在一个反应体系中进行；
等等。
发明的效果
通过本发明，可提供氧化酶，编码该氧化酶的多核苷酸，及利用它们制备甲硫氨酸、亮氨酸等α-氨基酸化合物的方法等。
具体实施方式
本发明中，作为人工进行氨基酸的改变的手法，例如可以列举，对于编码包含所要改变的氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸实施位点特异性突变导入，然后通过常规方法使该多核苷酸表达的手法。作为位点特异性突变导入方法，例如可以列举Olfert Landt等(Gene96 125-128 1990)、Smith等(Genetic Engineering 3 1 Setlow，J.and Hollaender，APlenum：New York)、Vlasuk等(Experimental Manipulation of Gene Expression，Inouye，M.：Academic Press，New York)、Hos.N.Hunt等(Gene 77 51 1989)等的方法、利用Mutan-Express Km(Takara Bio Inc.制)、TaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit(Takara Bio Inc.制)、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE公司制)等的市售试剂盒的方法。
作为人工进行氨基酸的改变的手法，例如还可以列举对于编码包含所要改变的氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸实施随机突变导入，然后通过常规方法使该多核苷酸表达的手法。在此，作为随机导入突变的手法，例如可以列举，以编码上述氨基酸序列的多核苷酸为模板，使用可扩增该多核苷酸的全长这样的引物对，在令用于底物的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的各自添加浓度与通常发生了改变的反应条件下、或者在使促进聚合酶反应的Mg2＋的浓度较通常增加的反应条件下进行PCR的方法等。作为这样的PCR的手法，可举出例如Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112中记载的方法。
“序列同一性”是指2个氨基酸序列或核苷酸序列间的同一性。前述“序列同一性”是通过对比较对象的序列整个区域以最适状态比对的2个序列进行比较来决定。本文中，比较对象的氨基酸序列或核苷酸序列的最适比对中，可以允许添加或缺失（例如空位等）。这样的序列同一性可以使用，例如，UWGCG Package提供的BESTFIT程序（Devereux et al（1984）Nucleic Acids Research 12， p387-395）、PILEUP、BLAST算法（Altschul S.F.（1993）J Mol Evol 36：290-300； Altschul S.F.（1990）J Mol Biol 215：403-10）等序列分析用工具而算出。序列同一性也可以使用市售的序列解析软件求出。
本发明中，作为目标多核苷酸的供给源的微生物可以由天然分离，还可以从菌株保藏机构购入获得。
作为能够获得这类微生物的菌株保藏机构，可举出例如：下述的菌株保藏机构。
1.IFO（Institute of Fermentation Osaka：财团法人发酵研究所）保藏中心
现在移管于独立行政法人 制品评价技术基础机构 生物遗传资源部门（NBRC）。在获得微生物之际，向NBRC申请购入即可，购入申请时例如可以访问NBRC的主页。
2. ATCC（美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection））
可以通过Summit Pharmaceuticals International ATCC 商业团体获得，购入微生物之际，例如可以访问该团体的主页。也可以从ATCC直接购入微生物。
3. JCM(理化学研究所微生物系统保存设施 (Japan Collection ofMicroorganisms, JCM)
现在移管于独立行政法人理化学研究所生物资源中心 (RIKEN BRC) 微生物材料开发室。获得微生物之际，向该机构申请购入即可，例如可以访问该机构的主页的培养物保藏中心相关的网址。
4.IAM培养物保藏中心
现在，IAM培养物保藏中心保存菌株之中，细菌、酵母、丝状真菌移管于独立行政法人 理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室（JCM），微藻类则移管于独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施（NIES）。获得微生物之际，向这些机构申请购入即可，例如可以访问这些机构的主页的培养物保藏中心相关的网址。
作为为了克隆目标多核苷酸、使探针与染色体DNA或DNA文库杂交的方法，可举出例如：菌落杂交、噬菌斑杂交，可以根据制备文库所用的载体的种类选择方法。
在使用的文库是使用质粒载体制备的情形中，可以利用菌落杂交。具体地，通过将文库DNA导入宿主微生物获得转化体，稀释所得转化体后，将该稀释物接种于琼脂培养基上，培养直至菌落出现。
在使用的文库是使用噬菌体载体制备的情形中，可以利用噬菌斑杂交。具体地，将宿主微生物和文库噬菌体在能够感染的条件下混合，进而混合软琼脂培养基后，将该混合物接种于琼脂培养基上，培养直至噬菌斑出现。
在上述任一杂交的情形中，均在进行了上述培养的琼脂培养基上设置膜，使转化体或噬菌体吸附/转印于该膜。将该膜进行碱处理后，进行中和处理，接着进行将DNA固定于该膜的处理。更具体地，例如，在噬菌斑杂交的情形中，在前述琼脂培养基上设置硝基纤维素膜或尼龙膜（例如，Hybond-N+（GE Healthcare 公司商标）），静置约1分钟使噬菌体粒子吸附/转印于膜。接着，将该膜在碱溶液（例如1.5M氯化钠、0.5M氢氧化钠）中浸渍约3分钟使噬菌体粒子溶解，由此使噬菌体DNA洗脱至膜上，然后在中和溶液（例如，1.5M氯化钠、0.5MTris-盐酸缓冲溶液pH7.5）中浸渍约5分钟。接着将该膜用清洗液（例如，0.3M氯化钠、30mM柠檬酸、0.2MTris-盐酸缓冲液pH7.5）清洗约5分钟，然后在例如约80℃加热约90分钟，由此将噬菌体DNA固定于膜。
使用如此制备的膜，进行探针的杂交。杂交可以基于例如，J.Sambrook,E.F.Frisch, T.Maniatis著“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）” Cold Spring Harbor Laboratory Press等的记载进行。
用于探针的DNA可以是利用放射性同位素标记的DNA，也可以是用荧光色素标记的DNA。
作为将用于探针的DNA通过放射性同位素标记的方法，可举出例如：通过利用Random Primer DNA Labeling Kit（Takara Bio Inc.制）等，将PCR反应液中的dCTP替换为（α-32P）dCTP，以用于探针的DNA为模板进行PCR的方法。
在将用于探针的DNA以荧光色素标记的情形中，可以使用例如，ECL DirectNucleic Acid Labeling and Detection System（GE Healthcare 公司制）等。
杂交例如可以如下所述进行。
按照每1cm2如上所述制备的膜为50至200μl的比例，准备含有450至900mM的氯化钠和45至90mM的柠檬酸钠、以0.1至1.0重量%的浓度含有十二烷基硫酸钠（SDS）、以0至200μl/ml的浓度含有变性的非特异性DNA、视情况可以以各自0至0.2重量%的浓度含有白蛋白、聚蔗糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮等的预杂交液（优选为含有900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠、1.0重量%的SDS和100μl/ml的变性Calf-thymusDNA的预杂交液），将前述膜浸渍于该预杂交液中，在42至65℃保温1至4小时。
接着，按照每1cm2膜为50至200μl的比例准备下述溶液，该溶液混合了例如含有450至900mM的氯化钠和45至90mM的柠檬酸钠、以0.1至1.0重量%的浓度含有SDS、以0至200μg/ml的浓度含有变性的非特异性DNA、视情况可以以各自0至0.2重量%的浓度含有白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等的杂交溶液（优选为含有900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠、1.0重量%的SDS和100μg/ml的变性Calf-thymusDNA的杂交溶液）以及通过前述方法制得的探针（相当于每1cm2膜为1.0×104至2.0×106cpm的量），浸渍于该杂交溶液中，在42至65℃保温12至20小时。
该杂交后将膜取出，使用含有15至300mM的氯化钠、1.5至30mM的柠檬酸钠和0.1至1.0重量%的SDS等的42至65℃的清洗液（优选为含有15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠和1.0重量%的SDS的65℃的清洗液）等进行清洗。将清洗后的膜用2×SSC（300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠）轻轻漂洗后，进行干燥。将该膜供给例如放射自显影等检测膜上探针的位置，由此在原始琼脂培养基上鉴定相当于与所用探针杂交的DNA的膜上位置的克隆，通过对其进行钓菌，分离具有该DNA的克隆。
培养如此得到的克隆，可以由所得培养菌体制备目标多核苷酸。
为了在宿主细胞中表达目标多核苷酸，例如，制备在宿主细胞内可发挥功能的启动子和前述多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，将其导入宿主细胞。
本文中，“以可发挥功能的形式连接而成”意指通过将目标多核苷酸导入宿主细胞来转化宿主细胞时，该多核苷酸处于以在启动子的控制下表达的方式与启动子结合的状态。
作为在微生物中可发挥功能的启动子，可举出：大肠杆菌乳糖操纵子的启动子、大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子或T7噬菌体的启动子、或者tac启动子、trc启动子或T7lac启动子等在大肠杆菌内可发挥功能的合成启动子等。
通过将目标多核苷酸、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和前述多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸整合到载体，可以制备重组载体。作为所使用的载体，可举出例如：包含能够在宿主细胞中复制的遗传信息，可以自主增殖，能够从宿主细胞分离、纯化，编码可检测标记的载体。作为可在宿主细胞为大肠杆菌时利用的载体，可举出：pUC119（Takara Bio Inc.制）、pTV118N（Takara Bio Inc.制）、pBluescriptII （东洋纺公司制）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen公司制）、pTrc99A（GE Healthcare 公司制）、pKK223-3（GEHealthcare 公司制）、pET-22b（Novagen公司制）、pET-15b（Novagen公司制）等。作为载体，若使用包含选择标记基因（例如，卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等赋予抗生素抗性的基因等）的载体，则可以将该选择标记基因的表型等作为指标选择导入了该载体的转化体。
本发明中所使用的转化体可以通过将目标多核苷酸、在宿主细胞内可发挥功能的启动子和前述多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸、或含有这些多核苷酸的重组载体导入宿主细胞来制备。
作为宿主细胞，可举出例如：属于埃希氏菌（Escherichia）属、芽孢杆菌（Bacillus）属、棒状杆菌（Corynebacterium）属、葡萄球菌（Staphylococcus）属、链霉菌（Streptomyces）属、酵母菌（Saccharomyces）属、克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）属、毕赤酵母（Pichia）属、红球菌（Rhodococcus）属和曲霉菌（Aspergillus）属的微生物等。
作为将多核苷酸或重组载体导入宿主细胞的方法，可对应于所用宿主细胞适用通常所使用的导入方法，可举出例如：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ndedition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、“Current Protocols inMolecular Biology”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中记载的氯化钙法、“Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System” Bio-Rad Laboratories, (1993)等中记载的电穿孔法等。
导入了目标多核苷酸或重组载体等的转化体例如可以以如上所述载体中所含的选择标记基因的表型作为指标来挑选。
例如，基于“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition”（1989）,Cold Spring Harbor Laboratory Press等中记载的通常的方法，通过进行限制性酶切位点的确认、核苷酸序列的解析、DNA印迹杂交（Southern hybridization）、蛋白质印迹杂交（Western hybridization）等，可以确认所得转化体拥有目标多核苷酸。
作为用于培养本发明中使用的转化体的培养基，可以使用例如：适宜含有微生物等宿主细胞的培养中所通常使用的碳源、氮源、有机盐、无机盐等的各种培养基。
作为碳源，可举出例如：葡萄糖、糊精、蔗糖等糖类，甘油等糖醇，富马酸、柠檬酸、丙酮酸等有机酸，动物油、植物油和糖蜜。这些碳源在培养基中的添加量相对于培养液通常为0.1至30%（w/v）左右。
作为氮源，可举出例如：肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、大豆粉、玉米浆（Corn Steep Liquor）、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等天然有机氮源，氨基酸类、硝酸钠等无机酸的钠盐，氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等无机酸的铵盐，富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸的铵盐以及尿素。它们之中，有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸类等在许多情形中也可作为碳源使用。这些氮源在培养基中的添加量相对于培养液通常为0.1至30%（w/v）左右。
作为有机盐、无机盐，可举出例如：钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌等的氯化物、硫酸盐、乙酸盐、碳酸盐和磷酸盐。具体可举出例如：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。这些有机盐和/或无机盐在培养基中的添加量相对于培养液通常为0.0001至5%（w/v）左右。
在导入tac启动子、trc启动子、T7lac启动子和lac启动子等由异乳糖诱导的类型的启动子和编码目标蛋白质的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸所得的转化体的情形中，还可以向培养基中少量添加例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为用于诱导目标蛋白质产生的诱导剂。在整合了受lacUV5启动子支配的T7 RNA聚合酶基因的噬菌体DE3的溶原菌（λDE3 lysogen）中，导入T7噬菌体启动子和编码目标蛋白质的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，并培养所得转化体的情形中，也可以在培养基中少量添加IPTG作为用于诱导目标蛋白质产生的诱导剂。
转化体的培养可以基于微生物等宿主细胞的培养所通常使用的方法来进行，可举出例如：试管振荡式培养、往复式振荡培养、小型发酵罐（Jar Fermenter）培养、罐（tank）培养等液体培养和固体培养。
培养温度可以在该转化体能够生长的范围适宜改变，通常为约15℃至约40℃。培养基的pH优选为约6至约8的范围。培养时间根据培养条件而不同，但通常优选为约1天至约5天。
作为从拥有编码目标蛋白质的多核苷酸并产生该目标蛋白质的转化体，例如，将编码目标蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体的培养物纯化目标蛋白质的方法，可以适用蛋白质纯化中所使用的通常的方法，例如，可举出如下所述的方法。
通过离心分离等从转化体的培养物收集细胞后，将其通过超声处理、DYNO MILL处理、弗氏压碎器处理等物理破碎法、或者使用表面活性剂或溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶的化学破碎法等进行破碎。通过离心分离、膜滤器过滤等从所得破碎液除去杂质，由此制备无细胞提取液，将其通过适宜使用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、金属螯合色谱、亲和色谱等分离纯化方法进行分级，可以纯化目标蛋白质。
作为色谱中所使用的载体，可举出例如：导入了羧甲基（CM）基团、二乙基氨基乙基（DEAE）基团、苯基或丁基的纤维素、糊精或琼脂糖等不溶性高分子载体。也可以使用市售的载体预填充柱，作为该市售的载体预填充柱，可举出例如：Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名，均为GE Healthcare公司制）、TSK-gel G3000SW（商品名，Tosoh公司制）等。
在目标蛋白质是在其氨基酸末端或羧基末端区域添加了连续数个残基的组氨酸的蛋白质时，可以使用金属螯合亲和柱来纯化该蛋白质。在目标蛋白质是以与谷胱甘肽S-转移酶融合的蛋白质的形式产生时，可以使用谷胱甘肽S-转移酶单克隆抗体柱对其进行纯化。
作为本发明中所使用的“转化体的处理物”，可举出例如：冻干转化体、有机溶剂处理转化体、干燥转化体、转化体磨碎物、转化体的自溶物、转化体的超声处理物、转化体提取物、转化体的碱处理物。作为转化体提取物，可举出无细胞提取液、由转化体制备的粗纯化蛋白质或纯化蛋白质、以及它们的固定化物。作为得到固定化物的方法，可举出例如：载体结合法（使目标蛋白质等吸附于硅胶、陶瓷等无机载体、纤维素、或离子交换树脂等的方法）和包含法（将目标蛋白质等拘束于聚丙烯酰胺、含硫多糖凝胶（例如角叉菜胶凝胶）、海藻酸凝胶、或琼脂凝胶等高分子的网孔结构之中的方法）。
若考虑使用了转化体的工业生产，则相较于使用存活转化体，使用杀死该转化体得到的处理物在制造设备限制少的方面是优选的。作为转化体的杀死处理方法，可举出例如：物理杀菌法（加热、干燥、冷冻、光线、超声、过滤、通电），使用化学药品的杀菌法（碱、酸、卤素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰(シアン)和抗生素）。通常，这些杀菌法之中，理想的是选择尽量不使目标蛋白质的酶活性失活、并且在反应体系中的残留、污染等影响少的处理方法。
本发明多核苷酸(A)编码下述(A1)至(A5)中的任一氨基酸序列：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（A4）i）与由SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（A5）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列。
本发明蛋白质(A)具有上述(A1)至(A5)中的任一氨基酸序列。
在本发明多核苷酸(A)编码的氨基酸序列或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列中，与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列之间可观察到的区别是一部分氨基酸的缺失、置换或添加等（以下，有时统称为氨基酸的改变）。前述“添加”不仅包括氨基酸在序列端部的添加，而且还包括氨基酸在序列中的插入。作为该氨基酸的改变，可举出例如：(a)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白质在细胞内受到的加工所致的缺失、(b)前述蛋白质由于来源生物的种类差异、个体差异等而天然产生的基因突变所造成的氨基酸的缺失、置换或添加、或者(c)由于人工导入的基因突变等而产生的氨基酸的缺失、置换或添加。
对于改变氨基酸的数目，只要是在以下范围内的数目即可：具有发生改变的上述氨基酸序列的蛋白质可以发挥与改变前的蛋白质相同的能力、即将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者。
作为本发明多核苷酸(A)所编码的氨基酸序列的(A3)或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列的(A3)中的“多个氨基酸”，例如可以列举2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、35、40、45或48个氨基酸。
作为氨基酸的置换，可举出例如：保守性置换为疏水性、电荷、pK、立体结构上的特征等类似的氨基酸。作为这样的置换，具体可举出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、(4)丝氨酸、苏氨酸；(5)赖氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等组内的置换。
作为氨基酸的添加，可举出例如：在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含连续6个残基左右的组氨酸的7个残基左右至25个残基左右的氨基酸的添加。更具体而言，可以列举：在蛋白质的氨基酸序列的氨基末端的、SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的添加，在蛋白质的氨基酸序列的羧基末端的、SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的添加。
作为本发明多核苷酸(A)所编码的氨基酸序列的(A2)或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列的(A2)中的“85%以上的序列同一性”，例如可以列举85、90、95、98或99%以上的序列同一性。
本发明多核苷酸(A)所编码的氨基酸序列或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列中，“与由SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸”是指，例如，在“克隆和序列”(渡边格监修、杉浦昌弘编集、1989年、农村文化社发行）等中记载的DNA印迹杂交法中，在（1）高离子浓度下［可举出例如：6XSSC（900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠）］，在65℃杂交从而与由SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸通过碱基配对形成杂交体，在（2）低离子浓度下［可举出例如：0.1 X SSC（15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠）］，在65℃保温30分钟后该杂交体也能够维持的多核苷酸。
作为上述的多核苷酸，具体而言，可以列举：具有SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列的多核苷酸；具有在SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列中缺失、置换或添加了其一部分核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸；或者具有与SEQ ID NO:4或13所示的核苷酸序列具有90%、95%、98%或99%以上的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明多核苷酸(A)所编码的氨基酸序列的(A5)或者本发明蛋白质(A)的氨基酸序列的(A5)的具体例列举如下：
(A5-1) i)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸的改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列V109I)；
(A5-2) i)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸的改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列G191D)；
(A5-3) i) 在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列Q246R)；
(A5-4) i) 在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸以及第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸的改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列V109I/G191D)；
(A5-5) i) 在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸以及第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列V109I/Q246R)；
(A5-6) i) 在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸以及第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列G191D/Q246R)；和
(A5-7) i) 在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸以及第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸改变的(altered)氨基酸序列，且ii)具有将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列(以下，有时也称为改变氨基酸序列V109I/G191D/Q246R)。
作为改变氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的具体例，可以列举SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。作为编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列，可以列举SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
本发明多核苷酸(A)可以是从自然界存在的DNA中克隆得到的多核苷酸，也可以是在该克隆得到的多核苷酸的核苷酸序列中人工导入其一部分核苷酸的缺失、置换或添加而成的多核苷酸，也可以是化学合成而得的多核苷酸。
本发明多核苷酸(A)例如可以从具有将α-羟基羧酸氧化为对应的α-氧代羧酸的能力的微生物、具体而言反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株等属于无色杆菌属的微生物得到。
例如，从反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)等属于无色杆菌属的微生物等按照通常的基因工程方法(例如，“新 细胞工程实验手则”(东京大学医科学研究所制癌研究部编、秀润社、1993年)中记载的方法)制备DNA文库，以制备的DNA文库作为模板，且使用适当的引物进行PCR，由此可以扩增编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸、编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸、或者具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的多核苷酸等，并制备本发明多核苷酸(A)。
在上述PCR中所用的引物的5’末端侧或3’末端侧或这两者中，可以添加限制酶识别序列等。
例如，以上述DNA文库为模板，并且将具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的寡核苷酸与具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR，由此可以扩增由SEQID NO:4所示核苷酸序列组成的多核苷酸。
作为上述PCR的条件，例如可以列举以下条件：将混合了4种dNTP各20μM、2种寡核苷酸引物各15pmol、Taq聚合酶1.3U以及作为模板的DNA文库的反应液在94℃保温2分钟后，进行10次在94℃10秒钟、然后在65℃30秒钟、然后在72℃90秒钟的保温循环，接着，进行20次在94℃10秒钟、然后在65℃30秒钟、然后在72℃1分钟和5秒钟的保温循环，进一步在72℃保持7分钟。
以上述DNA文库作为模板，将具有选自编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的寡核苷酸(例如，由编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端的约14个核苷酸以上的核苷酸序列组成的寡核苷酸)以及由DNA文库构建中所用载体的DNA插入部位附近的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的约14个核苷酸以上的寡核苷酸用作引物，进行PCR，由此也可以扩增具有编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸、具有编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸等，并制备本发明多核苷酸(A)。
本发明多核苷酸(A)也可如下获得，例如，对于插入微生物或噬菌体来源的载体的DNA文库，以由具有选自编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的约15个核苷酸以上的核苷酸序列组成的DNA作为探针，使之在上述条件下进行杂交，检测该探针特异性结合的DNA而获得。
本发明多核苷酸(A)也可以基于其核苷酸序列，按照例如亚磷酸三酯法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，进行具有目标核苷酸序列的核酸的化学合成来制备。
作为编码上述(A1)至(A5)中的任一氨基酸序列的密码子，以匹配大肠杆菌中的密码子使用频率的方式选择密码子，由此设计核苷酸序列，通过化学合成由所设计核苷酸序列组成的多核苷酸，也可以制备本发明多核苷酸(A)。
具体地，例如，以近似于进行表达的微生物细胞（例如，大肠杆菌）中的密码子使用频率的密码子使用频率的方式，选择与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列所包含的各氨基酸对应的密码子，设计编码目标氨基酸序列的核苷酸序列。大肠杆菌等中的密码子使用频率的信息例如可以利用本领域技术人员公知的DNA数据库(GenBank、EMBL、DDBJ等)而获得。
以下，示出具体步骤。
求出目标氨基酸序列所含的各氨基酸的个数。以与表达多核苷酸的微生物细胞的密码子的平均出现频率最接近的方式，对上述求出的个数的氨基酸分配使用的密码子。以同一密码子尽量不连续的方式，编辑各密码子的使用顺序。从N末端侧的氨基酸开始依次按照对各氨基酸所确定的顺序选择密码子，预定为该氨基酸残基的密码子。重复这些步骤，预定直至C末端的全部氨基酸的密码子，最后配置终止密码子。对于由预定密码子组成的核苷酸序列，确认不存在在微生物细胞中阻碍基因转录的核苷酸序列、后续操作中使用的限制酶识别的核苷酸序列。这类核苷酸序列存在时，将该核苷酸序列所涉及的密码子与其它部分使用的密码子进行交换。在设计这种核苷酸序列之际，为了后续操作，优选预先将适当的限制酶识别的核苷酸序列添加于5’末端侧和3’末端侧。
具有如此设计的核苷酸序列的多核苷酸的合成可以使用利用PCR的长链DNA合成法进行（细胞工学别册，植物细胞工学系列7“植物的PCR实验规程”，95-100页、岛本巧・佐佐木卓治编辑秀润社、1997年7月1日刊行）（以下，有时将本方法记为Assembly PCR法）。该方法中，仅使用长的合成寡核苷酸引物合成DNA。引物对以引物的各自3’末端具有约10bp至约12bp的互补链或重叠的方式而合成，以彼此的引物作为模板进行DNA合成。作为引物的全长，可举出例如：约60mer至约100mer等。优选可举出例如：约80mer至约100mer等。
将这些寡核苷酸引物依次通过PCR反应结合，由此得到具有目标核苷酸序列的DNA。所得DNA按照常规方法导入克隆载体，进行克隆。所得克隆的核苷酸序列通过DNA测序仪来确认，确认得到了具有目标核苷酸序列的多核苷酸。如此可以人工合成例如具有SEQID NO:13所示的核苷酸序列的多核苷酸，得到本发明多核苷酸(A)。
本发明多核苷酸(B)编码下述(B1)至(B4)中的任一氨基酸序列：
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、
（B3）i）在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列、或
（B4）i）与由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列。
本发明蛋白质(B)具有上述(B1)至(B4)中的任一氨基酸序列。
本发明多核苷酸(B)编码的氨基酸序列或本发明蛋白质(B)的氨基酸序列中，在与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列之间可观察到的区别是一部分氨基酸的缺失、置换或添加等(以下，有时也统称为氨基酸的改变)。前述“添加”不仅包括氨基酸在序列端部的添加，也包括氨基酸在序列中的插入。作为该氨基酸的改变，可举出例如：(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质在细胞内受到的加工所致的缺失，(b)由于前述蛋白质的来源生物的种类差异、个体差异等而天然产生的基因突变导致的氨基酸的缺失、置换或添加，或(c)由于人工导入的基因突变等而产生的氨基酸的缺失、置换或添加。
对于所改变的氨基酸的数目，只要是在以下范围内的数目即可：具有发生改变的上述氨基酸序列的蛋白质可以发挥与改变前的蛋白质相同的能力、即将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和将α-羟基-异己酸衍生物氧化转换成对应的α-氧代-异己酸衍生物的能力中的任一或两者。
作为本发明多核苷酸(B)所编码的氨基酸序列的(B3)或本发明蛋白质(B)的氨基酸序列的(B3)中的“多个氨基酸”，例如可以列举2、3、4、5、6、7、8、10、12、15或17个氨基酸。
作为氨基酸的置换，可举出例如：保守性置换为疏水性、电荷、pK、立体结构上的特征等类似的氨基酸。作为这样的置换，具体可举出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(4)丝氨酸、苏氨酸；(5)赖氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等组内的置换。
作为氨基酸的添加，可举出例如：在蛋白质的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含连续6个残基左右的组氨酸的7个残基左右至25个残基左右的氨基酸的添加。更具体而言，可以列举：在蛋白质的氨基酸序列的氨基末端的、SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的添加，在蛋白质的氨基酸序列的羧基末端的、SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的添加。
作为本发明多核苷酸(B)所编码的氨基酸序列的(B2)或本发明蛋白质(B)的氨基酸序列的(B2)中的“95%以上的序列同一性”，例如可以列举95、98或99%以上的序列同一性。
本发明多核苷酸(B)所编码的氨基酸序列或本发明蛋白质(B)的氨基酸序列中，“与由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸”是指，例如，在“克隆和序列”(渡边格监修、杉浦昌弘编集、1989年、农村文化社发行)等中记载的DNA印迹杂交法中，在（1）高离子浓度下［可举出例如：6XSSC（900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠）］，在65℃杂交从而与由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸通过碱基配对形成杂交体，(2)在低离子浓度下[可举出例如：0.1 X SSC（15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠）］，在65℃保温30分钟后该杂交体也能够维持的多核苷酸。
作为上述多核苷酸，具体可举出：具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸；具有在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中缺失、置换或添加了其一部分核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸；或者具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有95%、98%或99%以上的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明多核苷酸(B)可以是从自然界存在的DNA之中克隆得到的多核苷酸，也可以是该克隆得到的多核苷酸的核苷酸序列中人工导入其一部分核苷酸的缺失、置换或添加而成的多核苷酸，还可以是化学合成得到的多核苷酸。
本发明多核苷酸(B)可以由例如具有将α-羟基羧酸氧化为对应的α-氧代羧酸的能力的微生物，具体由反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）ATCC55564株等属于无色杆菌属的微生物得到。
例如，由反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）等属于无色杆菌属的微生物等，基于通常的基因工程手法（例如，“新 细胞工学实验规程”（东京大学医科学研究所制癌研究部编、秀润社、1993年）中记载的方法），制备DNA文库，将制备的DNA文库作为模板，并且使用适合的引物进行PCR，由此可以扩增编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多核苷酸、编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸、或具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸等，并制备本发明多核苷酸(B)。
在上述PCR中所用的引物的5’末端侧或3’末端侧或这两者中，可以添加限制酶识别序列等。
例如，以上述DNA文库为模板，并且将具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的寡核苷酸与具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR，由此可以扩增由SEQID NO:2所示核苷酸序列组成的多核苷酸。
作为上述PCR的条件，例如可以列举以下条件：将混合了4种dNTP各20μM、2种寡核苷酸引物各15pmol、Taq聚合酶1.3U以及作为模板的DNA文库的反应液在94℃保温2分钟后，进行10次在94℃10秒钟、然后在65℃30秒钟、然后在72℃90秒钟的保温循环，接着，进行20次在94℃10秒钟、然后在65℃30秒钟、然后在72℃1分钟和5秒钟的保温循环，进一步在72℃保持7分钟。
以上述DNA文库作为模板，将具有选自编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的寡核苷酸(例如，由编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端的约14个核苷酸以上的核苷酸序列组成的寡核苷酸)以及由DNA文库构建中所用载体的DNA插入部位附近的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的约14个核苷酸以上的寡核苷酸用作引物，进行PCR，由此也可以扩增具有编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸、具有编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸等，并制备本发明多核苷酸(B)。
本发明多核苷酸(B)也可如下获得，例如，对于插入微生物或噬菌体来源的载体的DNA文库，以由具有选自编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的约15个核苷酸以上的核苷酸序列组成的DNA作为探针，使之在上述条件下进行杂交，检测该探针特异性结合的DNA而获得。
本发明多核苷酸(B)也可以基于其核苷酸序列，按照例如亚磷酸三酯法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，进行具有目标核苷酸序列的核酸的化学合成来制备。
作为编码上述(B1)至(B4)中的任一氨基酸序列的密码子，以匹配大肠杆菌中的密码子使用频率的方式选择密码子，由此设计核苷酸序列，通过化学合成由所设计核苷酸序列组成的多核苷酸，也可以制备本发明多核苷酸(B)。
具体地，例如，以近似于进行表达的微生物细胞（例如，大肠杆菌）中的密码子使用频率的密码子使用频率的方式，选择与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所包含的各氨基酸对应的密码子，设计编码目标氨基酸序列的核苷酸序列。
如上所述制备的多核苷酸可以基于“Molecular Cloning: A Laboratory Manual2nd edition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、“Current Protocols inMolecular Biology”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中记载的方法克隆到载体。
如上所述制备的多核苷酸的核苷酸序列可以通过F.Sanger, S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467页等中记载的双脱氧链终止方法等进行解析。在用于核苷酸序列分析的试样制备中，可以使用例如，Perkin Elmer公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit等市售的试剂。
如上所述制备的多核苷酸编码具有将α-羟基羧酸(例如，2-羟基-4-(甲硫基)丁酸或α-羟基-异己酸)氧化转换成对应的α-氧代羧酸(例如，2-氧代-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代-异己酸)的能力的蛋白质的氨基酸序列的确认例如可以如下进行。
将如上所述得到的多核苷酸以连接于在宿主细胞内可发挥功能的启动子的下游的方式插入载体，将所得重组载体导入宿主细胞获得转化体。将所得转化体的培养物与α-羟基羧酸（例如，2-羟基-4-(甲硫基)丁酸或α-羟基-异己酸)作用。通过分析反应产物中的对应α-氧代羧酸(例如，2-氧代-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代-异己酸)的量，可以确认得到的多核苷酸编码具有目标能力的蛋白质的氨基酸序列。
为了使本发明多核苷酸(A)或本发明多核苷酸(B)在宿主细胞中表达，例如制备在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)或本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，将其导入宿主细胞。
作为在微生物中可发挥功能的启动子，可举出如上所述的在大肠杆菌内可发挥功能的合成启动子等。也可以利用在反硝化无色杆菌中控制本发明多核苷酸(A)或本发明多核苷酸(B)的表达的启动子。
将本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸整合至载体中，由此可以制备本发明重组载体(A)。
将本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸整合至载体中，由此可以制备本发明重组载体(B)。
将下列多核苷酸整合至载体中，由此可以制备本发明重组载体(AB)：
i)本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
ii)本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
本发明重组载体(AB)还可以包含编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质(以下，有时记为本蛋白质(C))的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
例如，将下列多核苷酸整合至载体中，由此可以制备本发明重组载体(ABC)：
a)本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
b)本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
以及
c)编码本蛋白质(C)的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
作为具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质，可以举出氨基酸脱氢酶、转氨酶。作为氨基酸脱氢酶，具体而言，可以举出丙氨酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶，可以优选地举出亮氨酸脱氢酶。
作为具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的上述蛋白质，更具体地，可举出：Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23(2003) 239-247中记载的来自球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus） IFO3525株的亮氨酸脱氢酶、和具有前述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列中第113位的丙氨酸被改变为甘氨酸的氨基酸序列的蛋白质。
SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列是Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247中记载的来自球形芽孢杆菌 IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列是在SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列中第113位的丙氨酸被改变为甘氨酸的氨基酸序列。
作为具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列，具体而言，还可以举出下述(C1)至(C3)中的任一氨基酸序列：
（C1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
（C2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（C3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
在本蛋白质(C)的上述氨基酸序列中，与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列之间可观察到的区别是一部分氨基酸的缺失、置换或添加等。前述“添加”不仅包括氨基酸在序列端部的添加，而且还包括氨基酸在序列中的插入。作为该氨基酸的改变，可举出例如：(a)具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的蛋白质在细胞内受到的加工所致的缺失、(b)前述蛋白质由于来源生物的种类差异、个体差异等而天然产生的基因突变所造成的氨基酸的缺失、置换或添加、或者(c)由于人工导入的基因突变等而产生的氨基酸的缺失、置换或添加。
对于改变氨基酸的数目，只要是在以下范围内的数目即可：具有发生改变的上述氨基酸序列的蛋白质可以发挥将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力。作为本蛋白质(C)的上述氨基酸序列的(C3)中的“多个氨基酸”，可以举出例如2、3、4、5、6、7、10、15、18、20、25、30、35、36或40个氨基酸。
作为氨基酸的置换，可举出例如：保守性置换为疏水性、电荷、pK、立体结构上的特征等类似的氨基酸。作为这样的置换，具体可举出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(4)丝氨酸、苏氨酸；(5)赖氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等组内的置换。
作为氨基酸的添加，可举出例如：在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含连续6个残基左右的组氨酸的约20个残基的氨基酸的添加。更具体而言，可以列举：在蛋白质的氨基酸序列的氨基末端的、SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的添加，在蛋白质的氨基酸序列的羧基末端的、SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的添加。
作为本蛋白质(C)的上述氨基酸序列的(C2)中的“90%以上的序列同一性”，可以举出例如90、95、98或99%以上的序列同一性。
编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸（以下，有时也记为本多核苷酸(C)）可以从例如具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的微生物、例如球形芽孢杆菌 IFO3525株等属于芽孢杆菌属的微生物得到。
基于通常的基因工程手法由球形芽孢杆菌 IFO3525株等属于芽孢杆菌属的微生物等制备DNA文库，以制备的DNA文库为模板，并且使用适合的引物进行PCR，由此可以扩增编码SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的多核苷酸、或编码SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸等而制备本多核苷酸(C)。
例如，作为具有编码SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸的扩增用引物，合成具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的寡核苷酸。作为用于将SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的第113位的丙氨酸改变为甘氨酸的突变导入用引物，合成具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
以上述DNA文库为模板，使用具有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，由此扩增具有SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸。将扩增得到的多核苷酸整合至载体，得到含有具有SEQ IDNO:43所示核苷酸序列的多核苷酸的重组载体。以所得重组载体为模板，使用具有SEQ IDNO:16所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，将所得PCR产物用Dpn I处理，然后导入大肠杆菌。分析所得转化体拥有的重组载体的核苷酸序列，得到编码导入了目标氨基酸突变的氨基酸序列、即SEQ ID NO:42所示氨基酸序列中第113位的丙氨酸被置换为甘氨酸的氨基酸序列（SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列）的多核苷酸。作为编码SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的核苷酸序列，可举出SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列。
本多核苷酸(C)可以基于其核苷酸序列，按照例如亚磷酸三酯法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，进行具有目标核苷酸序列的核酸的化学合成来制备。
作为编码上述(C1)至(C3)中任一氨基酸序列的密码子，以匹配大肠杆菌中的密码子使用频率的方式选择密码子，由此设计核苷酸序列，通过化学合成由所设计核苷酸序列组成的多核苷酸，也可以制备本多核苷酸(C)。
为了使本多核苷酸(C)在宿主细胞中表达，例如，制备在宿主细胞中可发挥功能的启动子与本多核苷酸(C)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，将其导入宿主细胞。
作为在微生物中可发挥功能的启动子，可举出如上所述的在大肠杆菌内可发挥功能的合成启动子等。也可以利用在球形芽孢杆菌等属于芽孢杆菌属的微生物中控制本多核苷酸(C)的表达的启动子。
如上所述制备的多核苷酸编码具有将α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代-异己酸)氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物(例如L-甲硫氨酸或L-亮氨酸)的能力的蛋白质的氨基酸序列的确认可以例如如下进行。
将如上所述得到的多核苷酸以连接于在宿主细胞内可发挥功能的启动子的下游的方式插入载体，将所得重组载体导入宿主细胞获得转化体。将所得转化体的培养物与α-氧代羧酸（例如，2-氧代-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代-异己酸)作用。分析反应产物中的对应L-α-氨基酸（例如，L-甲硫氨酸或L-亮氨酸)的量，由此可以确认所得多核苷酸编码具有目标能力的蛋白质的氨基酸序列。
将本发明多核苷酸(A)、本发明多核苷酸(B)或本多核苷酸(C)、或者含有这些多核苷酸中的一种以上的重组载体导入宿主细胞，由此可以制备转化体。
作为宿主细胞，可以举出例如属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属、链霉菌属、酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红球菌属和曲霉属的微生物等。
如上所述操作，通过将本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸导入宿主细胞，可以得到拥有本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸的转化体。作为该转化体，可举出：将外源的上述多核苷酸导入宿主细胞的染色体而成的转化体，即，染色体上拥有外源的上述多核苷酸的转化体。
通过将本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸导入宿主细胞，可以得到拥有本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸的转化体。作为该转化体，可举出：将外源的上述多核苷酸导入宿主细胞的染色体而成的转化体，即，染色体上拥有外源的上述多核苷酸的转化体。
如上所述操作，通过将
a)本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
b)本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
以及
c)编码本蛋白质(C)的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
导入宿主细胞，可以获得拥有下述多核苷酸的转化体：
a)本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
b)本发明多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
以及
c)编码本蛋白质(C)的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
上述a)的多核苷酸、b)的多核苷酸和c)的多核苷酸可以分别整合至不同的载体导入宿主细胞，也可以将其中一种以上整合至相同的载体上导入宿主细胞。在一种以上多核苷酸整合至单一载体的情形中，例如，可以将启动子、终止子等的参与表达控制的区域与目标多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使目标多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有上述a)的多核苷酸、b)的多核苷酸和c)的多核苷酸中的任一、或者它们中的一种以上。
本发明蛋白质(A)可以通过例如培养拥有本发明多核苷酸(A)的转化体而表达本发明蛋白质(A)来制备。
本发明蛋白质(B)可以通过例如培养拥有本发明多核苷酸(B)的转化体而表达本发明蛋白质(B)来制备。
本蛋白质(C)可以通过例如培养拥有本多核苷酸(C)的转化体而表达本蛋白质(C)来制备。
作为从拥有本发明多核苷酸(A)、本发明多核苷酸(B)或本多核苷酸(C)的转化体的培养物纯化本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)或本蛋白质(C)的方法，可以适用蛋白质纯化中所使用的通常的方法。
包含本发明蛋白质(A)的级分和包含本发明蛋白质(B)的级分例如可以以将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸氧化优先地生产2-氧代-4-(甲硫基)丁酸的能力、或将α-羟基-异己酸氧化优先地生产α-氧代-异己酸的能力为指标进行挑选。
包含本蛋白质(C)的级分例如可以以将2-氧代-4-(甲硫基)丁酸氨基化优先地生产L-甲硫氨酸的能力、或将α-氧代-异己酸氨基化优先地生产L-亮氨酸的能力为指标进行挑选。
本发明制备方法是L-α-氨基酸化合物的制备方法，其包括：
(1)使本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)中的任一或两者与α-羟基羧酸化合物作用，得到对应的α-氧代羧酸化合物的步骤；和
(2)使具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤(1)中得到的α-氧代羧酸化合物作用，得到对应的L-α-氨基酸化合物的步骤。
作为上述α-羟基羧酸化合物，可以举出式(4)所示的α-羟基羧酸：
R2-CH(OH)COOH (4)
式中，R2为氢；或者碳原子数为1-10的直链状、支链状或环式的烷基；或者具有为取代基的酰胺基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、单烷基酰胺基、二烷基酰胺基、烷氧基、烷硫基、羟基、巯基、羧基或烷氧基羰基的碳原子数为1-10的直链状或支链状的烷基；或者1H-咪唑基、苯基、3'-吲哚基、对羟基苯基或对烷氧基苯基，前述取代基所包含的烷基和烷氧基的碳原子数分别为1-3。
作为上述L-α-氨基酸化合物，可以举出L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸和L-缬氨酸，可以优选地举出L-丙氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸或L-缬氨酸。
作为上述α-羟基羧酸化合物，可以优选地举出α-羟基-异己酸，作为对应的α-氧代羧酸化合物，可以举出α-氧代-异己酸，作为对应的L-α-氨基酸化合物，可以举出L-亮氨酸。
作为上述α-羟基羧酸化合物，还可以优选地举出含硫α-羟基羧酸化合物，作为对应的α-氧代羧酸化合物，可以举出含硫α-氧代羧酸化合物，作为对应的L-α-氨基酸化合物，可以举出含硫L-α-氨基酸化合物。
作为上述含硫α-羟基羧酸，例示式(1)所示的含硫α-羟基羧酸：
式中，R1为氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基。
作为使本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)中的任一或两者与上述式(1)所示的含硫α-羟基羧酸作用而得到的含硫α-氧代羧酸化合物，可以例示式(2)所示的含硫α-氧代羧酸：
式中，R1表示与前述相同的含义。
作为使本蛋白质(C)与上述式(2)所示的含硫α-氧代羧酸作用而得到的含硫L-α-氨基酸化合物，可以例示式(3)所示的含硫L-α-氨基酸：
。
式(1)的含硫α-羟基羧酸、式(2)的含硫α-氧代羧酸、以及式(3)的含硫L-α-氨基酸中，作为R1所示的任选取代的C1-8的烷基中的C1-8的烷基，例示例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。
作为式(1)所示的含硫α-羟基羧酸，具体而言可以举出例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸、2-羟基-4-(乙硫基)丁酸、2-羟基-4-(丙硫基)丁酸、2-羟基-4-(丁硫基)丁酸、2-羟基-4-(戊硫基)丁酸、2-羟基-4-(己硫基)丁酸、2-羟基-4-(庚硫基)丁酸、2-羟基-4-(辛硫基)丁酸。
作为式(2)所示的含硫α-氧代羧酸，具体而言可以举出例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸、2-氧代-4-(乙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丁硫基)丁酸、2-氧代-4-(戊硫基)丁酸、2-氧代-4-(己硫基)丁酸、2-氧代-4-(庚硫基)丁酸、2-氧代-4-(辛硫基)丁酸。
作为式(3)所示的含硫L-α-氨基酸，具体而言可以举出例如2-氨基-4-(甲硫基)丁酸、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丁硫基)丁酸、2-氨基-4-(戊硫基)丁酸、2-氨基-4-(己硫基)丁酸、2-氨基-4-(庚硫基)丁酸、2-氨基-4-(辛硫基)丁酸。
作为R1所示的任选取代的C1-8的烷基，优选为甲基，作为式(1)所示的含硫α-羟基羧酸，优选地例示2-羟基-4-(甲硫基)丁酸。
本发明制备方法的步骤(1)中，将α-羟基-异己酸作为底物时，在步骤(1)中得到α-氧代-异己酸，在步骤(2)中得到L-亮氨酸。
本发明制备方法的步骤(1)中，将2-羟基-4-(甲硫基)丁酸作为底物时，在步骤(1)中得到2-氧代-4-(甲硫基)丁酸，在步骤(2)中得到L-甲硫氨酸。
本发明制备方法的步骤(1)中，本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)各自能够以各种形态提供给用于与α-羟基羧酸化合物作用的反应体系。本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)各自可以以经纯化的蛋白质的形态提供给本发明制备方法的步骤(1)的反应体系，也可以以包含在产生该蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给前述反应体系。“微生物的处理物”是指与上述的“转化体的处理物”同样制备的处理物。本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)还可以分别以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给上述反应体系。
为了使本发明蛋白质(A)与α-羟基羧酸化合物作用，具体而言，例如可以将本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(A)的固定化物、将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸导入宿主细胞而成的产生本发明蛋白质(A)的转化体的培养物、或者前述转化体的处理物提供给本发明制备方法的步骤(1)的反应体系。
为了使本发明蛋白质(B)与α-羟基羧酸化合物作用，具体而言，例如可以将本发明蛋白质(B)、本发明蛋白质(B)的固定化物、将编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸导入宿主细胞而成的产生本发明蛋白质(B)的转化体的培养物、或者前述转化体的处理物提供给本发明制备方法的步骤(1)的反应体系。
也可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物、以及将编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给本发明制备方法的步骤(1)的反应体系。还可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸两者导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸可以分别整合至不同的载体导入宿主细胞，也可以整合至相同载体上导入宿主细胞。将两个多核苷酸整合至单一的载体时，例如，可以将启动子、终止子等参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸中的任一或两者。
本发明制备方法的步骤(1)通常在水和氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有时记为NAD+)等辅酶的存在下进行。此时所使用的水可以为缓冲水溶液。作为该缓冲水溶液中使用的缓冲剂，可以举出例如三羟基甲基氨基甲烷、磷酸钠或磷酸钾等磷酸碱金属盐、乙酸钠或乙酸钾等乙酸碱金属盐、或它们的混合物。
本发明制备方法的步骤(1)中，除了水之外还可以使有机溶剂共存于反应体系中。作为所用的有机溶剂，可举出例如：叔丁基甲醚、二异丙醚、四氢呋喃等醚类；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类；甲苯、己烷、环己烷、庚烷、异辛烷等烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇类；二甲基亚砜等有机硫化合物、丙酮等酮类、乙腈等腈类、以及它们的混合物。
本发明制备方法的步骤(1)中，为了利用辅因子(cofactor)作为共轭系统，通常可以在反应体系中添加辅酶(coenzyme)。作为所添加的辅酶，可以举出例如氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下，有时记为NADP+)。反应体系内的辅因子的量通常为与作为底物的α-羟基羧酸化合物的量等摩尔或其以上，优选在反应开始时预先添加。
本发明制备方法的步骤(1)中，随着α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸或α-羟基-异己酸)的氧化反应的进行，反应液中的NAD+转换成还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有时记为NADH)。经转换而产生的NADH可以通过与具有将NADH转换成氧化型(NAD+)的能力的蛋白质作用而恢复成原始的NAD+，因此，上述步骤(1)的反应体系内可以进一步存在具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质。上述步骤(1)的反应体系内进一步存在具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质时，反应体系内的辅因子的量通常可以为催化剂量，与作为底物的α-羟基羧酸化合物的量等摩尔或其以下。
作为具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质，可以举出例如苹果酸脱氢酶等有机酸脱氢酶、还原酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基酸脱氢酶、或NADH氧化酶。作为氨基酸脱氢酶，可以举出本蛋白质(C)，更具体而言，可以举出属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物的亮氨酸脱氢酶。
具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质为NADH氧化酶时，通过在反应体系内共存有FAD等，有时该蛋白质的活性得到增强，例如可以在反应液中添加FAD等。具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质为NADH氧化酶时，反应液中的氧被消耗，转换成过氧化氢。通过转换而生成的过氧化氢可以通过具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质而恢复至原始的分子氧，因此，上述步骤的反应体系内可以进一步共存有具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质。作为具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质，可以举出例如过氧化氢酶。
具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质、具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质各自可以以经纯化的蛋白质或其固定化物的形态提供给本发明制备方法的步骤(1)的反应体系，也可以以包含在产生该蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给前述反应体系。“微生物的处理物”意指与上述“转化体的处理物”相同地制备的处理物。例如，可以将将编码具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。可以将将编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物进一步提供给上述反应体系。
还可以将将编码具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物、以及将编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。
可以将将编码具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质的多核苷酸和编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸两者导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。可以将编码具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质的多核苷酸和编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸分别整合至不同的载体导入宿主细胞，也可以整合至相同载体上导入宿主细胞。将两个多核苷酸整合至单一的载体时，例如，可以将启动子、终止子等参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质的多核苷酸和编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸中的任一或两者。
还可以将将选自编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸、编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸、编码具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质的多核苷酸、和编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸中的两种以上的多核苷酸导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。
本发明制备方法的步骤(1)中的反应例如通过将含有水、α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸化合物或α-羟基-异己酸)和NAD+、以及本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)中的任一或两者或者产生它们的转化体或其处理物、根据需要还含有有机溶剂、过氧化氢酶等的反应液利用搅拌、振荡等进行混合而进行。
上述方法中的反应时的pH可以适当选择，通常pH为约3至约10的范围。反应温度可以适当选择，从原料和产物的稳定性、反应速度的观点出发，通常为约0℃至约60℃的范围。
随着α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸或α-羟基-异己酸)的氧化反应的进行，反应液中的NAD+被转换成NADH。由此，上述步骤(1)的反应体系内不包含具有将NADH转换成NAD+的能力的蛋白质时，例如通过测定反应液中的NADH的每单位时间的增加量、即增加速度，可以监测前述氧化反应的进行。
反应的终点例如可以通过利用液相色谱等对反应液中的α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸化合物或α-羟基-异己酸)的量进行分析来确定。
反应时间可以适当选择，通常为约0.5小时至约10天的范围。
从反应液中回收α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物或α-氧代-异己酸)通过通常已知的任意方法来进行即可。
例如可以列举下述方法：通过将反应液的有机溶剂提取操作、浓缩操作等后处理根据需要与柱色谱、蒸馏等组合进行来纯化目标化合物。
将本发明制备方法的步骤(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物或α-氧代-异己酸)从反应液中纯化或部分纯化后，可以供给步骤(2)。还可以通过将步骤(1)的反应液添加至步骤(2)的反应液中，将步骤(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物或α-氧代-异己酸)供给步骤(2)。
本发明制备方法的步骤(2)中，本蛋白质(C)能够以各种形态提供给用于与α-氧代羧酸化合物作用的反应体系。本蛋白质(C)可以以经纯化的蛋白质的形态提供给上述步骤(2)的反应体系，也可以以包含在产生该蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给前述反应体系。“微生物的处理物”是指与上述“转化体的处理物”同样制备的处理物。本蛋白质(C)还可以以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给上述反应体系。
为了使本蛋白质(C)与α-氧代羧酸化合物作用，具体而言，例如，可以将本蛋白质(C)、本蛋白质(C)的固定化物、将编码本蛋白质(C)的多核苷酸导入宿主细胞而成的产生本蛋白质(C)的转化体的培养物、或者前述转化体的处理物提供给上述步骤(2)的反应体系。
本发明制备方法的步骤(2)通常在水、铵离子和NADH等辅酶的存在下进行。
此时所使用的水可以为缓冲水溶液。作为该缓冲水溶液中使用的缓冲剂，可以举出例如三羟基甲基氨基甲烷、磷酸钠或磷酸钾等磷酸碱金属盐、乙酸钠或乙酸钾等乙酸碱金属盐、或它们的混合物。
本发明制备方法的步骤(2)中，除了水以外，还可以使有机溶剂共存于反应体系中。作为使用的有机溶剂，例如可以列举：叔丁基甲醚、二异丙醚、四氢呋喃等醚类；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类；甲苯、己烷、环己烷、庚烷、异辛烷等烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇类；二甲基亚砜等有机硫化合物、丙酮等酮类、乙腈等腈类、以及它们的混合物。
本发明制备方法的步骤(2)中，为了利用铵离子作为氨基供体，通常在反应体系中添加铵盐化合物。作为所添加的铵盐化合物，可以举出例如硫酸铵、甲酸铵、氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、氢氧化铵、酒石酸铵、乙酸铵等。反应体系内的铵离子的量通常为与作为底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩尔或其以上，优选在反应开始时预先添加。
本发明制备方法的步骤(2)中，为了利用辅因子(cofactor)作为共轭系统，通常可以在反应体系中添加辅酶(coenzyme)。作为所添加的辅酶，可以举出例如还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下，有时记为NADPH)。反应体系内的辅因子的量通常为与作为底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩尔或其以上，优选在反应开始时预先添加。
本发明制备方法的步骤(2)中，随着α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸或α-氧代-异己酸)的还原性氨基化反应的进行，反应液中的NADH被转换成氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。经转换而产生的NAD+可以通过与具有将NAD+转换成还原型(NADH)的能力的蛋白质作用而恢复成原始的NADH，因此，上述步骤(2)的反应体系内可以进一步存在具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质。上述步骤(2)的反应体系内进一步存在具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质时，反应体系内的辅因子的量通常可以为催化剂量，为与作为底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩尔或其以下。
作为具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质，可以举出例如甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等有机酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、或氨基酸脱氢酶。
具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质可以以经纯化的蛋白质或其固定化物的形态提供给本发明制备方法的步骤(2)的反应体系，也可以以包含在产生该蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给前述反应体系。“微生物的处理物”是指与上述“转化体的处理物”同样制备的处理物。可以将将编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。
本发明制备方法的步骤(2)中，可以将将编码本蛋白质(C)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物、以及将编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给用于与α-氧代羧酸化合物作用的反应体系。
本发明制备方法的步骤(2)中，可以将将编码本蛋白质(C)的多核苷酸和编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸两者导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。编码本蛋白质(C)的多核苷酸和编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸可以分别整合到不同的载体中导入宿主细胞，也可以整合到相同的载体上导入宿主细胞。将两个多核苷酸整合到单一的载体中时，例如可以将启动子、终止子等的参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码本蛋白质(C)的多核苷酸和编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸中的任一或者两者。
本发明制备方法的步骤(2)中的反应例如通过将含有水、铵盐化合物、NADH、α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物或α-氧代-异己酸)、以及本蛋白质(C)或者产生其的转化体或其处理物、根据需要还含有有机溶剂、具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质等的反应液利用搅拌、振荡等混合来进行。
上述方法中的反应时的pH可以适当选择，通常pH为约3至约10的范围。反应温度可以适当选择，从原料和产物的稳定性、反应速度的观点出发，通常为约0℃至约60℃的范围。
反应的终点例如可以通过利用液相色谱等对反应液中的α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物或α-氧代-异己酸)的量进行分析来确定。
反应时间可以适当选择，通常为约0.5小时至约10天的范围。
从反应液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫L-α-氨基酸或L-亮氨酸)通过通常已知的任意方法来进行即可。
例如，可以列举下述方法：通过将反应液的晶析、有机溶剂提取操作、浓缩操作等后处理按照需要与柱色谱、蒸馏等组合进行来纯化目标化合物。
还可以在一个反应体系中进行本发明制备方法的步骤(1)和步骤(2)。
此时，本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)各自能够以各种形态提供给上述反应体系。
本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)可以以经纯化的蛋白质的形态提供给上述反应体系，也可以以包含在产生这些蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给上述反应体系。
本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)还可以以包含在将编码这些蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给上述反应体系。
例如，可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物和将编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的任一或两者、以及将编码本蛋白质(C)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸中的任一或两者、以及编码本蛋白质(C)的多核苷酸导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。可以将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸中的任一或两者、以及编码本蛋白质(C)的多核苷酸分别整合到不同的载体中导入宿主细胞，也可以整合到相同的载体上导入宿主细胞。将多个多核苷酸整合到单一的载体中时，例如可以将启动子、终止子等的参与表达控制的区域与上述多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使上述多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸、编码本发明蛋白质(B)的多核苷酸以及编码本蛋白质(C)的多核苷酸中的任一或两个以上。
在一个反应体系中进行本发明制备方法的步骤(1)和步骤(2)时的反应可以利用按照上述本发明制备方法的步骤(2)的反应的反应液和反应条件进行。
随着步骤(1)中的α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸或α-羟基-异己酸)的氧化反应的进行，反应液中的NAD+被转换成NADH。随着步骤(2)中的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸或α-氧代-异己酸)的还原性氨基化反应的进行，反应液中的NADH被转换成NAD+。由此，在一个反应体系中进行本发明制备方法的步骤(1)和步骤(2)时，可以以催化剂量循环辅酶(NAD+和NADH)。
反应的终点例如可以通过利用液相色谱等对反应液中的α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸化合物或α-羟基-异己酸)的量进行分析来确定。
反应时间可以适当选择，通常为约0.5小时至约10天的范围。
从反应液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫L-α-氨基酸或L-亮氨酸)可以与上述本发明制备方法的步骤(2)的情况同样地进行。
实施例
以下，通过实施例等来对本发明进一步详细地进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。
参考例1(染色体DNA的制备)
在两只500ml容量的烧瓶中分别装入各100ml的培养基(将2g葡萄糖、0.5g聚蛋白胨、0.3g酵母提取物、0.3g肉提取物、0.2g硫酸铵、0.1g磷酸二氢钾、0.05g硫酸镁七水合物溶解于100ml水中，用2N的HCl将pH值调节至6而得到的培养基)，在121℃灭菌15分钟。向其中分别加入各0.3ml在相同组成的培养基中、在30℃振荡培养48小时的反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株的培养液，在30℃振荡培养24小时。将所得培养液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，收集所产生的沉淀。将所得沉淀用50ml的0.85%的食盐水清洗，得到3.5g的湿菌体。
使用QIAprep Genomic-tip System (Qiagen公司制)，从所得到的菌体中得到染色体DNA(以下，记为染色体DNA(A))。
实施例1(本发明多核苷酸(A)和本发明多核苷酸(B)、分别包含它们的重组载体、以及拥有该载体的转化体的制备)
(1)引物合成
合成分别具有SEQ ID NO:9至12所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物。
[表1]
(2)包含本发明多核苷酸(B)的重组载体
使用具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO:10所示的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(A)为模板，以下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl，东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟后，进行30次在98℃10秒钟、接着在60℃30秒钟、接着在68℃60秒钟的保温循环，然后保持在4℃。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.1kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶NdeI和XhoI将DNA进行双酶切（doubledigestion），对酶切过的约1.1kb的DNA进行纯化。
使质粒载体pET-22b(Novagen公司制)通过限制酶NdeI和XhoI进行双酶切，对酶切过的载体DNA进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌(E.coli) DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NdeI和XhoI进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.1kb的DNA插入至上述载体中。对这些质粒当中的1个所拥有的约1.1kb的插入DNA的核苷酸序列进行分析时，表明该DNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。将该质粒命名为pET774。SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。质粒pET774被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的羧基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)。
(3)包含本发明多核苷酸(A)的重组载体
使用具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO:12所示的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(A)为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System（Roche Diagnostic公司制）的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行10次在94℃15秒钟、接着在65℃30秒钟、接着在72℃1分钟的保温循环，接着，进行20次在94℃15秒钟、接着在70℃30秒钟、接着在72℃1分钟的保温循环，进一步在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.0kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶NdeI和XhoI将DNA进行双酶切，对酶切过的约1.0kb的DNA进行纯化。
使质粒载体pET-22b(Novagen公司制)通过限制酶NdeI和XhoI进行双酶切，对酶切过的载体DNA进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NdeI和XhoI进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.0kb的DNA插入至上述载体中。对这些质粒当中的1个所拥有的约1.0kb的插入DNA的核苷酸序列进行分析时，表明该DNA具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。将该质粒命名为pET43。SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。质粒pET43被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的羧基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)。
实施例2(本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)的制备、以及使用该蛋白质的L-α-氨基酸化合物的制备)
(1)本发明蛋白质(B)
使用质粒pET774来转化大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)株。将所得到的转化体接种于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的800ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。将所得到的培养液进行离心分离，得到湿菌体。将约4.9g该湿菌体悬浮于包含0.5MNaCl和5mM咪唑的40ml的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(以下，有时记为结合缓冲液)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得到的破碎液在8000rpm、4℃进行10分钟离心分离，得到约28ml离心上清液。
将约10ml的所得到的离心上清液以5ml/分钟的流速加载到亲和柱(HisTrap HP、凝胶床5ml、GE Healthcare公司制)上。使约25ml的结合缓冲液以5ml/分钟的流速流过该柱，将未吸附蛋白质洗脱。其后，维持流速不变，使约35ml的包含0.5M NaCl和29.75mM 咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)流过，将未吸附蛋白质和低吸附蛋白质洗脱。
接着，在流过47.5ml期间，通过将咪唑浓度从29.75mM增加至500mM的梯度洗脱来洗脱吸附蛋白质，分离收集25ml的咪唑浓度为120mM至270mM附近的级分。将所得到的级分供给Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.5M Tris-HCl(pH9)的缓冲液交换，得到约2ml的纯化酶液(40g蛋白质/L)。混合0.31ml的所得到的纯化酶液的2倍稀释液、和50mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、10mg的NAD+、0.04ml的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、40mg的硫酸铵、和60U的亮氨酸脱氢酶(和光纯药公司制)，在30℃振荡24小时。针对该反应液，在下述条件下通过液相色谱进行含量分析。可知，相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了35.3%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
(2)本发明蛋白质(A)
使用质粒pET43来转化大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)株。将所得到的转化体接种于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的800ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。将所得到的培养液进行离心分离，得到湿菌体。将约5.2g该湿菌体悬浮于40ml的包含0.5M的NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(即结合缓冲液)中，使用Multi-BeadsShocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得到的破碎液在8000rpm、4℃进行10分钟离心分离，得到约28ml离心上清液。
将约10ml的所得到的离心上清液以5ml/分钟的流速加载到亲和柱(HisTrap HP、凝胶床5ml、GE Healthcare公司制)上。使约25ml的结合缓冲液以5ml/分钟的流速流过该柱，将未吸附蛋白质洗脱。其后，维持流速不变，使约35ml的包含0.5M NaCl和29.75mM 咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)流过，将未吸附蛋白质和低吸附蛋白质洗脱。
接着，在流过47.5ml期间，通过将咪唑浓度从29.75mM增加至500mM的梯度洗脱来使吸附蛋白质洗脱，分离收集25ml的咪唑浓度为120至270mM附近的级分。将所得到的级分供给Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.5M Tris-HCl(pH9)的缓冲液交换，得到约2ml的纯化酶液(9g蛋白质/L)。将0.62ml的所得到的纯化酶液用AmiconUltra-15(Millipore公司制)浓缩2倍。混合所得到的0.31ml的浓缩液、和50mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、10mg的NAD+、0.04ml的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、40mg的硫酸铵、和60U的亮氨酸脱氢酶(和光纯药公司制)，在30℃振荡24小时。针对该反应液，在下述条件下通过液相色谱进行含量分析。可知，相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了36.9%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
(3)本发明蛋白质(A)和本发明蛋白质(B)
混合0.31ml的实施例2(1)中制备的纯化酶液(40g蛋白质/L)的2倍稀释液和0.31ml的实施例2(2)中制备的纯化酶液(9g蛋白质/L)的2倍浓缩液，用Amicon Ultra-15(Millipore公司制)浓缩2倍。混合0.31ml的所得到的酶液、和50mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、10mg的NAD+、0.04ml的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、40mg的硫酸铵、和60U的亮氨酸脱氢酶(和光公司制)，在30℃振荡3小时。针对该反应液，在下述条件下通过液相色谱进行含量分析。可知，相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了47.0%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例3(含有本多核苷酸(C)的重组载体和拥有该载体的转化体的制备、以及本蛋白质(C)的制备)
(1)含有本多核苷酸(C)的重组载体
将球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株在100ml经灭菌的LB培养基中进行培养，得到0.4g菌体。使用Qiagen Genomic Tip (Qiagen公司制)，按照其附带的操作手册中记载的方法，从该菌体中纯化染色体DNA(以下，记为染色体DNA(B))。
以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列为基础，合成具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列(GCCATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列(GGGCCCGGGTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物。
使用具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(B)为模板，以使用Expand HighFidelity PCR System（Roche Diagnostic公司制）的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(B)溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 0.4μl
引物(4pmol/μl) 2μl
5×缓冲液(具有MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 35.1μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行25次在94℃20秒钟、接着在55℃25秒钟、接着在72℃1.5分钟的保温循环，进一步在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.1kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶NcoI和SmaI将DNA进行双酶切，对酶切过的约1.1kb的DNA进行纯化。
使质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)通过限制酶NcoI和SmaI进行双酶切，对酶切过的载体DNA及进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和XbaI进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.1kb的DNA插入至上述载体中。将这些质粒当中之一命名为pTrcLD。
(2)含有本多核苷酸(C)的重组载体
以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所述的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列为基础，作为用于将前述酶的第113位的丙氨酸置换为甘氨酸的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列(GTCGCTATATTACCGGTGAAGATGTTG)的寡核苷酸(有义引物)、和具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列(CAACATCTTCACCGGTAATATAGCGAC)的寡核苷酸(反义引物)。将具有SEQID NO:16所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例3(1)所述的重组载体pTrcLD为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pTrcLD的DNA溶液 0.4μl
dNTP混合物(包含在上述试剂盒内) 1μl
有义引物(50μM) 0.4μl
反义引物(50μM) 0.4μl
10×缓冲液(包含在上述试剂盒内) 5μl
PfuUltra (包含在上述试剂盒内) 1μl
超纯水 41.8μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在95℃保温1分钟后，进行12次在95℃50秒钟、接着在55℃1分钟、接着在68℃5分钟的保温循环，然后保存在4℃。
向所得到的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述试剂盒内)后，在37℃保温1小时。使用所得到的保温液来转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的各转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列，确认到导入了如所设计那样的突变。将具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的质粒命名为pTrcLD(A113G)。SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
(3)含有本多核苷酸(C)的重组载体
(3-1)用于核苷酸置换的部位特异性突变导入
以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列为基础，作为用于将第993位的腺嘌呤置换为胞嘧啶的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列(GATAGTATTCCAACCTATGTTGCGGC)的寡核苷酸(有义引物)、和具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列(GCCGCAACATAGGTTGGAATACTATC)的寡核苷酸(反义引物)。
将具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例3(2)所述的重组载体pTrcLD(A113G)为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pTrcLD(A113G)的DNA溶液 1μl
dNTP混合物(包含在上述试剂盒内) 1μl
有义引物(50μM) 0.4μl
反义引物(50μM) 0.4μl
10×缓冲液(包含在上述试剂盒内) 5μl
PfuUltra (包含在上述试剂盒内) 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在95℃保温1分钟后，进行12次在95℃50秒钟、接着在60℃1分钟、接着在68℃5.5分钟的保温循环，然后保存在4℃。
向所得到的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述试剂盒内)后，在37℃保温1小时。使用所得到的保温液来转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法确定突变位置的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrcLD(A113G)nd。
(3-2)含有本多核苷酸(C)的重组载体
以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列为基础，合成具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列(GGGCATATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物(有义引物)、和具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列(GGATCCTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物(反义引物)。使用具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ IDNO:21所示的寡核苷酸引物，以实施例3(3-1)所述的重组载体pTrcLD(A113G)nd为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System（Roche Diagnostic公司制）的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pTrcLD(A113G)nd的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行10次在94℃15秒钟、接着在55℃30秒钟、接着在72℃1.5分钟的保温循环，接着，进行20次在94℃15秒钟、接着在60℃30秒钟、接着在72℃1.5分钟的保温循环，进一步在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.1kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶NdeI和BamHI将DNA进行双酶切，对酶切过的约1.1kb的DNA进行纯化。
使质粒载体pET-15b(Novagen制)通过限制酶NdeI和BamHI进行双酶切，对酶切过的载体DNA进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得到的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选10个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NdeI和BamHI进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在4个质粒中，确认到各自约1.1kb的DNA插入至上述载体中。以这样的方式得到的质粒被设计为能够表达下述蛋白质，所述蛋白质在重组载体pTrcLD(A113G)nd所编码的亮氨酸脱氢酶的氨基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的20个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)。将所得到的质粒当中之一命名为pETLD(A113G)。
(4)本蛋白质(C)
使用重组载体pETLD(A113G)来转化大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)株。将所得到的转化体接种于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的800ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。将所得到的培养液进行离心分离，得到约6g的湿菌体。将约6g该湿菌体悬浮于40ml的包含0.5M的NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(即结合缓冲液)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得到的破碎液在8000rpm、4℃进行10分钟离心分离，得到约25ml离心上清液。
将约10ml的所得到的离心上清液以5ml/分钟的流速加载到亲和柱(HisTrap HP、凝胶床5ml、GE Healthcare公司制)上。使约25ml的结合缓冲液以5ml/分钟的流速流过该柱，将未吸附蛋白质洗脱。其后，维持流速不变，使约35ml的包含0.5M NaCl和29.75mM 咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)流过，将未吸附蛋白质和低吸附蛋白质洗脱。接着，在流过47.5ml期间，通过将咪唑浓度从29.75mM增加至500mM的梯度洗脱来使吸附蛋白质洗脱，分离收集30ml的咪唑浓度为160mM至443mM附近的级分。将所得到的级分供给Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.5M Tris-HCl(pH9)的缓冲液交换，得到约2ml的级分(32.6g蛋白质/L)。以下，将该级分记为亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液。
实施例4(使用本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)的L-α-氨基酸化合物的制备)
混合0.31ml的实施例2(1)中制备的纯化酶液(40g蛋白质/L)的2倍稀释液和0.31ml的实施例2(2)中制备的纯化酶液(9g蛋白质/L)的2倍浓缩液，用Amicon Ultra-15(Millipore公司制)浓缩2倍。混合0.31ml的所得到的酶液、50mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、10mg的NAD+、0.04ml的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、40mg的硫酸铵、和0.15ml的实施例3(4)中制备的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(32.6g蛋白质/L)，在30℃振荡1小时。针对该反应液，在下述条件下通过液相色谱进行含量分析。可知，相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了49.9%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例5(本发明多核苷酸(A)、本发明重组载体(ABC)、和拥有该载体的转化体的制备)
(1)含有本发明多核苷酸(A)的重组载体
制备具有分别在SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列的5’末端添加有核苷酸序列ccatggct、在3’末端添加有核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的双链DNA。SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
使所制备的约1.0kb的双链DNA通过限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，对酶切过的DNA进行纯化。
使质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)通过限制酶NcoI和BmaHI进行双酶切，对酶切过的载体DNA进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌JM109株。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.0kb的DNA插入至上述载体中。确定所得到的质粒的核苷酸序列，将具有目标核苷酸序列的质粒命名为pTrc43SC。
(2)本发明重组载体(ABC)
(2-1)含有本多核苷酸(C)的重组载体
以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 239-247所记载的来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列为基础，作为用于将第561位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列(CGTAGCTTACAAACTTTGCGAGTATTTAC)的寡核苷酸(有义引物)、和具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列(GTAAATACTCGCAAAGTTTGTAAGCTACG)的寡核苷酸(反义引物)。将具有SEQ IDNO:22所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例3(3)所述的质粒pTrcLD(A113G)nd为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pTrcLD(A113G)nd的DNA溶液 1μl
dNTP混合物(包含在上述试剂盒内) 1μl
有义引物(50μM) 0.4μl
反义引物(50μM) 0.4μl
10×缓冲液(包含在上述试剂盒内) 5μl
PfuUltra (包含在上述试剂盒内) 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在95℃保温1分钟后，进行12次在95℃50秒钟、接着在60℃1分钟、接着在68℃5.5分钟的保温循环，然后保存在4℃。
向所得到的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述试剂盒内)后，在37℃保温1小时。使用所得到的保温液来转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrcLD(A113G)ndhd。
(2-2)含有本发明多核苷酸(B)的重组载体
将具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列(CCATGGCTATGAAAAAGCTCTCCATCGCCC)的寡核苷酸(有义引物)和具有SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列(CAAGCTTGCTAGCCTTCGTGCGGCAGGGCTTC)的寡核苷酸(反义引物)用作引物，以实施例1(2)所述的质粒pET774为模板，以下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pET774的DNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl，东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟后，进行30次在98℃10秒钟、接着在60℃30秒钟、接着在68℃60秒钟的保温循环，然后保持在4℃。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.1kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶NcoI和HindIII将DNA进行双酶切，对酶切过的约1.1kb的DNA进行纯化。
使质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)通过限制酶NcoI和HindIII进行双酶切，对酶切过的载体DNA及进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和HindIII进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.1kb的DNA插入至上述载体中。将这些质粒当中之一命名为pTrc774NH。
(2-3)含有本发明多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重组载体
使用具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列(CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG)的寡核苷酸(有义引物)和具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列(GCTGCAGCCTAGCCTTCGTGCGGCAGGGCTTC)的寡核苷酸(反义引物)，以实施例5(2-2)所述的质粒pTrc774NH为模板，以下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pTrc774NH的DNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl，东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟后，进行30次在98℃10秒钟、接着在60℃30秒钟、接着在68℃60秒钟的保温循环，然后保持在4℃。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.1kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶BamHI和PstI将DNA进行双酶切，对酶切过的约1.1kb的DNA进行纯化。
使实施例5(2-1)所述的质粒pTrcLD(A113G)ndhd通过限制酶BamHI和PstI进行双酶切，对酶切过的质粒DNA进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶BamHI和PstI进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.1kb的DNA插入至质粒pTrcLD(A113G)ndhd中。将这些质粒当中之一命名为pTrcLD(A113G)/774。
(2-4)含有本发明多核苷酸(A)、本发明多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重组载体
将具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列(GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG)的寡核苷酸(有义引物)和SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列(CAAGCTTGTTAGCCACGGGCTTCCCACACC)所示的寡核苷酸(反义引物)用作引物，以实施例5(1)所述的质粒pTrc43SC为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System（Roche Diagnostic公司制）的下述反应液组成进行PCR。
[反应液组成]
pTrc43SC的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行10次在94℃15秒钟、接着在65℃30秒钟、接着在72℃1分钟的保温循环，接着，进行20次在94℃15秒钟、接着在70℃30秒钟、接着在72℃1分钟的保温循环，进一步在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.0kb的DNA条带。
向剩余的PCR反应液中添加限制酶PstI和HindIII将DNA进行双酶切，对酶切过的约1.0kb的DNA进行纯化。
使实施例5(2-3)所述的质粒pTrcLD(A113G)/774通过限制酶PstI和HindIII进行双酶切，对酶切过的质粒DNA进行纯化。
混合这些经纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶PstI和HindIII进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中，确认到各自约1.0kb的DNA插入至质粒pTrcLD(A113G)/774中。将这些质粒当中之一命名为pTrcLD(A113G)/774/43SC。
实施例6(使用拥有本发明重组载体(ABC)的转化体的处理物的L-α-氨基酸化合物的制备)
使用质粒pTrcLD(A113G)/774/43SC来转化大肠杆菌JM109株。将所得到的转化体接种于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的100ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。将所得到的培养液进行离心分离，得到湿菌体。将约0.8g该湿菌体悬浮于5ml的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得到的破碎液在8000rpm、4℃进行10分钟离心分离，得到约3.5ml离心上清液(28g蛋白质/L)。
将0.34ml的所得到的离心上清液用Amicon Ultra-15(Millipore公司制)浓缩3.4倍。混合0.1ml的所得到的浓缩离心上清液、0.35ml的使用氨水制备为pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、0.05ml的0.5M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、和20mg的硫酸铵，在30℃振荡1小时。针对该反应液，在下述条件下通过液相色谱进行含量分析。可知，生成93.5g/L的L-甲硫氨酸。相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，L-甲硫氨酸收率为30.4%。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例7（含有编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备）
（1）含有编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
（1-1）
合成具有SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列（CCATATGTCTCAAAAACCAAAAATCATCG）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列（ACTCGAGGCCACGGGCTTCCCACACCTGCG）的寡核苷酸（反义引物）。使用具有SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO:31所示的寡核苷酸引物，以实施例5的（1）中记载的质粒pTrc43SC为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System（Roche Diagnostic公司制）的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SC的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有 MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在94℃保温2分钟后，进行10次94℃ 15秒、接着55℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟的保温循环，接着进行20次94℃ 15秒、接着60℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟的保温循环，进而在72℃保持7分钟。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.0kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NdeI和XhoI，使DNA双酶切，将酶切过的约1.0kbDNA进行纯化。
利用限制酶NdeI和XhoI使质粒载体pET-22b（Novagen制）双酶切，将酶切过的DNA进行纯化。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选10个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NdeI和XhoI双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在4个质粒中，确认到各自约1.0kb的DNA被插入到上述载体中。将这些质粒中的1个命名为pET43SCcHis。质粒pET43SCcHis被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。
（1-2）
合成具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列（GCCATGGCTATGTCTCAAAAACCAAAAATC）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列（GGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的寡核苷酸（反义引物）。使用具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO:33所示的寡核苷酸引物，以实施例7（1-1）中记载的质粒pET43SCcHis为模板，在使用了Expand High Fidelity PCR System（RocheDiagnostic公司制）的下述反应液中进行PCR。
［反应液组成］
pET43SCcHis的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有 MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在94℃保温2分钟后，进行10次94℃ 15秒、接着55℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟的保温循环，接着进行20次94℃ 15秒、接着60℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟的保温循环，进而在72℃保持7分钟。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.0kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NcoI和BamHI，使DNA双酶切，将酶切过的DNA进行纯化。
利用限制酶NcoI和BamHI使质粒载体pTrc99A（GE healthcare公司制）双酶切，将酶切过的DNA进行纯化。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选10个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和BamHI双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在4个质粒中，前述约1.0kb的DNA被插入。将这些质粒中的1个命名为pTrc43SCcHis。质粒pTrc43SCcHis被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。
（2）含有编码具有改变氨基酸序列V109I的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
作为用于基于SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列、将第325位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列（CGCTGTTGCTGATATTACCATCGGCCTG）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列（CAGGCCGATGGTAATATCAGCAACAGCG）的寡核苷酸（反义引物）。SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第325位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤导致SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸。
将具有SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例7（1-2）中记载的质粒pTrc43SCcHis为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中，添加1μl的DpnI限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-g325a。质粒pTrc43SCcHis-g325a被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸的氨基酸序列。
（3）含有编码具有改变氨基酸序列G191D的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
作为用于基于SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列、将第572位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列（GGCGGCATACGTCGATCGTGACGAGCTG）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列（CAGCTCGTCACGATCGACGTATGCCGCC）的寡核苷酸（反义引物）。SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第572位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤导致SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸。
将具有SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例7（1-2）中记载的质粒pTrc43SCcHis为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI 限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-g572a。质粒pTrc43SCcHis-g572a被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸的氨基酸序列。
（4）含有编码具有改变氨基酸序列Q246R的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
作为用于基于SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列、将第737位的腺嘌呤置换为鸟嘌呤的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列（GCAGCACTGGTACGGGCACTGCGCTCTG）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列（CAGAGCGCAGTGCCCGTACCAGTGCTGC）的寡核苷酸（反义引物）。SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第737位的腺嘌呤置换为鸟嘌呤导致SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸。
将具有SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例7（1-2）中记载的质粒pTrc43SCcHis为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI 限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-a737g。质粒pTrc43SCcHis-a737g被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的氨基酸序列。
（5）含有编码具有改变氨基酸序列V109I/G191D的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
引物使用用于将SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第572位的鸟嘌呤转换成腺嘌呤的突变导入引物、即具有SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ IDNO:37所示的核苷酸序列的寡核苷酸，以实施例7（2）中记载的质粒pTrc43SCcHis-g325a为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis-g325a的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-g325a/g572a。质粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸和第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸的氨基酸序列。
（6）含有编码具有改变氨基酸序列V109I/Q246R的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
引物使用用于将SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第737位的腺嘌呤转换成鸟嘌呤的突变导入引物、即具有SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ IDNO:39所示的核苷酸序列的寡核苷酸，以实施例7（2）中记载的质粒pTrc43SCcHis-g325a为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis-g325a的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-g325a/a737g。质粒pTrc43SCcHis-g325a/a737g被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的氨基酸序列。
（7）含有编码具有改变氨基酸序列G191D/Q246R的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
引物使用用于将SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第737位的腺嘌呤转换成鸟嘌呤的突变导入引物、即具有SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ IDNO:39所示的核苷酸序列的寡核苷酸，以实施例7（3）中记载的质粒pTrc43SCcHis-g572a为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis-g572a的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-g572a/a737g。质粒pTrc43SCcHis-g572a/a737g被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的氨基酸序列。
（8）含有编码具有改变氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的重组载体
引物使用用于将SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列中的第737位的腺嘌呤转换成鸟嘌呤的突变导入引物、即具有SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ IDNO:39所示的核苷酸序列的寡核苷酸，以实施例7（5）中记载的质粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis-g325a/g572a的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 5.5分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI 限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g。质粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在改变(altered)的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改变的氨基酸序列是具有在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸的氨基酸序列。
实施例8（本发明蛋白质(A)的热稳定性评价）
（1）
使用质粒pTrc43SCcHis、pTrc43SCcHis-g325a/g572a、pTrc43SCcHis-g325a/a737g、或者质粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体分别在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中接种，在30℃振荡培养15小时。将所得的各培养液离心分离，得到约0.1g的湿菌体。将各自约0.1g的湿菌体分别悬浮于含有0.5M的NaCl和5mM咪唑的1ml的20mM磷酸缓冲液（pH7.4）（即，结合缓冲液）中，使用Multi-Beads Shocker（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得的破碎液在13000rpm、4℃进行10分钟离心分离，得到各自约0.7ml的离心上清液。
在所得的各自的离心上清液中追加约0.3ml的结合缓冲液达到约1ml后，将其加载到亲和柱（HisTrap HP、凝胶床1ml、GE healthcare公司制）上。在该柱中流过约3ml的结合缓冲液，使未吸附蛋白质洗脱。然后，使含有0.5M NaCl和500mM 咪唑的约2ml的20mM磷酸缓冲液（pH7.4）流过，使各自的吸附蛋白质洗脱，收集洗脱液。将约2ml的各自的洗脱液供给Amicon Ultra-15（Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.5M Tris-HCl（pH9）的缓冲液交换，得到各自约0.4ml的纯化酶液。测定各自的纯化酶液的蛋白质浓度。来自导入pTrc43SCcHis的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为3.1g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a/g572a的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.5g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a/a737g的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为3.1g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为3.2g蛋白质/L。
将所得的纯化酶液分别以形成0.45g蛋白质/L的方式稀释，将0.06ml的所得的稀释酶液在41℃热处理30分钟后，冷却至4℃。将0.045ml的所得的酶液和0.055ml的0.5MTris-HCl缓冲液（pH9.0）混合，以使2-羟基-4-（甲硫基）丁酸钙（东京化成公司制）为47mM、NAD＋为3.2mM的方式进行添加，在30℃保温。以340nm的波长每10秒测定一次前述反应液的吸光度，测定约10分钟。将1分钟使1μmol的NAD+还原的酶量设为1U，求得酶活性。作为对照，使用没有进行热处理的稀释酶液同样地进行反应，测定反应液的吸光度，求得酶活性。将使用了没有进行热处理的稀释酶液的反应中的酶活性设为100％，算出热处理过的稀释酶液的残留活性。结果示于表2。
[表2]
（2）
使用质粒pTrc43SCcHis、pTrc43SCcHis-g325a、pTrc43SCcHis-g572a、pTrc43SCcHis-a737g、pTrc43SCcHis-g325a/g572a、pTrc43SCcHis-g572a/a737g、pTrc43SCcHis-g325a/a737g、或者质粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g，转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体分别在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中接种，在30℃振荡培养15小时。将所得的各培养液离心分离，得到约0.1g的湿菌体。将各自约0.1g的湿菌体分别悬浮于含有0.5M的NaCl和5mM咪唑的1ml的20mM磷酸缓冲液（pH7.4）（即，结合缓冲液）中，使用Multi-Beads Shocker（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得的破碎液在12000rpm、4℃进行10分钟的离心分离，分别得到约0.7ml离心上清液。
在所得的各自的离心上清液中追加约0.3ml的结合缓冲液达到约1ml后，将其加载到亲和柱（HisTrap HP、凝胶床1ml、GE healthcare公司制）上。在该柱中流过约3ml的结合缓冲液，使未吸附蛋白质洗脱。然后，使含有0.5M NaCl和500mM 咪唑的约2ml的20mM磷酸缓冲液（pH7.4）流过，使各自的吸附蛋白质洗脱，收集洗脱液。将约2ml的各自的洗脱液供给Amicon Ultra-15（Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.5M Tris-HCl（pH9）的缓冲液交换，得到各自约0.4ml的纯化酶液。测定各自的纯化酶液的蛋白质浓度。来自导入pTrc43SCcHis的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.3g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.9g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g572a的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.9g蛋白质/L，来自pTrc43SCcHis-a737g转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为4.2g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a/g572a的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.1g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g572a/a737g的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为3.3g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a/a737g的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.6g蛋白质/L，来自导入pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g的转化体的纯化酶液的蛋白质浓度为2.7g蛋白质/L。
将所得的纯化酶液分别以形成0.45g蛋白质/L的方式稀释，将0.06ml的所得的稀释酶液在40.5℃热处理30分钟后，冷却至4℃。将0.045ml的所得的酶液和0.055ml的0.5MTris-HCl缓冲液（pH9.0）混合，以使2-羟基-4-（甲硫基）丁酸钙（东京化成公司制）为47mM、NAD＋为3.2mM的方式进行添加，在30℃保温。以340nm的波长每10秒测定一次前述反应液的吸光度，测定约10分钟。将1分钟使1μmol的NAD+还原的酶量设为1U，求得酶活性。作为对照，使用没有进行热处理的稀释酶液同样地进行反应，测定反应液的吸光度，求得酶活性。将使用了没有进行热处理的稀释酶液的反应中的酶活性设为100％，算出热处理过的稀释酶液的残留活性。结果示于表3。
[表3]
实施例9（本发明重组载体(ABC)和拥有该载体的转化体的制备）（1）含有编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的本发明重组载体(ABC)
（1-1）含有本多核苷酸(C)的重组载体
基于Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 239-247中记载的、来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列，作为用于将第561位的鸟嘌呤转换成腺嘌呤的突变导入引物，合成具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列（CGTAGCTTACAAACTTTGCGAGTATTTAC）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列（GTAAATACTCGCAAAGTTTGTAAGCTACG）的寡核苷酸（反义引物）。
将具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以实施例3的（3-2）中记载的质粒pETLD(A113G)为模板，以使用QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pETLD(A113G)的DNA溶液 1μl
dNTP混合物（包含在上述试剂盒中） 1μl
有义引物（50μM） 0.4μl
反义引物（50μM） 0.4μl
10×缓冲液（包含在上述试剂盒中） 5μl
PfuUltra （包含在上述试剂盒中） 1μl
超纯水 41.2μl。
［PCR反应条件］
将放入了上述反应液组成的反应液的容器固定于热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR Sｙstem2400）中，在95℃保温1分钟后，进行12次95℃ 50秒、接着60℃ 1分钟、接着68℃ 6.8分钟的保温循环后，在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶（包含在上述试剂盒中）后，在37℃保温1小时。使用所得的保温液转化大肠杆菌DH5α。
从所得到的转化体中提取质粒后，通过双脱氧法来确定突变位点的核苷酸序列。将确认到导入了如所设计那样的突变的质粒命名为pETLD(A113G)hd。
在质粒pETLD(A113G)hd中加入限制酶NcoI和BamHI，使该质粒DNA双酶切，将酶切过的约1.1kb的DNA纯化。
利用限制酶NcoI和BamHI使质粒载体pTrc99A（GE healthcare公司制）双酶切，将酶切过的载体DNA纯化。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选10个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和BamHI双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在4个质粒中，约1.1kb的DNA被插入到上述载体中。将这些质粒中的1个命名为pTrcLD(A113G)nh。质粒pTrcLD(A113G)nh被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的氨基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的20个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis）。
（1-2）含有本发明多核苷酸(B)的重组载体
将具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列（CCATGGCTATGAAAAAGCTCTCCATCGCCC）的寡核苷酸（有义引物）和SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列（GCTGCAGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）所示的寡核苷酸（反义引物）用作引物，以实施例1的（2）中记载的质粒pET774为模板，以下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
质粒pET774的DNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl、东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700）中，在94℃保温2分钟后，进行30次98℃ 10秒、接着60℃ 30秒、接着68℃ 60秒的保温循环后，在4℃保持。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.1kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NcoI和PstI，使DNA双酶切，将酶切过的约1.1kbDNA进行纯化。
利用限制酶NcoI和PstI使质粒载体pTrc99A（GE healthcare公司制）双酶切，将酶切过的载体DNA进行纯化。
将这些纯化了的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和PstI双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在6个质粒中，约1.1kb的DNA被插入到上述载体中。将这些质粒中的1个命名为pTrc774chNP。质粒pTrc774chNP被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。
（1-3）含有本发明多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重组载体
将具有SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列（CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG）的寡核苷酸（有义引物）和SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列（GCTGCAGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）所示的寡核苷酸（反义引物）用作引物，以实施例9（1-2）中记载的质粒pTrc774chNP为模板，以下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc774chNP的DNA溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl、东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700）中，在94℃保温2分钟后，进行30次98℃ 10秒、接着60℃ 30秒、接着68℃ 60秒的保温循环后，在4℃保持。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.1kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶BamHI和PstI，使DNA双酶切，将酶切过的约1.1kb的DNA进行纯化。
利用限制酶BamHI和PstI使实施例9（1-1）中记载的质粒pTrcLD(A113G)nh双酶切，将酶切过的质粒DNA进行纯化。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶BamHI和PstI双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在6个质粒中，约1.1kb的DNA被插入到质粒pTrcLD(A113G)nh中。将这些质粒中的1个命名为质粒pTrcLD(A113G)nh/774ch。
（1-4）含有本发明多核苷酸(A)的重组载体
合成具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列（GCCATGGCTATGTCTCAAAAACCAAAAATC）的寡核苷酸（有义引物）、和具有SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的寡核苷酸（反义引物）。使用具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO:41所示的寡核苷酸引物，以实施例7的（1-1）中记载的质粒pET43SCcHis为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System(RocheDiagnostic公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pET43SCcHis的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有 MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在94℃保温2分钟后，进行10次94℃ 15秒、接着55℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟的保温循环，接着进行20次94℃ 15秒、接着60℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟的保温循环，进而在72℃保持7分钟。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.0kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NcoI和HindIII，使DNA双酶切，将酶切过的约1.0kb的DNA进行纯化。
利用限制酶NcoI和HindIII使质粒载体pTrc99A（GE healthcare公司制）双酶切，将酶切过的载体DNA进行纯化。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选10个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和HindIII双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在4个质粒中，约1.0kb的DNA被插入到上述载体中。将这些质粒中的1个命名为pTrc43SCchNH。质粒pTrc43SCchNH被设计为能够表达具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的羧基末端添加由含有连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列（SEQ ID NO:45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。
（1-5）含有本发明多核苷酸(A)、本发明多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重组载体
将具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）的寡核苷酸（有义引物）和具有SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的寡核苷酸（反义引物）用作引物，以实施例9（1-4）中记载的质粒pTrc43SCchNH作为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCchNH的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有 MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在94℃保温2分钟后，进行10次94℃ 15秒、接着65℃ 30秒、接着72℃ 1分钟的保温循环，接着进行20次94℃ 15秒、接着70℃ 30秒、接着72℃ 1分钟的保温循环，进而在72℃保持7分钟。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.0kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶PstI和HindIII，使DNA片段双酶切，将酶切过的约1.0kbDNA进行纯化。
利用限制酶PstI和HindIII使实施例9（1-3）中记载的质粒pTrcLD(A113G)nh/774ch双酶切，将酶切过的质粒DNA进行纯化。
将这些纯化了的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶PstI和HindIII双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在6个质粒中，约1.0kb的DNA被插入到质粒pTrcLD(A113G)nh/774ch中。将这些质粒中的1个命名为pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCch。
（2）含有编码具有改变氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本发明蛋白质(A)的多核苷酸的本发明重组载体(ABC)
将具有SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）的寡核苷酸（有义引物）和具有SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的寡核苷酸（反义引物）用作引物，以实施例7的（8）中记载的质粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g作为模板，以使用Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的下述反应液组成进行PCR。
［反应液组成］
pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪（PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400）中，在94℃保温2分钟后，进行10次94℃ 15秒、接着65℃ 30秒、接着72℃ 1分钟的保温循环，接着进行20次94℃ 15秒、接着70℃ 30秒、接着72℃ 1分钟的保温循环，进而在72℃保持7分钟。
然后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测出约1.0kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶PstI和HindIII，使DNA双酶切，将酶切过的约1.0kbDNA进行纯化。
利用限制酶PstI和HindIII使实施例9（1-5）中记载的质粒pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCch双酶切，将酶切过的约6.4kb的质粒DNA进行纯化。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶进行连接，用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所挑选的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶PstI和HindIII双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在6个质粒中，约1.0kb的DNA被插入到上述约6.4kb的质粒DNA中。将这些质粒中的1个命名为pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCMch。
实施例10（使用拥有本发明重组载体(ABC)的转化体的处理物的L-α-氨基酸化合物的制备）
（1）拥有本发明重组载体(ABC)的转化体，所述本发明重组载体(ABC)含有编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的本发明蛋白质(A)的多核苷酸
使用质粒pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCch转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基上接种，在30℃振荡培养15小时。将所得的培养液离心分离，得到湿菌体。将约0.1g的该湿菌体悬浮于1ml的0.5MTris-HCl缓冲液（pH9）中，使用Multi-Beads Shocker（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得的破碎液在8000rpm、4℃进行10分钟的离心分离，得到约0.7ml离心上清液。
将0.1ml的所得的离心上清液、0.4ml的使用氨水调节为pH9的2-羟基-4-（甲硫基）丁酸（东京化成公司制）的40％水溶液、10mg的NAD＋、和20mg的硫酸铵混合，在30℃振荡18小时。对于该反应液，在下述条件下进行采用了液相色谱的含量分析。可知生成85.1g/L的L-甲硫氨酸。相对于在反应中使用的2-羟基-4-（甲硫基）丁酸的量，L-甲硫氨酸收率为21.5％。
（含量分析条件）
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
（2）拥有本发明重组载体(ABC)的转化体，所述本发明重组载体(ABC)含有编码具有改变氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本发明蛋白质(A)的多核苷酸
使用质粒pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCMch转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基上接种，在30℃振荡培养15小时。将所得的培养液离心分离，得到湿菌体。将约0.1g的该湿菌体悬浮于1ml的0.5MTris-HCl缓冲液（pH9）中，使用Multi-Beads Shocker（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm进行20分钟的破碎处理。将所得的破碎液在8000rpm、4℃进行10分钟的离心分离，得到约0.7ml离心上清液。
将0.1ml的所得的离心上清液、0.4ml的使用氨水调节为pH9的2-羟基-4-（甲硫基）丁酸（东京化成公司制）的40％水溶液、10mg的NAD＋、和20mg的硫酸铵混合，在30℃振荡2小时。对于该反应液，在下述条件下进行采用了液相色谱的含量分析。可知生成82.5g/L的L-甲硫氨酸。相对于在反应中使用的2-羟基-4-（甲硫基）丁酸的量，L-甲硫氨酸收率为20.8％。
（含量分析条件）
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例11（使用本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)的L-α-氨基酸化合物的制备）
（1）使用具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)的L-α-氨基酸化合物的制备
将0.1ml的实施例2（1）中制备的本发明蛋白质(B)的纯化酶液（40g蛋白质/L）的2倍稀释液、0.1ml的实施例2（2）中制备的本发明蛋白质(A)的纯化酶液（9g蛋白质/L）的2倍浓缩液、和0.1ml的实施例3（4）中制备的亮氨酸脱氢酶（A113G）纯化酶液（32.6g蛋白质/L）的2倍稀释液混合，用Amicon Ultra-15（Millipore公司制)浓缩，得到0.1ml的纯化酶混合液。将0.1ml的所得的纯化酶混合液、0.1ml的使用氨水调节为pH9的DL‐α‐羟基异己酸（ACROS ORGANICS公司制）的40％水溶液、10mg的NAD＋、0.3ml的0.5M Tris-HCl缓冲液（pH9.0）、和20mg的硫酸铵混合，在30℃振荡18小时。对于该反应液，在下述条件下进行采用了液相色谱的含量分析。可知相对于在反应中使用的DL‐α‐羟基异己酸的量，生成的L-亮氨酸为60.9％。
（含量分析条件）
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
（2）使用具有改变氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(B)和本蛋白质(C)的L-α-氨基酸化合物的制备
将0.1ml的实施例2（1）中制备的本发明蛋白质(B)的纯化酶液（40g蛋白质/L）的2.5倍稀释液、0.1ml的由实施例8（1）中的pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g转化体制备的本发明蛋白质(A)的纯化酶液（3.2g蛋白质/L）的4.5倍浓缩液、和0.1ml的实施例3（4）中制备的亮氨酸脱氢酶（A113G）纯化酶液（32.6g蛋白质/L）的2倍稀释液混合，用Amicon Ultra-15（Millipore公司制)浓缩，得到0.1ml的纯化酶混合液。将0.1ml的所得的纯化酶混合液、0.1ml的使用氨水调节为pH9的DL‐α‐羟基异己酸（ACROS ORGANICS公司制）的40％水溶液、10mg的NAD＋、0.3ml的0.5M Tris-HCl缓冲液（pH9.0）、和20mg的硫酸铵混合，在30℃振荡18小时。对于该反应液，在下述条件下进行采用了液相色谱的含量分析。可知相对于在反应中使用的DL‐α‐羟基异己酸的量，生成的L-亮氨酸为88.0％。
（含量分析条件）
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合
流量：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
产业可利用性
根据本发明，可提供氧化酶、编码该酶的多核苷酸、和利用它们的甲硫氨酸、亮氨酸等α-氨基酸化合物的制备方法等。
［序列表自由文本］
SEQ ID NO:9-12
设计用于PCR的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:13
编码脱氢酶的多核苷酸
SEQ ID NO:14-41
设计用于PCR的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:44-45
设计的氨基酸序列。
序列表
<110> SUMITOMO CHEMICAL CO., LTD.
<120> 脱氢酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用
<130> S33397WO01
<150> JP2014-143022
<151> 2014-7-11
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 353
<212> PRT
<213> 反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）
<400> 1
Met Lys Lys Leu Ser Ile Ala Gln Ala Tyr Glu Tyr Gly Arg Arg Val
1 5 10 15
Leu Met Ala Gln Gly Val Pro Glu Asp Ile Ala Arg Asp Val Ala Glu
20 25 30
His Leu Val Glu Ser Asp Arg Val Gly Tyr Ala Ser His Gly Leu Ser
35 40 45
Ile Leu Thr Asn Tyr Arg Arg Val Leu Ser Glu Gly Leu Ala Arg Pro
50 55 60
Asp Gly Arg Pro Glu Leu Val Asn Asp Arg Gly Ala Met Leu Ala Tyr
65 70 75 80
Asp Gly His Asn Gly Leu Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Val Ile Glu
85 90 95
Lys Ala Ile Glu Arg Thr Gln Glu His Gly Gln Cys Ile Leu Thr Leu
100 105 110
Arg His Ser His His Leu Gly Arg Met Gly His Phe Gly Glu Met Val
115 120 125
Ala Ala Lys Gly Leu Ile Leu Leu Ala Phe Thr Asn Val Ile Asn Arg
130 135 140
Ala Pro Thr Val Ala Pro Phe Gly Gly Ala Gln Ala Cys Leu Thr Thr
145 150 155 160
Asn Pro Leu Cys Phe Ala Gly Pro Leu Pro Gly Gly Arg Pro Pro Phe
165 170 175
Ile Val Asp Met Ala Thr Ser Ser Ile Ala Val Asn Lys Ala Arg Val
180 185 190
Leu Ala Ala Lys Gly Glu Pro Ala Pro Glu Gly Ala Leu Ile Asp Ala
195 200 205
Gln Gly Asn Pro Thr Thr Asp Pro Gly Ala Leu Phe Thr Asp Pro Pro
210 215 220
Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Tyr Ala Leu Gly Leu
225 230 235 240
Val Ala Glu Leu Leu Ala Gly Val Leu Ser Gly Gly Gly Thr Ile Gln
245 250 255
Pro Glu His Pro Arg Asn Gly Val Ala Thr Asn Asn Met Phe Ala Leu
260 265 270
Leu Leu Asp Pro Gln Val Asp Phe Asn Thr Asp Trp Arg Ser Leu Glu
275 280 285
Val Gly Ala Phe Ile Asp Tyr Leu His Ala Cys Lys Pro Gln Pro Gly
290 295 300
Val Glu Ser Val Gln Tyr Pro Gly Glu Tyr Glu Ala Arg Asn Arg Ala
305 310 315 320
Ile Asn Ala Asp Thr Val Glu Phe Asp Thr Arg Ile Trp Glu Gly Leu
325 330 335
Thr Arg Leu Ala Val Asp Leu Gly Val Pro Glu Ala Leu Pro His Glu
340 345 350
Gly
<210> 2
<211> 1059
<212> DNA
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 2
atgaaaaagc tctccatcgc ccaagcctat gaatacggcc gccgcgtgct gatggcgcaa 60
ggcgtgcccg aggacatcgc ccgcgacgtg gccgaacacc tggtcgaatc cgaccgcgtg 120
ggctacgcca gccacggcct gtccatcctg acgaactacc gccgcgtgct gtccgagggc 180
ctggcccgcc ccgacggccg ccccgaactg gtcaacgacc gcggcgccat gctggcctac 240
gacggccaca acggcctggg ccagtacgtc ggcaaggtgg tcatcgaaaa agccatcgag 300
cgcacccagg agcacggcca gtgcatcctg accctgcgcc acagccacca cctgggccgc 360
atgggccatt tcggcgaaat ggtggcggcc aagggcctga tcctgctggc cttcaccaac 420
gtgatcaacc gcgcccccac cgtggccccc ttcggcggcg cgcaggcctg cctgaccacc 480
aacccgctgt gcttcgccgg ccccctgccc ggaggccgcc cgcccttcat cgtggacatg 540
gccaccagct ccatcgccgt caacaaggcc cgcgtgctgg ccgccaaggg cgaacccgcc 600
cccgaaggcg cgctgatcga cgcccagggc aaccccacca cggaccccgg cgcgctcttc 660
accgacccgc ccggcgccct gctgcccttc ggcggccaca agggctacgc cctgggcctg 720
gtggccgaac tgctggccgg cgtcctgtcc ggcggcggca cgatccagcc ggaacacccc 780
cgcaacggcg tggccacgaa caacatgttc gcgctcctgc tggacccgca ggtggacttc 840
aacaccgact ggcgctccct ggaagtcggc gccttcatcg actacctgca cgcctgcaag 900
ccccaacccg gcgtcgaatc ggtgcaatat cccggcgaat acgaagcccg caaccgcgcc 960
atcaacgcgg acaccgtgga attcgacacc cgcatctggg aaggcctgac cagactcgcc 1020
gtggacctgg gcgtcccgga agccctgccg cacgaaggc 1059
<210> 3
<211> 325
<212> PRT
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 3
Met Ser Gln Lys Pro Lys Ile Ile Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Asp
1 5 10 15
Leu Arg Glu Arg Val Ala Ala Ala Cys Glu Ile Ile Asp Val Pro Val
20 25 30
Gly Gln Asn Pro Ala Gln Ala Val Pro Glu Ala Gln Arg Ala Glu Val
35 40 45
Ala Gly Met Val Cys Thr Val Arg Thr Arg Val Asp Gln Ala Leu Leu
50 55 60
Asp Ala Phe Pro Ala Leu Ala Val Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Phe
65 70 75 80
Asp Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Asn Arg Arg Gln Val Leu Ile Cys
85 90 95
Asn Thr Pro Gly Val Leu Asp Gly Ala Val Ala Asp Val Thr Ile Gly
100 105 110
Leu Met Leu Cys Leu Ala Arg Asn Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe Val
115 120 125
Arg Ser Gly Ala Trp Thr Lys Ser Ala Phe Pro Leu Thr Thr Asp Ile
130 135 140
Arg Gly Lys Thr Leu Gly Leu Leu Gly Met Gly Arg Ile Gly Lys Val
145 150 155 160
Val Ala Arg Thr Ala Gln Ala Phe Asp Met Lys Val Ile Tyr His Asn
165 170 175
Arg Arg Glu Asp Arg Ser Val Gln Gly Leu Ala Ala Tyr Val Gly Arg
180 185 190
Asp Glu Leu Phe Lys Phe Ser Asp Val Leu Ser Ile His Ile Pro Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Thr Arg His Ser Val Gly Lys Arg Glu Phe Glu Leu Met
210 215 220
Lys Pro Thr Ala Tyr Val Ile Asn Thr Ala Arg Gly Pro Val Leu Asp
225 230 235 240
Glu Ala Ala Leu Val Gln Ala Leu Arg Ser Gly Thr Ile Ala Gly Ala
245 250 255
Gly Leu Asp Val Met Glu Gln Glu Pro Leu Pro Pro Ser Ser Pro Leu
260 265 270
Cys Glu Leu Pro Asn Val Val Leu Gln Ala His Val Gly Ser Ala Thr
275 280 285
His Glu Thr Arg Arg Ala Met Ile Asp Leu Ala Val Ala Asn Leu Leu
290 295 300
Asp Ala Leu Ala Gly Arg Lys Pro Gln Ala Met Val Asn Pro Gln Val
305 310 315 320
Trp Glu Ala Arg Gly
325
<210> 4
<211> 975
<212> DNA
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 4
atgagccaaa aaccgaaaat catcgtatcc gcgccggtgc ccgccgatct gcgcgagcgc 60
gtggccgccg cctgtgaaat catcgacgtg cccgtggggc agaaccccgc gcaagccgtg 120
cccgaggcgc agcgcgccga agtcgctggc atggtctgca cggtgcgcac ccgcgtggac 180
caggcgttgc tcgacgcttt tcccgcgcta gccgtcagtt ccaatttcgc cgtgggattc 240
gacaacgtcg atctggacgc ggccaaccgc cgccaggtgc tcatctgcaa tacgcccggc 300
gtgctggacg gcgcggtcgc ggacgtgacc atcggcctga tgctgtgcct ggcccgcaac 360
ctggtggccg gcgacgcgtt cgtgcgcagc ggcgcctgga ccaagagcgc gtttccactg 420
accacggaca tacgcggcaa gacgctgggc ctgctcggca tgggccgtat cggcaaggtg 480
gtggcgcgca cggcgcaggc tttcgacatg aaggtgatct atcacaaccg gcgcgaggat 540
cggtcggtgc aaggtctggc cgcctacgtc gggcgcgacg agctgttcaa gttctcggac 600
gtgctgagca tccacatccc gctgtcggcc gagacgcgcc attccgtggg caagcgtgaa 660
ttcgagctga tgaagcctac ggcttatgtc atcaatacgg cgcgcggccc ggtgctggac 720
gaggcggcgc tggtccaggc gctgcgcagc ggcacgatcg ccggcgccgg cctggacgtg 780
atggagcagg agccgctgcc gccgtccagc cccttgtgcg agctgcccaa cgtggtgttg 840
caggcgcacg tgggcagcgc cacccacgag acgcggcgcg ccatgatcga cctggcggtg 900
gccaacctgc tggacgcgct ggccgggcgc aagccgcagg ccatggtcaa cccgcaggtg 960
tgggaagccc gcggc 975
<210> 5
<211> 325
<212> PRT
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 5
Met Ser Gln Lys Pro Lys Ile Ile Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Asp
1 5 10 15
Leu Arg Glu Arg Val Ala Ala Ala Cys Glu Ile Ile Asp Val Pro Val
20 25 30
Gly Gln Asn Pro Ala Gln Ala Val Pro Glu Ala Gln Arg Ala Glu Val
35 40 45
Ala Gly Met Val Cys Thr Val Arg Thr Arg Val Asp Gln Ala Leu Leu
50 55 60
Asp Ala Phe Pro Ala Leu Ala Val Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Phe
65 70 75 80
Asp Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Asn Arg Arg Gln Val Leu Ile Cys
85 90 95
Asn Thr Pro Gly Val Leu Asp Gly Ala Val Ala Asp Ile Thr Ile Gly
100 105 110
Leu Met Leu Cys Leu Ala Arg Asn Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe Val
115 120 125
Arg Ser Gly Ala Trp Thr Lys Ser Ala Phe Pro Leu Thr Thr Asp Ile
130 135 140
Arg Gly Lys Thr Leu Gly Leu Leu Gly Met Gly Arg Ile Gly Lys Val
145 150 155 160
Val Ala Arg Thr Ala Gln Ala Phe Asp Met Lys Val Ile Tyr His Asn
165 170 175
Arg Arg Glu Asp Arg Ser Val Gln Gly Leu Ala Ala Tyr Val Asp Arg
180 185 190
Asp Glu Leu Phe Lys Phe Ser Asp Val Leu Ser Ile His Ile Pro Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Thr Arg His Ser Val Gly Lys Arg Glu Phe Glu Leu Met
210 215 220
Lys Pro Thr Ala Tyr Val Ile Asn Thr Ala Arg Gly Pro Val Leu Asp
225 230 235 240
Glu Ala Ala Leu Val Arg Ala Leu Arg Ser Gly Thr Ile Ala Gly Ala
245 250 255
Gly Leu Asp Val Met Glu Gln Glu Pro Leu Pro Pro Ser Ser Pro Leu
260 265 270
Cys Glu Leu Pro Asn Val Val Leu Gln Ala His Val Gly Ser Ala Thr
275 280 285
His Glu Thr Arg Arg Ala Met Ile Asp Leu Ala Val Ala Asn Leu Leu
290 295 300
Asp Ala Leu Ala Gly Arg Lys Pro Gln Ala Met Val Asn Pro Gln Val
305 310 315 320
Trp Glu Ala Arg Gly
325
<210> 6
<211> 978
<212> DNA
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 6
atgtctcaaa aaccaaaaat catcgttagc gcaccagttc cggccgatct gcgcgaacgt 60
gttgcagcgg cctgcgaaat tatcgatgtg cctgttggtc agaatccggc gcaggcggtt 120
ccagaggcgc agcgtgcgga agtagccggt atggtatgta ctgtacgtac gcgtgtggat 180
caggctctgc tggatgcgtt cccggccctg gccgtttcca gcaacttcgc ggtgggtttt 240
gacaacgtgg acctggacgc ggcgaaccgt cgccaggtac tgatttgcaa cacccctggc 300
gttctggacg gcgctgttgc tgatattacc atcggcctga tgctgtgcct ggctcgtaac 360
ctggtggcag gtgacgcttt cgttcgcagc ggtgcttgga ccaaatccgc ctttccgctg 420
accaccgaca tccgtggtaa aaccctgggc ctgctgggca tgggccgcat cggcaaagtc 480
gtcgcacgca ccgcgcaggc tttcgatatg aaggtgatct accataaccg tcgtgaagat 540
cgctctgtac agggcctggc ggcatacgtc gatcgtgacg agctgttcaa attcagcgac 600
gtcctgtcta tccacatccc gctgtctgct gaaacgcgcc actccgtagg caaacgtgag 660
tttgaactga tgaagccgac cgcgtatgtt attaacactg cgcgtggtcc ggttctggat 720
gaagcagcac tggtacgggc actgcgctct ggtacgattg ctggtgctgg tctggacgtg 780
atggaacagg aaccgctgcc gccgtcttcc ccgctgtgtg agctgccgaa tgtcgtgctg 840
caagctcacg tgggttccgc gactcacgaa actcgtcgtg ctatgattga tctggcggtt 900
gctaacctgc tggacgcact ggcaggccgt aaaccgcagg caatggttaa cccgcaggtg 960
tgggaagccc gtggctaa 978
<210> 7
<211> 364
<212> PRT
<213> 球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）
<400> 7
Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Gly Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu
115 120 125
Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile
165 170 175
Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu
180 185 190
His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala
195 200 205
Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp
210 215 220
Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr
260 265 270
Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile
305 310 315 320
Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg
355 360
<210> 8
<211> 1095
<212> DNA
<213> 球形芽孢杆菌
<400> 8
atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60
gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120
ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180
ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240
acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300
cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccggtg aagatgttgg tacaaccgta 360
acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420
ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480
gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540
ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600
gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660
gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720
gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780
aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840
gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900
tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960
tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020
gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080
ttgaacggcc gttaa 1095
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 9
ccatatgaaa aagctctcca tcgcccaag 29
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 10
actcgaggcc ttcgtgcggc agggcttc 28
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 11
ccatatgagc caaaaaccga aaatcatcg 29
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 12
actcgaggcc gcgggcttcc cacacctgcg gg 32
<210> 13
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸，编码脱氢酶
<400> 13
atgtctcaaa aaccaaaaat catcgttagc gcaccagttc cggccgatct gcgcgaacgt 60
gttgcagcgg cctgcgaaat tatcgatgtg cctgttggtc agaatccggc gcaggcggtt 120
ccagaggcgc agcgtgcgga agtagccggt atggtatgta ctgtacgtac gcgtgtggat 180
caggctctgc tggatgcgtt cccggccctg gccgtttcca gcaacttcgc ggtgggtttt 240
gacaacgtgg acctggacgc ggcgaaccgt cgccaggtac tgatttgcaa cacccctggc 300
gttctggacg gcgctgttgc tgatgttacc atcggcctga tgctgtgcct ggctcgtaac 360
ctggtggcag gtgacgcttt cgttcgcagc ggtgcttgga ccaaatccgc ctttccgctg 420
accaccgaca tccgtggtaa aaccctgggc ctgctgggca tgggccgcat cggcaaagtc 480
gtcgcacgca ccgcgcaggc tttcgatatg aaggtgatct accataaccg tcgtgaagat 540
cgctctgtac agggcctggc ggcatacgtc ggtcgtgacg agctgttcaa attcagcgac 600
gtcctgtcta tccacatccc gctgtctgct gaaacgcgcc actccgtagg caaacgtgag 660
tttgaactga tgaagccgac cgcgtatgtt attaacactg cgcgtggtcc ggttctggat 720
gaagcagcac tggtacaggc actgcgctct ggtacgattg ctggtgctgg tctggacgtg 780
atggaacagg aaccgctgcc gccgtcttcc ccgctgtgtg agctgccgaa tgtcgtgctg 840
caagctcacg tgggttccgc gactcacgaa actcgtcgtg ctatgattga tctggcggtt 900
gctaacctgc tggacgcact ggcaggccgt aaaccgcagg caatggttaa cccgcaggtg 960
tgggaagccc gtggctaa 978
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 14
gccatggaaa tcttcaagta tatgg 25
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 15
gggcccgggt taacggccgt tcaaaatatt 30
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 16
gtcgctatat taccggtgaa gatgttg 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 17
caacatcttc accggtaata tagcgac 27
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 18
gatagtattc caacctatgt tgcggc 26
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 19
gccgcaacat aggttggaat actatc 26
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 20
gggcatatgg aaatcttcaa gtatatgg 28
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 21
ggatccttaa cggccgttca aaatatt 27
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 22
cgtagcttac aaactttgcg agtatttac 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 23
gtaaatactc gcaaagtttg taagctacg 29
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 24
ccatggctat gaaaaagctc tccatcgccc 30
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 25
caagcttgct agccttcgtg cggcagggct tc 32
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 26
cggatccgag gaaacagacc atgg 24
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 27
gctgcagcct agccttcgtg cggcagggct tc 32
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 28
gctgcagcag gaaacagacc atgg 24
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 29
caagcttgtt agccacgggc ttcccacacc 30
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 30
ccatatgtct caaaaaccaa aaatcatcg 29
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 31
actcgaggcc acgggcttcc cacacctgcg 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 32
gccatggcta tgtctcaaaa accaaaaatc 30
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 33
ggatcctcag tggtggtggt ggtggtg 27
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 34
cgctgttgct gatattacca tcggcctg 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 35
caggccgatg gtaatatcag caacagcg 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 36
ggcggcatac gtcgatcgtg acgagctg 28
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 37
cagctcgtca cgatcgacgt atgccgcc 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 38
gcagcactgg tacgggcact gcgctctg 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 39
cagagcgcag tgcccgtacc agtgctgc 28
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 40
gctgcagctc agtggtggtg gtggtggtg 29
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 41
caagcttgtc agtggtggtg gtggtggtg 29
<210> 42
<211> 364
<212> PRT
<213> 球形芽孢杆菌
<400> 42
Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu
115 120 125
Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile
165 170 175
Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu
180 185 190
His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala
195 200 205
Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp
210 215 220
Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr
260 265 270
Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile
305 310 315 320
Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg
355 360
<210> 43
<211> 1095
<212> DNA
<213> 球形芽孢杆菌
<400> 43
atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60
gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120
ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180
ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240
acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300
cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccgctg aagatgttgg tacaaccgta 360
acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420
ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480
gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540
ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600
gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660
gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720
gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780
aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840
gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900
tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960
tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020
gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080
ttgaacggcc gttaa 1095
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的氨基酸序列
<400> 44
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His
20
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的氨基酸序列
<400> 45
Leu Glu His His His His His His
1 5

Claims (43)

1.编码下述（A1）或（A3）的氨基酸序列的多核苷酸：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸的能力和将α-羟基-异己酸氧化转换成对应的α-氧代-异己酸的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列。
2.权利要求1记载的多核苷酸，其具有包含以使得编码所述氨基酸序列的核苷酸序列的密码子使用频率匹配大肠杆菌的密码子使用频率的方式选择的密码子的改变的核苷酸序列。
3.在宿主细胞内可发挥功能的启动子与权利要求1或2记载的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
4.含有权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸的重组载体。
5.将权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸或权利要求4记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体。
6.权利要求5记载的转化体，其中宿主细胞是微生物。
7.拥有权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸的转化体。
8.重组载体的制备方法，其包含在可在宿主细胞内复制的载体中整合权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸的步骤。
9.转化体的制备方法，其包含将权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸或权利要求4记载的重组载体导入宿主细胞的步骤。
10.编码下述（B1）的氨基酸序列的多核苷酸：
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
11.在宿主细胞内可发挥功能的启动子与权利要求10记载的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
12.含有权利要求10或11记载的多核苷酸的重组载体。
13.将权利要求10或11记载的多核苷酸或权利要求12记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体。
14.权利要求13记载的转化体，其中宿主细胞是微生物。
15.拥有权利要求10或11记载的多核苷酸的转化体。
16.重组载体的制备方法，其包含在可在宿主细胞内复制的载体中整合权利要求10或11记载的多核苷酸的步骤。
17.转化体的制备方法，其包含将权利要求10或11记载的多核苷酸或权利要求12记载的重组载体导入宿主细胞的步骤。
18.含有权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸和权利要求10或11记载的多核苷酸的重组载体。
19.权利要求18记载的重组载体，进一步包含编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
20.权利要求19记载的重组载体，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质是亮氨酸脱氢酶。
21.权利要求19或20记载的重组载体，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（C1）的氨基酸序列：
（C1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
22.将权利要求18至21中任一项记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体。
23.权利要求22记载的转化体，其中宿主细胞是微生物。
24.转化体，其拥有：
i）具有编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
ii）权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸；和
iii）权利要求10或11记载的多核苷酸。
25.下述（A1）或（A3）的氨基酸序列的蛋白质：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸的能力和将α-羟基-异己酸氧化转换成对应的α-氧代-异己酸的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列。
26.下述（B1）的氨基酸序列的蛋白质：
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
27.L-α-氨基酸化合物的制备方法，其包含：
（1）使下述（A1）或（A3）的氨基酸序列的蛋白质和下述（B1）的氨基酸序列的蛋白质中的任一或两者与α-羟基羧酸化合物作用，得到对应的α-氧代羧酸化合物的步骤：
（A1）SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、
（A3）i）在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中，具有选自第109位的缬氨酸置换为异亮氨酸、第191位的甘氨酸置换为天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置换为精氨酸中的1个以上氨基酸置换的改变的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸或其钙盐氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸的能力和将α-羟基-异己酸氧化转换成对应的α-氧代-异己酸的能力中的任一或两者的蛋白质的氨基酸序列；
（B1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
和
（2）使具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤（1）中得到的α-氧代羧酸化合物作用，得到对应的L-α-氨基酸化合物的步骤。
28.权利要求27记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是含硫α-羟基羧酸化合物，对应的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物，对应的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物，步骤（1）中与α-羟基羧酸化合物作用的蛋白质是至少具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸或其钙盐氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸的能力的蛋白质。
29.权利要求28记载的制备方法，其中：
含硫α-羟基羧酸化合物是式（1）所示化合物：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基；
含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义；
含硫L-α-氨基酸化合物是式（3）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义。
30.权利要求27记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是α-羟基-异己酸，对应的α-氧代羧酸化合物是α-氧代-异己酸，对应的L-α-氨基酸化合物是L-亮氨酸，步骤（1）中与α-羟基羧酸化合物作用的蛋白质是至少具有将α-羟基-异己酸氧化转换成对应的α-氧代-异己酸的能力的蛋白质。
31.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质是亮氨酸脱氢酶。
32.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（C1）的氨基酸序列：
（C1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
33.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）中与α-羟基羧酸化合物作用的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
34.权利要求33记载的制备方法，其中所述转化体是权利要求5、6、7、13、14、15、22、23或24中任一项记载的转化体。
35.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
36.权利要求35记载的制备方法，其中所述转化体是权利要求22、23或24中任一项记载的转化体。
37.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）在具有将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成氧化型的能力的蛋白质的存在下进行。
38.权利要求37记载的制备方法，其中具有将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成氧化型的能力的蛋白质是进一步具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质。
39.权利要求37记载的制备方法，其中具有将还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成氧化型的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
40.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中步骤（2）在具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质的存在下进行。
41.权利要求40记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质是进一步具有将α-羟基羧酸化合物氧化转换成对应的α-氧代羧酸化合物的能力的蛋白质。
42.权利要求40记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
43.权利要求27至30中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）和步骤（2）在一个反应体系中进行。
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