JP2023527107A - シスチンを生体触媒還元するための酵素的触媒酸化還元系のコア構成成分としての生体触媒 - Google Patents
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Abstract
本発明は、シスチンをシステインへ還元するための酵素に関し、この酵素が、ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．４．８又はＥＣ１．８．４．１０を有するチオレドキシン（タンパク質ｉ）及びＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．１．９を有するチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）のタンパク質活性を備える融合タンパク質であり、この融合タンパク質の活性が、上記タンパク質ｉ及びｉｉと同じであるが融合していない個々のタンパク質の混合の活性の少なくとも１００％であることを特徴とする。本発明はまた、上記融合タンパク質を用いる補因子の存在下で、シスチンをシステインへ酵素的に還元するための方法にも関する。
Description
本発明は、シスチンをシステインへ還元するための酵素に関し、この酵素が、ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．４．８又はＥＣ１．８．４．１０を有するチオレドキシン（タンパク質ｉ）及びＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．１．９を有するチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）のタンパク質活性を備える融合タンパク質であり、ここで、この融合タンパク質の活性が、上記タンパク質ｉ及びｉｉと同じであるが融合していない個々のタンパク質の混合物の活性の少なくとも１００％であることを特徴とする。本発明はさらに、上記融合タンパク質を用いる補因子の存在下で、シスチンをシステインへ酵素的に還元するための方法に関する。
システインは、Ｃｙｓ又はＣと略されるが、側鎖－ＣＨ２－ＳＨを有するα－アミノ酸である。天然に存在するエナンチオマー形態は、Ｌ－システインであり、そしてこれのみがタンパク質を構成するアミノ酸であるので、本発明の文脈においては、システインが記述子なしで用いられる場合、Ｌ－システインを意味する。スルフヒドリル基の酸化は、一緒にジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基を生じ、その結果として、シスチンの形成をもたらし得る。シスチンについては、上記と同じことがいえ、すなわち記述子のない場合、本発明においてＬ－エナンチオマー（又はＲ，Ｒ－シスチン）を意味する。Ｌ－システインは、アミノ酸メチオニンから形成できるため、ヒトにとって半必須アミノ酸である。
アミノ酸Ｌ－システインは、例えば、（詳細には製パン業界における）食品添加物として、化粧品における原材料として、及び活性医薬成分（詳細にはＮ－アセチルシステイン及びＳ－カルボキシメチルシステイン）の製造のための開始物質として使用されており、したがって、経済的に重要である。食品産業界における香味添加（例えば鶏肉又は食肉の香味添加）物質としてのシステインの使用が、特に重要であるとみられる。Ｌ－システインはまた、こね粉のレオロジーを改変するためにも使用され、及び例えば果汁における抗酸化剤としても使用される。
全ての生物において、Ｌ－システインは、硫黄代謝における重要な役割を果たす。これは、タンパク質、メチオニン、ビオチン、リポ酸、グルタチオン及び他の硫黄含有代謝物の合成のために使用される。Ｌ－システインはまた、補酵素Ａの生合成においても使用される。酵素において、チオール基は、しばしば、反応の触媒において重要な役割を果たすか、又は分子内又は分子間のジスルフィド結合を通してタンパク質を安定化させる。
Ｌ－システインは、髪、毛、爪、ひづめ、羽根及び角などのケラチン含有物質から、加水分解によって得られ得る。しかし、このような方法は、常に生物安全性及び環境保護に関する問題を提起する。これらはまた、生産性が低い。代替法として、前駆体からの生体内変換による生成のための方法及びＬ－システインの発酵生産のための方法が、開発されている（ＵＳ６２１８１６８Ｂ１、ＵＳ５９７２６６３Ａ、ＵＳ２００４－０３８３５２Ａ、ＣＡ２３８６５３９Ａ２、ＥＰ２１３８５８５、ＥＰ１７６９０８０、及びＥＰ２７２６６２５Ｂ１）。
発酵生産の不利益は、Ｌ－システインの（発酵制御を最適化した後であってさえ）低い収率であり、これはまた、システインが、大気中の酸素の存在下で酸化することによって主にジスルフィドＬ－シスチンとして存在し、この形態で得られ得るためでもある。
酸化反応は、可逆的であり、したがって、Ｌ－シスチンは、選択的還元によって変換されて、Ｌ－システインに戻され得る。しかし、Ｌ－シスチンが、（例えば傾瀉器を用いて）細胞から分離された後の電気分解によって、Ｌ－システインへと還元されて戻った場合、この化学変換は、このようなＬ－システインが、香味添加剤の規則（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｆｌａｖｏｒｉｎｇｓ）にしたがって天然であるとは申告できないことを意味する。
香味添加剤に対するＥＵ規則（ＥＵ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｆｌａｖｏｒｉｎｇｓ、１３３４／２００８ 食品のラベル表示規則の再編に対する規則第２２項）にしたがって、天然の香味料は、以下のように規定されている：「天然」香味添加剤は、天然に存在しそして天然において検出されている、香味添加特性を有する化学的に定義された物質である。これらは、好適な物理的、酵素的又は微生物的プロセスによって、植物、動物又は微生物起源の開始物質から得られ、そのまま使用される、又は１以上の従来の食品製造方法によってヒトが消費するために調製される。
用語「天然」は、本出願においてもこの意味で使用される。風味添加剤の製造における天然の原材料の使用には、関心が高い。
酵素的開裂は、高い発酵性シスチン収量を利用して、天然のシステインの製造を可能にする。このような酵素的プロセスの実施のために、好適な酸化還元酵素カスケード系が、必要である。文献公知のジスルフィド開裂酵素の例としては、チオレドキシン、グルタレドキシン、及びジスルフィドイソメラーゼが挙げられる。しかし、これらの酵素は、多くの場合、ポリペプチドの中又はタンパク質の２つのサブユニットの間に形成されているジスルフィドに対して作用する。遊離のシスチンの開裂は、少数のタンパク質について（例えば、細菌のチオレドキシンについて、これは、次いでチオレドキシンレダクターゼによって再生成され、そのためにＮＡＤＰＨが補因子として必要とされる）しか文献に記載されていない。このような酸化還元酵素又は酵素カスケードは、多くの場合、対応する電子を還元反応のために提供するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを、補因子として必要とする。
したがって、シスチンレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨなどの補因子の補助によって基質シスチンを使用し、２つの電子を移動させて、最終生成物として２つのシステインを形成することを、特徴とする。
よって、このことは、補因子がこの反応に等モル量加えられなければならないことを意味し、費用がかさむので、経済的に望ましくない。これは、補因子を再生成する第２反応と組み合わせることによって、回避することができる。再生成系として、アルコールデヒドロゲナーゼ又はグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼなどのデヒドロゲナーゼを使用することができる。経済的な視点からは、相応する高収率で、発酵によってこれらの酵素を生成することをもできなければならない。
必要な酵素の生成に関する労力は、酵素の数と共に増大するので、遺伝子操作によって個別の酵素を融合することに、経済的な意義がある。これは、空間的に近接していることによって１つの酵素から次の酵素へとより容易に基質が移動できるという、さらなる利点を有する。しかし、このような酵素融合は、多くの場合、発酵生産性の減衰をもたらすか、又はさもなければ、この融合タンパク質が、低減した活性を有するかもしくは全く活性を有さない。２つの酵素が融合タンパク質において相互阻害効果を有することを避けるために、代わりに、この２つのタンパク質を接続し／隔てる、より長いリンカー配列が、しばしば使用される。非常に短いリンカー配列が使用されているか、又は全くリンカー配列が使用されていない場合、開始タンパク質の混合物と比較して同等の活性を示す融合タンパク質は、稀である。
らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）において（Ｗｉｅｌｅｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，ｐｐ．２５６０４－２５６０６）、Ｎ末端がチオレドキシンレダクターゼと相同でありかつＣ末端がチオレドキシンと相同であるタンパク質が、チオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼとして活性であることが見出されている。この２つのタンパク質単位を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の相同なタンパク質と比較すると、これらは、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）において、２２アミノ酸スペーサー／リンカーを介して連結されている。
Ｗｉｅｌｅｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，ｐｐ．２５６０４－２５６０６
本発明の目的は、安価に生産され得、そして先行技術において公知のチオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼタンパク質の混合物と少なくとも同程度に高い活性を有する、シスチンをシステインへ生体触媒還元するためのタンパク質を提供することである。シスチンをシステインへ酵素的に還元するための方法におけるこのタンパク質の使用により、特に効率的かつ経済的な方法を提供する。
この目的は、シスチンをシステインへ還元するための酵素を提供することによって達成され、この酵素は、ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．４．８又はＥＣ１．８．４．１０を有するチオレドキシン（タンパク質ｉ）及びＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．１．９を有するチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）のタンパク質活性を備える融合タンパク質であり、融合タンパク質の活性が、チオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼと同じであるが融合していない個々のタンパク質の混合物の活性の少なくとも１００％であることを特徴とする。
本発明にしたがい、シスチンをシステインへ還元するための酵素は、タンパク質ｉ及びｉｉのタンパク質活性を備える融合タンパク質である。これは、タンパク質ｉ（ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．４．８又はＥＣ１．８．４．１０に記載されるＴｒｘ）の活性及びタンパク質ｉｉ（ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．１．９に記載されるＴＲ）の活性に寄与するコード配列（ｃｄｓ）が、融合していることを意味する。第１のｃｄｓの後ろに存在する停止コドンを除去することにより、２つのｃｄｓが、１つのｃｄｓとして一緒に発現する。
Ｔｒｘのタンパク質活性は、活性部位にジスルフィド結合を有するオキシドレダクターゼであり、還元状態又は酸化状態で存在し得る。
この反応において、２つの電子が、２つのスルフヒドリル基からジスルフィド結合へと（分子内または分子間で）移された。ここで、Ｔｒｘ内において、分子内ジスルフィド結合が形成される。次いで、Ｔｒｘの還元状態は、オキシドレダクターゼＴＲの触媒活性によって戻される。これは、電子を必要とし、この電子は、Ｔｒｘに移されて、ジスルフィド結合を開裂する。
タンパク質が、シスチンに対して、Ｔｒｘ及び／又はＴＲ（本明細書中以後、タンパク質が両方の活性を有する場合にシスチンレダクターゼ／ＣＲ活性と呼ぶ）のどちらとして活性であるかは、以下の試験によって確認され得る：
まず、ＮＡＤＰＨの消費が、３４０ｎｍにて測光法により測定され得る。融合タンパク質、基質シスチン及び補因子ＮＡＤＰＨを含む混合物において、電子は、ＮＡＤＰＨからシスチンへと移され、システインを形成する。次いで、ＮＡＤＰＨの消費は、測光法によりモニタリングされ得る。
あるいは、形成されたシステインもまた、このような混合物（融合タンパク質、シスチン及びＮＡＤＰＨを含む）中で測定されてもよい。これは、システインの遊離のＳＨ基がＤＴＮＢ（５，５’－ジチオビス－２－ニトロ安息香酸；Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬）と反応して色素を形成する能力を用いる。この着色化合物Ｃｙｓ－ＴＮＢは、４１２ｎｍにて測定することができる。したがって、時間経過にわたるこの反応の過程は、シスチンに対する融合タンパク質の酵素活性を測定することを可能にする。
タンパク質ｉ及びタンパク質ｉｉは、好ましくは微生物配列である。
チオレドキシン（タンパク質ｉ）は、好ましくは、大腸菌由来のチオレドキシン１のタンパク質活性（本発明の文脈においてＴｒｘＡと略す）である。
チオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）は、好ましくは、大腸菌由来のチオレドキシンレダクターゼのタンパク質活性（本発明の文脈においてＴｒｘＢと略す）である。
２つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質が特に好ましく、ここで、これらのアミノ酸配列の１つは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及び特に好ましくは少なくとも９０％、配列番号７と同一であり、そして他方のアミノ酸配列は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及び特に好ましくは少なくとも９０％、配列番号８と同一であり、そしてここで、この融合タンパク質は、ＣＲ活性を有する。
したがって、融合タンパク質は、ＴｒｘＡＢ又はＴｒｘＢＡ／ＴｒｘＢ５Ａ（融合タンパク質ＴｒｘＡＢにおいてタンパク質ＴｒｘＡがＴｒｘＢに対してＮ末端側に配置された場合）と呼ばれる。反対に、融合タンパク質ＴｒｘＢＡ又はＴｒｘＢ５Ａにおいて、タンパク質ＴｒｘＢは、ＴｒｘＡに対してＮ末端側に配置されている。融合タンパク質は、ＴｒｘＡＢ、ＴｒｘＢＡ又はＴｒｘＢ５Ａであることが好ましい。融合タンパク質は、大腸菌由来のチオレドキシンＡ及びチオレドキシンＢのアミノ酸配列の融合であることが特に好ましく、特別に好ましくは、アミノ酸配列番号９、配列番号１０、及び配列番号２８からなる群より選択される１つである。
特に好ましい実施形態において、融合タンパク質はＴｒｘＢＡであり、特別に好ましくは、配列番号１０を有するアミノ酸配列である。
ＤＮＡ同一性の程度は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において見出され、ｂｌａｓｔｎアルゴリズムに基づく、「ヌクレオチドｂｌａｓｔ」プログラムによって決定される。デフォルトのパラメータを、２以上のヌクレオチド配列のアラインメントについてのアルゴリズムパラメータとして使用した。デフォルトの一般的パラメータは、以下である：最大標的配列＝１００；短クエリ＝「短入力配列についての自動補正パラメータ」；予測閾値＝１０；ワードサイズ＝２８；短入力配列についての自動補正パラメータ＝０。対応のデフォルトスコアリングパラメータは、マッチ／ミスマッチスコア＝１、－２；ギャップコスト＝線形である。
タンパク質配列は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／における「タンパク質ｂｌａｓｔ」プログラムを用いて比較される。このプログラムは、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用する。デフォルトのパラメータを、２以上のタンパク質配列のアラインメントについてのアルゴリズムパラメータとして使用した。デフォルトの一般的パラメータは、以下である：最大標的配列＝１００；短クエリ＝「短入力配列についての自動補正パラメータ」；予測閾値＝１０；ワードサイズ＝２８；短入力配列についての自動補正パラメータ＝０。対応のデフォルトスコアリングパラメータは、：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト＝存在：１１伸長：１；組成補正＝暫定補正スコアマトリックス補正。
本発明の文脈において、ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡＢ、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡなどのタンパク質は大文字で書き始め、他方で、これらのタンパク質をコードする配列（ｃｄｓとも略される）は、小文字によって識別される（ｔｒｘＡ、ｔｒｘＢ、ｔｒｘＡＢ、ｔｒｘＢＡ、ｔｒｘＢ５Ａ又はＭｌ－ｔｒｘＢＡ）。
本発明の文脈において、融合タンパク質という用語は、２つの別個のタンパク質であるチオレドキシン（Ｔｒｘ）及びチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）を含むタンパク質を意味する。これは、遺伝子によってコードされ、そのコード領域は、Ｔｒｘコード領域とＴＲコード領域とを含み、結果として、これらが一緒に１つの単位として転写されそしてポリペプチドへと翻訳される。
２つの個々のタンパク質であるＴｒｘ及びＴＲを用いることと比較してＴｒｘ及びＴＲを含む融合タンパク質を用いる詳細な利点は、空間における２つのタンパク質の位置からもたらされる：ＴＲは電子をＴｒｘへと移すが、ここで、ＴｒｘとＴＲとが、３次元的な拡散の過程において最初から互いに対面している必要はないが、融合タンパク質においては互いに連結している。言い換えると、空間的に近接であることは、電子が、酵素から他方へとより容易に受け渡され得ることを意味する。
個々のタンパク質は、別個に精製されなければならないが、融合タンパク質における酵素活性は共に単離されており、このこともまた、大きな経済的利点である。
好ましくは、融合タンパク質は、精製を補助するために、特に好ましくはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）などの配列を、さらに含む。Ｈｉｓタグは、タンパク質精製及び標的化したタンパク質を検出するために使用され得る、タンパク質タグである。ポリヒスチジンタグのアミノ酸配列は、少なくとも６つのヒスチジン（６ＨＩＳ）の配列であり、その遺伝子配列は、開始メチオニンコドンの後のＮ末端に又は停止コドンの前のＣ末端にて、ｃｄｓ中にクローニングされる。これは、ポリヒスチジンタグを有する融合タンパク質をもたらす。ただ１つのＨｉｓタグのクローニングは、Ｔｒｘ及びＴＲのタンパク質から構成される融合タンパク質を精製することを可能にする。このことは、精製に必要な反応工程をより少なくするだけでなく、クローニング戦略をも簡易化する意味がある。
加えて、ポリペプチド配列とＨｉｓタグとの間にプロテアーゼ又はインテインについての開裂部位を挿入することが可能であり、それによって、タンパク質精製の後にＨｉｓタグを切断して除くことが可能となる。
融合タンパク質において、Ｎ末端側に配置されたタンパク質のアミノ酸配列は、Ｃ末端側が１から最大５のアミノ酸によって短縮されることが好ましい。融合タンパク質において、Ｎ末端側に配置されたタンパク質のアミノ酸配列は、Ｃ末端側が１つのアミノ酸によって短縮されることが特に好ましい。
融合タンパク質において、Ｃ末端に位置するタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端側が、好ましくは１から最大５のアミノ酸、特に好ましくは１つのアミノ酸によって短縮される。特に好ましくは、融合タンパク質において、Ｃ末端に位置するタンパク質において、開始コドンが存在しない。この後者の特徴は、この点において翻訳し直すことがないという利点を有する。
さらに、チオレドキシン（タンパク質ｉ）及びチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）の融合タンパク質活性のアミノ酸配列は、融合タンパク質において、１から最大５のアミノ酸、特に好ましくは１つのアミノ酸のリンカー配列によって連結されていることが好ましい。
チオレドキシン（タンパク質ｉ）及びチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合タンパク質において互いに直接続くこと、すなわちリンカー配列が存在しないことが、特に好ましい。
上述したように、呼応して作用することによってそのクローニング、精製及び活性を改善するタンパク質を融合タンパク質中で一緒にすることは、有益である。しかし、２つの融合タンパク質の折り畳み又はこの場合に必須であるこれらの間の相互作用を妨げないために、長いリンカー配列が望ましいと考えられる。しかし、この場合、２つのタンパク質（Ｔｒｘ、ＴＲ）の直接融合が機能的酵素対をもたらすことが、驚くべきことに見出された。この事実は、融合タンパク質の活性が、融合の順序に依存するという知見により、より強調される。したがって、融合タンパク質ＴｒｘＡＢは、個々のタンパク質の混合物に匹敵する活性を示した。
融合タンパク質ＴｒｘＡＢ（配列番号９）において、ＴｒｘＡ配列（配列番号７）における停止コドンは存在せず、ＴｒｘＢ（配列番号８）における最初のアミノ酸（メチオニン、Ｍ）は欠失している。さらに、このタンパク質は、Ｈｉｓタグ（配列番号９におけるアミノ酸１～１２）を有する。ＴｒｘＡの最後のアミノ酸（Ａｌａ）とＴｒｘＢの開始コドンを除去したあとの最初のアミノ酸（Ｇｌｙ）との間には、リンカー配列が存在しない。
融合タンパク質ＴｒｘＢＡ（配列番号１０）において、ＴｒｘＢ配列（配列番号８）における最後のアミノ酸（リシン）及び停止コドンは存在せず、他方で、ＴｒｘＡ（配列番号７）における最初のアミノ酸（メチオニン、Ｍ）は欠失している。さらに、このタンパク質は、Ｈｉｓタグ（配列番号１０におけるアミノ酸１～１２）を有する。１アミノ酸（Ｇｌｙ）のリンカー配列が、ＴｒｘＢの最後から２番目のアミノ酸（Ａｌａ）とＴｒｘＡの最初のアミノ酸（Ｓｅｒ）との間に存在している。
融合タンパク質ＴｒｘＢ５Ａ（配列番号２８）については、ＴｒｘＢとＴｒｘＡとの間に５アミノ酸のリンカー配列（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）が存在することを除いて、ＴｒｘＢＡについて記載したことと同じことが適用される。
開始コドンと終止コドンとの間に位置する、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域は、コード配列（ｃｄｓ）と呼ばれる。ｃｄｓは、非コード領域に取り囲まれている。遺伝子と呼ばれるものは、生物学的に機能するタンパク質を生成するための基本情報の全てを含むＤＮＡの部分である。遺伝子は、転写によって一本鎖ＲＮＡコピーが生成される元となるＤＮＡの部分、及びさらに、この複製方法の調節に関与する発現シグナルを、含む。発現シグナルは、例えば少なくとも１つのプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位及びリボソーム結合部位を含む。さらに、ターミネーター及び１つ以上のオペレーターによる発現調節が、可能である。
機能的プロモーターについて、このプロモーターの調節下にあるｃｄｓは、ＲＮＡへと転写される。
融合タンパク質のタンパク質ｉ（チオレドキシン）をコードするＤＮＡの部分は、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドと、チオレドキシンをコードするＤＮＡマトリックス、例えば大腸菌から単離されたゲノムとを用いるＰＣＲによって最初に増幅されて、次いで、それぞれの場合において、同様の様式で生成された融合タンパク質のタンパク質ｉｉ（チオレドキシンレダクターゼ）配列を含むＤＮＡ分子と、標準的分子生物学技術によって、インフレーム融合が起こるように結合され得る。融合タンパク質においてタンパク質ｉとｉｉとの間に存在する、Ｃ末端に位置する融合パートナーの第２の開始コドンは、代替の読み取り枠を回避するために、削除されてもよい。２つの融合パートナーの転移点において、種々の長さのリンカー配列が、挿入されてもよい。
クローニング部位を介した融合の代わりに、ＤＮＡ分子全体を、遺伝子合成によって生成してもよい。次いで、このＤＮＡ分子は、公知の方法により、ベクター、例えばプラスミド内に導入されてもよく、又は細菌株の染色体内に直接組み込まれてもよい。好ましくは、ＤＮＡ分子は、プラスミド、例えばｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ－ＩＢＡ３、ｐＧＪ３４７７又はｐＥＴなどの公知の発現ベクターの誘導体内に、導入される。
このＤＮＡ分子は、まず、融合タンパク質のコード配列及びわずかな他のヌクレオチドを担い、プロモーター及びターミネーターからの所定の距離においてクローニングが起こるようにプラスミド内にクローニングされること、すなわち、このＤＮＡ分子が、プロモーターをコードする領域の３’及びターミネーターをコードする領域の５’にてプラスミド内にクローニングされることが好ましい。
好適なプロモーターは、構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーター、又は誘導性プロモーター、例えばｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ラムダＰＬ、ａｒａＢ、ｃｕｍａｔｅもしくはｔｅｔプロモーター又はこれらに由来する配列などの、当業者に公知の全てのプロモーターである。融合タンパク質は、特に好ましくは、アラビノース誘導型ａｒａＢプロモーター（ＰＢＡＤ）の制御下で発現される。
使用されるプラスミドは、選択マーカーを担ってもよい。好適な選択マーカーは、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、その他などの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。プラスミドは、好ましくは、発現によりアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。また、選択マーカーとして好適には、栄養要求性マーカーであり、これは、プラスミドを含むそれぞれの細菌株において欠失している、代謝において必須な遺伝子をコードするからである。
プラスミドは、当業者に公知の方法を用いて、細菌株の細胞に導入されてもよい（形質転換）。この細菌株は、好ましくは、グラム陰性菌、特に好ましくは腸内細菌科属の細菌株、特別に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）種の株である。
プラスミドを含む細菌株は、発酵プロセスにおいて使用されてもよく、すなわち、細菌細胞は、培地中、好ましくは選択的ＬＢ培地（プラスミド内に存在する選択マーカーに対応する）中で増殖されて、培養後に上澄みを捨てることを伴う沈殿法によって培地から分離され、溶解されてもよい。発現された融合タンパク質は、次いで、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばＨｉｓタグを介して、上記参照）によって、単離されてもよい。
本発明の酵素は、高収率で、よって安価で、発酵によって生成され得るという利点を有する。その生成は、特に経済的に有効であり、そしてまた、２種の別個のタンパク質を単離する代わりに、１種の融合タンパク質のみを生成し、精製し、そして単離する必要があるだけであるので、有益である。
酵素が、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨなどの電子供与体として、すなわち還元剤としての補因子によって再生成され得るということは、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを再生成するための系は既に存在しているので、有益である。
Ｔｒｘ及びＴＲの酵素活性は、補因子の変換を介して、例えば３４０ｎｍにて光化学的に決定され得る。これは、還元状態（ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ）から酸化状態（ＮＡＤＰ／ＮＡＤ）になる際に、３４０ｎｍでの吸光計数が有意に変化するから可能なのである。
種々の構築物（融合タンパク質）又は種々の混合比率の別個のタンパク質の酵素活性の測定の際、驚くべき、そして当業者に予測できなかったことに、この融合タンパク質の活性が、同じであるが融合していない、チオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの別個のタンパク質の混合物の活性の、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも１５０％、そして特に好ましくは少なくとも２００％であることを見出した。このことは、この融合タンパク質の活性が、同じであるが融合していない別々のタンパク質ｉ及びｉｉの混合物の活性と同程度に高いか、又はより高くすらあるということを意味する。
より正確には、このことは、補因子又は基質を含まない陰性対照の場合を除き、各々の場合において、基質、補因子及び緩衝系からなる同じ反応混合物を、最初に入れたことを意味する。同量の融合タンパク質を混合物に加えた後、又は個々のタンパク質ｉ（Ｔｒｘ）及びｉｉ（ＴＲ）を別の混合物に加えた後、同じ反応条件下で同じ時間に、補因子転換が測定された。又は、基質の量における減少又は生成物の量における増大を検出することも、同様に可能である。
この酵素は、好ましくは、融合タンパク質の遺伝子が、配列番号２と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及び特に好ましくは少なくとも９０％同一である１つのＤＮＡ配列、ならびに配列番号３と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及び特に好ましくは少なくとも９０％同一である別のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする。
特に好ましい実施形態において、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、配列番号５である。
本発明は、シスチンをシステインへ酵素的に還元するための方法をさらに提供し、この方法は、システインが補因子の存在下で本発明の酵素によって還元されることによって特徴づけられる。
シスチンからシステインへの酵素的還元において、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）は、２つのスルフヒドリル（－ＳＨ）基に変換され、すなわち、２分子のＬ－システインが、１分子の化学化合物シスチンから形成される。本発明の融合タンパク質は、還元を触媒し、そして電子をシスチンのジスルフィドに移す。
ここで驚いたことには、融合タンパク質ＴｒｘＢＡの活性は、同じであるが融合していない個々のタンパク質ＴｒｘＡ及びＴｒｘＢの混合物の活性よりも特に顕著に高かった（実施例４、図４を参照されたい）。
本発明の方法の特定の利点は、この方法を用いて生成されたシステインが、香味添加剤に対する規則（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｆｌａｖｏｒｉｎｇｓ）にしたがう天然のシステインとして、申請され得ることである。
経済的なプロセスのためのさらなる挑戦は、中性ｐＨ範囲（又は生理学的ｐＨ範囲、すなわちおよそｐＨ７．４）内の緩衝系における、シスチンの低い溶解性であった。
このプロセスは、好ましくは４～１１、特に好ましくは５～１０、そして特別に好ましくは６～９のｐＨ範囲内で起こる。
生理学的ｐＨでのシスチンをシステインへ酵素的に還元するための方法において本発明の酵素が使用される場合が特別に有益であり、したがってさらには特に好ましい。
このプロセスは、好ましくは２０～４０℃、特に好ましくは２５～３０℃の温度で起こる。
このプロセスは、好ましくは、補因子が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨからなる群より選択される物質であることを特徴とする。この補因子は、特に好ましくはＮＡＤＰＨである。
このプロセスは、好ましくは、還元後、形成されたシステインが単離されることによって、特徴づけられる。標的生成物のさらなる精製のために、以下の工程／手順が用いられ得る：
イオン交換吸着によるＬ－システインの単離
析出結晶化。
イオン交換吸着によるＬ－システインの単離
析出結晶化。
このようなプロセスは、先行技術から公知である（例えば、ＷＯ２０１３／０００８６４を参照されたい）。
シスチンからシステインへの還元において、本発明の酵素は、酸化され、すなわち、電子をシスチンへと移してジスルフィド結合を形成する。存在するＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ補因子の電子が、融合タンパク質（ＴＲ部分）の活性により融合タンパク質（Ｔｒｘ部分）へと移るので、ＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ＋が、それぞれ形成される。それゆえに、本方法は、補因子再生成酵素を含むことが好ましい。特に好ましくは、この補因子再生成酵素は、デヒドロゲナーゼであり、さらに、還元は、さらなる電子供与体の存在下で起こる。
補因子再生成酵素は、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼであってもよい。特に好ましい実施形態において、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼであり、イソプロパノールが、電子供与体として使用される。
本発明は、本明細書中以下で、例示的な実施形態を参照するがそれらに制限されることなく、より詳細に説明される。
実施例１：シスチンレダクターゼ系ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＢＡ、及びＴｒｘＡＢの生成
発現ベクターの調製：
対応する候補タンパク質ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡＢ、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡについてコードするＤＮＡ配列の発現のためのベクターとして、発現プラスミドｐＧＪ３４７７を選択した。これは、ＣｏｌＥ１複製起源に基づく、中～高コピープラスミド（細胞あたり５０～６０コピー）である。プラスミドマップを図１に示すが、このプラスミドマップ上に、共通の１カ所切断制限酵素の位置（６塩基の認識配列を有する）を示す。この配列を、配列番号１１に特定する。
発現ベクターの調製：
対応する候補タンパク質ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡＢ、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡについてコードするＤＮＡ配列の発現のためのベクターとして、発現プラスミドｐＧＪ３４７７を選択した。これは、ＣｏｌＥ１複製起源に基づく、中～高コピープラスミド（細胞あたり５０～６０コピー）である。プラスミドマップを図１に示すが、このプラスミドマップ上に、共通の１カ所切断制限酵素の位置（６塩基の認識配列を有する）を示す。この配列を、配列番号１１に特定する。
このプラスミドにおいて、それぞれの候補のコード配列を、アラビノース誘導型プロモーターＰＢＡＤの制御下に置いた。
まず、発現プラスミド全体を、逆ＰＣＲによって増幅した：
５０ｎｇのｐＧＪ３４７７ ＤＮＡ、それぞれ０．５ｐｍｏｌのプライマー ３４７７－ｆｗｒｄ（配列番号１２）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）、Ｑ５（Ｒ）反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）、１単位のＱ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、最終容量５０μｌ中。
ＰＣＲプログラム：９８℃にて１分間、次いで９８℃にて３０秒間、６５℃にて３０秒間（アニーリング）、及び７２℃にて２分間（合成）の３０サイクル。
５０ｎｇのｐＧＪ３４７７ ＤＮＡ、それぞれ０．５ｐｍｏｌのプライマー ３４７７－ｆｗｒｄ（配列番号１２）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）、Ｑ５（Ｒ）反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）、１単位のＱ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、最終容量５０μｌ中。
ＰＣＲプログラム：９８℃にて１分間、次いで９８℃にて３０秒間、６５℃にて３０秒間（アニーリング）、及び７２℃にて２分間（合成）の３０サイクル。
反応の最後に、制限酵素ＤｐｎＩ（１０単位、ＮＥＢ）を反応混合物に加え、そしてこの混合物を、３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。その後、ＤＮＡのクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）を行った。
ｔｒｘＡ及びｔｒｘＢのクローニング：
タンパク質－コード配列ｔｒｘＡ（配列番号２）及びｔｒｘＢ（配列番号３）のクローニングのために、オリゴヌクレオチドプライマーを決め、その標的遺伝子特異的配列を、少なくとも１５ヌクレオチド伸ばした。これは、ベクターＤＮＡの末端における配列と重なる。この遺伝子を、ＰＣＲによってＢＬ２１の大腸菌ゲノムから増幅した（コロニーＰＣＲ）。
タンパク質－コード配列ｔｒｘＡ（配列番号２）及びｔｒｘＢ（配列番号３）のクローニングのために、オリゴヌクレオチドプライマーを決め、その標的遺伝子特異的配列を、少なくとも１５ヌクレオチド伸ばした。これは、ベクターＤＮＡの末端における配列と重なる。この遺伝子を、ＰＣＲによってＢＬ２１の大腸菌ゲノムから増幅した（コロニーＰＣＲ）。
以下の混合物を、ＰＣＲによる増幅のために選択した：
５０ｎｇのゲノム大腸菌ＢＬ２１ ＤＮＡ（ＮＥＢ）、それぞれ０．５ｐｍｏｌのプライマーｔｒｘＡ－ｆｗｒｄ（配列番号１４）及びｔｒｘＡ－ｒｅｖ（配列番号１５）又はｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号１６）及びｔｒｘＢ－ｒｅｖ（配列番号１７）、Ｑ５（Ｒ）反応緩衝液（ＮＥＢ）、１単位のＱ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、最終容量５０μｌ中。
ＰＣＲプログラム：９８℃にて１分間、次いで９８℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間（アニーリング）、及び７２℃にて１５秒間（ｔｒｘＡ）又は３０秒間（ｔｒｘＢ）（合成）の３０サイクル。
５０ｎｇのゲノム大腸菌ＢＬ２１ ＤＮＡ（ＮＥＢ）、それぞれ０．５ｐｍｏｌのプライマーｔｒｘＡ－ｆｗｒｄ（配列番号１４）及びｔｒｘＡ－ｒｅｖ（配列番号１５）又はｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号１６）及びｔｒｘＢ－ｒｅｖ（配列番号１７）、Ｑ５（Ｒ）反応緩衝液（ＮＥＢ）、１単位のＱ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、最終容量５０μｌ中。
ＰＣＲプログラム：９８℃にて１分間、次いで９８℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間（アニーリング）、及び７２℃にて１５秒間（ｔｒｘＡ）又は３０秒間（ｔｒｘＢ）（合成）の３０サイクル。
反応の最後に、制限酵素ＤｐｎＩ（１０単位、ＮＥＢ）を反応混合物に加え、そしてこの混合物を、３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。その後、ＤＮＡのクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）を行った。
ＬＩＣ－ＰＣＲ：
一般に、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＬＩＣ－ＰＣＲ（ＰＣＲ生成物のライゲーション依存型クローニング）を介して、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ Ｃ． ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｐ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、ｐｐ．６０６９－６０７４に記載の通りに、基本発現ベクターｐＧＪ３４７７内に正確な塩基で導入した。
一般に、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＬＩＣ－ＰＣＲ（ＰＣＲ生成物のライゲーション依存型クローニング）を介して、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ Ｃ． ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｐ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、ｐｐ．６０６９－６０７４に記載の通りに、基本発現ベクターｐＧＪ３４７７内に正確な塩基で導入した。
この目的のために、それぞれの候補タンパク質の５０ｎｇの精製したコードＤＮＡを、５０ｎｇの調製したベクターＤＮＡと共に、ＬＩＣ－ＰＣＲ反応において使用した。
次いで、ＬＩＣ－ＰＣＲ混合物を、標準的方法を用いて、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞内に形質転換させ、そして選択的ＬＢ培地（ＬＢ＋１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）上にプレート播種し、そして３７℃にて１８時間にわたりインキュベートした。正しいクローンの同定のために、プラスミドＤＮＡを得られたコロニーから単離し、そして発現カセットを完全に配列決定した。
発現ベクターｐＧＪ３４７７及びコードＤＮＡ配列ｔｒｘＡ又はｔｒｘＢからなる得られたプラスミドを本明細書中以後、ｔｒｘＡ又はｔｒｘＢ発現ベクターと呼ぶ。
ｔｒｘＡＢ及びｔｒｘＢＡのクローニング：
対応する融合タンパク質ＴｒｘＡＢ又はＴｒｘＢＡをそれぞれコードするＤＮＡであるｔｒｘＡＢ又はｔｒｘＢＡのクローニングを、上述のｔｒｘＡ及びｔｒｘＢのクローニングと同様の様式で、ｔｒｘＡ配列をｔｒｘＢ発現ベクター内にＮ末端Ｈｉｓタグとタンパク質ＴｒｘＢをコードする配列ｔｒｘＢとの間にＬＩＣ－ＰＣＲによって挿入すること、又はｔｒｘＢ配列をｔｒｘＡ発現ベクター内にＨｉｓタグとタンパク質ＴｒｘＡをコードする配列ｔｒｘＡとの間にＬＩＣ－ＰＣＲによって挿入することにより、行った：
対応する融合タンパク質ＴｒｘＡＢ又はＴｒｘＢＡをそれぞれコードするＤＮＡであるｔｒｘＡＢ又はｔｒｘＢＡのクローニングを、上述のｔｒｘＡ及びｔｒｘＢのクローニングと同様の様式で、ｔｒｘＡ配列をｔｒｘＢ発現ベクター内にＮ末端Ｈｉｓタグとタンパク質ＴｒｘＢをコードする配列ｔｒｘＢとの間にＬＩＣ－ＰＣＲによって挿入すること、又はｔｒｘＢ配列をｔｒｘＡ発現ベクター内にＨｉｓタグとタンパク質ＴｒｘＡをコードする配列ｔｒｘＡとの間にＬＩＣ－ＰＣＲによって挿入することにより、行った：
以下の混合物を、ＰＣＲによる増幅のために選択した：
ベクターＤＮＡ（ｔｒｘＡ又はｔｒｘＢ発現ベクター）を、プライマー ｖｔｒｘＡ－ｆｗｒｄ（配列番号１８）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）又はｖｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号２１）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）を用いて、逆ＰＣＲによって増幅した。そのために、以下のＰＣＲプログラムを選択した：９８℃にて２分間、次いで、９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて２．５分間を３０サイクル。
融合タンパク質についてのｔｒｘＡ又はｔｒｘＢ遺伝子セグメントを、プライマー ｆｔｒｘＡ－ｆｗｒｄ（配列番号２２）及びｆｔｒｘＡ－ｒｅｖ（配列番号２３）又はｆｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号１９）及びｆｔｒｘＢ－ｒｅｖ（配列番号２０）を用いてＰＣＲによって増幅した。そのために、以下のＰＣＲプログラムを、選択した：９８℃にて２分間、次いで９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて１５秒間を３０サイクル。ＢＬ２１ゲノムＤＮＡを、テンプレートとして用いた。
ベクターＤＮＡ（ｔｒｘＡ又はｔｒｘＢ発現ベクター）を、プライマー ｖｔｒｘＡ－ｆｗｒｄ（配列番号１８）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）又はｖｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号２１）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）を用いて、逆ＰＣＲによって増幅した。そのために、以下のＰＣＲプログラムを選択した：９８℃にて２分間、次いで、９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて２．５分間を３０サイクル。
融合タンパク質についてのｔｒｘＡ又はｔｒｘＢ遺伝子セグメントを、プライマー ｆｔｒｘＡ－ｆｗｒｄ（配列番号２２）及びｆｔｒｘＡ－ｒｅｖ（配列番号２３）又はｆｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号１９）及びｆｔｒｘＢ－ｒｅｖ（配列番号２０）を用いてＰＣＲによって増幅した。そのために、以下のＰＣＲプログラムを、選択した：９８℃にて２分間、次いで９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて１５秒間を３０サイクル。ＢＬ２１ゲノムＤＮＡを、テンプレートとして用いた。
ＰＣＲ反応の最後に、制限酵素ＤｐｎＩ（１０単位、ＮＥＢ）をそれぞれの反応混合物に加え、そしてこの混合物を、３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。その後、ＤＮＡ挿入物のクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）を行った。
ＬＩＣ－ＰＣＲ反応を、５０ｎｇのｔｒｘＡ又はｔｒｘＢ発現ベクターの増幅したベクターＤＮＡ及び７５ｎｇのＤＮＡ挿入物（ｔｒｘＢ又はｔｒｘＡ）を用いて実施した。
次いで、ＬＩＣ－ＰＣＲ混合物を、標準的方法を用いて、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞内に形質転換させ、そして選択的ＬＢ培地（ＬＢ＋１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）上にプレート播種し、そして３７℃にて１８時間にわたりインキュベートした。正しいクローンの同定のために、プラスミドＤＮＡを得られたコロニーから単離し、そして発現カセットを完全に配列決定した。
配列番号９及び配列番号１０を、それぞれ配列番号４及び配列番号５の配列の発現から得られる融合タンパク質ＴｒｘＢＡ及びＴｒｘＡＢのアミノ酸配列と特定した。
実施例２：シスチンレダクターゼＭｌ－ＴｒｘＢＡのクローニング
序章で説明した通り、らい菌は、チオレドキシン（Ｔｒｘ）及びチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）に相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子セグメントを保有している（Ｗｉｅｌｅｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、ｐｐ．２５６０４－２５６０６）。この配列は、公共のデータベースから取得可能である（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１０９０９０４２．１）。
序章で説明した通り、らい菌は、チオレドキシン（Ｔｒｘ）及びチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）に相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子セグメントを保有している（Ｗｉｅｌｅｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、ｐｐ．２５６０４－２５６０６）。この配列は、公共のデータベースから取得可能である（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１０９０９０４２．１）。
公共のデータベースから得られた配列を、宿主大腸菌のコドン使用頻度についてコンピューターでカスタマイズした。これを、ＩＤＴウェブサーバー（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）を用いて行った。標的ベクターｐＧＪ３４７７内へのクローニングのために、コード領域を、ベクター配列と重なる配列によって５’及び３’末端にて伸長した（ｔｒｘＡ及びｔｒｘＢのクローニングも参照されたい）。得られたＤＮＡ配列全体（配列番号２４に示す）を、Ｇｅｎｅａｒｔ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）によって合成的に生成し、Ｍｌ－ｔｒｘＢＡと呼んだ（ｍｌ－ｔｒｘＢＡとも呼ぶ）。
合成Ｍｌ－ｔｒｘＢＡ配列を、ｔｒｘＡ及びｔｒｘＢ発現ベクターのＬＩＣ－ＰＣＲによるクローニングと同様に、ベクターｐＧＪ３４７７内にクローニングした。
タンパク質コード配列Ｍｌ－ｔｒｘＢＡ（配列番号２４）のクローニングのために、オリゴヌクレオチドプライマーを決定し、この標的遺伝子特異的配列を、ベクターＤＮＡの末端にて配列が重なる少なくとも１５ヌクレオチド伸長した。合成遺伝子は、テンプレートとして役立った。
以下の混合物を、ＰＣＲによる増幅のために選択した：
２０ｎｇのテンプレート（Ｇｅｎｅａｒｔ）、それぞれ０．５ｐｍｏｌのプライマーＭｌ－ｔｒｘＢＡ－ｆｗｒｄ（配列番号２５）及びＭｌ－ｔｒｘＢＡ－ｒｅｖ（配列番号２６）、Ｑ５（Ｒ）反応緩衝液、１単位のＱ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、最終容量５０μｌ中。
ＰＣＲプログラム：９８℃にて１分間、次いで９８℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間（アニーリング）、及び７２℃にて６０秒間（合成）の３０サイクル。
２０ｎｇのテンプレート（Ｇｅｎｅａｒｔ）、それぞれ０．５ｐｍｏｌのプライマーＭｌ－ｔｒｘＢＡ－ｆｗｒｄ（配列番号２５）及びＭｌ－ｔｒｘＢＡ－ｒｅｖ（配列番号２６）、Ｑ５（Ｒ）反応緩衝液、１単位のＱ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、最終容量５０μｌ中。
ＰＣＲプログラム：９８℃にて１分間、次いで９８℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間（アニーリング）、及び７２℃にて６０秒間（合成）の３０サイクル。
反応の最後に、制限酵素ＤｐｎＩ（１０単位、ＮＥＢ）を反応混合物に加え、そしてこの混合物を、３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。その後、ＤＮＡのクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）を行った。
ＬＩＣ－ＰＣＲ：
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＬＩＣ－ＰＣＲ（ＰＣＲ生成物のライゲーション依存型クローニング）を介して、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ Ｃ． ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｐ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、ｐｐ．６０６９－６０７４に記載の通りに、基本発現ベクターｐＧＪ３４７７内に正確な塩基で導入した。
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＬＩＣ－ＰＣＲ（ＰＣＲ生成物のライゲーション依存型クローニング）を介して、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ Ｃ． ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｐ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、ｐｐ．６０６９－６０７４に記載の通りに、基本発現ベクターｐＧＪ３４７７内に正確な塩基で導入した。
この目的のために、５０ｎｇの精製したコードＤＮＡを、６０ｎｇの調製したベクターＤＮＡと共に、ＬＩＣ－ＰＣＲ反応において使用した。
次いで、ＬＩＣ－ＰＣＲ混合物を、標準的方法を用いて、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞内に形質転換させ、そして選択的ＬＢ培地（ＬＢ＋１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）上にプレート播種し、そして３７℃にて１８時間にわたりインキュベートした。正しいクローンの同定のために、プラスミドＤＮＡを得られたコロニーから単離し、そして発現カセットを完全に配列決定した。
発現ベクターｐＧＪ３４７７及びコードＤＮＡ配列Ｍｌ－ｔｒｘＢＡからなる得られたプラスミドを、本明細書中以後、Ｍｌ－ｔｒｘＢＡ発現ベクターと呼んだ。
実施例３：シスチンレダクターゼＴｒｘＢ５Ａ（リンカー配列を含む）のクローニング
ｔｒｘＢ５Ａのクローニング：
対応する融合タンパク質ＴｒｘＢ５ＡをコードするＤＮＡであるｔｒｘＢ５Ａのクローニングを、上述のｔｒｘＢＡのクローニングと同様の様式で、Ｃ末端を５アミノ酸伸長したＴｒｘＢ配列（本明細書中以後ＴｒｘＢ５と呼び、ｃｄｓをｔｒｘＢ５と呼ぶ）をｔｒｘＡ発現ベクター内にＨｉｓタグとタンパク質ＴｒｘＡをコードする配列ｔｒｘＡとの間にＬＩＣ－ＰＣＲによって挿入することにより、行った：
ｔｒｘＢ５Ａのクローニング：
対応する融合タンパク質ＴｒｘＢ５ＡをコードするＤＮＡであるｔｒｘＢ５Ａのクローニングを、上述のｔｒｘＢＡのクローニングと同様の様式で、Ｃ末端を５アミノ酸伸長したＴｒｘＢ配列（本明細書中以後ＴｒｘＢ５と呼び、ｃｄｓをｔｒｘＢ５と呼ぶ）をｔｒｘＡ発現ベクター内にＨｉｓタグとタンパク質ＴｒｘＡをコードする配列ｔｒｘＡとの間にＬＩＣ－ＰＣＲによって挿入することにより、行った：
以下の混合物を、ＰＣＲによる増幅のために選択した：
ベクターＤＮＡ（ｔｒｘＡ発現ベクター）を、プライマーｖｔｒｘＡ５－ｆｗｒｄ（配列番号２９）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）を用いる逆ＰＣＲによって増幅し、そのために、以下のＰＣＲプログラムを選択した：９８℃にて２分間、次いで９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて２．５分間の３０サイクル。
ｔｒｘＢ５を、プライマーｆｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号１９）及びｆｔｒｘＢ５－ｒｅｖ（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって増幅し、そのために、以下のＰＣＲプログラムを選択した：９８℃にて２分間、次いで９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて１５秒間の３０サイクル。ＢＬ２１ゲノムＤＮＡを、テンプレートとして用いた。
ベクターＤＮＡ（ｔｒｘＡ発現ベクター）を、プライマーｖｔｒｘＡ５－ｆｗｒｄ（配列番号２９）及び３４７７－ｒｅｖ（配列番号１３）を用いる逆ＰＣＲによって増幅し、そのために、以下のＰＣＲプログラムを選択した：９８℃にて２分間、次いで９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて２．５分間の３０サイクル。
ｔｒｘＢ５を、プライマーｆｔｒｘＢ－ｆｗｒｄ（配列番号１９）及びｆｔｒｘＢ５－ｒｅｖ（配列番号３０）を用いるＰＣＲによって増幅し、そのために、以下のＰＣＲプログラムを選択した：９８℃にて２分間、次いで９８℃にて４５秒間／６０℃にて３０秒間／７２℃にて１５秒間の３０サイクル。ＢＬ２１ゲノムＤＮＡを、テンプレートとして用いた。
ＰＣＲ反応の最後に、制限酵素ＤｐｎＩ（１０単位、ＮＥＢ）をそれぞれの反応混合物に加え、そしてこの混合物を、３７℃にて１時間にわたってインキュベートした。その後、ＤＮＡ挿入物のクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）を行った。
ＬＩＣ－ＰＣＲ反応を、５０ｎｇのｔｒｘＡ発現ベクターの増幅したベクターＤＮＡ及び７５ｎｇのＤＮＡ挿入物（ｔｒｘＢ５）を用いて実施した。
次いで、ＬＩＣ－ＰＣＲ混合物を、標準的方法を用いて、大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞内に形質転換させ、そして選択的ＬＢ培地（ＬＢ＋１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）上にプレート播種し、そして３７℃にて１８時間にわたりインキュベートした。正しいクローンの同定のために、プラスミドＤＮＡを得られたコロニーから単離し、そして発現カセットを完全に配列決定した。
配列番号２８は、配列番号２７の配列の発現によって得られる融合タンパク質ＴｒｘＢ５Ａのアミノ酸配列を特定する。
実施例４：シスチンレダクターゼの酵素活性
タンパク質ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ、及びＭｌ－ＴｒｘＢＡの組換え発現のために、対応するタンパク質をコードする実験中の発現プラスミドを、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ／ＵＳＡ）内に導入した。この細菌細胞を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有のＬＢ培地上にプレート播種した。次いで、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び０．２％アラビノース（ｗ／ｖ）を含む２５ｍｌのＬＢ培地に、１つのコロニーを接種し、２８℃にて培養シェーカーキャビネット内で１９時間にわたってインキュベートした。
タンパク質ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ、及びＭｌ－ＴｒｘＢＡの組換え発現のために、対応するタンパク質をコードする実験中の発現プラスミドを、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ／ＵＳＡ）内に導入した。この細菌細胞を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有のＬＢ培地上にプレート播種した。次いで、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び０．２％アラビノース（ｗ／ｖ）を含む２５ｍｌのＬＢ培地に、１つのコロニーを接種し、２８℃にて培養シェーカーキャビネット内で１９時間にわたってインキュベートした。
発現したタンパク質の単離のため、細胞を、遠心分離（４０００ｇにて１０分間）によって沈殿させ、培地上清を除去し、そして菌体を溶解緩衝液（ＰＢＳ＋１０％ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ））中に再懸濁した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒキット（Ｓｉｇｍａ）のマニュアルにおける製造業者の指示にしたがって、細胞を、１５分間ＲＴにて完全に溶解させ、次いで、不溶性の物質を遠心分離（９５００ｒｐｍにて２０分間、製造業者の指示通り）によって除去した。アフィニティークロマトグラフィーによる上清（すなわち細胞溶解物）の精製のために、得られた細胞溶解物を、ＰＢＳ平衡化Ｐｒｏｔｉｎｏ ＩＤＡ２０００カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）上にロードした。洗浄工程（７ｍｌのＰＢＳ）の後、サンプルを、５ｍｌの溶出緩衝液（ＰＢＳ＋２００ｍＭイミダゾール）で溶出した。得られたタンパク質濃縮物を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって決定した。
種々の酵素ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡのシスチンレダクターゼ活性を、以下で詳細に記載する２つの分析方法を用いて決定した。
１．第１の方法は、測光検出方法からなり、これは、ＮＡＤＰＨの消費及び還元反応の間に生じる３４０ｎｍにおける吸光値の低下に基づく。図２に模式的に示すように、還元におけるシスチンのシステインへの酵素的変換は、補因子ＮＡＤＰＨの消費によって達成される。
以下のアッセイ混合物を、測光測定のために使用した。サンプルの最終容量は１ｍｌである：
１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
２ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）
１ｍＭ シスチン（Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）
酵素を除く全てのアッセイ構成成分を混合後、反応を、酵素の添加によって開始する：
１０μｇの酵素ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡとＴｒｘＢとの混合物、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡ。アッセイ混合物を、室温（およそ２５℃）で、以下の測定までインキュベートした。
１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
２ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）
１ｍＭ シスチン（Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）
酵素を除く全てのアッセイ構成成分を混合後、反応を、酵素の添加によって開始する：
１０μｇの酵素ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡとＴｒｘＢとの混合物、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡ。アッセイ混合物を、室温（およそ２５℃）で、以下の測定までインキュベートした。
種々の１ｍｌアッセイ混合物におけるＮＡＤＰＨ濃度を、、種々の時間において、分光光度計（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０１ ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３４０ｎｍでの吸光値の形で測定した。３４０ｎｍでの吸光値を、種々のサンプルの酵素活性を、製造業者Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＴｈｅｒｍｏ ＩＮＳＩＧＨＴソフトウェアを用いて計算するために用いた。それぞれの場合において、熱不活性化酵素を含むか、酵素を含まないか、基質としてシスチンを含まないか、又は補因子としてＮＡＤＰＨを含まないかのいずれかのサンプルを、陰性対照として並行して測定した。
時間経過にわたる吸光度における変化（減少）を用い、酵素活性を、記録曲線の開始点での線形勾配から決定した。これは、ＮＡＤＰＨ消費速度を示す。常に同量の酵素を使用するので、速度を比較することができる。
２． 第２の方法において、図３で模式的に示すように、シスチンレダクターゼ活性によりシスチンから形成されたシステインを、化合物ＤＴＮＢ（５，５’－ジチオビス－２－ニトロ安息香酸；Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬）との反応により、遊離のＳＨ基を介して直接決定した。本発明の文脈において、ＤＴＮＢアッセイとも呼ぶ。
以下のアッセイ混合物を、測光測定のために使用した。サンプルの最終容量は１ｍｌである：
１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
２ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）
１ｍＭシスチン（Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）
酵素を除く全ての構成成分を混合後、反応を、酵素の添加によって開始する：
１０μｇの酵素ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡとＴｒｘＢとの混合物、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡ。アッセイ混合物を、室温（およそ２５℃）で、以下の測定までインキュベートした。
１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
２ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）
１ｍＭシスチン（Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）
酵素を除く全ての構成成分を混合後、反応を、酵素の添加によって開始する：
１０μｇの酵素ＴｒｘＡ、ＴｒｘＢ、ＴｒｘＡとＴｒｘＢとの混合物、ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ又はＭｌ－ＴｒｘＢＡ。アッセイ混合物を、室温（およそ２５℃）で、以下の測定までインキュベートした。
Ｌ－システインを、Ｌｅｅ Ｓ．－Ｈ．ｅｔ ａｌ．１９９５（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２１３、ｐｐ．８３７－８４４）に記載の試験によって、５，５’－ジチオビス－２－ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を用いて定量した。Ｃｙｓ－ＴＮＢの定量は、ＤＴＮＢを介した４１２ｎｍでの吸光度の測定によるものであった。ＨＰＬＣの分析もまた、可能である。
それぞれの場合において、熱不活性化酵素を含むか、酵素を含まないか、基質としてシスチンを含まないか、又は補因子としてＮＡＤＰＨを含まないかのいずれかのサンプルを、陰性対照として並行して測定した。
図４は、１で上記した通り、酵素ＴｒｘＢＡ、ＴｒｘＢ５Ａ、ＴｒｘＡＢ、及びＭｌ－ＴｒｘならびにＴｒｘＡ及びＴｒｘＢの（９：１）混合物の相対的シスチンレダクターゼ活性を、測光決定にしたがって示す。ＴｒｘＡ及びＴｒｘＢの（９：１）混合物の活性を１に正規化し、そして全ての他の活性セットをそれに相対化する。ＴｒｘＡ及びＴｒｘＢの（９：１）混合物は、比較試験が最も活性な混合比であることを示した、個々の酵素の混合比と推測される。
図５は、２で上記した通り、ＴｒｘＢＡ及びＴｒｘＡＢによるシステイン形成の、ＤＴＮＢアッセイ及びＨＰＬＣにしたがう検出を示す。
ＴｒｘＡ及びＴｒｘＢについてのｃｄｓの間の６０ヌクレオチド以上の領域で、ＴｒｘＢ５Ａより長いリンカー配列を含むクローンを使用することは、融合タンパク質における活性を驚くほど低下させた。
実施例５：シスチンレダクターゼ及びＡＤＨの酵素組み合わせの活性
補因子ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ＋に対する酵素特異性の比較は、シスチンレダクターゼＴｒｘＢＡ及びＴｒｘＡＢが、補因子ＮＡＤＰＨに対して非常に特異的であることを見出した。この試験において、ＮＡＤＰ＋により、シスチンに対する酵素活性は検出されなかった。
補因子ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ＋に対する酵素特異性の比較は、シスチンレダクターゼＴｒｘＢＡ及びＴｒｘＡＢが、補因子ＮＡＤＰＨに対して非常に特異的であることを見出した。この試験において、ＮＡＤＰ＋により、シスチンに対する酵素活性は検出されなかった。
この反応について、酵素アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）がＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに変換し戻すことができる程度を、組み合わせ実験で調べた。
この目的のために、以下の条件を使用した：
１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
５μｌのイソプロパノール
２ｍＭ ＥＤＴＡ
１５～５０μＭ ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ＋
１ｍＭシスチン
５μｇの酵素ＴｒｘＢＡ
５０μｌの細胞溶解物粗抽出物、又は陰性対照として５０μｌのリン酸緩衝液（１．５ｍｌの４×リン酸緩衝液ｐＨ７．４中０．５ｍｌの細胞のＦａｓｔ Ｐｒｅｐ消化。細胞の精製は、ＥＰ１８３２６５８Ｂ１に記載される）
１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
５μｌのイソプロパノール
２ｍＭ ＥＤＴＡ
１５～５０μＭ ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ＋
１ｍＭシスチン
５μｇの酵素ＴｒｘＢＡ
５０μｌの細胞溶解物粗抽出物、又は陰性対照として５０μｌのリン酸緩衝液（１．５ｍｌの４×リン酸緩衝液ｐＨ７．４中０．５ｍｌの細胞のＦａｓｔ Ｐｒｅｐ消化。細胞の精製は、ＥＰ１８３２６５８Ｂ１に記載される）
この反応物を、３０℃にて６０分間にわたりインキュベートした。サンプルを、５分間隔で採取し、放出されたシステインを、ＷＯ２０１３／０００８６４Ａ１に記載されるように、ＤＴＮＢで誘導体化した。定量は、ＤＴＮＢを介した４１２ｎｍでの吸光度の測定であった。
図６は、再生成系としてのＡＤＨの存在下（用いる）又は非存在下（用いない）の、ＴｒｘＢＡによるシステイン形成の、ＤＴＮＢアッセイを用いる測定の結果を示す。
図面において使用される略号
ＡｒａＣ：ＡｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子）
ｐＡｒａＣ：ＡｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子；ＰＢＡＤに対してｒｅｖ方向）のプロモーター
ｐＢＡＤ（本発明の文脈において、ＰＢＡＤとも呼ぶ）：挿入された標的タンパク質配列の（下流の）発現のためのアラビノース誘導型プロモーター
６ＨＩＳ：Ｈｉｓタグについてのコード領域
ｔｅｒｍ：転写ターミネーター
Ａｍｐ：アンピシリン耐性マーカー
ＣＲ：シスチンレダクターゼ
ｒｅｌ．：相対
ｂｐｓ：塩基対
ｔ：時間
ＡｒａＣ：ＡｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子）
ｐＡｒａＣ：ＡｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子；ＰＢＡＤに対してｒｅｖ方向）のプロモーター
ｐＢＡＤ（本発明の文脈において、ＰＢＡＤとも呼ぶ）：挿入された標的タンパク質配列の（下流の）発現のためのアラビノース誘導型プロモーター
６ＨＩＳ：Ｈｉｓタグについてのコード領域
ｔｅｒｍ：転写ターミネーター
Ａｍｐ：アンピシリン耐性マーカー
ＣＲ：シスチンレダクターゼ
ｒｅｌ．：相対
ｂｐｓ：塩基対
ｔ：時間
Claims (15)
- シスチンをシステインへ還元するための酵素であって、ここで、前記酵素は、
ｉ） ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．４．８又はＥＣ１．８．４．１０を有するチオレドキシン（タンパク質ｉ）及び
ｉｉ） ＫＥＧＧデータベース番号ＥＣ１．８．１．９を有するチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）
のタンパク質活性を備える融合タンパク質であり、
前記融合タンパク質の前記活性は、前記タンパク質ｉ及びｉｉと同じであるが融合していない個々のタンパク質の混合物の活性の少なくとも１００％であることを特徴とする、前記酵素。 - タンパク質ｉ及びタンパク質ｉｉが、微生物配列であることを特徴とする、請求項１に記載の酵素。
- チオレドキシン（タンパク質ｉ）が、大腸菌由来のチオレドキシン１のタンパク質活性であることを特徴とする、請求項２に記載の酵素。
- チオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）が、大腸菌由来のチオレドキシンレダクターゼのタンパク質活性であることを特徴とする、請求項２に記載の酵素。
- 前記融合タンパク質が、２つのアミノ酸配列を含み、ここで、
前記アミノ酸配列のうちの１つが配列番号７と少なくとも５０％同一であり、及び前記アミノ酸配列の他方が配列番号８と少なくとも５０％同一であって、及び
前記融合タンパク質が、ＣＲ活性を有することを特徴とする、請求項１～４の１項以上に記載の酵素。 - 融合タンパク質において、Ｎ末端側に配置されたタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端が１から最大５のアミノ酸、短縮されていることを特徴とする、請求項１～５の１項以上に記載の酵素。
- Ｃ末端側に配置されたタンパク質のアミノ酸配列が、融合タンパク質においてＮ末端が１から最大５のアミノ酸、短縮されていることを特徴とする、請求項１～６の１項以上に記載の酵素。
- チオレドキシン（タンパク質ｉ）とチオレドキシンレダクターゼ（タンパク質ｉｉ）との融合タンパク質活性のアミノ酸配列が、前記融合タンパク質において１から最大５のアミノ酸のリンカー配列によって連結していることを特徴とする、請求項１～７の１項以上に記載の酵素。
- 前記融合タンパク質が、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～８の１項以上に記載の酵素。
- シスチンからシステインへ酵素的に還元するための方法であって、システインが、請求項１～９のいずれか１項に記載の酵素によって補因子の存在下で還元されることを特徴とする、前記方法。
- 前記還元が、６～９のｐＨにおいて起こる、請求項１０に記載の方法。
- 補因子が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨからなる群より選択される物質である、請求項１０及び１１のうち１項又はその両方において記載の方法。
- 補因子再生成酵素を含むことを特徴とする、請求項１０～１２のうち１項以上において記載の方法。
- 前記補因子再生成酵素が、デヒドロゲナーゼであり、還元が電子供与体の存在下でさらに起こることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
- 前記デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼであり、イソプロパノールが電子供与体として使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
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