CN106318917B - 天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天冬氨酸‑β‑半醛脱氢酶(ASADH)突变体及其应用。本发明提供了能有效地利用NAD(H)的ASADH突变体，其能用于构建NAD(H)依赖性型的天冬氨酸家族氨基酸合成途径，从而可解决工程菌中辅因子不平衡的问题。

Description

天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
根据饮食需求可将20种蛋白质氨基酸分为非必需氨基酸和必需氨基酸，必需氨基酸不能被人和动物自身合成，只能通过饮食获取。而天冬氨酸家族的四种氨基酸都属于必需氨基酸，在氨基酸产业中占据着重要的角色。
天冬氨酸家族氨基酸包括L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸，属于人和动物九种必需氨基酸中的重要组成部分，作为添加剂成分广泛应用于饲料、食品、医药和化妆品领域，巨大的市场规模使得其生产技术进步引人关注。在其合成途径中的天冬氨酸半醛脱氢酶以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为特异辅因子，有研究表明在葡萄糖为碳源的培养基中，大肠杆菌通过碳代谢产生的还原力NADPH不足以满足合成代谢的需求，约1/3的NADPH来源于膜结合的转氢酶PntAB。如果代谢途径中有依赖NADPH的还原酶，则可能会由于NADPH供应不足而成为限速步骤，因此在天冬氨酸家族氨基酸合成途径(图8)中提供足够的NADPH是保证其生物合成产量的关键因素。
目前主要利用发酵法生产天冬氨酸家族氨基酸，其原理是利用微生物的某些营养缺陷型菌株，通过代谢控制发酵，人为地改变和控制微生物的代谢途径来实现工业化生产。在天冬氨酸家族氨基酸合成支路上，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(aspartate-β-semialdehydedehydrogenase，ASADH)以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为特异辅因子，而糖酵解途径只产生NAD(H)形式的还原力。根据13C同位素示踪结果显示在葡萄糖培养基中野生型大肠杆菌葡萄糖利用摩尔比估计为：25％通过PPP途径，2％通过ED途径，仅有非常少的比例通过TCA循环转化为二氧化碳，而PPP与ED途径是大肠杆菌胞内NADPH的主要来源，已有研究证明大肠杆菌体内葡萄糖代谢产生NADPH不 足以满足生物质合成的代谢需求，如果工程菌代谢途径中有依赖NADPH的还原酶，则可能会由于NADPH供应不足而成为限速步骤。
还原型烟酰胺腺苷二核苷酸(NADH)和氧化型烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)是细胞代谢中转移电子的重要辅因子，在糖酵解等途径的氧化还原反应中，作为各种不同氧化还原酶的辅因子而扮演着氧化剂或还原剂的角色。还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADP)/烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)作为细胞内另一种形式的辅因子，常作为细胞合成途径的辅因子，主要来源于碳代谢中的磷酸戊糖途径(PPP)，ED途径和TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶反应，形成NADPH的精确比例由碳代谢流的分配决定，因菌种和环境条件的差别表现出很大的差异。
有研究发现，E.coli和Psedomonas fluorescens等细菌在碳代谢中合成的NADPH量不足以满足细菌的生物量合成，约1/3的NADPH通过膜结合的转氢酶(PntAB)进行平衡(Fuhrer，T.，and Sauer，U.(2009)，Journal of bacteriology191，2112-2121)，因此工程菌的外源合成途径中如果存在NADPH依赖型的氧化还原酶，可能由于NADPH供应的不足而成为瓶颈。
为了尽可能地减少由于辅因子不平衡而带来工程菌生产能力的下降，目前采用的手段主要有：(1)过表达嘧啶核苷酸转氢酶PntAB；(2)利用蛋白质工程改造的工程酶，构建NADH依赖型的途径。但是在工程菌中过表达转氢酶也有一定的缺陷，转氢酶的过表达将带来能量的消耗和细胞代谢压力，影响菌体的快速生长。也有研究提出通过蛋白质工程改造途径中NADP(H)依赖的酶，构建NADH依赖的途径。
综上，本领域需要进一步地研究天冬氨酸家族氨基酸合成途径中的关键性因素，以期提高发酵法生产天冬氨酸的生产效率，降低生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，所述突变体对应于大肠杆菌来源的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的氨基酸序列，
第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或
第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)和第171位突变为Ala(A)；或
第171位由His(H)突变为Lys(K)；或
第163位由Ala(A)突变为Ser(S)；或
第351位由Leu(L)突变为Val(V)；或
第138位由Ser(S)突变为Gln(Q)。
在一个优选例中，所述突变体来源于革兰氏阴性菌；较佳地，所述突变体来源于：大肠杆菌(Escherichia coli)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)。
在另一优选例中，所述突变体来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)，或第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)且第171位突变为Ala(A)，或第第171位由His(H)突变为Lys(K)，或第163位由Ala(A)突变为Ser(S)，或第351位由Leu(L)突变为Val(V)，或第138位由Ser(S)突变为Gln(Q)；或
所述突变体来源于菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，其第351位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或
所述突变体来源于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)，其第353位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或
所述突变体来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，其第351位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或
所述突变体来源于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，其第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)；
所述突变体来源于伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)，其第351位由Gln(Q)突变为Asn(N)。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种将天冬氨酸-β-半醛脱氢酶由NADP(H)依赖型酶改变为NAD(H)依赖型酶的方法，包括：将天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的氨基酸序列的特定位点进行氨基酸突变，获得突变体，该突变体对应于大肠杆菌 来源的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的氨基酸序列，
第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或
第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)和第171位突变为Ala(A)；或
第171位由His(H)突变为Lys(K)；或
第163位由Ala(A)突变为Ser(S)；或
第351位由Leu(L)突变为Val(V)；或
第138位由Ser(S)突变为Gln(Q)。
在一个优选例中，针对革兰氏阴性菌来源的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶进行突变；较佳地，针对以下物种的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶进行突变：大肠杆菌(Escherichia coli)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)。
在本发明的另一方面，提供所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体的用途，用于以NAD(H)为辅因子，催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛(L-ASA)或者其逆反应。
在一个优选例中，L-天冬氨酸-β-半醛作为高丝氨酸脱氢酶和二氢吡啶二羧酸合酶的底物，最终生成天冬氨酸家族氨基酸(包括赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸)。
在另一优选例中，所述的用途是离体的用途，例如发生于细胞培养物中或细胞发酵过程中，并非发生于人体或动物体中。
在本发明的另一方面，提供一种生产天冬氨酸家族氨基酸的方法，所述的方法包括：利用所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，以NAD(H)为辅因子，催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛(L-ASA)，以高丝氨酸脱氢酶和二氢吡啶二羧酸合酶催化L-天冬氨酸-β-半醛，生成天冬氨酸家族氨基酸。
在一个优选例中，所述的方法在宿主细胞内进行，包括：
将所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体的编码序列转化入宿主细胞，培养该细胞，在细胞内进行生产；或
将宿主细胞内源性的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变为所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，培养该细胞，在细胞内进行生产。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是具有天冬氨酸家族氨基酸合成途径 的细胞(如细菌、真菌、植物细胞)；较佳地，所述细胞中具有：NAD(H)或其生成途径，L-β-天冬氨酰磷酸或其生成途径，高丝氨酸脱氢酶或其生成途径，二氢吡啶二羧酸合酶或其生成途径；较佳地，所述细胞包括：大肠杆菌(Escherichia coli)，谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A-C、各表达的蛋白的表达纯化。
图2、热点氨基酸与酶活测定原理。A.热点氨基酸在三维结构(PDB：1GL3)上的分布情况；B.12个热点氨基酸列表；C.文库筛选与酶活测定原理。
图3、ecASADH突变体蛋白的纯酶活测定。
图4、ITC测定NADP+的解离常数。A、ecASADH与NADP+等温滴定曲线；B ecASADH-Q350N与NADP+等温滴定曲线；C、ecASADH-Q350NH171A与NADP+等温滴定曲线；D、NADP+与三个突变体结合的热力学参数柱形图。
图5、ecASADH与突变蛋白在L-高丝氨酸合成途径中多酶偶联反应。A、从L-天冬氨酸起始多酶合成L-高丝氨酸的原理；B、在NADH体系中L-高丝氨酸合成曲线；C；在NADPH体系中L-高丝氨酸合成曲线。
图6、不同来源的ASADH与其突变体蛋白(A)的纯酶活测定(B)。
图7、ecASADH与其突变蛋白与不同的辅因子结合模式模拟。
A-F：ecASADH、ecASADH-Q350N、ecASADH-Q350N/H171A分别与不同辅因子的结合模式，其中A为晶体结构PDB：1GL3，其余结合模式为分子对接结果；
G：NADP+烟酰胺部分的氨基N原子与野生型ecASADH的Q350或者突变体蛋白N350的羰基O原子在分子动力学模拟中的距离变化；
H：NAD+烟酰胺部分的氨基N原子与野生型ecASADH的Q350或者突变体蛋白N350的羰基O原子在分子动力学模拟中的距离变化。
图8、天冬氨酸家族氨基酸合成途径。
具体实施方式
天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase，ASADH)位于天冬氨酸家族四大氨基酸分枝途径的节点关键位置，细菌来源的ASADH专一地利用NADP(H)，几乎不能利用NAD(H)为辅因子。为了解决该问题，本发明人通过对大肠杆菌来源的ASADH辅因子结合活性中心范围内的氨基酸位点进行单点饱和突变文库构建，通过反复筛选，获得了能有效地利用NAD(H)的ASADH突变体。本发明获得的ASADH突变体具有构建NAD(H)依赖性型的天冬氨酸家族氨基酸合成途径，从而可解决工程菌中辅因子不平衡的问题。
天冬氨酸半醛脱氢酶(ASADH，EC 1.2.1.11)在细菌中通过asd基因编码，是生物合成途径中的关键酶，在植物、大多数细菌和真菌中存在天冬氨酸生物合成途径，ASADH处于第一分枝的关键节点位置，以NADP为辅因子通过催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛(L-ASA)，反应结构式如下式(I)。
天冬氨酸家族氨基酸合成途径中，ASADH处于第一分支的节点位，是NADPH依赖型的脱氢酶。本发明通过蛋白质工程手段对ASADH活性中心进行改造重构，获得了一类ASADH的突变体，其能高效利用NAD(H)进行反应，这就使得从根本上解决天冬氨酸家族氨基酸合成途径中辅因子不平衡的问题成为可能，可构建NAD(H)依赖型的合成途径，提高工程菌的生产能力而尽可能减小对转氢酶PntAB的依赖。
本发明获得的ASADH突变体，可以以NAD(H)为辅因子，催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛(L-ASA)。L-ASA可作为高丝氨酸脱氢酶和二氢吡啶二羧酸合酶的底物，形成重要的下游产物，包括赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和细菌细胞壁重要组分2，6-二氨基庚二酸(2，6-diaminopimetic acid,2,6-DAP)。
本发明还包括所述ASADH突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用， 术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的ASADH突变体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。但是，这些变异形式中，对应于大肠杆菌来源的ASADH的氨基酸序列第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或第171位由His(H)突变为Lys(K)；或第163位由Ala(A)突变为Ser(S)；或第351位由Leu(L)突变为Val(V)；或第138位由Ser(S)突变为Gln(Q)，也即在上述任一指定的位点上氨基酸是保守的。
本发明还包括在本申请权利要求中所指定的ASADH突变体基础上的其它变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸构成的变异体。但是，这些变异形式中，对应于大肠杆菌来源的ASADH的氨基酸序列第350位由Gln(Q)突变为Asn(N)；或第171位由His(H)突变为Lys(K)；或第163位由Ala(A)突变为Ser(S)；或第351位由Leu(L)突变为Val(V)；或第138位由Ser(S)突变为Gln(Q)，也即在上述任一指定的位点上氨基酸是保守的。
本发明还提供了编码本发明ASADH突变体或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替 换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少70％，较佳地至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的编码ASADH突变体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ASADH突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的ASADH突变体。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码ASADH突变体(或变异体)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，植物细胞 等。
作为本发明的优选方式，宿主细胞是具有天冬氨酸家族氨基酸合成途径的细胞，如细菌、真菌、植物细胞；较佳地，所述细胞中具有：NAD(H)或其生成途径，L-β-天冬氨酰磷酸或其生成途径，高丝氨酸脱氢酶或其生成途径，二氢吡啶二羧酸合酶或其生成途径。
本发明的ASADH突变体(或其片段、变异形式或衍生物)的多核苷酸在转化入具有天冬氨酸家族氨基酸合成途径的宿主细胞后，可直接用于生产天冬氨酸家族氨基酸。
本发明的ASADH突变体可以高效地利用NAD(H)作为辅因子。在获得了本发明的ASADH突变体的信息后，本领域人员清楚如何用于后续制备天冬氨酸家族氨基酸。所述的ASADH突变体可以以NAD(H)为辅因子，催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛(L-ASA)。L-ASA作为高丝氨酸脱氢酶和二氢吡啶二羧酸合酶的底物，最终生成天冬氨酸家族氨基酸(包括赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸)。
作为本发明的一种优选方式，提供了一种胞内生物合成天冬氨酸家族氨基酸的方法：将所述的ASADH突变体的编码基因转化入具有天冬氨酸家族氨基酸合成途径的宿主细胞，培养该细胞，从而生产天冬氨酸家族氨基酸。
作为另一种优选方式，可以将宿主细胞内源的ASADH基因进行敲除，再转入本发明的ASADH突变体的编码基因，从而构建具有NAD(H)依赖性型的天冬氨酸家族氨基酸合成途径的宿主细胞。
作为另一种优选方式，可以将宿主细胞基因组中的ASADH进行定点突变，突变后可形成氨基酸序列如本发明的ASADH突变体的ASADH突变体，从而构建具有NAD(H)依赖性型的天冬氨酸家族氨基酸合成途径的宿主细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
2.1从大肠杆菌中克隆野生型ASADH
本发明采用E.coli来源的ASADH，从MG1655的基因组中扩增出asd基 因，在其N端加入6个His后连入pET28a载体进行表达。利用镍柱纯化，得到大肠杆菌来源的野生型ASADH。
2.2通过PDB数据库搜索大肠杆菌来源的ASADH蛋白质三维结构
通过RCSB PDB数据库搜索大肠杆菌来源的ASADH蛋白质三维结构，数据检索到两种不同形式的ASADH，包括开放形式和闭合形式。其中PDB ID为1GL3的结构是ASADH与NADP和其底物类似物的三维立体复合物，本发明采用该结构作为后续分析的基础。
2.3利用Molegro Molecular Viewer等软件对辅因子结合活性中心进行分析，构建大肠杆菌来源的ASADH单点饱和突变文库；
本发明利用Molegro Molecular Viewer(27)对大肠杆菌来源的ASADH(ecASADH)晶体结构进行分析，选择NADP+结合活性中心范围内54个氨基酸靶点进行单点饱和突变文库构建，得到12个热点氨基酸位点对NAD(H)的利用有较显著的改善。以其中对NAD+利用能力最高的突变蛋白ecASADH-Q350N为出发序列，构建基于热点氨基酸的11个迭代单点饱和突变，并进行筛选，获得了更有效利用NAD+的突变蛋白ecASADH-Q350N/H171A。
2.4NAD+利用能力提高的突变体蛋白酶学性质测定
将从两轮文库筛选中得到的ecASADH突变体蛋白进行纯化，测定纯酶活力，并对NAD+利用显著提高的两株突变体蛋白ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A进行动力学参数测定与辅因子结合能力测定。
2.5体外测定突变体蛋白ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A在天冬氨酸家族氨基酸生理合成方向的辅因子利用能力
由于天冬氨酸-β-磷酸为高能化合物，不能稳定存在与水溶液中，因此在以上的文库筛选与酶活测定中都是以天冬氨酸-β-半醛为底物，测定ASADH的非生理方向的合成反应，鉴定了其对氧化型辅因子NAD+与NADP+的利用能力。为了进一步验证突变体蛋白在生理合成方向对还原型辅因子的利用能力，本发明采用多酶偶联的反应体系，通过偶联了大肠杆菌来源的双功酶天 冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I(aspartokinase-homoserinedehydrogenase，AK-HSD I)(28)与枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase，bsGDH)(29)，以L-天冬氨酸为底物,检测L-高丝氨酸的累积量来表征突变体蛋白在生理反应方向对还原型辅因子NADPH与NADH的利用能力。
2.6多重序列比对与不同细菌来源的ASADH突变蛋白酶活鉴定
选择与ecASADH序列相似度从65％-95％的五株细菌来源的蛋白进行序列比对，发现在文库筛选中获得的突变位点Q350在该几株不同来源的ASADH序列中都十分保守，因此也分别对5个不同来源的ASADH进行定点突变Q350N，在以NAD+为辅因子的酶活测定中，五个突变体蛋白分别比野生型有了显著的NAD+利用能力提高。
2.7分子对接与分子动力学模拟分析突变体蛋白ecASADH-Q350N和ecASADH-Q350N/H171A分别与NAD(P)+的结合方式
通过分子对接分析了突变体蛋白ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A与不同辅因子的结合方式，并用分子动力学模拟分析了关键原子对的距离变化。发现了当谷氨酰胺突变为天冬酰胺后，引入了对辅因子额外的氢键相互作用，稳定了NAD+与蛋白的复合物，使得突变体蛋白能更高效地利用辅因子NAD+。
材料与方法
菌株质粒与培养条件
E.coli的培养基为LB(液体或固体)，37℃培养富集菌体，30℃培养诱导蛋白表达。氨苄青霉素(Amp)，氯霉素(Cm)，卡那霉素(Kan)的配制和使用浓度见Sambrook等主编的Molecular cloning：a laboratory manual。
工具酶、试剂
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶为MBI公司产品，T4DNA连接酶和dNTP为Takara公司产品。实验所用引物及构建的载体见表1。
表1、实验用引物列表
注：NNK和MNN代表简并密码，K代表G/T，M代表C/A，N代表A/C/T/G，酶切位点用下划线表示，组氨酸标签用斜体表示。
分子生物学及溶剂测定方法
PCR、质粒DNA抽提、限制性内切酶消化、去磷酸化、连接、琼脂糖凝胶电泳、转化、基因的诱导表达等分子生物学常规操作参照《分子克隆实验指南》。胶回收DNA和TA克隆均按照相应的产品说明书进行。
ASADH体外酶活测定条件方法(即非生理方向酶活测定)
反应体系：200mM N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid(Ches)，pH9.0，40mM KPi，1mMNADP+(NAD+)，2mM L-ASA，30℃。在加入酶液后立即加入L-ASA启动反应。在340nm波长下记录一段时间内OD340的持续增长情况来表征酶活。
酶活定义：在30℃，pH9.0条件下，1分钟内生成1μmol NAD(P)H所需要的酶量。
酶学性质测定
Km值测定方法：在200mM Ches，pH 9.0，饱和浓度的KPi，饱和浓度的L-ASA条件下，分别在10个不同浓度的辅因子的体系中加入适量的酶进行酶活测定，以辅因子浓度为横坐标、酶活力为纵坐标，利用软件Graphpad prism5.0进行非线性拟合获得Km与Vmax的值。
Kcat值测定方法：将上述Vmax的除以加入酶量的μmol数，获得Kcat值。
ITC测定NADP+的解离常数
测定体系：100mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM KCl，25℃，纯蛋白浓度100μM，NADP+浓度为3mM.每次滴入2μLNADP+，重复20次，间隔时间为120s。
实验中所有蛋白的克隆与表达纯化
分别利用引物ecASADH-NT-F+ecASADH-R和seASADH-NT-F+ecASADH-R从大肠杆菌Escherichia coli MG1655和沙门氏菌Salmonella typhimurium的基因组中扩增asd基因(ecASADH和seASADH)，在其N端加入6个His后连入pET28a载体的NcoI/BamHI酶切位点。
来源于Pantoea ananatis(patASADH，密码子优化前序列的NCBI参考序列登录号NC_013956.2)，Haemophilus influenza(hiASADH，密码子优化前序列的GenBank登录号L42023.1)，Pseudomonas aeruginosa(paoASADH，密码子优化前序列的NCBI参考序列登录号NC_002516.2)和Vibrio cholerae(vcASADH，密码子优化前序列的NCBI参考序列登录号NC_009457.1)的ASADH均在南京金斯瑞生物科技有限公司进行根据大肠杆菌偏好的密码子优化后全基因合成，与ecASADH和seASADH在N端带有相同的6个his标签，构建到pET28a载体的NcoI/EcoRI酶切位点进行表达。
野生型ecASADH的氨基酸序列见SEQ ID NO:1，野生型paoASADH的氨基酸序列见SEQ ID NO:2，野生型patASADH的氨基酸序列见SEQ ID NO:3，野生型seASADH的氨基酸序列见SEQ ID NO:4，野生型hiASADH的氨基酸序列见SEQ ID NO:5，野生型vcASADH的氨基酸序列见SEQ ID NO:6。
对得到的载体进行全质粒PCR引入谷氨酰胺保守位点的定点突变，得到突变蛋白patASADH-Q351N(即patASADH第351位氨基酸由Q突变为N，应用突变引物PATQ-F和PATQ-R)、hiASADH-Q353N(即hiASADH第353位氨基酸由Q突变为N，应用突变引物HIQ-F和HIQ-R)、paoASADH-Q351N(即paoASADH第351位氨基酸由Q突变为N，应用突变引物PAOQ-F和PAOQ-R)、seASADH-Q351N(即seASADH第351位氨基酸由Q突变为N，应用突变引物SEQ-F和SEQ-R)和vcASADH-Q350N(即vcASADH第350位氨基酸由Q突变为N，应用突变引物VCQ-F和VCQ-R)的表达载体。
以ecHK-HSD-NT-F+ecHK-HSD-R引物，从Escherichia coli MG1655中扩增AK-HSDI的编码基因ThrA基因，引入G433R突变和N端6个his标签，构建到pET28a载体的NdeI/HindIII位点。从已构建的带有bsGDH编码基因的载体(Tao,R.等，Biotechnology letters36,835-841)中扩增bsGDH后，引入N端6个his标签，构建到pET28a载体的NdeI/HindIII/位点，得到pET28a-bsGDH。
ecASADH-H171K构建：以pET28a-ecASADH为模板，用引物 ecASADH-H171-F/R进行全质粒扩增，并用DpnI对扩增产物进行酶切后，取适量产物转化BL21(DE3)，获得ecASADH-H171文库，通过酶标仪进行NAD+活力测定筛选，将NAD+活力最高的突变体划线获取单克隆后测定突变位点为H171K，获得ecASADH-H171K。
ecASADH-A163S构建：以pET28a-ecASADH为模板，用引物ecASADH-A163-F/R进行全质粒扩增，并用DpnI对扩增产物进行酶切后，取适量产物转化BL21(DE3)，获得ecASADH-A163文库，通过酶标仪进行NAD+活力测定筛选，将NAD+活力最高的突变体划线获取单克隆后测定突变位点为A163S，获得ecASADH-A163S。
ecASADH-L351V构建：以pET28a-ecASADH为模板，用引物ecASADH-L351-F/R进行全质粒扩增，并用DpnI对扩增产物进行酶切后，取适量产物转化BL21(DE3)，获得ecASADH-L351文库，通过酶标仪进行NAD+活力测定筛选，将NAD+活力最高的突变体划线获取单克隆后测定突变位点为L351V，获得ecASADH-L351V。
ecASADH-S 138Q构建：以pET28a-ecASADH为模板，用引物ecASADH-S138-F/R进行全质粒扩增，并用DpnI对扩增产物进行酶切后，取适量产物转化BL21(DE3)，获得ecASADH-S138文库，通过酶标仪进行NAD+活力测定筛选，将NAD+活力最高的突变体划线获取单克隆后测定突变位点为S138Q，获得ecASADH-S138Q。
ecASADH-Q350N构建：以pET28a-ecASADH为模板，用引物ecASADH-Q350-F/R进行全质粒扩增，并用DpnI对扩增产物进行酶切后，取适量产物转化BL21(DE3)，获得ecASADH-Q350文库，通过酶标仪进行NAD+活力测定筛选，将NAD+活力最高的突变体划线获取单克隆后测定突变位点为Q350N，获得ecASADH-Q350N。
ecASADH-Q350N/H171A构建：以pET28a-ecASADH-Q350N为模板，用引物ecASADH-H171-F/R进行全质粒扩增，并用DpnI对扩增产物进行酶切后，取适量产物转化BL21(DE3)，获得ecASADH-Q350N/H171文库，通过酶标仪进行NAD+活力测定筛选，将NAD+活力最高的突变体划线获取单克隆后测定突变位点为H171A,获得ecASADH-Q350N/H171A。
所有蛋白都在E.coli BL21(DE3)中进行表达，将37℃过夜培养得到的种子液1％转接新鲜LB培养基，37℃培养OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM 的IPTG进行诱导，30℃继续培养5h后，12000rpm收集菌体。利用镍柱快速纯化步骤分别对不同的蛋白进行纯化，并通过SDS-PAGE检测蛋白的纯化情况，如图1A-C。
实施例1、单点饱和突变文库构建
采用E.coli来源的ASADH，从MG1655的基因组中扩增出asd基因，在其N端加入6个His后连入pET28a载体进行表达。利用镍柱纯化，得到大肠杆菌来源的野生型ASADH。
通过RCSB PDB数据库搜索大肠杆菌来源的ASADH蛋白质三维结构，数据检索到两种不同形式的ASADH，包括开放形式和闭合形式。其中PDB ID为1GL3的结构是ASADH与NADP和其底物类似物的三维立体复合物，采用该结构作为后续分析的基础。
利用Molegro Molecular Viewer(Thomsen，R.等，Journal of medicinalchemistry 49，3315-3321)对大肠杆菌来源的ASADH(ecASADH)晶体结构进行分析，选择NADP+结合活性中心范围内54个氨基酸靶点进行单点饱和突变文库构建，得到12个热点氨基酸位点对NAD(H)的利用有较显著的改善，如图2A-C。
通过第一轮文库的筛选后得到12个热点氨基酸，选取NAD+-依赖型酶活最高的前5个突变体蛋白进行纯化，非生理方向酶活测定。反应体系200mM N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid(Ches)，pH 9.0，40mM KPi，1mMNADP+(NAD+)，2mM L-ASA，30℃。
发现ecASADH-Q350N能最有效地利用NAD+。将ecASADH-Q350N作为出发序列，构建11个单点饱和突变文库进行第二轮筛选，获得了NAD+-依赖型酶活进一步提高的突变体蛋白ecASADH-Q350N/H171A。如图3，白色柱体表示NADP+-依赖型的酶活，黑色柱体表示NAD+-依赖型的酶活，突变体ecASADH-H171K、ecASADH-A163S、ecASADH-L351V、ecASADH-S 138Q、ecASADH-Q350N、ecASADH-Q350N/H171A与野生型ecASADH相比，NAD+-依赖型酶活分别提高了3.8、3.7、2.8、2.2、22.2和50.3倍。
实施例2、ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A的辅因子依赖性酶学性质鉴定
将NAD+-依赖型酶活最高的两株突变体蛋白进行酶学性质测定，测定结果见表2。测定结果表明，两个突变体蛋白对NAD+的亲和力都得到了提高，与野生型ecASADH相比Km值分别降低了4.6倍和35倍。同时催化效率得到了提高，与野生型蛋白相比，对NAD+的转换数kcat值分别提高了9倍和12倍。
同时发生突变后的蛋白对NADP+的亲和力也有很大的提高，结合突变蛋白对NADP+催化性能的下降，本发明人推测由于蛋白突变后增强了对NADP+的结合力，导致NADP+的解离成为限速，从而导致反应能力下降。为了进一步验证NADP+对突变蛋白的结合力，进行了后续的ITC实验。
表2、野生型与突变体ecASADH动力学参数测定
实施例3、野生型ecASADH与突变体蛋白对辅因子NADP+结合能力的测定
通过等温滴定量热法(isothermal titrationcalorimetry，ITC)测定了NADP+与ecASADH、ecASADH-Q350N、ecASADH-Q350N/H171A的解离常数kd。结果如图4，从解离常数的变化可以看出，与酶学参数一致，蛋白突变后与NADP+结合力有了极大的提高，过高的结合力可能会导致产物NADPH的解离缓慢而影响了对NADP+的催化能力。
实施例4、野生型ecASADH与突变体蛋白在生理方向对还原型辅因子依赖性测定
由于天冬氨酸-β-磷酸在水溶液中不能稳定存在，因此以上酶活实验都是测定以天冬氨酸-β-为底物的非生理方向酶反应。为了模拟胞内生理方向的酶 反应，验证突变蛋白在生理方向是否发生了辅因子依赖性的变化，是否能有效利用NADH为辅因子，本发明人做了多酶偶联反应。在酶反应体系中加入了AK-HSD I，该酶能将L-天冬氨酸转化为天冬氨酸-β-磷酸，为ASADH提供前体。同时加入了bsGDH作为辅因子循环体系，最后通过检测在不同辅因子存在的条件下L-高丝氨酸的合成来反应突变体蛋白在生理方向对辅因子的依赖性。反应体系为：100mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM KCl，7mM L-Aspartate，7mM D-葡萄糖，5mM MgCl2，5mM ATP，0.3mM NAD(P)H，50μg AK-HSD I，30μg bsGDH和0.5μg ecASADH，ecASADH-Q350N或者ecASADHQ350NH171A。
从图5可以看出，在NADH存在的条件下，两个突变蛋白ecASADH-Q350N、ecASADH-Q350N/H171A能有效地合成L-高丝氨酸，而野生型ecASADH几乎不能利用NADH；在NADPH存在的条件下，野生型ecASADH能高效地合成L-高丝氨酸，而突变蛋白合成能力下降。
以上结果与非生理方向的反应情况基本一致，也就是无论在生理方向还是非生理方向，突变蛋白的辅因子依赖性都发生了一致的变化，与野生型相比，突变体能更有效地利用NAD(H)为辅因子。
实施例5、不同来源的ASADH定点突变与辅因子依赖性酶活测定
选择了与ecASADH序列相似性65-95％的五株细菌Pantoea ananatis(patASADH)，Haemophilus influenza(hiASADH)，Pseudomonas aeruginosa(paoASADH)，Salmonellatyphimurium(seASADH)和Vibrio cholerae(vcASADH)进行了多重比对，发现350位置的谷氨酰胺十分保守，为了验证将其突变为天冬酰胺后是否也能影响这些蛋白的辅因子依赖性，本发明人对这五株细菌来源的ASADH进行了定点突变，得到突变蛋白paoASADH-Q351N，patASADH-Q351N，seASADH-Q351N，hiASADH-Q353N和vcASADH-Q350N，并测定了野生型与突变蛋白在不同辅因子条件下的非生理方向酶活。反应体系：200mM N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid(Ches)，pH 9.0，40mM KPi，1mM NADP+(NAD+)，2mM L-ASA，30℃。结果如图6，发现与各自的野生型蛋白相比，以上突变体的NAD+-依赖型酶活分别提高了63.5、7.7、17.9、10.8和7.5倍。与ecASADH一致，野生型蛋白都几乎不能利用NAD+，在关键位点谷氨酰胺处发生突变后都能有效提高对NAD+的利用。
实施例6、分子对接与分子动力学模拟分析ecASADH、ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A与不同辅因子的结合模式
由于已有晶体结构为ecASADH与NADP+的复合物，为了分析突变蛋白与不同辅因子的结合模式，从而推测辅因子依赖性转变的机理，本发明人通过分子对接分析了突变蛋白与不同辅因子的结合模式，并通过分子动力学模拟分析了Q350位点的羰基O原子与辅因子烟酰胺部分的氨基N原子在动力学中的距离变化，如图7。结果表明辅因子NADP+与NAD+相比在腺苷部分多了一个磷酸根，与周围的氨基酸残基R10、T37、S38等形成稳定的氢键，NAD+复合物中缺少这些氢键，而氢键能够稳定复合物的结构，因此野生型蛋白能更好地利用NADP+。当发生突变后，N350与两个辅因子烟酰胺部分都形成了氢键，增强了相互作用，因此突变蛋白与野生型相比能更好地利用NAD+，而过强的相互作用却影响了NADP+的解离，降低了催化性能。从分子动力学模拟的结果可以看出，N350与辅因子NAD+烟酰胺部分的目标原子对的距离稳定处于氢键范围内，也就是整个过程中氢键是稳定存在的，而Q350与相应原子的距离却一直处于氢键范围之外，与实验部分结果一致。
讨论
本发明通过对ecASADH辅因子结合活性中心的分析，选择了以NADP+为中心范围内54个氨基酸为靶点进行单点饱和突变文库的构建，在筛选了13,000个克隆后，根据纯酶活测定结果得到了系列突变体蛋白，在以NAD+为辅因子表现出比野生型ASADH明显更高的酶活，并对酶活显著提高的ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A进行了酶学性质鉴定与机理分析。同时根据多重序列比对结果，在关键的谷氨酰胺位点进行定点突变后也获得了NAD+-依赖型酶活显著提高的其余5个不同来源的ASADH突变体。
在细菌中ASADH几乎都是较严格的NADP(H)依赖型的蛋白，对NAD(H)表现出非常低的酶活。据本发明人目前的检索范围未发现细菌来源的NAD(H)依赖型ASADH，在古菌中ASADH对NAD(H)的利用能力比细菌稍好，但是仍然远远低于对NADPH的利用能力，而且古菌来源的ASADH在接近其生存温度的70％条件下kcat少于大肠杆菌来源的ASADH在30％条件下酶活的1％，因此本发明人获得的突变体蛋白在以NAD+为辅因子时比天然蛋白表现出更 高的优势性。而在大肠杆菌中通过中心碳代谢合成的NADPH不足以满足其生物质的合成需求，约1/3用于同化的NADPH来源于膜结合的转氢酶PntAB提供，在快速合成天冬氨酸家族氨基酸的工程菌中存在着NADPH严格依赖性的ASADH，更加重了大肠杆菌平衡NADPH不足的负担，可能成为生产的限速瓶颈。本发明获得的突变体蛋白无论在生理方向还是非生理方向都增大其对NAD(H)的利用能力，具有应用于天冬氨酸家族氨基酸合成途径的重要潜力，减少工程菌的代谢压力和对PntAB的依赖，也许能得到发酵性能提高的工程菌株。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体来源于革兰氏阴性菌，且对应于大肠杆菌来源的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶氨基酸序列第350位的相应位点由Gln突变为Asn；所述革兰氏阴性菌选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)；或
所述突变体来源于大肠杆菌天冬氨酸-β-半醛脱氢酶，其氨基酸序列第350位由Gln突变为Asn且第171位由His突变为Ala；或第171位由His突变为Lys；或第163位由Ala突变为Ser；或第351位由Leu突变为Val；或第138位由Ser突变为Gln。
2.如权利要求1所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其第350位由Gln突变为Asn；或
所述突变体来源于菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，其第351位由Gln突变为Asn；或
所述突变体来源于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)，其第353位由Gln突变为Asn；或
所述突变体来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，其第351位由Gln突变为Asn；或
所述突变体来源于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，其第350位由Gln突变为Asn；或
所述突变体来源于伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)，其第351位由Gln突变为Asn。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求1-2任一所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种将天冬氨酸-β-半醛脱氢酶由NADP(H)依赖型酶改变为NAD(H)依赖型酶的方法，其特征在于，包括：将革兰氏阴性菌的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的氨基酸序列的特定位点进行氨基酸突变，获得突变体，该突变体对应于大肠杆菌来源的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的氨基酸序列第350位的相应位点由Gln突变为Asn；所述革兰氏阴性菌选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)；或
将大肠杆菌天冬氨酸-β-半醛脱氢酶氨基酸序列的第350位由Gln突变为Asn且第171位由His突变为Ala；或第171位由His突变为Lys；或第163位由Ala突变为Ser；或第351位由Leu突变为Val；或第138位由Ser突变为Gln。
7.权利要求1-2任一所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体的用途，用于以NAD(H)为辅因子，催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛或者其逆反应。
8.一种生产天冬氨酸家族氨基酸的方法，其特征在于，所述的方法包括：利用权利要求1-2任一所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，以NAD(H)为辅因子，催化L-β-天冬氨酰磷酸去磷酸化转变为L-天冬氨酸-β-半醛，以高丝氨酸脱氢酶和二氢吡啶二羧酸合酶催化L-天冬氨酸-β-半醛，生成天冬氨酸家族氨基酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法在宿主细胞内进行，包括：
将权利要求1-2任一所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体的编码序列转化入宿主细胞，培养该细胞，在细胞内进行生产；或
将宿主细胞内源性的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变为权利要求1-2任一所述的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体，培养该细胞，在细胞内进行生产。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是具有天冬氨酸家族氨基酸合成途径的细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞中具有：NAD(H)或其生成途径，L-β-天冬氨酰磷酸或其生成途径，高丝氨酸脱氢酶或其生成途径，二氢吡啶二羧酸合酶或其生成途径。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)，谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3428282A1 (en) * 2017-07-11 2019-01-16 Alderys Ectoine-producing yeast
CN108546652A (zh) * 2018-03-10 2018-09-18 西北农林科技大学 一株骆驼刺泛菌突变株pa11zm1的筛选方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103215286A (zh) * 2012-11-12 2013-07-24 江南大学 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103215286A (zh) * 2012-11-12 2013-07-24 江南大学 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L-赖氨酸合成代谢中NADPH代谢的研究进展;张伟国等;《食品与生物技术学报》;20121231;第31卷(第10期);第1009-1017页 *
Mutagenesis of Key Residues in the Binding Center of L-Aspartate-β-Semialdehyde Dehydrogenase from Escherichia coli Enhances Utilization of the Cofactor NAD(H);Xiaoshu Xu et al.;《Chembiochem》;20151210;第17卷(第1期);第56-64页 *
The Central Enzymes of the Aspartate Family of Amino Acid Biosynthesis;Ronald E.Viola;《Acc.Chem.Res.》;20011231;第34卷(第5期);第339-349页 *

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