JP2020501525A - グルタチオンレダクターゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドを含む組成物に関する。本発明はまた、グルタチオンレダクターゼをコードする核酸にも、核酸を含む発現ベクターにも、および核酸または発現ベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。本発明は、ポリペプチドの調製のための方法およびシスチンの還元のためのポリペプチドの使用にさらに関する。本発明は、そのうえ、シスチンの酵素的還元のための方法に関する。
グルタチオンレダクターゼ(GRとも略される)(EC1.8.1.7)は、グルタチオンジスルフィド(GSSG)のスルフヒドリル型グルタチオン(GSH)への還元を触媒し、これは、酸化ストレスに抵抗し、還元性環境を維持する際に有用な分子である。酸化ストレスへの抵抗および還元性環境の提供は、食品用途、たとえば食品の保存のために有益である。
本発明は、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドの同定に基づく。ポリペプチドは、たとえばケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)種由来などのようにケトミウム(Chaetomium)属の微生物に由来してもよい。
a)配列番号1の成熟ポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド;
b)配列番号1の成熟ポリペプチド配列と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列の相補鎖に中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド;および
d)配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるグルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
−配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1または請求項2に記載のグルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
−宿主細胞におけるグルタチオンレダクターゼの発現を指示する1つ以上のコントロール配列に作動可能に連結された請求項3に記載の核酸を含む発現ベクター。
−本発明のポリペプチド、本発明の核酸、または本発明の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
−本発明のポリペプチドの調製のための方法であって、
ポリペプチドの産生を可能にする条件下で適した発酵培地において本発明による宿主細胞を培養するステップ;および任意選択で
ポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
−酸化チオールの還元のための本発明のポリペプチドの使用。
−シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法であって、
本発明のポリペプチド、補助因子、および媒介物質を含む還元溶液とシスチンを接触させるステップ;ならびに任意選択で
システインを回収するステップ
を含む方法。
−システインおよび本発明のポリペプチドを含む組成物。
をも提供する。
配列番号1は、ケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)由来のグルタチオンレダクターゼポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためにコドンペアを最適化したケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)由来のグルタチオンレダクターゼポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
用語「相補鎖」は、用語「相補体(complement)」と区別なく使用することができる。核酸の相補鎖は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体とすることができる。二本鎖核酸を指す場合、ポリペプチドをコードする核酸の相補体は、アミノ酸配列をコードする鎖の相補鎖またはそれを含有する任意の核酸分子を指す。典型的に、リバース相補鎖が、意図される。
a)配列番号1の成熟ポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するまたは配列番号1のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド;
b)配列番号1の成熟ポリペプチド配列と少なくとも50%の配列同一性を有するまたは配列番号1のポリペプチド配列と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列のまたは配列番号2のポリペプチドコード配列の相補鎖に中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド;および
d)配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列に対してまたは配列番号2のポリペプチドコード配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるグルタチオンレダクターゼ活性(EC1.8.1.7)を有するポリペプチドに関する。
i.配列番号1の(成熟)ポリペプチド配列と、少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列(または対応する野生型配列または酵母、たとえばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などのような異種有機体における発現のためにコドン最適化されたもしくはコドンペア最適化された配列)の相補鎖に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド;または
ii.配列番号2の(成熟)ポリペプチドコード配列(または対応する野生型配列または酵母、たとえばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などのような異種有機体における発現のためにコドン最適化されたもしくはコドンペア最適化された配列)に対して少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
である本発明のポリペプチドをも提供する。
本発明のポリペプチド、補助因子、および媒介物質を含む還元溶液とシスチンを接触させるステップ;ならびに任意選択で
システインを回収するステップ
を含む方法にも関する。
[実施例1:S.セレビシエ(S.cerevisiae)におけるケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)由来のグルタチオンレダクターゼの発現]
高い温度で機能するグルタチオンレダクターゼ(GR)活性を有するポリペプチドをケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)変種サーモフィラム、株DSM1495に起源を持つケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)から得た。
[2.1 耐熱性真菌グルタチオンレダクターゼ&酵母グルタチオンレダクターゼの温度依存性の活性]
様々な温度での実施例1による酵素およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(Sigma−Aldrich、G3664)酵素由来の市販で入手可能な酵母グルタチオンレダクターゼの活性を、15分間、アッセイバッファー0.1M Tris pH8.0中の10mM GSSGおよび0.5mM NADPHとの酵素のインキュベーションならびに直後に340nmで吸光度を測定することによって定量化した。反応液を、所望の温度(20〜80℃の間でおよそ10℃ごと)に設定したウォーターバス中のガラス試験管において、その温度で15分間、NADPHの許容され得る変換をもたらすことが予想された希釈度でインキュベートした。15分後、反応液を、溶けかかった氷上で急速に冷却することによってクエンチし、読み取りを2分以内に実行した。1本のチューブをブランク(酵素の代わりにバッファーを追加)として追加し、さらなるブランクはウォーターバス中でインキュベートしなかったが、反応の間、氷上で保存した(氷ブランク)。氷ブランクは、開始時に1回およびその日の終わりに1回の2回測定した。測定した吸光度を、対応するブランク(同じ温度でインキュベートした)および様々な希釈係数に対して補正し、活性を、酵素について観察された最も高い活性を基準として示した。反応の開始時の反応混合物の組成は、以下のとおりであった:250マイクロリットル アッセイバッファーpH8.0+250マイクロL 40mM GSSG+250マイクロL 2mM NADPH+反応を開始するための250マイクロリットル酵素希釈液。
両方のGR酵素についてのpH曲線を、室温で0.1Mリン酸バッファーにおいてpH6〜10の間のすべてのpH単位で活性をアッセイすることによって得た。GR酵素なしのブランクをすべてのpHに含めた。pH6〜9のバッファーは、所望のpHを得るために様々な比で0.1M Na2HPO4溶液および0.1M NaH2PO4溶液を混合することによって作製した。バッファーがpH10に達するためには水酸化ナトリウムの追加を必要とした。50mMのNADPHストックを、milliQ水中で調製し、水酸化ナトリウムを追加して、NADPHが可溶性で安定するpH8にした。GSSG溶液は、それぞれのpHについて別々に調製した(20mM=15mL Greinerチューブ中61.3mg/5mLバッファー)。酵素は、最初に、水中で20×に希釈し、次いで、様々なpH設定値のバッファー中で100×に希釈した。NADPHストック溶液は、酵素の追加の前のNADPHのバックグラウンド変換を最小限にするために、アッセイを開始する前に所望のバッファー中で25×に少し希釈した。アッセイは以下のとおりに実行し:100マイクロL GSSG溶液pH X+50マイクロリットルNADPH溶液pH X+50マイクロリットル希釈酵素pH X、次に、所望のpHでの反応速度の読み取り340nmを実行した。反応の傾き(Δ340nm/分)を、同じpHのブランクの反応(酵素の代わりにバッファーを追加した)の傾きに対して補正し、活性を、その酵素について測定された最も高い活性を基準として示した。第1の測定シリーズは、真菌GR(非熱ショック)についてのものとし、第2のシリーズは、酵母GRについてのものとした。
実施例1において産生された真菌GRを、可能性のあるプロテアーゼ活性を不活性化するために熱ショックにかけた。サンプル溶液におけるグリセロールのあらゆる安定作用を妨げるために、サンプルをバッファー中で100倍に希釈し、サンプルを、ウォーターバス中で60分間65℃にさらした。サンプルを、15mLプラスチックGreinerチューブ中で、あらかじめ平衡化したバッファー(0.1M Tris pH8.0)に対して希釈した。次いで、チューブを閉じ、ウォーターバス中にすぐに戻した。60分後、チューブを効率的に冷却するために、溶けかかった氷上に置いた。サンプルを冷蔵保存した。熱ショックにかけた真菌GR(既に100×に希釈)および市販の酵母GR(Sigma−Aldrich G3664)をアッセイバッファー(0.1M Tris pH8.0)においてそれぞれ20×および2500×に希釈した。溶液を2枚のPCRプレートのウェルに移し(ウェル当たり100マイクロL、酵素サンプル当たり8ウェルを3カラム)、残った希釈液は、溶けかかった氷上に保った。PCR機器は、カラムの方向にプレートにわたって温度勾配を適用するようにプログラムした。一方のPCRプレートは、64〜40℃の範囲にわたる温度で(A→H=64/62.5/59.4/54.6/49.2/44.6/41.5/40℃)、他方は、56〜80℃の範囲にわたる温度で(A→H=80/78.5/75.4/70.6/65.2/60.6/57.5/56℃)インキュベートした。温度勾配を30分間保持し、次いで、PCRプレートは、速やかに冷却し(PCR機器において)、分析まで4℃の一定温度に戻した(この場合、約20分間)。両方のプレートを、PCR機器において同時にではあるが異なる機械(同じタイプの)でインキュベートした。
熱ショックにかけた真菌GR(既に100×に希釈)および市販の酵母GR(Sigma−Aldrich G3664)をバッファー(0.1M Tris pH8)において20×および2500×に希釈した。サンプルを2枚のPCRプレート(ウェル当たり100マイクロL)に移し、残った希釈液を一晩、冷蔵保存した。一方のプレートは30℃で、他方は、50℃で、PCR機械において16時間(蓋の温度105℃)インキュベートした。16時間後、PCRプログラムは、活性の分析まで温度を4℃まで下げた。活性の分析のために、50マイクロリットルをPCRプレートのウェルからMTPにおけるGR活性アッセイに移した。ブランク(酵素の代わりにバッファー)を、NADPHのバックグラウンド変換による傾き(Δ340nm/分)の補正のために含めた。様々なウェル(温度当たり酵素当たりに8つ)の結果を平均し、冷蔵庫で一晩保存したサンプルの活性(=100%、酵素がその条件下で安定していることを仮定)を基準として示した。熱ショック真菌GRおよび市販で入手可能な酵母GRの16時間のインキュベーションは以下の結果をもたらした(表1)。
シスチンのシステインへの還元を、媒介物質としての酸化グルタチオンおよび補助因子としてのNADPHの存在下において真菌GRおよび酵母GR(sigma)を使用して実行した。反応の概要は、以下のとおりとする。
CYS−CYS+2GSH→2CYS+GSSG
GSSG+NADPH→2GSH+NADP+H
Claims (15)
- グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドであって、
a)配列番号1の成熟ポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド;
b)配列番号1の成熟ポリペプチド配列と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
c)配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列の相補鎖に中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド;および
d)配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド。 - ケトミウム・サーモフィラム(Chaetomium thermophilum)に由来し得る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1または2に記載のグルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
- 宿主細胞におけるグルタチオンレダクターゼの発現を指示する1つ以上のコントロール配列に作動可能に連結された、請求項3に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項1もしくは2に記載のポリペプチド、請求項3に記載の核酸、または請求項4に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 組換え酵母細胞、好ましくは、組換えサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項5に記載の組換え宿主細胞。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドの調製のための方法であって、
前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で適した発酵培地において請求項5に記載の宿主細胞を培養するステップ;および任意選択で
前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む、方法。 - 酸化チオールの還元のための、請求項1または2に記載のポリペプチドの使用。
- シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法であって、
請求項1または2に記載のポリペプチド、補助因子、および媒介物質を含む還元溶液とシスチンを接触させるステップ;ならびに任意選択で
前記システインを回収するステップ
を含む方法。 - 前記還元溶液と前記シスチンを接触させる前記ステップは、25℃〜75℃の範囲内の温度で実行される、請求項9に記載の方法。
- 前記媒介物質は、グルタチオンである、請求項10または11に記載の方法。
- 前記補助因子は、好ましくは酸化型(NADP+)のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)または好ましくは酸化型(NAD+)のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記還元溶液は、少なくとも6のpHを有する、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- システインおよび請求項1または2に記載のポリペプチドを含む組成物。
- グルコン酸、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、アセトン、およびアセトアルデヒドから選択される1つ以上のものをさらに含む、請求項14に記載の組成物。
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