CN110088274A

CN110088274A - 谷胱甘肽还原酶

Info

Publication number: CN110088274A
Application number: CN201780079133.4A
Authority: CN
Inventors: 马克·亚历山大·范登伯格; 埃拉赫·贾马尔扎德; 塞缪尔·阿德里安斯·玛丽亚·瑞纳德
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2019-08-02
Also published as: EP3559217A1; JP2020501525A; WO2018114576A1; KR20190095429A; US20190330600A1

Abstract

本发明涉及具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽，所述多肽选自由以下项组成的组：a)具有包含SEQ ID NO:1的成熟多肽序列的氨基酸序列的多肽，或者2)包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

Description

谷胱甘肽还原酶

技术领域

本发明涉及具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽和包含此类多肽的组合物。本发明还涉及编码谷胱甘肽还原酶的核酸，包含该核酸的表达载体，以及包含该核酸或表达载体的重组宿主细胞。本发明还涉及用于制备该多肽的方法和该多肽用于还原胱氨酸的用途。本发明还涉及用于酶促还原胱氨酸的方法。

背景技术

谷胱甘肽还原酶(也缩写为GR)(EC 1.8.1.7)催化将谷胱甘肽二硫化物(GSSG)还原为巯基形式谷胱甘肽(GSH)，GSH是一种在抵抗氧化应激和维持还原环境方面有用的分子。在食品应用中，抵抗氧化应激和提供还原环境是有益的，例如用于保存食品。

可受益于GSH的还原环境的一种应用是胱氨酸或L-胱氨酸朝向半胱氨酸或L-半胱氨酸的还原。半胱氨酸是食品、制药和个人护理行业中的前体。较大的食品应用中的一种是产生风味。例如，美拉德反应中半胱氨酸与糖的反应产生肉风味。半胱氨酸也用作烘焙的加工助剂，并作为抗氧化剂添加到天然果汁产品中。当用作食品添加剂时，半胱氨酸的E编号为E920。

虽然变异谷胱甘肽还原酶催化相同的转换，但这并不意味着它们适用于相同的应用。各种应用对酶必须起作用所处的条件提出不同的要求。可能影响酶促转换速率的物理和化学参数是温度(其对反应速率具有正面影响，但可能对酶稳定性具有负面影响)、含水量、pH、盐浓度、食品基质的结构完整性、酶的活化剂或抑制剂的存在、底物和产物的浓度等。

因此，存在对用于具有改进性质的几种应用(例如在热稳定性可为有利的较高温应用中)的改进谷胱甘肽还原酶的持续需求。

对于食品方面的应用，重要的是GSH不受微生物污染。避免微生物污染的一种解决方案是在诸如至少40℃的高温下产生GSH。

发明内容

本发明基于对具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽的鉴定。所述多肽可以来源于例如Chaetomium属的微生物，诸如来源于物种Chaetomium thermophilum。

本发明的多肽优选是嗜热的，例如是热稳定的(即在其酶促活性方面能够承受热处理)和/或热活性的(即仅在高温下发展出其完全酶促活性)。替代性地或另外，本发明的多肽可以是在宽pH范围内和/或相对高或低的pH下具有活性的多肽。

提供具有改善的嗜热性质的谷胱甘肽还原酶是拓宽其应用的重要方式。与其他谷胱甘肽还原酶相比，热活性和热稳定的谷胱甘肽还原酶具有显著的优势。例如，可以在相对高的温度下使用热活性或热稳定的谷胱甘肽还原酶来进行GSSG的还原，并且这会导致与高温起作用的过程的相容性。此外，可以以较高的反应速率来进行较高温度下的GSSG还原。

在宽pH范围内有活性的谷胱甘肽还原酶也是有利的，因为可以在具有广泛不同pH范围的不同方法中使用本发明的多肽。还可以在pH值在过程中经历显著波动的过程中使用此类多肽。也可以是其中出现6至10的pH值的过程。

具有谷胱甘肽还原酶活性的本发明的多肽尤其可用于食品成分的生产，优选用于在高于40℃的温度下将胱氨酸还原为半胱氨酸。这是有益的，因为其降低了食品成分的微生物污染风险。

因此，本发明提供了具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽，所述多肽选自由以下项组成的组：

a)具有包含SEQ ID NO:1的成熟多肽序列的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

c)由这样的核酸编码的多肽，所述核酸包含在中等严格性条件下与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列的互补链杂交的序列；以及

d)包含由这样的核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少50％的序列同一性。

本发明还提供了：

-一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1或权利要求2所述的具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽，所述核酸包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少50％序列同一性的序列。

-一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求3所述的核酸，所述核酸可操作地连接到一个或多个控制序列，所述控制序列指导谷胱甘肽还原酶在宿主细胞中的表达。

-一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的多肽、本发明的核酸或本发明的表达载体。

-一种用于制备本发明的多肽的方法，所述方法包括：

在允许产生多肽的条件下，在合适的发酵培养基中培养根据本发明的宿主细胞；以及任选地，

回收所述多肽。

-本发明的多肽用于还原氧化硫醇的的用途。

-一种用于将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法，所述方法包括：

使胱氨酸与包含本发明的多肽、辅因子和介体(mediator)的还原溶液接触；以及任选地

回收所述半胱氨酸。

-一种组合物，所述组合物包含半胱氨酸和本发明的多肽。

附图说明

图1显示了在实施例1中使用的表达载体。

图2显示了在不同温度下酵母谷胱甘肽还原酶和来自Chaetomium thermophilum的真菌谷胱甘肽还原酶多肽的温度活性。

图3显示了在不同pH下酵母谷胱甘肽还原酶和来自Chaetomium thermophilum的谷胱甘肽还原酶多肽的相对活性。

图4显示了在不同温度下30分钟后酵母谷胱甘肽还原酶和来自Chaetomiumthermophilum的真菌谷胱甘肽还原酶多肽的残余活性。

图5显示了使用酵母谷胱甘肽还原酶和来自Chaetomium thermophilum的谷胱甘肽还原酶多肽的半胱氨酸形成。

序列表说明

SEQ ID NO:1列出了来自Chaetomium thermophilum的谷胱甘肽还原酶多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2列出了编码来自Chaetomium thermophilum的谷胱甘肽还原酶多肽的氨基酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列经密码子对优化以在Saccharomycescerevisiae中表达。

详细说明

术语“互补链”与术语“互补体”可以互换使用。核酸的互补链可以是编码链的互补体或者非编码链的互补体。提及双链核酸时，编码多肽的核酸的互补体指的是氨基酸序列编码链的互补链或者指的是含有它的任何核酸分子。通常，想要的是反向互补链。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

“表达载体”包含编码多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到用于在体外或在多核苷酸的宿主细胞中表达和/或翻译的适当的控制序列(例如启动子，以及转录和翻译终止信号)。

表达载体可以是任何下述载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA步骤并且可以引起多核苷酸表达。所述载体的选择通常依赖于载体与该载体被导入的细胞的相容性。所述载体可以是线性的或闭合的环状质粒。所述载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外主体存在、其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当导入宿主细胞时整合到基因组中并与其整合进入的染色体一起复制的载体。整合型克隆载体可以随机整合或在宿主细胞染色体的预定靶基因座整合。载体系统可以是单个载体或质粒，或两个或更多个载体或质粒，其合在一起含有将被导入到宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。

本文所定义的“宿主细胞”是适于遗传操作的生物体并且可以在用于目标产物(例如根据本发明的多肽)的工业生产的细胞密度下培养的生物体。宿主细胞可以是在自然界发现的宿主细胞或在遗传操作或传统诱变后源自亲本宿主细胞的宿主细胞。有利地，宿主细胞是重组宿主细胞。

术语“杂交”意为寡聚化合物(例如，核酸化合物)基本互补链的配对。

可在低严格性、中等严格性、或高严格性条件下进行杂交。低严格性杂交条件包括在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在至少50℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可提高至55℃)。中等严格性杂交条件包括在约45℃的6×SSC中杂交，接着在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或更多次。高严格性杂交条件包括在约45℃的6×SSC中杂交，接着在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或更多次。

核酸或多核苷酸序列在本文中被定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸指的是RNA和DNA。术语“核酸”和“多核苷酸序列”在本文中可以互换使用。

术语“多肽”指的是包含通过肽键连接的氨基酸残基并且含有多于5个氨基酸残基的分子。在本文中使用时，术语“蛋白质”与术语“多肽”是同义的并且也可以指两个或更多个多肽。因此，术语“蛋白质”和“多肽”可以互换使用。多肽可以被任选地修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰基化、法呢基化、异戊二烯基化(prenylated)、磺化等)以添加功能性。在一定条件下在特定底物存在时展示活性的多肽可被称为酶。应当理解的是，由于遗传密码的简并性，可以产生编码给定多肽的诸多核苷酸序列。

“分离的核酸片段”是天然不作为片段存在，并且在自然状态下将不会发现的核酸片段。

在本文中使用时，术语“分离的多肽”是指从与其天然相关联的至少一种组分(例如其他多肽材料)移出的多肽。分离的多肽可以不含任何其他杂质。如通过SDS-PAGE或适合此目的且本领域技术人员已知的任何其他分析方法所测定，分离的多肽可以是至少50％纯，例如至少60％纯、至少70％纯、至少75％纯、至少80％纯、至少85％纯、至少80％纯、至少90％纯或至少95％纯、96％纯、97％纯、98％纯、99％纯、99.5％纯、99.9％纯。分离的多肽可由重组宿主细胞产生。

优选地，本发明的多肽或包含本发明多肽的组合物不含除谷胱甘肽还原酶活性之外的其他酶活性。更优选地，本发明的多肽或包含本发明多肽的组合物不含肽酶活性、蛋白酶活性和/或磷酸酶活性。

“成熟多肽”在本文中被定义为在mRNA被翻译成多肽且所述多肽被翻译后修饰之后获得的最终形式的多肽。翻译后修饰包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化和通过切割除去前导序列例如信号肽、原肽和/或前原肽。

“成熟多肽编码序列”表示编码成熟多肽的多核苷酸(参考其氨基酸序列)。

术语“核酸构建体”在本文中指的是这样的单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因或经修饰后含有以自然界不存在的方式联合和并置的核酸区段。当核酸构建体包含编码序列表达所需的所有控制序列、其中所述控制序列可操作地连接到所述编码序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。

术语“启动子”在本文中被定义为下述DNA序列，其与RNA聚合酶结合并指导聚合酶到核酸序列的正确下游转录起点以起始转录。启动子还可以包含调节物的结合位点。

关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组的”表示：细胞、核酸、蛋白质或载体已通过导入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质被修饰，或者该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中没有发现的基因，或者表达以其它方式异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。术语“重组的”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。

术语“序列同一性”或“序列同源性”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在本文中定义，为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，所述序列就最佳比较的目的被比对。为了优化两条序列之间的比对，可以向被比较的两条序列中的任意条中引入缺口。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可以在更短长度上，例如在约20、约50、约100或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是在报告的被比对区域上两条序列之间相同匹配的百分比。

可以使用数学算法来完成两条序列之间的序列比较和序列同一性百分比确定。本领域技术人员会意识到事实上几种不同的计算机程序可用于比对两条序列和确定两条序列之间的同一性(Kruskal,J.B.(1983)，在D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编辑)，Time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequencecomparison，第1-44页，Addison Wesley中的An overview of sequence comparison)。可以使用用于比对两条序列的Needleman和Wunsch算法来测定两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。算法可以比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已经通过计算机程序NEEDLE实现。就本发明的目的而言，使用来自EMBOSS包(2.8.0或更高版本，EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,1.and Bleasby,A.Trends inGeneticsl6,(6)pp276-277,http://emboss,bioinformatics,nl/)的NEEDLE程序。对蛋白质序列而言，对取代矩阵使用EBLOSUM62。对核苷酸序列而言，使用EDNAFULL。使用的任选参数是10的缺口开放罚分和0.5的缺口延伸罚分。技术人员应当明白，所有这些不同的参数会产生轻微不同的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体同一性百分比不会显著改变。

通过上述程序NEEDLE比对后，如下计算查询序列和本发明序列之间的序列同一性百分比：用两条序列中展示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中相应位置的数量除以减去了比对中缺口总数的比对总长度。本文定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序输出中被标记为“最长同一性”。

本发明的核酸和蛋白质序列还可以被用作“查询序列”以针对公开数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可以使用Altschul等人(1990)J.MoI.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可以使用NBLAST程序(计分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(计分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得加缺口的比对用于比较的目的，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见国立生物信息中心(Nataional Center for Biotechniology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

“合成分子”例如合成核酸或合成多肽是通过体外化学合成或酶法合成产生的。其包括但不限于，利用所选宿主生物体的最优密码子选择产生的变体核酸。

可对合成核酸的密码子选择进行优化，优选地根据W02006/077258和/或W02008000632(其通过引用并入本文)中所述的方法进行。W02008/000632解决了密码对优化。密码对优化是这样的方法，其中优化已经对其密码子选择、特别是使用的密码对进行修饰的编码多肽的核苷酸序列，以获得编码多肽的核苷酸序列的改进表达和/或所编码的多肽的改进生产。密码对被定义为编码序列中一组两个相继的三联体(密码子)。本领域技术人员知道需要根据宿主物种对密码子选择进行调整，从而可能产生与SEQ ID NO:2具有显著同源性偏离、但仍然编码根据本发明多肽的变体。

本发明涉及具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽(EC 1.8.1.7)，所述多肽选自由以下项组成的组：

a)具有包含SEQ ID NO:1的成熟多肽序列的氨基酸序列的多肽，或具有包含SEQID NO:1的多肽序列的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽，或包含与SEQ ID NO:1的多肽序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

c)由这样的核酸编码的多肽，所述核酸包含在中等严格性条件下与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO 2的多肽编码序列的互补链杂交的序列；以及

d)包含由这样的核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:2的多肽编码序列具有至少50％的序列同一性。

本发明多肽的优点是其为热稳定的并在较高温度下保持其活性。这允许在例如包含热处理以减少污染的食品加工中使用所述多肽，而不使本发明多肽的活性失活。

本发明还提供了本发明的多肽，所述多肽是：

i.包含与SEQ ID NO:1的(成熟)多肽序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

ii.由这样的核酸编码的多肽，所述核酸包含在高严格性条件下与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列(或相应的野生型序列，或经密码子优化或密码子对优化以用于在异源生物体(诸如酵母，例如Saccharomyces cerevisiae)中表达的序列)的互补链杂交的序列；或

ii.包含由这样的核酸编码的氨基酸序列的多肽，所述核酸与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽编码序列(或相应的野生型序列，或经密码子优化或密码子对优化以用于在异源生物体(诸如酵母，例如Saccharomyces cerevisiae)中表达的序列)具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

本发明还涉及这样的多肽，所述多肽为上述多肽的分离的、基本上纯的、纯的、重组的、合成的或变异的多肽。

本发明的多肽可能够来源于Chaetomium属的生物体，诸如来源于Chaetomiumthermophilum。关于本发明多肽的来源，词语“来源于”或“能够来源于”表示：当利用根据本发明的多肽进行BLAST搜索时，根据本发明的多肽可源自天然资源(例如微生物细胞)，所述天然资源的内源多肽显示出与本文所公开多肽最高的同源性或同一性百分比。

优选地，本发明的多肽可以是与SEQ ID NO:1的(成熟)多肽序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85、86％、87％、88％、89％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％或100％序列同一性的多肽。

根据本发明的多肽可以由任何合适的多核苷酸序列编码。通常，多核苷酸序列是经密码子优化或经密码子对优化的序列，以用于在特定宿主细胞中表达本文所公开的多肽。本发明的多肽可以由包含合适的控制序列和/或信号序列的多核苷酸序列编码，例如以用于分泌。

本发明的多肽可以由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严格性条件下，优选在高严格性条件下与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列(或相应的野生型序列，或经密码子优化或密码子对优化以用于在异源生物体(诸如Bacillus，例如Bacillus subtilis)中表达的序列)的互补链杂交。

本发明的多肽还可以由这样的核酸编码，所述核酸与SEQ ID NO:2的(成熟)多肽编码序列(或相应的野生型序列，或经密码子优化或密码子对优化以用于在异源生物体(诸如酵母，例如Saccharomyces cerevisiae)中表达的序列)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％或100％同一性。

本发明的多肽还可以是SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，所述变体在成熟多肽SEQID NO:1的一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入。SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体可以是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽的氨基酸有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个或多于12个氨基酸不同。

在一个实施方式中，本发明的特征为本文所公开的多肽的生物活性片段。

本发明的多肽可以是天然存在的多肽，或经遗传修饰的或重组的多肽。

可以纯化本发明的多肽。蛋白质纯化是本领域技术人员已知的。

本发明的多肽可以优选是热稳定的和/或热活性的。另外或替代性地，本发明的多肽可以在宽pH范围内具有活性且/或在相对高或低的pH下具有活性。

本发明的多肽可以是热稳定的。本文中的“热稳定的”是指在50℃下孵育30分钟后，本发明多肽的残余谷胱甘肽还原酶活性可为至少60％。在55℃、60℃、65℃或70℃下孵育30分钟后，本发明多肽的残余谷胱甘肽还原酶活性可为至少50％。

本文中的“残余活性”是指与在其他方面相同的反应条件(pH、底物等)下在酶的最适温度范围内的原始比活性/体积活性相比，酶在特定温度下持续特定孵育持续时间后具有的任何比酶促活性/体积酶促活性。酶的比活性/体积活性是指特定量的转换底物(例如以μmol计)/单位时间(例如以分钟计)/酶量(例如以mg或ml计)。酶的残余活性由上述孵育持续时间后酶的比活性/体积活性除以原始比活性/体积活性得到，以百分比(％)表示。在这种情况下，酶的比活性可以以U/mg表示，并且酶的体积活性可以以U/ml表示。或者，在描述意义上，酶的比活性/体积活性也可以以katal/mg或katal/ml表示。

术语“酶活性”或“酶促活性”，有时也称为“催化活性”或“催化效率”，通常是本领域技术人员已知的，是指酶的转换率，并且通常借助于比率k_kat/K_M来表示，其中k_kat为催化常数(也称为转换数)，并且K_M值对应于底物浓度，在该底物浓度下反应速率为其最大值的一半。或者，酶的酶促活性也可以通过比活性(转换底物的μmol数×mg^-1×min^-1；参见上文)或体积活性(转换底物的μmol数×ml^-1×min^-1；参见上文)来指定。

关于酶促活性，还可以参考一般文献，诸如Structure and Mechanism inProtein Science:A guide to enzyme catalysis and protein folding,Alan Fersht,W.H.Freeman,1999；Fundamentals of Enzyme Kinetics,Athel Cornish-Bowden,Wiley-Blackwell 2012和Voet等人，“Biochemie”[Biochemistry],1992,VCH-Verlag，第13章，第331-332页。

因此，在50℃的温度下30分钟后，本发明的热稳定多肽的残余活性可为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。优选地，在50℃的温度下30分钟后，本发明的多肽的残余活性在75％至100％的范围内，诸如75％至90％。

具有谷胱甘肽还原酶活性的本发明多肽优选为热活性的。本文中的“热活性”是指此类多肽的最适温度为至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃。

可以如实施例2中所述测定热活性。

术语“最适温度”通常是技术人员已知的，涉及酶表现出其最大酶促活性的温度范围。与此相关的可以参考相关文献，诸如Enzyme Assays:A Practical Approach,RobertEisenthal,Michael J.Danson,Oxford University Press 2002；Voet等人，“Biochemie”,1992,VCH-Verlag，第13章；第331页；I.H.Segel,Enzyme Kinetics:Behavior andAnalysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems,WileyInterscience,1993；以及A.G.Marangoni,Enzyme Kinetics:A Modern Approach,WileyInterscience,2002。

在本文中，最适温度优选应理解为这样的温度范围，在所述温度范围中本发明多肽在其他方面恒定的反应条件下的最大酶促活性为至少80％，优选至少90％。

根据本发明的多肽的最适温度优选在50°至70℃的范围内，诸如在55℃至65℃的范围内。

因此，本发明多肽优选为热稳定的(即在其酶促活性方面能够承受热处理)和/或热活性的(即仅在高温下发展出其完全酶促活性)。

本发明多肽可以在相对高的pH(诸如为至少6、至少7、至少8或至少9的pH)下具有活性。

术语“最适pH”通常是技术人员已知的，涉及酶具有其最大酶促活性的pH范围。与此相关的可以参考相关文献，诸如Enzyme Assays:A Practical Approach,RobertEisenthal,Michael J.Danson,Oxford University Press 2002和Voet等人，“Biochemie”,1992,VCH-Verlag，第13章；第331页。在本文中，术语最适pH通常应理解为表示这样的pH范围，在所述pH范围中根据本发明使用的谷胱甘肽还原酶在其他方面恒定的反应条件下具有最大酶促活性的至少80％，优选至少90％。

本发明的多肽可以在非常宽的pH范围内具有活性。在pH 6至pH 10的范围内，本发明的多肽的活性可优选为最大活性的至少10％。因此，可以在具有广泛不同的pH范围的不同过程中使用本发明多肽。还可以在pH值在过程中经历显著波动的过程中使用该多肽。也可以是其中出现6至10的pH值的过程。

在pH 6.0至pH 10的整个pH范围内，本发明的多肽的活性为与最大活性(即在其他方面相同的条件下，优选在最适温度和浓度下，具有最适pH值的最大活性)相比至少10％，更优选至少15％，进一步优选至少20％，最优选至少25％，特别为至少30％。

本发明进一步提供了编码具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽的核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少50％序列同一性的序列。

本发明的核酸可包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQID NO:2或其成熟多肽编码序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

本发明的多核苷酸序列可包含SEQ ID NO:2或可包含SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列。

本发明的核酸可为SEQ ID NO:2的核酸的分离的、基本上纯的、纯的、重组的、合成的或变异的核酸。变异核酸序列可以例如与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性。

本发明还提供了包含本发明的核酸的核酸构建体。还提供了包含本发明的核酸的表达载体，或本发明的核酸，所述核酸可操作地连接到一个或多个控制序列，所述控制序列指导多肽在宿主细胞中的表达。

存在一些将核酸插入核酸构建体或表达载体中的方法，这些方法是本领域技术人员已知的，参见例如Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001。利用控制序列(例如，启动子和终止子序列)操纵编码本发明多肽的核酸可能是期望的。

启动子可为适合真核或原核宿主细胞的显示出转录活性的任何适当启动子序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可从编码与细胞同源(天然)或异源(外来)的细胞外或细胞内多肽的多核苷酸获得。启动子可为组成型或诱导型启动子。诱导型启动子可以是例如淀粉诱导型启动子。

本发明还提供了包含本文公开的核酸或表达载体的宿主细胞或重组宿主细胞。合适的宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞，或细菌细胞。

优选地，宿主细胞或重组宿主细胞是真核细胞，更优选酵母。更优选地，本发明宿主细胞为Saccharomyces cerevisiae或重组Saccharomyces cerevisiae。

更优选地，本发明的宿主细胞是热不稳定的宿主细胞，或嗜常温宿主细胞，或活性峰低于35℃的宿主细胞。热不稳定的宿主细胞的优点是可以通过在例如40℃至75℃下进行热处理来容易地降低不希望的酶促副活性。

优选地，本发明的重组宿主细胞，优选为Saccharomyces cerevisiae，还包含编码脱氢酶(优选热稳定和/或热活性脱氢酶)的核酸。优选地，编码葡糖脱氢酶的核酸来源于Bacillus，优选来源于Bacillus megaterium或Bacillus subtilis。来源于Bacillussubtilis的酶的示例可从US5126256和US5114853获知。更优选地，基因构建体允许过度表达脱氢酶，诸如葡糖脱氢酶。将编码脱氢酶的核酸与本文所公开的核酸或表达载体组合的优点是重组宿主细胞提供两种酶。(葡糖)脱氢酶可有利地用于辅因子的再生。

本发明的发明人发现，通过使用Saccharomyces cerevisiae作为宿主，减少了不希望的副活性，诸如肽酶、蛋白酶和磷酸酶。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，所述方法包括：在有益于生产所述多肽的条件下在合适的发酵培养基中培养宿主细胞；和生产所述多肽。本领域技术人员知道如何根据使用的宿主细胞，例如发酵培养基的组成，温度和pH来进行用于生产本文所公开多肽的方法。可以在摇瓶或者在体积为0.5升或1升或更大至10到100或更多立方米的发酵罐中培养宿主细胞。根据宿主细胞的需求，可以有氧地或厌氧地进行培养。

有利地，从发酵培养基中回收或分离本文所公开的多肽。

或者，不从分离的发酵培养基中回收本文所公开的多肽。发酵培养基，或本发明的重组宿主细胞，或Saccharomyces cerevisiae可以立即用于酶促还原氧化硫醇，而无需从发酵培养基中进行回收。

因此，本发明涉及本发明多肽用于还原氧化硫醇的用途。优选地，本发明涉及本发明多肽用于还原氧化型谷胱甘肽或用于产生还原型谷胱甘肽的用途。更优选地，本发明涉及本发明多肽用于与介体，优选谷胱甘肽一起还原氧化硫醇的用途。更优选地，本发明涉及本发明多肽用于还原胱氨酸的用途。更优选地，本发明涉及本发明多肽用于在25℃至75℃范围内的温度下，优选在30℃至65℃或35℃至60℃范围内的温度下，更优选在40℃至75℃范围内的温度下，最优选在45℃至75℃或甚至50℃或60℃至75℃的范围内的温度下还原氧化硫醇的用途。

本发明还涉及用于将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法，所述方法包括：

使胱氨酸与包含本发明的多肽、辅因子和介体的还原溶液接触；以及任选地

回收所述半胱氨酸。

本发明的发明人发现本发明多肽可有效地用于胱氨酸的酶促还原。本发明的多肽特别允许在高温下酶促还原胱氨酸，这有益于降低半胱氨酸的微生物污染风险。这在半胱氨酸的食品应用中是有利的。

因此，在一个优选的实施方式中，本发明的使胱氨酸与还原溶液接触的步骤在25℃至75℃范围内的温度下，优选在30℃至65℃或35℃至60℃范围内的温度下，更优选在40℃至75℃范围内的温度下，最优选在45℃至75℃或甚至50℃或60℃至75℃的范围内的温度下进行。

如本发明上下文中使用的辅因子意指帮助本发明多肽的辅助分子。优选地，辅因子是辅酶。优选地，辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate；NADPH)，优选呈氧化形式(NADP+)，或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，优选呈氧化形式(NAD+)。

如本发明上下文中使用的介体旨在表示促进电子转移过程的化合物，即催化电子转移至胱氨酸，从而导致还原的半胱氨酸的化合物。优选地，本发明的介体是谷胱甘肽。谷胱甘肽可以呈氧化形式(也缩写为GSSG)或呈还原形式(也缩写为GSH)。

在一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液的pH为至少6。更优选地，本发明的还原溶液的pH为至少6.5、至少7、至少7.5、至少8.5或至少9.0。更优选地，还原溶液的pH为至多7、至多8、至多9、至多10、至多11或至多12。

在一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液还包含辅因子再生体系。辅因子再生体系的使用提供了用于酶促还原胱氨酸的改进方法，因为在还原过程中不需要额外的步骤来添加辅因子。此外，使辅因子再生是成本有效的，因为需要较低量的辅因子来提供将胱氨酸还原为半胱氨酸。优选地，辅因子再生体系包含酶和相应的底物。优选地，辅因子再生体系包含葡糖脱氢酶和葡萄糖和/或甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase)和甲酸盐(formate)。优选地，葡糖脱氢酶和葡萄糖和/或甲酸脱氢酶是热稳定和/或热活性的酶。更优选地，葡糖脱氢酶来源于Bacillus，更优选来源于Bacillus megaterium或Bacillussubtilis。热稳定性脱氢酶从例如US5126256和US5114853中已知，描述了来源于Bmegaterium的脱氢酶。发现甲酸脱氢酶特别适用于NADH的再生，而葡糖脱氢酶适用于NADPH和NADH两者的再生。本发明的辅助因子再生系统中的替代性酶是醇脱氢酶、NADP依赖性甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、H₂驱动的NAD(P)+还原性氢化酶或亚磷酸盐脱氢酶。特别优选的是包含醇脱氢酶和醇的辅因子再生体系，更优选为包含醇脱氢酶和异丙醇或醇脱氢酶和乙醇的辅因子再生体系。使用醇脱氢酶并使用醇作为底物的优点在于，通过醇脱氢酶形成的产物(诸如使用异丙醇后形成的丙酮和使用乙醇后形成的乙醛)是挥发性的，因此它们可以容易地从本发明的还原溶液和/或包含半胱氨酸的溶液中去除。

在一个优选的实施方式中，本发明的方法以工业规模进行。在本发明的整个说明书中，工业规模方法或工业过程可以理解为包括使用体积规模≥10L，优选≥100L，更优选≥1m³、≥5m³，甚至更优选≥10m³，最优选≥25m³，优选小于250m³的还原溶液的方法。

在另一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液含有低的，即小于5％(重量)或小于1％(重量)的能够催化将半胱氨酸再氧化成胱氨酸的化合物或不含能够催化将半胱氨酸再氧化成胱氨酸的化合物。具有“吸附”电子倾向的此类化合物的示例是三价铁、硝酸根(nitrate)、铜离子。优点是本发明的还原溶液中半胱氨酸的量增加。

在另一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液是水溶液。优选地，还原溶液或水溶液包含缓冲液。优选地，缓冲液是磷酸钠缓冲液。或者，缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(或tris HCl缓冲液)或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(缩写为MES缓冲液)。

鉴于通过本发明的酶促还原产生的半胱氨酸具有无微生物污染的优点，因此允许在食品应用中安全使用，本发明涉及包含半胱氨酸和本发明多肽的组合物。更具体地，本发明的组合物是食品组合物。食品组合物是这样的组合物，其被认为是安全的且/或其适用于制造食品。更优选地，本发明的组合物还包含选自葡糖酸、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽(GSH或GSSG)、丙酮和乙醛中的一种或多种。

此外，由本发明产生的半胱氨酸可有利地用于食品、食品基质中，或用于加工香料的生产。

在下面的非限制性实施例中进一步说明了本发明。

实施例

实施例1：来自Chaetomium thermophilum的谷胱甘肽还原酶在S.cerevisiae中的表达。

从源自Chaetomium thermophilum var.嗜热菌株DSM 1495的Chaetomiumthermophilum获得具有在高温下起作用的谷胱甘肽还原酶(GR)活性的多肽。

如WO2008/000632中所述，使用SEQ ID NO:1的氨基酸序列作为模板来进行S.cerevisiae特异性密码子对优化。为了克隆目的，在编码真菌GR的基因的5'端和3'端引入含有BsaI识别位点的DNA序列。通过使用金门克隆(golden gate cloning)，将真菌GR基因置于S.cerevisiae TDH3启动子与TAL1终止子之间，随后转化到E.coli中进行增殖。使用卡那霉素抗性基因选择转化体，所述卡那霉素抗性基因赋予对新霉素的抗性。分离含有THD3启动子-真菌GR SEQ ID NO:2-TAL1终止子(POT)表达盒的质粒并用作PCR反应中的模板，以扩增POT，同时添加与图1所示的线性化S.cerevisiae 2微米表达载体pRS30g的5'端和3'端同源的50个碱基对的DNA序列。将真菌GR POT表达盒和线性化的pRS30g通过PEG醋酸锂(LIAC)方法共转化至缺乏内源性谷胱甘肽还原酶活性的公众可获得的S.cerevisiaeCEN.PK113-7D(ΔGLR1)中。载体骨架和真菌GR POT通过同源重组在体内重组到功能性表达载体中。使用赋予G418抗性的pRS30g上存在的KanMx标记进行转化体的选择。在酵母提取物、植物蛋白胨、D葡萄糖培养基(YEPh-D培养基)+G418(200μg/ml)中培养正确的转化体。将该预培养物用于接种Verduyn培养基(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,van DijkenJP.1992a.Effect of Benzoic Acid on Metabolic Fluxes in Yeasts:A Continuous-Culture Study on the Regulation of Respiration and AlcoholicFermentation.Yeast 8:501-517.)+G418(在2L摇瓶中400ml，200RPM,30℃)中的发酵至起始OD600为0.1。孵育24小时后，将细胞离心，用milli-Q水(mQ)洗涤，并悬浮在200mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)中至10％w/w(基于湿颗粒重量)。将悬浮物以1ml份转移到含有500mg玻璃珠(0.45-0.50mm)的2ml管中。通过下述方式来机械裂解细胞：在Precellys 24均化器上以5000RPM充分振荡管40秒三次，在各次振荡间在冰上冷却两分钟。通过在4℃以12000RPM离心15分钟，汇集上清液，并以3000RPM离心60分钟来去除不溶性细胞碎片。将该无细胞提取物用作谷胱甘肽还原酶的来源。

实施例2：热稳定的谷胱甘肽还原酶的生化表征

2.1热稳定的真菌谷胱甘肽还原酶和酵母谷胱甘肽还原酶的温度依赖性活性

通过下述方式来量化根据实施例1的酶和市售的来自Saccharomyces cerevisiae的酵母谷胱甘肽还原酶(Sigma-Aldrich,G3664)在不同温度下的活性：将酶与10mM GSSG和0.5mM NADPH在测定缓冲液0.1M Tris pH 8.0中孵育15min，然后立即测量340nm处的吸光度。将反应在玻璃试管中在设定至所需温度(约在20℃和80℃之间每10℃)的水浴中以预期在该温度下在15分钟内产生可接受的NADPH转换的稀释孵育。15min后，通过在融冰上快速冷却来猝灭反应，并在2分钟内进行读取。加入一个管作为空白(加入缓冲液代替酶)，额外的空白不在水浴中孵育，而是在反应过程中储存在冰上(冰空白)。测量冰空白两次，一次在这天开始时，一次在这天结束时。针对相应的空白(在相同温度下孵育)校正测量的吸光度，并且相对于观察到的酶的最高活性来表示不同的稀释因子和活性。反应开始时反应混合物的组成如下：250微升测定缓冲液pH 8.0+250微升40mM GSSG+250微升2mM NADPH+250微升酶稀释液，以起始反应。

GR的相对活性如图2所示。真菌热稳定的谷胱甘肽还原酶在60℃下显示出最大的催化活性。

2.2真菌热稳定谷胱甘肽还原酶的pH依赖性活性

通过在室温下在0.1M磷酸盐缓冲液中测定pH 6与pH 10之间的每个pH单位下的活性，来获得两种GR酶的pH曲线。在每个pH下包括不含GR酶的空白。通过以不同比率混合0.1MNa2HPO4溶液和0.1M NaH2PO4溶液以获得所需的pH来制备pH 6-9的缓冲液。获得pH 10的缓冲液需要添加氢氧化钠。在milliQ水中制备50mM的NADPH储备液，加入氢氧化钠至pH 8，其中NADPH为可溶且稳定的。针对每种pH单独地制备GSSG溶液(20mM＝在15mL Greiner管中61.3mg/5mL缓冲液)。首先将酶在水中稀释20倍，然后在处于不同pH设定点的缓冲液中稀释100倍。在开始测定前不久，将NADPH储备溶液在所需缓冲液中稀释25倍，以在加入酶之前使NADPH的背景转换最小化。该测定如下进行：100微升GSSG溶液pH X+50微升NADPH溶液pH X+50微升稀释的酶pH X，接着在所需pH下进行340nm处的动态读取。针对相同pH下空白反应(加入缓冲液而不是酶)的斜率来校正反应的斜率(Δ340nm/min)，并且将活性相对于该酶的最高测量活性进行表示。第一测量系列为针对真菌GR(非热休克的)，第二系列为针对酵母GR。

相对活性如图3所示。真菌GR在pH 8至10之间显示出最大的催化活性。

2.3真菌谷胱甘肽还原酶的热稳定性(30分钟)

将实施例1中产生的真菌GR进行热休克以使可能的蛋白酶活性失活。将样品在缓冲液中稀释100倍以防止样品溶液中甘油的任何稳定化效应，并使样品在水浴中经受65℃持续60分钟。将样品稀释到15mL塑料Greiner管中的预平衡缓冲液(0.1M Tris pH 8.0)中。然后将管封闭并立即放回水浴中。60分钟后，将管放在融冰上以进行有效冷却。将样品冷藏。将热休克的真菌GR(已经稀释100倍)和商业酵母GR(Sigma-Aldrich G3664)分别在测定缓冲液(0.1M Tris pH 8.0)中稀释20倍和2500倍。将溶液转移到2个PCR板的孔中(每孔100微升，每个酶样品3列，每列8个孔)；将剩余的稀释物保持在融冰上。对PCR设备进行编程，以在列的方向上跨越板施加温度梯度。将一个PCR板在64℃至40℃的温度下孵育(A→H＝64/62.5/59.4/54.6/49.2/44.6/41.5/40℃)，将另一个PCR板在56℃至80℃的温度下孵育(A→H＝80/78.5/75.4/70.6/65.2/60.6/57.5/56℃)。将温度梯度保持30min，然后将PCR板快速冷却(在PCR设备中)回4℃的恒定温度直至分析(在这种情况下约20分钟)。两个板同时在PCR设备中，但在(相同类型的)不同机器中孵育。

两种GR酶的温度稳定性曲线如图4所示。真菌GR在40-65度的温度范围内稳定，而酵母GR在55度孵育30分钟后损失超过80％的活性。

2.4真菌谷胱甘肽还原酶在应用中的热稳定性(16小时)

将热休克的真菌GR(已经稀释100倍)和商业酵母GR(Sigma-Aldrich G3664)在缓冲液(0.1M Tris pH 8)中稀释20倍和2500倍。将样品转移到2个PCR板的孔中(每孔100微升)；将剩余的稀释物冷藏保存过夜。将一个板在30℃下、另一个板在50℃下在PCR机器中孵育16小时(盖温105℃)。16小时后，PCR程序使温度回降至4℃，直至活性分析。对于活性分析，将50微升从PCR板的孔转移至MTP中的GR活性测定。包括空白(缓冲液代替酶)以用于使用NADPH的背景转换来校正斜率(Δ340nm/min)。将不同孔(每个温度每种酶8个孔)的结果取平均值并相对于在冰箱中储存过夜的样品的活性(＝100％，假设酶在那些条件下是稳定的)表示。热休克真菌GR和市售酵母GR的16小时孵育产生了以下结果(表1)：

表1：对在(略微)提高的温度下进行GR酶的过夜孵育的结果的概述

实施例3：在谷胱甘肽存在下使用谷胱甘肽还原酶以将胱氨酸还原成半胱氨酸

使用真菌GR和酵母GR(sigma)，在作为介体的氧化型谷胱甘肽和作为辅因子的NADPH存在下，进行将胱氨酸还原为半胱氨酸。示意性反应如下：

CYS-CYS+2GSH→2CYS+GSSG

GSSG+NADPH→2GSH+NADP+H。

在具有温度和pH控制的200ml夹套容器中进行反应。总工作体积为100毫升。在两个容器中进行反应。容器1含有参考酵母GR(Sigma)，容器2含有热稳定的真菌GR。在55摄氏度下进行反应，用NaOH(1M)将pH控制在8。表2总结了反应物和酶的浓度。

表2：在使用GR酶还原胱氨酸中应用的组分的浓度(在100mL中)

化合物	容器1	容器2
			酶	酵母GR(Sigma)	真菌GR
酶剂量(单位/ml)*	2.0	2.0
			GSSG(g)	0.1	0.1
胱氨酸g)	1.0	1.0
			NADPH(g)	4.775	4.775

*单位为微摩尔/毫升/分钟。

在t＝0(就在加入酶之前)、0.25、1、2、3、4和5小时时取样。将200μl样品以13000RPM离心1分钟，并将100μl上清液转移至900μl的0.111N HCL(终浓度为0.1N HCL)，混合并在-20℃下储存。通过LCMS-MS方法分析所有样品以测量L-胱氨酸、L-半胱氨酸、GSH、GSSG，以及这些组分的组合。此外，通过澄清的样品溶液在视觉上确认反应的完全，表明低可溶性L-胱氨酸被还原成高度可溶的L-半胱氨酸。随时间的半胱氨酸形成在图5中示出。在五小时孵育内使用真菌GR将约10g/l的L-胱氨酸完全还原为L-半胱氨酸。在酵母GR(sigma)存在下半胱氨酸的水平不随时间提高，这表明酶在所应用的条件下无活性。

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 谷胱甘肽还原酶

<130> 32280-WO-PCT

<160> 2

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 1

Met Ala Pro Ile Ser Lys Glu Thr Asp Phe Leu Val Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Leu Gly Ala Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Gly Ala

20 25 30

Arg Ala Met Ile Ile Glu Gly Lys Arg Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn

35 40 45

Val Gly Cys Val Pro Lys Lys Val Thr Phe Asn Ala Ala Ala Ile Ala

50 55 60

Glu Thr Ile His His Ser Lys Ala Tyr Gly Phe Asn Val Gln Glu Thr

65 70 75 80

Ala Pro Phe Asp Trp Ala Thr Phe Lys Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val

85 90 95

Lys Arg Leu Asn Gly Ile Tyr Glu Arg Asn Leu Ala Asn Asp Lys Val

100 105 110

Glu Tyr Val His Gly Trp Ala Lys Leu Ile Ser Pro Asn Gln Val Glu

115 120 125

Val Thr Leu Glu Asp Gly Ser Lys Thr Val Val Ser Ala Lys Lys Ile

130 135 140

Leu Ile Ala Val Gly Gly Tyr Pro Ser Pro Pro Pro Ala Ile Pro Gly

145 150 155 160

Ala Glu Tyr Gly Thr Asn Ser Asp Gly Phe Phe Asp Ile Asp Lys Leu

165 170 175

Pro Lys Lys Val Ala Leu Val Gly Ala Gly Tyr Ile Ala Val Glu Phe

180 185 190

Ala Gly Met Phe Asn Ala Leu Gly Val Glu Thr His Leu Phe Ile Arg

195 200 205

His Asp His Phe Leu Arg Ala Phe Asp Pro Met Ile Gln Glu Gly Val

210 215 220

Thr Lys Glu Tyr Glu Arg Leu Gly Val Lys Leu His Lys Arg Ser Ala

225 230 235 240

Leu Thr Arg Val Asp Lys Asp Ala Thr Thr Gly Gln Leu Thr Ile His

245 250 255

Tyr Lys Glu Gly Asp Gly Glu Gly Val Ile Gly Asp Val Asp His Leu

260 265 270

Ile Trp Ala Ile Gly Arg Lys Pro Ala Thr Gln Gly Leu Gly Leu Glu

275 280 285

Ala Ala Gly Val Lys Thr Asp Glu Lys Gly Tyr Ile Val Val Asp Glu

290 295 300

Tyr Gln Asn Thr Ser Val Glu Asn Ile Tyr Ala Leu Gly Asp Val Thr

305 310 315 320

Gly Arg Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Ala Ala Gly Arg Lys Leu

325 330 335

Ala Ala Arg Leu Tyr Gly Pro Glu Gln Phe Arg Thr Ala Lys Leu Asp

340 345 350

Tyr Glu Asn Val Pro Ser Val Val Phe Ala His Pro Glu Val Gly Ala

355 360 365

Ile Gly Leu Thr Glu Pro Gln Ala Ile Glu Lys Tyr Gly Lys Glu Asn

370 375 380

Val Lys Val Tyr Lys Ser Asn Phe Ile Ala Met Tyr Tyr Ala Met Met

385 390 395 400

Glu Pro Glu Gln Lys Ala Pro Thr Ser Tyr Lys Leu Val Cys Val Gly

405 410 415

Pro Glu Glu Arg Val Val Gly Leu His Ile Met Gly Leu Gly Ser Ala

420 425 430

Glu Ile Leu Gln Gly Phe Gly Val Ala Ile Lys Met Gly Ala Thr Lys

435 440 445

Ala Asp Phe Asp Asn Cys Val Ala Ile His Pro Thr Ser Ala Glu Glu

450 455 460

Leu Val Thr Met Arg

465

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon Pair Optimized DNA Sequence

<400> 2

atggctccaa tctccaagga aactgacttc ttggtcattg gtggtggttc tggtggtttg 60

ggtgccgcta gagctgcttc cggtcgttat ggtgccagag ctatgatcat tgaaggtaag 120

agattgggtg gtacttgtgt caacgttggt tgtgttccaa agaaggtcac tttcaacgct 180

gctgccattg ctgaaaccat tcaccactcc aaggcttacg gtttcaacgt tcaagaaacc 240

gctccattcg actgggctac tttcaaggcc aagagagatg cttacgtcaa gagattgaat 300

ggtatctacg aaagaaactt ggctaacgac aaggttgaat acgtccacgg ttgggctaaa 360

ttgatctctc caaaccaagt tgaagtcact ttagaagatg gttccaagac cgttgtttct 420

gccaagaaga tcttgattgc tgtcggtggt tacccatctc caccaccagc cattccaggt 480

gctgaatacg gtactaactc cgatggtttc ttcgacattg acaaattgcc taagaaggtt 540

gctttggtcg gtgctggtta catcgccgtt gaatttgctg gtatgttcaa cgccttgggt 600

gtcgaaaccc acttgttcat cagacacgac catttcttga gagctttcga cccaatgatc 660

caagaaggtg tcaccaagga atacgaaaga ttaggtgtca aattgcacaa gagatctgct 720

ttgactagag ttgacaagga tgctaccacc ggtcaattaa ctattcacta caaggaaggt 780

gatggtgaag gtgttatcgg tgacgttgac catttgatct gggctattgg tagaaagcca 840

gctactcaag gtttaggttt ggaagctgct ggtgtcaaga ccgatgaaaa gggttacatt 900

gttgttgacg aataccaaaa cacttctgtt gaaaacatct acgctttggg tgatgtcacc 960

ggtcgtgtcg aattgacccc agttgccatt gccgctggta gaaaattggc tgctcgtcta 1020

tacggtccag aacaattcag aaccgctaag ttggactacg aaaacgttcc atccgttgtc 1080

tttgctcacc cagaagttgg tgctatcggt ttgactgaac ctcaagctat cgaaaagtac 1140

ggtaaggaaa acgtcaaggt ctacaaatct aacttcatcg ccatgtacta cgctatgatg 1200

gaaccagaac aaaaggctcc aacttcttac aaattggttt gtgttggtcc agaagaaaga 1260

gttgttggtt tgcacatcat gggtttgggt tctgctgaaa tcttgcaagg tttcggtgtc 1320

gccatcaaga tgggtgctac taaggctgat ttcgacaact gtgttgccat tcacccaacc 1380

tctgctgaag aattagtcac catgcgataa 1410

Claims

1.一种具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽，所述多肽选自由以下项组成的组：

a)具有包含SEQ ID NO:1的成熟多肽序列的氨基酸序列的多肽；

2.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽能够来源于Chaetomium thermophilum。

3.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1或权利要求2所述的具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽，所述核酸包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少50％序列同一性的序列。

4.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求3所述的核酸，所述核酸可操作地连接到一个或多个控制序列，所述控制序列指导谷胱甘肽还原酶在宿主细胞中的表达。

5.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求1或2所述的多肽，根据权利要求3所述的核酸，或根据权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞为重组酵母细胞，优选重组Saccharomyces cerevisiae细胞。

7.一种制备根据权利要求1或2所述的多肽的方法，所述方法包括：

在允许产生所述多肽的条件下，在合适的发酵培养基中培养根据权利要求5所述的宿主细胞；以及任选地，

回收所述多肽。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽用于还原氧化硫醇的用途。

9.一种将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法，所述方法包括：

使胱氨酸与包含根据权利要求1或2所述的多肽、辅因子和介体的还原溶液接触；以及任选地

回收所述半胱氨酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述使胱氨酸与所述还原溶液接触的步骤在25℃至75℃范围内的温度下进行。

11.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述介体为谷胱甘肽。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，优选呈氧化形式(NADP+)，或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，优选呈氧化形式(NAD+)。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述还原溶液的pH为至少6。

14.一种组合物，所述组合物包含半胱氨酸和根据权利要求1或权利要求2所述的多肽。

15.根据权利要求14所述的组合物，所述组合物还包含选自葡糖酸、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽、丙酮和乙醛中的一种或多种。