KR101875564B1 - 포도당 및 글리세롤을 이용한 유가식 배양을 통한 리시놀레산으로 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생물전환공정 - Google Patents

포도당 및 글리세롤을 이용한 유가식 배양을 통한 리시놀레산으로 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생물전환공정 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 측면은 오메가-하이드록시지방산 생산용 재조합 미생물에 관한 것으로, pelB 서열이 도입된 에스터가수분해효소(esterase) 유전자를 포함하는 오메가-하이드록시지방산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.

Description

포도당 및 글리세롤을 이용한 유가식 배양을 통한 리시놀레산으로 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생물전환공정{BIOTRANSFORMATION OF RICINOLEIC ACID INTO ω-HYDROXYUNDEC-9-ENOIC ACID BY FED-BATCH FERMENTATION USING GLUCOSE AND GLYCEROL}
본 발명은 오메가-하이드록시지방산 생산용 재조합 미생물, 및 이를 이용한 오메가-하이드록시지방산 생산 방법에 관한 것이다.
오메가-하이드록시지방산은 지방산의 말단에 하이드록시기가 결합된 지방산의 일종으로(HOCH2(CH2)nCOOH) 폴리에틸렌 계열의 플라스틱 제조 시 모노머로 사용되고 화장품 또는 의약품의 제조에 널리 이용된다. 또한, 오메가-하이드록시지방산은 폴리아미드, 폴리에스터 계열의 플라스틱 제조 및 화장품, 생활용품 제조에 널리 사용되는 장쇄 디카르복실산 합성의 전구체로도 이용된다.
일반적으로 오메가-하이드록시지방산은 자연계에 거의 존재하지 않으므로 유기합성법에 의해 산업적으로 제조되고 있으나, 유기합성법은 고온 및 고압의 조건에서 수행되며, 독성 산화물이 배출되므로 환경적으로 유해하다.
따라서, 환경 친화적이고 단순화된 오메가-하이드록시지방산 제조 방법이 개발되고 있으며, 특히 청정기술인 생물학적 제조 방법이 활발히 연구되고 있다.
예컨대, 캔디다 트로피칼리스(Candidatropicalis)를 이용한 장쇄 디카르복실산 및 전구체인 하이드록시지방산의 제조 방법이 보고된 바 있다. 그러나, 상기 방법은 최초 기질로 데칸(decane), 노난(nonane)과 같은 석유 유래의 원료를 공급해야 하고, 최종 산물의 순도가 낮은 단점이 있다.
이를 해결하고자 재조합 미생물을 이용한 생물 전환 공정이 개발된 바 있다. 상기 공정에서 장쇄 지방산인 리시놀레산은 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)에 의해 케톤 대사체인 케토올레익산으로 변환되고, 배이어-빌리거 모노산소첨가효소(BVMO)에 의해 에스터 대사체로 변환된다. 또한, 상기 에스터 대사체는 에스터가수분해효소(esterase)에 의해 하이드록시디카르복실산으로 변환되고, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 추가적인 도입에 의해 디카르복실산으로 변환된다.
그러나 상기 공정은 생산성 및 수율이 미흡하여 산업적인 활용이 어려웠으므로, 경제성을 확보하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 오메가-하이드록시지방산을 효율적으로 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 오메가-하이드록시지방산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, pelB 서열이 도입된 에스터가수분해효소(esterase) 유전자를 포함하는 오메가-하이드록시지방산 생산용 재조합 미생물이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 pelB 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 유전자, 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 유전자를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 장쇄 지방산을 오메가-하이드록시지방산으로 변환할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 장쇄 지방산은 올레산, 리시놀레산(ricinoleic acid), 12-하이드록시스테아릭산(12-hydroxystearic Acid), 리놀레인산(linoleic acid), 팔미톨레인산(Palmitoleic acid), 또는 레스쿠에롤린산(lesquerolic acid)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 오메가-하이드록시지방산은 오메가-하이드록시노난산(ω-hydroxynonanoic acid), 오메가-하이드록시운데칸산(ω-hydroxyundecanoic acid), 또는 오메가-하이드록시운덱-9-에논산(ω-hydroxyundec-9-enoic acid)일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 오메가-하이드록시지방산의 생산 방법이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 생산 방법은 포도당 및 글리세롤을 탄소원으로 이용하되, 탄소원 제한 유가식 배양(carbon source-limited fed-batch) 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 알코올탈수소효소 유전자, BVMO 유전자, 및 에스터가수분해효소 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 미생물은 탄소원 제한 유가식 배양(carbon source-limited fed-batch)되고, 상기 탄소원은 포도당 및 글리세롤을 포함하는 오메가-하이드록시지방산의 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 재조합 미생물은 에스터가수분해효소의 세포 내 도입위치가 변경되어 작용 활성이 증가하므로, 생산성이 현저히 증대될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 생산 방법은 세포 내 조효소의 재생산으로 인해 효소 반응이 원활하게 진행되므로 생산성이 현저히 증대될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물의 생물 전환 경로를 도식화 한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터, pelB 서열 및 에스터가수분해효소의 염기 서열을 도식화 한 것이다.
도 3은 YC-AB 균주의 유가식 배양을 통해 에스터 화합물을 생산한 결과이다. (A) 포도당 제한 공급 방식으로 배양한 결과이다. (B) 글리세롤 제한 공급 방식으로 배양한 결과이다. (C) 글리세롤 고농도 공급 방식으로 배양한 결과이다.
도 4는 YC-ABE 균주의 유가식 배양을 통해 오메가-하이드록시운덱-9-에논산 을 생산한 결과이다. (A) 리시놀레산 투입 후 포도당의 공급을 중단한 결과이다. (B) 리시놀레산 투입 후 포도당을 제한적 공급한 결과이다.
도 5는 pelB 서열 도입에 따른 에스터가수분해효소의 세포 내 위치를 도식화 한 것이다.
도 6은 pelB 서열 도입에 따른 재조합 미생물의 생산성을 비교한 결과이다. (A) pelB 서열을 도입하지 재조합 미생물의 생산성을 측정한 결과이다. (B) pelB 서열이 도입된 재조합 미생물의 생산성을 측정한 결과이다. (C) 변형된 pelB 서열이 도입된 재조합 미생물의 생산성을 측정한 결과이다.
도 7은 pelB 서열 도입에 따른 재조합 미생물의 생산성을 비교하고자, 고농도 세포를 이용하여 유가식 배양을 수행한 결과이다. (A) pelB 서열을 도입하지 재조합 미생물의 생산성을 측정한 결과이다. (B) pelB 서열이 도입된 재조합 미생물의 생산성을 측정한 결과이다. (C) 변형된 pelB 서열이 도입된 재조합 미생물의 생산성을 측정한 결과이다.
도 8은 변형된 pelB 서열이 도입된 재조합 미생물의 유가식 배양을 통해 오메가-하이드록시운덱-9-에논산을 생산한 결과이다. (A) 포도당 제한 공급 방식으로 배양한 결과이다. (B) 글리세롤 제한 공급 방식으로 배양한 결과이다. (C) 글리세롤 고농도 공급 방식으로 배양한 결과이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물의 생물 전환 경로를 도식화 한 것이다.
본 발명의 일 측면은 pelB 서열이 도입된 에스터가수분해효소(esterase) 유전자를 포함하는 오메가-하이드록시지방산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 상기 재조합 미생물은 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 유전자, 및 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 유전자를 더 포함할 수 있고, 상기 에스터가수분해효소, 알코올탈수소효소, 및 는 외인성(exogenous)일 수 있다.
도 1을 참조하면, 상기 재조합 미생물에서 장쇄 지방산인 리시놀레산은 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)에 의해 케톤 대사체인 케토올레익산으로 전환될 수 있으며, 상기 케토올레익산은 BVMO에 의해 (E)-11-(헵타노일옥시)운덱-9-에논산으로 전환될 수 있다. 또한, 상기 (E)-11-(헵타노일옥시)운덱-9-에논산은 에스터가수분해효소(esterase)에 의해 오메가-하이드록시운덱-9-에논산으로 전환될 수 있으며, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 추가적인 도입에 의해 디카르복실산으로 전환될 수 있다.
상기 "알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)"는 알코올에서 수소를 제거하여 알데하이드 또는 케톤을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매할 수 있다.
상기 "에스터가수분해효소(esterase)"는 에스터 화합물의 에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 상기 에스터가수분해효소는 상기 BVMO에 의해 생성된 사슬 내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 중쇄 지방산 및 오메가-하이드록시지방산으로 분해할 수 있다.
상기 "BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)"는 케톤을 산화시켜 락톤이나 에스터 화합물을 생성하는 배이어-빌리거 산화 반응을 촉매할 수 있다. 상기 BVMO는 케톤 대사체를 에스터기가 도입된 지방산 유도체로 변환할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .), 로도코커스 속(Rhodococcus sp). 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp .), 코마노나스 속(Comanonas sp .), 아시네토박터 속(Acinetobacter sp .), 아트로박터 속(Arthrobacter sp .), 브라키모나스 속(Brachymonas sp.) 균주에서 유래할 수 있다.
특히, 상기 재조합 미생물은 pelB 서열이 도입된 에스터가수분해효소 유전자를 포함하므로, 상기 에스터 대사체를 효율적으로 하이드록시디카르복실산으로 변환할 수 있다.
상기 pelB 서열은 대장균의 세포막 간극 신호 서열의 일종으로(Rietsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 130408-13053, 1996, Raina et al., J. Biol. Chem. 272: 10349-10352, 1997), 세포 내에서 발현된 단백질의 막을 통한 수송을 촉진하고 주변질 세포(periplasm)로 이동시킬 수 있다.
상기 오메가-하이드록시지방산 생산 경로의 기질인 에스터 화합물은 소수성의 특성으로 인해 상기 에스터가수분해효소의 위치에 따라 변환 효율이 상이해질 수 있다.
도 5를 참조하면, 상기 에스터가수분해효소는 상기 pelB 서열에 의해 주변질 세포에 위치할 수 있으며, 세포막에 다량 존재하는 에스터 화합물과 상호 작용이 증가하여 변환 효율이 현저히 개선될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 pelB 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 구성될 수 있고, 메티오닌(methionine) 및 알라닌(alanine)이 치환된 서열번호 2의 핵산 서열로 구성될 수 있다.
또한, 상기 pelB 서열은 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물"은 핵산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2의 핵산 서열과 적어도 40% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 핵산을 의미한다.
상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 상기 pelB 서열의 구조적, 기능적 상동성으로 인한 분비 촉진 활성을 의미한다. 상기 "서열 상동성”은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 대비하여 결정되며, 비교 영역에서의 일부 핵산 서열이 추가 또는 삭제될 수 있다.
상기 재조합 미생물은 형질 전환에 의해 대사 조작된 상기 숙주 세포(host cell)를 의미한다. 상기 숙주 세포는 발현 벡터에 의한 형질 전환이 용이한 세포를 지칭하는 것으로 유전 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.
상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.
또한, 상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability), 단백질 기능성(protein functionality)의 제어를 통한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외인성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다.
적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.
따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 미생물은 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 미생물의 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예컨대, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.
유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.
상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현된다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현되도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.
한편, 상기 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
형질 전환 하고자 하는 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5; 538-544(2005))을 이용한 형질 전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 미생물은 장쇄 지방산을 오메가-하이드록시지방산으로 변환할 수 있다.
상기 장쇄 지방산은 탄소수 16 내지 20의 장쇄 지방산 일 수 있고, 바람직하게는 올레산, 리시놀레산(ricinoleic acid), 12-하이드록시스테아릭산(12-hydroxystearic Acid), 리놀레인산(linoleic acid), 팔미톨레인산(Palmitoleic acid), 또는 레스쿠에롤린산(lesquerolic acid)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 오메가-하이드록시지방산은 탄소수 5 내지 14의 오메가-하이드록시지방일 수 있고, 오메가-하이드록시노난산(ω-hydroxynonanoic acid), 오메가-하이드록시운데칸산(ω-hydroxyundecanoic acid), 또는 오메가-하이드록시운덱-9-에논산(ω-hydroxyundec-9-enoic acid)일 수 있으나, 이제 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 오메가-하이드록시지방산의 생산 방법이 제공된다.
상기 재조합 미생물은 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 미생물은 형질 전환에 의해 에스터가수분해효소, 알코올탈수소효소, 및 BVMO를 발현할 수 있으므로, 상기 효소의 촉매 활성을 통해 장쇄 지방산을 오메가-하이드록시지방산으로 변환할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생산 방법은 리시놀레산을 오메가-하이드록시운덱-9-에논산(ω-hydroxyundec-9-enoic acid)으로 변환할 수 있다.
이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.
표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.
계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.
예컨대, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생산 방법은 포도당 및 글리세롤을 탄소원으로 이용할 수 있으며, 상기 재조합 미생물은 탄소원 제한 유가식 배양(carbon source-limited fed-batch)될 수 있다.
상기 탄소원 제한 유가식 배양(carbon source-limited fed-batch fermentation)은 탄소원을 배지 중에 지속적으로 공급하되, 탄소원 공급량 및 세포의 섭취량을 동등하게 하여 배지 내 탄소원의 잔류량을 최소화하는 배양 방식이다. 특히, 고농도의 포도당은 기질인 리시놀레산의 세포 내 유입을 억제할 수 있으므로 배지 내 농도를 낮은 수준으로 유지하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 생산 방법은 포도당의 제한적 공급에 의해 저해될 수 있는 세포의 성장을 촉진하고자 글리세롤을 함께 공급할 수 있고, 상기 배양 방식에 의해 상기 재조합 미생물의 생산성은 현저히 증대될 수 있다.
한편, 상기 생산 방법은 pH stat 방식으로 탄소원의 공급을 제어할 수 있다. 예컨대, 상기 탄소원은 용존산소(DO) 또는 pH를 기준으로 제한적 공급될 수 있으며, pH를 기준으로 하는 'pH stat 방식'은 단순하고 정확하게 탄소원의 공급량을 제어할 수 있다.
또한, 상기 리시놀레산은 배양 중 초기 탄소원이 모두 소모된 후 배지에 첨가될 수 있다. 균체가 초기 탄소원을 소모하여 충분히 성장한 후 리시놀레산을 첨가할 때, 생물 전환 공정의 효율이 우수하므로 생산성이 현저히 증대될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.
제조예 : 재조합 미생물 구축
리시놀레산으로부터 에스터 화합물 및 오메가-하이드록시운덱-9-에논산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 관련 효소 유전자가 도입된 플라스미드를 구축하고 숙주 세포에 도입하였다.
pACYCDuet, pCOLAduet 플라스미드를 기반으로 외인성 유전자가 도입된 플라스미드를 하기 표 1과 같이 구축하였다.
또한, 에스터가수분해효소의 활성을 증대시키고자 서열번호 1의 pelB 서열 및 서열번호 2의 pelB 서열을 에스터가수분해효소의 유전자에 도입하였다.
구축된 플라스미드를 숙주 세포에 도입하여 하기 표 2의 재조합 미생물을 제조하였다.
구분 특징 비고
pCOLADuet ColA origin, Kanr, T7 promoter 공벡터
pACYC-adh-kt2440 M. luteus NCTc2665 adh, P. putida KT2440 BVMO 유전자를 포함하는 pCOLADuet -
pCOLA-pfeI P. fluorescens SIK WI pfeI 유전자를 포함하는 pCOLADuet -
pCOLA-pelB-pfeI pelB 서열(서열번호 1)이 도입된 P. fluorescens SIK WI pfeI 유전자를 포함하는 pCOLADuet 제조예 1
pCOLA-pelB2-pfeI pelB 서열(서열번호 2)이 도입된 P. fluorescens SIK WI pfeI 유전가 도입된 pCOLADuet 제조예 2
구분 특징 비고
BL21(DE3) 모균주 -
YC-AB BL21(DE3) pACYC-adh-kt2440 제조예 3
YC-ABE BL21(DE3) pACYC-adh-kt2440 pCOLA-pfeI 제조예 4
YC-ABE-pelB BL21(DE3) pACYC-adh-kt2440 pCOLA-pelB-pfeI 실시예 1
YC-ABE-pelB2 BL21(DE3) pACYC-adh-kt2440 pCOLA-pelB2-pfeI 실시예 2
실험예 1 : 탄소원 공급 방식에 따른 생산성 시험
리시놀레산이 에스터 화합물로 생물 전환될 때 요구되는 NAD+ 및 NADPH와 같은 조효소는 포도당 제한 유가식 배양에 의해 원활하게 재생될 수 있다. 그러나, 포도당의 계속적인 공급은 비누화 반응에 의한 거품의 생성을 유발하고, 리시놀레산의 세포 내 유입을 억제할 수 있다.
따라서, 이를 극복하고자 탄소원으로 글리세롤을 공급하는 유가식 배양을 수행하였으며, 탄소원 종류 및 공급 방식에 따른 생산성을 비교하고자 포도당 및 글리세롤을 탄소원으로 하는 유가식 배양(2.5L)을 수행하였다.
초기 20g/L 포도당 및 0.5% Yeast extract가 첨가된 1L Risenberg 배지(5g/L (NH4)2HPO4, 13.5g/L KH2PO4, 1.7g/L C6H807, 10mL trace metal solution)에 YC-AB 균주를 접종(O.D 0.1)한 후, 27℃, 700rpm, 1 vvm 조건에서 발효 공정을 수행하였다.
초기 공급한 포도당이 소모된 시점에서 pH-stat 방식으로 포도당을 제한적으로 공급하고 세포를 고농도로 배양하였다. 세포의 농도가 약 30g/L에 도달했을 때, 0.1 mM의 IPTG 및 리시놀레산 기질을 투입하였으며, 포도당 제한 공급, 글리세롤 제한 공급, 및 글리세롤 고농도 공급 방식으로 유가식 배양을 수행하였다.
글리세롤 제한 공급 방식은 포도당 제한 공급 방식과 비교하여 거품의 생성을 현저히 억제하였다.
특히, 고농도의 글리세롤을 간헐적으로 투입했을 때(글리세롤 고농도 계속 공급 방식), 포도당 제한 공급 방식과 비교하여 전환율(리시놀레산 → 오메가-하이드록시운덱-9-에논산)은 28%, 생산성은 20% 증가하였다(도 3).
구분 포도당
제한공급		 글리세롤
제한공급		 글리세롤
고농도 공급
소모된 리시놀레산
(mM)		 170.6 181.9 160.5
케토올레익산
(mM)		 31.6 14.7 18.1
에스터 화합물
(mM)		 102.4 105.5 122.9
전환율
(%)		 60 58 77
생산성
(mM/h)		 5.12 5.27 6.14
또한, 포도당의 계속적인 공급에 따른 전환율 및 생산성을 측정하였다.
포도당을 계속적으로 공급하지 않고 중단하였을 때, 전환율(리시놀레산 → 오메가-하이드록시운덱-9-에논산)은 6%, 생산성은 0.16mM/h으로 측정되었다.
반면, 포도당을 계속적으로 공급했을 때, 전환율(리시놀레산 → 오메가-하이드록시운덱-9-에논산)은 23%, 생산성은 0.61mM/h으로 측정되었다.
즉, 포도당 계속 제한 공급 방식의 유가식 배양에 의해 전환율 및 생산성이 약 4.2배, 3.8배 증가하였다(도 4).
구분 포도당 미공급 포도당 제한공급
소모된 리시놀레산
(mM)		 56.6 52.3
케토올레익산
(mM)		 14.4 5.4
에스터 화합물
(mM)		 14.4 30.4
오메가-하이드록시운덱-9-에논산(mM) 3.2 12.2
전환율
(%)		 6 23
생산성
(mM/h)		 0.16 0.61
실험예 2 : pelB 서열 도입에 따른 효소 활성 시험
pelB 서열 도입에 따른 효소 활성을 시험하고자 YC-ABE, YC-ABE-pelB(실시예 1), Yc-ABE-pelB2(실시예 2) 재조합 균주의 생산성을 비교하였다.
상기 재조합 균주를 20g/L 포도당 및 0.5% Yeast extract가 첨가된 100ml Risenberg 배지(5g/L (NH4)2HPO4, 13.5g/L KH2PO4, 1.7g/L C6H807, 10mL trace metal solution)에서 OD 1.0에 도달할 때까지 배양한 후 0.1mM IPTG를 첨가하고 20℃에서 배양하였다.
상기 재조합 균주에 도입된 효소를 발현시킨 후 포도당이 소모된 시점에서 균주를 회수하여 새로운 배지에서 리시놀레산을 첨가하고 생물 전환 공정을 수행하였다.
이 때, pelB 서열을 에스터가수분해효소에 도입했을 때, 전환율 및 생산성이 2.8배 및 2.2배 증가하였다(도 6).
구분 pfeI pelB-pfeI pelB2-pfeI
소모된 리시놀레산
(mM)		 8.6 10.6 10.5
케토올레익산
(mM)		 2.3 1.4 3.3
에스터 화합물
(mM)		 2.3 1.6 1.8
오메가-하이드록시운덱-9-에논산(mM) 1.8 5.0 4.0
전환율
(%)		 21 47 38
생산성
(mM/h)		 0.45 1.25 1.00
재조합 균주의 오메가-하이드록시운덱-9-에논산 생산성을 비교하고자 고농도 세포를 이용하여 유가식 배양을 수행하였다.
포도당 제한 공급 방식의 유가식 배양 결과, pelB 서열(실시예 1)을 도입했을 때 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생산성 및 전환율이 증가하였다. 특히, 서열번호 2의 변형된 pelB 서열(실시예 2)을 도입 했을 때, 생산성 및 전환율은 33%, 43% 각각 증가하였다(도 7)
즉, 상기 결과는 pelB 서열의 도입에 의해 세포막에 존재하는 에스터 화합물 및 에스터가수분해효소의 상호 작용이 현저히 증대될 수 있음을 시사한다.
구분 pfeI pelB-pfeI pelB2-pfeI
소모된 리시놀레산
(mM)		 22.0 18.8 23.8
케토올레익산
(mM)		 10.0 0.0 11.8
에스터 화합물
(mM)		 1.6 0.0 0.0
오메가-하이드록시운덱-9-에논산(mM) 12.2 14.6 17.5
전환율
(%)		 55 78 73
생산성
(mM/h)		 0.61 0.73 0.87
실험예 3 : 탄소원 종류에 따른 생산성 시험
탄소원의 종류에 따른 생산성을 비교하고자 2.5L 발효기 수준의 유가식 배양을 수행하였다.
초기 20g/L 포도당 및 0.5% Yeast extract가 첨가된 1L Risenberg 배지(5g/L (NH4)2HPO4, 13.5g/L KH2PO4, 1.7g/L C6H807, 10mL trace metal solution)에 YC-ABE-pelB2 균주를 접종(O.D 0.1)한 후, 27℃, 700rpm, 1 vvm 조건에서 발효를 수행하였다.
초기 공급한 포도당이 소모된 시점에서 pH-stat을 통해 포도당을 제한적으로 공급하고 세포를 고농도로 배양하였다. 세포의 농도가 약 30g/L 에 도달했을 때, 0.1mM의 IPTG 및 리시놀레산 기질을 투입하였으며, 포도당 제한 공급, 글리세롤 제한 공급, 및 글리세롤 고농도 공급 방식으로 유가식 배양을 수행하였다.
특히, 고농도의 글리세롤을 간헐적으로 투입했을 때, 포도당 제한 공급 방식과 비교하여 최종 산물의 생산성이 약 36% 증가하였다(도 8).
구분 포도당 제한공급 글리세롤 제한공급 글리세롤
고농도 공급
소모된 리시놀레산
(mM)		 23.8 31.6 39.0
케토올레익산
(mM)		 11.8 6.6 6.0
에스터 화합물
(mM)		 0.0 3.0 6.0
오메가-하이드록시운덱-9-에논산(mM) 17.5 15.8 23.7
전환율
(%)		 73 50 61
생산성
(mM/h)		 0.87 0.79 1.19
즉, 탄소원으로서 글리세롤을 공급할 때, 거품의 생성이 억제되고, 리시놀레산의 유입이 차단되지 않으므로 최종 산물의 생산성이 향상될 수 있다. 특히, 고농도의 글리세롤의 간헐적 공급은 리시놀레산의 전환을 현저히 촉진할 수 있다.
또한, pelB 서열이 도입된 에스터가수분해효소는 주변질 세포로 이동하고, 소수성의 에스터 화합물과 상호 작용이 증대되므로 최종 산물의 생산성이 현저히 개선될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Kookmin University <120> BIOTRANSFORMATION OF RICINOLEIC ACID INTO OMEGA-HYDROXYUNDEC-9-ENOIC ACID BY FED-BATCH FERMENTATION USING GLUCOSE AND GLYCEROL <130> 16PP10363 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB sequence <400> 1 aaatacctgc tgccgaccgc tgctgctggt ctgctgctcc tcgctgccca gccggcgatg 60 gcc 63 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB sequence <400> 2 aaatacctgc tgccgaccgc tgctgctggt ctgctgctcc tcgctgccca gccggcg 57

Claims (5)

  1. 탄소원 제한 유가식 배양(carbon source-limited fed-batch)을 통한 오메가-하이드록시지방산 생산용 재조합 대장균에 있어서,
    알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 유전자, BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 유전자, 및 서열번호 2의 pelB 서열이 도입된 에스터가수분해효소(esterase) 유전자를 포함하고,
    장쇄 지방산을 오메가-하이드록시지방산으로 변환하는 재조합 대장균.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 장쇄 지방산은 올레산, 리시놀레산(ricinoleic acid), 12-하이드록시스테아릭산(12-hydroxystearic Acid), 리놀레인산(linoleic acid), 팔미톨레인산(Palmitoleic acid), 또는 레스쿠에롤린산(lesquerolic acid)인 재조합 대장균.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 오메가-하이드록시지방산은 오메가-하이드록시노난산(ω-hydroxynonanoic acid), 오메가-하이드록시운데칸산(ω-hydroxyundecanoic acid), 또는 오메가-하이드록시운덱-9-에논산(ω-hydroxyundec-9-enoic acid)인 재조합 대장균.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 탄소원 제한 유가식 배양(carbon source-limited fed-batch)하는 단계를 포함하는 오메가-하이드록시지방산의 생산 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    포도당 및 글리세롤을 탄소원으로 이용하는 생산 방법.
KR1020180059256A 2018-05-24 2018-05-24 포도당 및 글리세롤을 이용한 유가식 배양을 통한 리시놀레산으로 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생물전환공정 KR101875564B1 (ko)

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KR20240024427A (ko) 2022-08-17 2024-02-26 김영생 바실러스속 호열성 세균 균주를 포함하는 생균제 조성물 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 또는 유기성 폐기물 처리방법

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