KR20240024427A - 바실러스속 호열성 세균 균주를 포함하는 생균제 조성물 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 또는 유기성 폐기물 처리방법 - Google Patents
바실러스속 호열성 세균 균주를 포함하는 생균제 조성물 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 또는 유기성 폐기물 처리방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바실러스속 호열성 세균 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604(SARC-BSL) 또는 Bacillus pumilus OYR 0108(SARC-BSS) 균주를 포함하는 생균제 및 이를 이용한 음식물 폐기물 처리방법을 개시한다.
Description
본 발명은 바실러스속 호열성 세균 균주를 포함하는 생균제 조성물 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 또는 유기성 폐기물 처리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 호열성 세균 B. subtilis subsp. subtilis LSK 0604(SARC-BSL) 및 B. pumilus OYR 0108(SARC-BSS) 균주를 포함하는 생균제 또는 이를 이용한 음식물 쓰레기 또는 유기성 폐기물 처리방법에 관한 것이다.
생명공학기술 또는 유전공학기술에서 유전자 조작된 미생물의 배양에는 통상적으로 동물성 LB배지(Luria-Bertani broth)가 특화된 기본배지로 사용되고 일반 미생물의 액체 배양에는 식물성 TS배지(Tryptic Soy broth)가 사용된다. 이 밖에 미생물학에서 배양배지의 기초배지로는 한천배지(Agar medium)로서 LA 배지, NA 배지, PDA 배지 또는 TSA 배지가 사용된다.
미생물의 실험실적 배양에는 고체배지(solid medium) 또는 액체배지(broth medium)을 사용하여 병(universal bottle) 또는 플라스크(conical flask) level 에서 회분 배양하는 것이 일반적이다. 유가배양(Fed-batch culture)은 특정 물질 예컨대, 아미노산, 유기산, 효소, 항생물질 등 목적 물질의 생산을 위해 필요한 영양 성분을 일시 투입하는 회분식 배양(Batch culture)과 달리 어떤 특정 기질을 제한적으로 바이오 리액터 예컨대 Bench-top,Jar-fermenter 에 투입하여 wet cell paste 또는 target chemical 등 대사산물을 유도, 조절 획득할 때까지 발효 산물을 인출하지 않으므로 상기 회분배양(batch culture)과 연속배양(continuous culture)의 중간에 해당되는 기법이다. 생명공학에서는 일반적으로 flask level의 회분식 배양을 통하여 미생물 균주의 대사 특성이 확인되면, 이어서 유가식 배양을 통하여 타겟 미생물의 대사특성에 따른 미생물의 배양학적 특성 등을 규명하게 되고 나아가 특정 타겟의 대사 산물의 생합성이 가능하다.
한편, 고온성 미생물 또는 세균(이하, 본 발명에서는 호열성 미생물 또는 세균으로 혼용한다)은 고온, 강산성 또는 강알칼리성 등 극한조건(extremes)에서 생존하므로 그의 배양 또는 분리ㆍ동정이 비교적 까다롭다. 따라서, 호열성 미생물로부터 항생물질, 항암물질, 단백질 또는 효소등 유용한 생리 활성물질의 생산 가능성(potentialities)으로 인하여 많은 연구가 진행되어 왔다. 특히 호열성 미생물의 분리 배양 동정을 위해 사용되는 고형의 Agar 배지는 젤강도(strength)가 약하고 이액현상(syneresis)으로 인하여 수분손실이 초래하므로 적절한 고체배지(solid medium)의 연구가 필요하였다.
또한, 호열성 미생물은 극한 조건에 자생하여 왔기 때문에 인공배양시 극한 환경에 맞는 배양조건 즉 배양배지 조성 특히 에너지원(carbon source), pH, 온도, 통기가 적절 조절되지 않으면 그의 대량 배양 및 특정 대사산물의 생합성 또는 그의 분리 정제가 곤란하였으므로 동 균주들의 대량배양의 연구가 필요하였다.
대한민국 특허등록 제10-2197224호에는 극한 미생물은 아니지만 통상의 TPYG 배지 대체용으로서 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract)과 포도당(glucose)을 포함하는 보툴리늄 독소 생산 균주(Clostridium botulinum, type A)의 배양 배지조성물이 개시되어 있고, 또 식중독균 대장균 0157(E. coli 0157:H7)의 종균 배지 조성물로서 에너지원인 당류 특히 락토스(lactose)가 결핍된 배지와 이를 이용한 식중독균 검출방법이 개시되어 있다(대한민국 특허 제10-1882090).
한편, 대한민국 특허등록 제10-2175256호에는 동물세포 동결 보존 후 해동시 특히 면역세포 등의 회수율, 생존율 및 세포 활성을 저하시키지 않을 목적으로 미생물 세포의 동결 보존(cryopreservation)용 배양 조성물, 특히 자연살해 세포의 동결보존 배양배지로서 탄소원으로 DMSO, Dextran 및 질소원으로 알부민(Albumine)이 포함되는 특수 배양배지가 공지되어 있다.
또 대한민국 특허등록 제10-1591584호에는 골수 유래의 줄기세포 배양배지 조성물들이 공지되어 있는 바 이들은 모두 동물세포의 동결보존 후 면역세포의 생존, 활성 또는 동물진피 섬유아세포의 분화, 형성과 관련되어져 있다.
대한민국 특허등록 제10-1875564호 및 동 10-1875502호에는 각각 유가식 배양(fed-batch culture) 기술이 공지되어 있는데 전자는 대장균(E. coli)으로 부터 포도당(glucose)과 글리세롤(glycerol)을 포함하는 탄소원 제한(carbon source limited) 유가식 배양배지를 사용하여 타겟 화합물인 오메가-하이드록시 지방산 생합성 전환을 그리고, 후자의 경우 중온범위의 생육 최적온도 35 ∼ 39℃, 최적 pH 7.0 에서 생육하는 중온성 Bacillus 속 subtilis KCTC 1021 균주로부터 유가식 배양을 통하여 특정 화합물 비타민 K2 의 생물전환 방법이 공지되어 있다.
한편, 바실러스속 고온성 세균 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604(SARC - BSL)균주(이하, 바실러스속'A균주'라 한다) 및 대두박이 함유된 어분의 제조방법이 국내 특허 공개번호 10-2012-06601호에 그리고 동일 바실러스속 고온성 세균 균주로 종(species)이 이와 상이한 B. lumilus OYR 0103(SARC - BSS) 균주(이하,바실러스속'B균주'라 한다) 및 이를 이용한 대두박이 함유된 어분의 제조방법이 국내 특허공개공보 10-2012-06606호에 각각 개시되어 있다.
상기 호열성 세균 균주들은 그 생육 적온이 통상적으로 37℃ 즉 35 ∼ 39℃ 의 중온이상의 고온 범위이나 Bacillus 속 종균의 상기 생육 적온 이상 즉 40 ∼ 50℃ 의 물(H2O) 또는 액체배지에서는 그 자생 및 생육이 가능하지만 60℃ 이상의 고온 특히, 70℃ 에서는 그 생육이 전혀 불가능한 것으로 확인된 바 있다(상기 특허공개공보 명세서 참조).
상기 바실러스속의 호열성 세균 균주들(A 및 B균주라 한다)은 각각 2010. 2. 19자로 국제 미생물 기탁기관에 KCCM 11067P 및 KCCM 11066P 로 각각 기탁되어 현재까지 유효하게 보존되어 있다.
그러나, 지금까지 상기 호열성 세균 균주들은 고체 배지 agar medium 과 액체배지(NA broth)에서 40 ∼ 50℃ 범위에서는 배양된 바 있지만, 그 이상의 60℃ ∼ 80℃까지의 고온범위에서 상기 고체배지의 특성 및 배양학적 특성 나아가 병(Bottles) 및 플라스크(flasks level)의 액체배지 내에서 대량 배양하거나 또는 특정 효소단백질 예컨대, 세정제 또는 음식물 폐기물 처리용 Lipase 와 Alkaline phosphatase 효소의 생합성 나아가 그 효소 특성이나 균주세포 생육특성에 대하여는 전혀 연구된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 온천수 유래의 상기 Bacillus 속 고온성 미생물 을 포함하는 호열성 세균 균주의 배양학적 특성 즉, 최적 배지 조성물을 제공하는 데 있다(도 1, 2 및 도 5).
본 발명의 다른 목적은 2.5L 이상의 Jar-fermenter 를 이용하여 발효 초기에는 탄소원으로 3% 이상의 Maltose 와 0.5% Tryptone 및 0.5% Yeast extract를 각각 첨가한 액체 배지를 이용하고 그후 상기 탄소원이 다 소진된 때부터는 발효 16시간 이내에 포도당(glucose)을 연속적으로 공급하여 CDW 16.0g/L에 이르는 호열성 세균 균주 세포의 속성 유가 배양방법을 제공하는 데 있다(도 2).
본 발명의 또 다른 목적은 발효 초기에 상기 조건의 발효배지에서 발효 16시간 이내에 최대 Alkaline Phosphatase(AP) activity 11.6 U/g wet cell weight/L 에 도달하는 지방 분해 Lipase 효소 활성을 갖는 호열성 세균 세포의 대량 생산방법을 제공하는 데 그 목적이 있다(도3).
본 발명의 이밖의 목적은 상기 활성의 지방 분해효소 활성을 갖는 호열성 세균 균주를 포함하는 생균제 제제와 그 용도 즉, 사용하는 음식물 폐기물 처리방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 다양한 실시예 및 실험결과들을 통하여 달성한다.
본 발명에 따른 호열성 세균 균주들(A, B)의 Universal Bottle 및 flask level 의 배양을 통하여 최적 배양배지와 배양 조건을 규명하는 단계와; 상기에서 얻은 최적 배지 조성물과 배양 조건에 따라 상기 호열성 세균 균주들의 세포를 대량 생산하기 위한 Bench-top fermenter를 이용한 유가식 배양(fed-batch culture) 조건인 초기 배지 농도 즉, 탄소원(Carbon source)으로는 말토스(maltose)를, 그리고 최적 질소원(Nitrogen source)을 첨가하고 그후에는 생육 초기의 에너지원( Carbon source)인 말토스가 소진된 때부터는 pH, 통기속도(vvm), 교반속도(rpm)를 조절하고 상기 에너지원(Carbon source) 말토스 대신 포도당(glucose)을 5 ∼ 7g/L/h feed rate로 공급하여 lipase 와 Alkaline phosphatase(AP) 효소의 최대 활성도를 달성하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 미생물 세포들을 원심분리하여 wet cell paste 를 얻고, 이를 폐기물, 특히 음식물 쓰레기에 첨가하여 속성 분해, 처리하는데 적합한 미생물 생균제제를 제조하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 미생물 생균제제를 이용하여 음식물 폐기물의 처리방법을 제공하고 이를 평가하는 단계를 통하여 달성한다.
본 발명은 본 발명 호열성 세균 균주들의 생육 극대화를 위하여 말토스( Maltose)를 포함하는 기초 배지(Basial Medium) 조성물(M)을 제공하는 효과가 있고, 생육 초기에는 상기 기초배지 조성물(M)을 사용하고 말토스가 소진된 후에는 탄소원으로서 포도당(glucose)을 사용하여 가장 바람직한 유가식 배양방법과 이를 이용한 상기 호열성 세균 균주 세포들의 대량 배양 및 lipase 효소 생합성 방법을 제공하는 효과가 있다. 그 뿐아니라 본 발명은 음식물 쓰레기 폐기물 처리용 생균제제 조성물과 이를 이용한 음식물 폐기물 처리방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1a ∼ 1j는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들을 병(universal Bottle) 또는 플라스크(Shake flasks)를 사용하여 회분배양(batch culture)시 0.3% 이상 농도의 포도당(glucose)을 2종의 질소원과 함께 배양배지 성분으로 동시에 첨가하여 121℃/20분간 autoclave 에서 멸균하여 사용할 수 없음을 확인하여 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 Bench-Top 발효기 내에서 기초 배지(M)의 구성 성분의 함량을 변경한 Medium G(55 maltose, 15% yeast extract 및 15% Tryptone)를 사용하고 autoclave 하여 발효개시 후 glucose feed rate 6.0g/L/h 이상, 1,500 rpm, 1.33 vvm 에서 OD(580nm) 36.7 및 CDW(g/L) 15.8의 Cell의ar growth 의 최대치를 확인하여 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 배양중 분비하는 Lipase 및 AP 효소의 기질(Substances)인 oil-free 및 Phosphate-free 배지(Medium M)에서 AP 효소활성(u/g) 및 세포성장(cellular growth)을 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들을 통상의 아가배지(agar medium)와 본 발명 생균제제용 Maltose 첨가 기초배지(M medium)에 각각 도말하여 60℃, 600rpm 조건의 Incubator에서 4h ∼ 10h 동안 배양시, agar 배지(4a, 4b 및 4c)의 경우 고열에 의한 이액현상 발생 후 경화 균열이 나타나고, M배지(4d)에서는 이러한 것이 없이 정상 Cellular growth 와 Colony 생육상을 나타내 보인 사진도(4d),
도 5a는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 glucose 와 Tryptone 및 Yeast extract를 혼합 첨가 사용하여 121℃/20분간 동시autoclave 멸균한 후, 배양배지로서 사용하여 회분배양할 때, 포도당과 아미노산이 밀라드 반응결과 생성된 물질을 대사하는 과정에서 다당류(Polysaccharides)를 다량 생합성하여 세포 외표면에 뒤집어 쓰므로써(encapsulated) 30h 이상 장시간 생육지연(Long Lag phase)을 나타내는 보인 증거를 확인한 현미경 사진도,
도 5b는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 본 발명 기초배지(M) 즉, mal tose가 첨가된 배지에서 다당류의 생합성 없이 정상 생육한 결과, 간상의 생육상을 보인 현미경 사진도,
도 6은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 배양중 carbon source 로부터 유기산으로 전환한 결과를 HPLC 를 수행하여 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 Bench-Top 발효기 내에서 기초 배지(M)의 구성 성분의 함량을 변경한 Medium G(55 maltose, 15% yeast extract 및 15% Tryptone)를 사용하고 autoclave 하여 발효개시 후 glucose feed rate 6.0g/L/h 이상, 1,500 rpm, 1.33 vvm 에서 OD(580nm) 36.7 및 CDW(g/L) 15.8의 Cell의ar growth 의 최대치를 확인하여 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 배양중 분비하는 Lipase 및 AP 효소의 기질(Substances)인 oil-free 및 Phosphate-free 배지(Medium M)에서 AP 효소활성(u/g) 및 세포성장(cellular growth)을 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들을 통상의 아가배지(agar medium)와 본 발명 생균제제용 Maltose 첨가 기초배지(M medium)에 각각 도말하여 60℃, 600rpm 조건의 Incubator에서 4h ∼ 10h 동안 배양시, agar 배지(4a, 4b 및 4c)의 경우 고열에 의한 이액현상 발생 후 경화 균열이 나타나고, M배지(4d)에서는 이러한 것이 없이 정상 Cellular growth 와 Colony 생육상을 나타내 보인 사진도(4d),
도 5a는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 glucose 와 Tryptone 및 Yeast extract를 혼합 첨가 사용하여 121℃/20분간 동시autoclave 멸균한 후, 배양배지로서 사용하여 회분배양할 때, 포도당과 아미노산이 밀라드 반응결과 생성된 물질을 대사하는 과정에서 다당류(Polysaccharides)를 다량 생합성하여 세포 외표면에 뒤집어 쓰므로써(encapsulated) 30h 이상 장시간 생육지연(Long Lag phase)을 나타내는 보인 증거를 확인한 현미경 사진도,
도 5b는 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 본 발명 기초배지(M) 즉, mal tose가 첨가된 배지에서 다당류의 생합성 없이 정상 생육한 결과, 간상의 생육상을 보인 현미경 사진도,
도 6은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 배양중 carbon source 로부터 유기산으로 전환한 결과를 HPLC 를 수행하여 나타낸 결과이다.
본 발명에 따르면 본 발명에서 시료로 사용한 호열성 세균 균주들은 중온범위(35 ∼ 40℃) 이상의 60℃ 이상의 고온에서 아가배지(agar medium)의 사용은 한천(agar)의 수분이 상기 고열에 의해 이액되거나 배지 표면이 경화, 균열되어 사용할 수 없는 것으로 확인되었다. 60℃ 이상에서 한천배지의 경화, 균열의 발생은 한천(agar)에 함유된 물(H2O)과 유리당 그리고 한천배지 제조시 첨가되는 Skim mill 또는 Yeast Extract 에 함유된 아미노산과 결합하여 4h 이상 millard reaction의 진행이 그 원인으로 사료되었다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 호열성 세균 균주들은 universal bottle 또는 소형 용량의 flask level 에서 배양한 액체 배양균주(culture broth)들을 더 큰 용량의 flask level에서 진탕배양 하거나 또는 bench-top fermentor 에서 fed-batch 배양할 시 접종 작업에 직접 사용하는 것이 발효의 항상성과 균일성 유지에 유효하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 호열성 균주들은 통상의 Bacillus 속의 중온성 균주들과 전혀 달리 배양 초기에는 탄소원(Carbon source) 로서 전체 배지 조성물 100 중량%에 대하여 말토스(maltose) 0.3 중량%(w/v), 질소원(Nitrogen source)으로서는 트립톤(Tryptone) 0.3 중량%(w/v)와 효모 추출물(Yeast extract) 0.3 중량%(w/v) 그리고 Castenholz 무기성분 10 × 배액 가장 바람직하게는 0.1 부피%(v/v)으로 구성된 말토스 기초배지(M)에서 배양되어야 하고, 그 1/5 로 희석된 희석배지(M/5)를 사용하여서는 병 또는 플라스크를 사용한 회분배양에서 각각 OD( 580nm) 각각 1.4 및 1.8 까지 최대 성장이 가능하였다. 상기 병 또는 플라스크에서 OD 1.4 또는 1.8 이상으로 성장하지 못하는 제한요소(limiting factor)는 산소(O2) 부족으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따르면, 본 발명의 호열성 세균 균주 세포들의 대량 생산을 위한 유가배양에서는 교반기의 교반속도, 산소공급율, NaOH 의 공급이 반드시 요구되었다. 바람직한 교반속도는 1,000 ∼ 2,000rpm, 산소공급율은 1.00 ∼ 1.55vvm 으로 확인되었다.
또, 본 발명에 따르면, 말토스 기초배지(M) 보다 1/5 희석 배지(M/5)에서 속성배양 즉 본 발명 균주의 성장속도가 큰 것은 이들 균주가 성장과정에서 다양한 유기산들을 생합성하면서 최적 pH 7.5 에서 산성 쪽 pH 5.0 까지 급격히 떨어지기 때문인 것으로 확인되었다.
본 발명자들은 다수의 실험결과, Bottle 이나 flask를 이용한 회분 배양(batch culture)시 가장 바람직한 carbon source 는 이당류로서 맥아당(maltose)임을 확인 하였다. 이와 달리 포도당(glucose) 또는 그의 이성체인 dcxtrose 등 단당류를 사용하는 경우에는 autoclave 에서 121℃/15 ∼ 20분간 멸균(autoclaving) 고정에서 함께 첨가되는 Nitrogen source 로서 Tryptone 이나 Yeast extract 유래의 아미노산과 milard 반은에 의하여 생성된 아미노당으로 인하여 호열성 세균의 생육 지연이 초래되어 대량 세포 수득이 불가능하였다.
더욱더 불리한 점은 본 발명 호열성 세균들이 60℃ 이상의 고온, 고열 조건하에서 세포 증식과정에서 glucose 의 분해과정에서 Energy 를 얻고 유기산을 활발히 생합성으로 인하여 배양배지의 pH가 급속히 저하되는데 이때 NaOH 가 다량 요구되며 만일, NaOH 를 공급하지 않는 경우 본 발명 호열성 세균 균주들은 점액성 다당류(polysaccharides)를 대량 생성시켜 뒤집어 쓰면서(encapsulated) 균주 성장은 급정지(Quick Halt)되는 것이 확인되기 때문이다.
또, 본 발명자들은 본 발명 호열성 균주들의 병 또는 플라스크를 이용한 회분 배양을 통하여 생육 최적 pH는 7.5, 최적 생육 적온은 60℃로 확인하였으며 최적 inoculm size는 0.1%(w/v) 이며 0.1% 이하와 0.5% 이상에서는 lag phase 가 24시간 이상 각각 계속되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명 호열성 세균 균주들의 상기 최적 pH, 생육 최적 온도 및 최적 접종량 범위에서 개시한 실시예 및 실험들을 통하여 본 발명자들은 본 발명 세균 균주 세포 생산의 극대화 즉, 대량 속성 생산을 위한 회분배양시에는 carbon source를 반드시 맥아당(maltose)을 사용하여야 하고 유가배양시 초기단계에도 반드시 maltose를, 상기 carbon source가 소진단계부터 그후 진행단계에서는 sugar assay를 통해 carbon source 의 모니터링이 가능한 포도당(glucose)을 일정 공급속도로 공급하여도 본 발명 균주들이 포도당을 신속히 분해 이용하여 pH가 급격히 저하되더라도 NaOH가 자동으로 pumping되게 함으로써 pH를 생육 최적범위 7.0 ∼ 7.5 수준으로 계속 유지시킴으로써 호열성 세균 세포의 대량 생산이 가능하다는 사실을 최초로 규명하였다.
한편, 본 발명에 따른 호열성 세균 균주 세포의 대량 생산과 동시에 지방 분해효소 생합성의 극대화를 위하여 Bench-top fermentor 에서 유가배양(fed-batch culture)을 수행하는 경우, 배지 조성물 총중량의 5% 의 맥아당(maltose)에 15%의 Yeast extract 와 15%의 Tryptone을 동시 첨가한 배지에서(in situ) 121℃/20분간 autoclove한 후 배양을 개시하여 상기 맥아당이 소진되는 단게에서 0.3%(w/v)의 별도 멸균한 포도당(glucose) stock solution)을 시간당 5 ∼ 6g/L 의 feed rate로 공급 배양하는 것이 가장 바람직하였다. 이경우, 본 발명에 따른 호열성 세균 균주의 성장지연(growth lag)이나 다당류(polysaccharide) 생합성은 발견되지 않았다.
본 발명에 따른 호열성 세균 균주의 가장바람직한 유가배양법은 Carbon source 는 맥아당(maltose)을 사용하여 lag phase 를 억제하고 상기 맥아당이 다 소진되기 시작하는 단계에서 별도 멸균하여 제조한 포도당(glucose)을 주가(注加)하면서 Alkali feed pump 를 사용하여 NaOH 를 자동 공급하여 생육 최적 pH 7.0 을 유지함으로써 성장속도를 유지하하는 것이 바람직하였다.
포도당(glucose) 또는 이의 이성체인 디-포도당(dextrose)을 다른 질소원( Nitrogen source)인 트립톤(Tripton) 또는/및 효모 추출물(Yeast Extract)등 영양성분들과 60℃ 고온에서 함께 배양 배지로 첨가 사용하는 경우에는 본 발명 세균 균주들이 상기 당들을 에너지원으로 사용하여 다량의 유기산(organic acids)과 다당류(polysacchari des)를 발효기 내에 생합성하여 방출하고 세포 성장속도를 저하시켜 long lag phase 를 촉진하는 결과를 초래하는 것이 확인되었다(도 5 ∼ 도 6).
현미경 사진도 5a에는 배양액(culture broth) 내에 유기산들과 다당류가 다량 형성되어 있는 모습이 확인된다.
glucose는 60℃ 이상에서는 유기산으로 분해, 생합성됨으로 인하여 pH가 저하되면서 NaOH 펌프가 가동되어 pH 7.0으로 유지되며 이때 Yeast extract 또는 Tryptone 유래의 아미노산과 용이하게 결합하여 이른바 amilo reaction 에 의해 황갈색의 amino 당을 형성함으로써 본 발명 호열성 세균 균주의 생육저해를 현저히 초래하는 것으로 사료된다.
도 6은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주 배양시 생성되는 젖산, 초산 및 프로피오닉산 기타 유기산의 HPLC 결과를 확인할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 기초 배양 배지(M)에서 6g/L/h 수준의 glucose feed rate 로 fed - batch 를 수행한 결과, 교반속도(agitation) 750 ∼ 1,000 rpm 에서와 1,000 ∼ 1,250 rpm 에서는 cell dry weight(CDW)가 각각 5g/L 및 10g/L 수준이었으나 1,500 ∼ 2,000 rpm(산소공급율 1.33vvm)에서는 최대 CDW 16g/L, OD(580mm)는 36.4 에 도달하였음을 확인하였다(도 2).
본 발명에 따른 호열성 세균 균주들(A, B)은 이미 음식물 대두 폐기물에 함유된 지방질 성분의 분해에 관여하는 Lipase 와 Alkaline phosphatase 의 생합성 된다는 점, 그리고 이들 효소의 생합성 특성은 상호 linear curve 를 형성한다는 점과 관련 TBS 액체 배지에서 45℃, 100rpm 및 0.3vvm 에서 8시간(h) 에 최대 성장을 보이며, 배양 개시 8h에 각각 200U/g wet cells 및 2U/g wet cells 효소 활성을 나타낸다는 사실이 이미 확인된 바 있다(특허 공개번호 10-2012-6601 및 10-2012-6606호 특허공개 명세서 참조). 상기 효소 특성은 API zyme kit를 이용하여 확인하고 이와 아울러, 본 발명자들은 효소활성을 파라니트로 페닐 카프릴레이트(P-nitrophenyl caprylate)와 파라니트로 페닐 포스페이트(P-nitrophenyl phospate)를 각각 기질로 사용하여 lipase 와 AP 효소를 Fed-batch 배양중 sampling한 다음 가수분해된 P-nitrophenol 을 spectromet er(450nm)에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 확인한 결과, 본 발명 유가 배양조건 즉 M배지에서 60℃, pH 7.0, 1,500rpm, 1.33vvm 및 glucose feed rate 6.0g/L/h 조건에서 대량 배양 개시 16h 만에 효소 활성이 각각 최대 2,000U/G 및 11.6U/g wet cells 로서 상기 종래 공지전 특허보다 약 10배 이상 상승시켰음을 확인하였다.
본 발명자들은 본 발명 호열성 세균 균주들은 통상의 중온성(20 ∼ 35℃) 또는 고온성(30 ∼ 45℃) 범위에서 잘 성장하는 미생물 균주들과 달리, 상기 효소들의 활성(specific activity)이 Mg2+ 이온 보다는 특히 Ca2+ 이온에 더욱 효과적이며 이 밖에도 Ba2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+ 또 Co2+ 이온 등 2가 양이온(divalent cations)에 매우 효과적임을 확인하고 본 발명 호열성 세균 균주 배양용 기초배지 조성물(M) 제조시 무기염류 및 미량원소의 종류와 첨가량을 최적화하는데 적용하였다(표 1).
본 발명자들은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들의 배양 배지에 대하여 탄소원(carbon source)로서 올리브유, 팜유, 참기름 등 oil류를 사용하는 것은 cellul lar growth 에 지장을 초래하기 때문에 바람직하지 않았다. 또 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들은 이당류인 맥아당(Maltose)이 첨가된 배지 조성물에서 정상 생육이 개시된 후 colony 가 우점화된 후에야 비로소 음식물 쓰레기 유래의 oil류나 기타 지방질 물질을 신속히 분해 자화하여 에너지원(Energy source)으로 사용하는 것으로 사료된다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들은 phosphate free 및 oil-free 배지에서 lipase 효소의 활성 지표가 되는 Alkaline phosphatase 의 활성이 극대화 된다는 사실도 아울러 재확인하였다.
이하에서는, 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예들을 기재하지만, 본 발명이 이들에 제한되지 않는 것임은 당업자 간에 명백하다.
[실시예 1] 본 발명에 따른 호열성 세균 균주 배양 배지 조성물(M) 및 배양
본 발명 균주들의 plate 도말용 고체배지 및 병 또는 플라스크를 이용한 액체 배양용 기초배지 조성물(M)은 다음 표 1과 같다.
| 성분 | 함량(중량 또는 부피)/L | 백분율 |
| maltose | 3g | 0.3 wt% |
| Tryptone | 3g | 0.3 wt% |
| Yeast extract | 3g | 0.3 wt% |
| 무기염류 용액(10 ×) | 100 mL | 0.01 v% |
| [주] 무기염류(10 ×) 용액은, L당 nitrilotriacetic acid 1.0g, CaSO4ㆍ2H2O 0.6g MgSO4ㆍ7H2O 1.0g, NaCl 0.08g, KNO3 1.03g, NaNO3, 6.81g, NaHPO4 1.11g, FecL3 soln 0.28g/L, 10mL, 미량원소 용액 10mL 임. 미량원소 용액은 L 당 H2SO4(98%) 0.5mL, MnSO4ㆍH2O 2.2g ZnSO4ㆍ7H2O 0.5g, H3BO4 0.5g, CuSO4 0.016g, Na2MoO4ㆍ2H2O, CoCl2ㆍ6H2O 0.046g 임. |
||
본 발명 호열성 세균 균주들을 상기 기초배지(M)의 1/5 희석배지(M/5)와 L 당 glucose 3g, Yeast extract 3g, peptone 15g, L-cystine 0.5g, NaCl 2.5g, 티오글리콜산 나트륨 0.5g 으로 구성된 TSB(Tryptic soy broth, MBT1053) 배지를 (pH 각각 7.0) 사용하여 incubator 에서 60℃ 로 병(universal bottle)을 사용하여 150rpm 으로 진탕 배양한 후 무균실에서 다시 2L side-arm shake flask 로 옮겨( Transfer) 다시 incubator 에서 동일한 온도, pH 및 교반속도로 비교 배양 실험을 수행하였다.상기 flask 진탕배양 비교 실험은 각각 3반복(3set) 수행하고, 세포 성장속도는 OD(580nm)로 확인하여 그 평균값을 구한 결과는 [표 2]와 같다.
| 구분 |
cellular growth OD(580 nm) | ||||||
| 균주 | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h | |
| 본 발명 M/5 희석 배지 |
A | 0.5 | 1.6 | 1.7 | 1.8 | 1.6 | 1.5 |
| B | 0.8 | 1.7 | 1.7 | 1.7 | 1.6 | 1.4 | |
| TSB 배지 |
A | 0.3 | 0.5 | 0.7 | 0.9 | 0.8 | 0.7 |
| B | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.7 | |
실험결과, 본 발명에 따른 호열성 균주들은 본 발명 M/5 희석배지에서 종래 TSB 액배지에 비하여 대체로 약 2배의 세포 성장속도를 확인할 수 있었다. 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 TSB 배지에서 세포 성장속도가 지연되는 것은 autoclave(고압멸균기)에서 121℃/15 ∼ 20분간 멸균시 배지에 첨가된 포도당( glucose)이 Yeast Extract, peptone 유래의 아미노산 특히 L-Cystine 과 용이하게 결합하여 아미노당을 형성함으로써 Energy 원으로서 그 이용이 제한(limited)되어 세포 성장 지연을 초래한 것으로 사료 되었다.
[실시예 2] 본 발명에 따른 호열성 세균 균주(A, B) 배양배지의 최적 pH, 온 도(T)
본 발명자들은 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들(A, B)의 최적 배양 pH 및 온도(T)를 확인하기 위하여 몇 차례 실험을 추가로 더 수행하였다. 실험결과, carbon source 로 포도당(glucose)을 사용한 경우는 60℃ 이상에서는 36시간(h) 이상의 생육지연(Lag Phase)이 확인되었다. 이는 배지를 구성하는 glucose 와 Yeast extract 또는 Tryptone 유래의 아미노산이나 peptide 와 121℃/15분 이상 autoclaving 과정에서 browning reaction 으로 인하여 생성된 아미노당을 본 발명 호열성 세균들이 분해 자화하지 못하고 다당류(polysaccharides)를 생합성하는 것으로 확인 되었다. 그러나, 이당류 중에서 glucose - glucose 가 α1→4 결합한 maltose 를 첨가 사용한 경우에는 밀라드 반응이 발생하지 않아 생육지연 없이 정상 생육하여 OD(580nm) 1.8에 도달할 수 있었다(표 3, 도 5b).
즉, 본 발명 세균 균주들은 탄소원으로 오직 maltose 를 사용하는 경우에만 병배양과 Flask를 사용하는 회분 배양시, 55℃ 이상 60℃ 에서도 정상 생육이 확인되었다. 그러나, 탄소원을 glucose 로하여 상기 두 질소원들을 혼합 사용하는 ㄱ경우에는 glucose 0.3% 이하 농도에서는 동시 첨가하여 멸균(○)하거나 또는 상기 질소원들과 별도로 멸균한 후(autoclaved seperately) 첨가(●)하여 사용하든 상관 없이 모두 정상 성장하나(1a, 1b), glucose 농도를 0.5% 이상 첨가시에는 반드시 분리 glucose를 별도 멸균한 후 첨가해야만 하였다(1c ∼ 1f). glcose 첨가량이 1% 이상으로 사용하는 경우에는 glucose 와 질소원을 별도 멸균하여 첨가하거나(●), 동시 멸균하여 첨가하거나(○) 상관없이 생육 지연으로 본 발명 호열성 세균들(A, B)의 세포를 수득할 수 없엇다(1g ∼ 1j).
| Carbon Source |
Celluar growth OD(580nm) | |||||
| 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h | |
| (포도당) α1→2gloucose |
- |
- |
- |
- |
- |
0.4 |
| (설탕) α1→2Sucrose |
- |
- |
- |
- |
- |
0.5 |
| (젖당) β1→4Lactose |
- |
- |
- |
- |
0.4 |
0.5 |
| (셀로비오스) β1→4celobios |
- |
- |
- |
- |
- |
0.5 |
| (맥아당) α1→4maltose |
0.4 |
1.6 |
1.8 |
2.0 |
2.0 |
1.8 |
| [주] 나머지 첨가한 무기염류와 미량요소는 [표1] 기초배지와 동일함. | ||||||
이상의 실험결과, 본 발명에 따른 호열성 세균 균주는 60℃ 에서도 배양 8h 만에 최고 생육 속도 OD 2.0(580nm)에 도달하였음을 확인할 수 있었다.본 발명자들은 본 발명에 따른 세균 균주들을 배양온도 65℃이상 70 ℃ 에서도 배양시간 8h 이후의 생육 속도를 확인한 결과 60℃ 에서와 큰 차이가 없었으므로 이후의 병(Bottle) 또는 Flask 배양 나아가 Bench-Top 유가배양시 pH 7.0, T 60℃ 에서 탄소원으로서 maltose, 질소원으로서 Tryptone 및 Yeast extract 를 필수성분으로 하는 기초배지(M)로 하고 유가 배양시에는 탄소원이 소진되기 시작할 때 부터 glucose 를 Feeding 하는 방식을 채택하여 배양하기로 최종 결정하였다.
포도당(glucose)은 본 발명 유가배양(Fed-batch)시 5 ∼ 7g/L/h 의 Feed rate 를 채용하는 경우 glucose 와 아미노산 또는 peptide 류와 화학 결합하는 이른바 milard reaction을 유도하지 않을 뿐 아니라, 본 발명 세균 균주들에 의한 다당류(polysaccharides)의 생합성 및 생육지연 없이 배양 8h 이후부터 wet cell paste 를 속성, 다량 수득할 수 있었는데 특히, 하기 발효 조건에서 세포 성장의 극대화를 달성할 수 있었다(표 4).
| 발효조건 |
기초배지 × 5 |
glucose feed rate(L/h) |
stirter speed (rpm) |
airation rate (vvm) |
CDW (g/L) |
wet cell weight(g/L) |
| 실험예 1 | M × 5 | 4.0g | 1,500 | 1.33 | 8.5 | 17.5 |
| 실험예 2 | M × 5 | 5.0g | 1,500 | 1.33 | 9.4 | 21.4 |
| 실험예 3 | M × 5 | 6.0g | 1,500 | 1.33 | 10.1 | 26.5 |
| 실험예 4 | M × 5 | 7.0g | 1,500 | 1.33 | 9.8 | 25.2 |
| [주] 1. 기초배지(M)의 ×5 배의 초기배지는 0.5% maltose , 1.5% tryptone. 1.5% Y east extractt를 사용하고, 8h 초기 배양 후 glucose의 feed를 개시하여 8h 추가 배양 후 종료. 2. pH 7.0/T 60℃ 3. CDW : cell dy weight(g/L) |
||||||
상기 실험결과, 본 발명 세균 균주는 pH 7.0/T 60℃ 조건의 Fed-batch 배양에서 최적 glucose feed-rate 는 5.0 ∼ 7.0g/L/h, 가장 바람직하게는 6.0g/L/h 로 확인되었다. 본 발명자들은 상기 glucose feed rate 에서 wet cell weight 26.5g/L 까지 수득할 수 있었다(표 4).
[실시예 3] 본 발명 세균 균주의 병 또는 플라스크 배양 및 Bench-Top fermenter 발효용 Carbon source 와 Nitrgen source 의 멸균 조건과 세포성장
본 발명 호열성 세균 균주의 배양배지 제조시 탄소원으로 glucose, 질소원으로 Tryptone 와 Yeast extract의 첨가 농도별, 별도(●) 또는 동시(○) 멸균( autoclave) 조건하에서 생육상의 확인 결과는 도 1a 내지 도 1f 에서 이미 보인 바와 같다.
즉, 본 발명 호열성 세균 균주의 병이나 플라스크를 사용하여 회분배양시 glucose 와 tryptone 또는/및 Yeast extract 를 함께 0.5% 이상 농도로 동시에 첨가하여 121℃/15 ∼ 20분간 멸균하여 사용하는 경우에는 도 1c ∼ 도 1f 에서 보인바 세포 생육이 지연되었고, 도 1g ∼ 도 1j 에서 확인되는 바와 같이 glucose 농도 1% 이상 첨가하는 경우에는 상기 질소원 유래의 아미노산과의 밀라드 반응에 의하여 uptake 하지 못하고 다당류를 생합성하므로 균주 세포 성장이 극도로 지연(lag phase)되었다. 따라서, 회분배양이나 유가식 배양을 통하여 호열성 세균 세포를 대량 생산하거나 특정 목표 물질을 생합성하는 경우에는 0.3% 이상 농도의 포도당(glucose)을 trytone 이나 Yeast extract 와 동시 멸균하여 결코 사용할 수 없음이 확인되었다.
이상의 실험결과에 따르면, 본 발명 세균 균주의 회분식 배양시 탄소원으로 포도당(glucose)의 첨가, 사용은 0.3% 이하 농도까지, 그리고 그 이상의 농도에서는 사용할 수 없고 다만, 유가식(fed-batch) 배양시에는 그 이상의 농도 가장 바람직하게는, glucose feed rate 5.0 ∼ 7.0g/L/h(pH 7.0, 1,500rpm, 1.33vvm)까지 사용될 수 있음이 확인되었다.
본 발명에 따르면, 탄소원으로 glucose 를 0.5% 농도로 첨가한 회분 배양배지를 사용하여 병 또는 플라스크에서 pH 7.0, T 60℃의 Incubator 에서 회분배양한 결과, 다당류를 생합성하고 배지 내에서 아미노당 반응에 의해 생육이 지연되었으며(도 5a), 탄소원으로 glucose 대신 maltose 를 0.5% 농도로 첨가, 사용하는 경우에는 배지내 아미노당 반응에 의한 다당류 생성과 세포의 생육 지연이 없었다(도 5b).
[실시예 4] 본 발명에 따른 세균 균주들의 변경된 배지조성(G1 ∼ G2)을 사용한 Fed-batch culture 시 최적 발효조건(세포성장 및 효소 생합성 극대화)
| 구분 | 본 발명 세균 균주 A | 본 발명 세균 균주 B | ||
| 배지종류 | G1 | G2 | G1 | G2 |
| 초기배양배지 (Ratio) |
5 : 10 : 10 |
5 : 15 : 15 |
5 : 10 : 10 |
5 : 15 : 15 |
| 최대 OD (580nm) |
26.3 |
[36.4] |
26.5 |
[36.7] |
| 최대시간 OD(h) |
18 |
[35] |
18 |
[34] |
| 최대CDW (g/L) |
10.4 |
[15.9] |
10.5 |
[15.6] |
| Total CDW(g) |
26.0 |
[39.8] |
26.2 |
[40.1] |
| GFR (g/L/h) |
6.0 |
6.0 |
6.0 |
6.0 |
| glucose 소모량(g) |
72.5 |
[93.5] |
66.3 |
[85.7] |
| NaOH 중화량(g) |
21.6 |
[26.2] |
21.6 |
[27.1] |
| yeild g cell/g gh |
0.36 |
[0.43] |
0.40 |
[0.47] |
| 최대 Enzyme activity U/g wet cell |
5.3 |
[11.6] |
9.3 |
[11.2] |
| 최대 Enzyme 활성시간(h) |
18.5 |
[19.5] |
19.0 |
[19.5] |
| 비고 [주1] 초기배양배지 구성성분 Ratio는 maltose, Tryptone 및 Yeast extra ct배양 초기첨가 중량 비율임. [주2] GFR은 glucose feed rate(g/L/h) |
||||
본 발명 호열성 세균 균주 A 및 B 의 세포 성장율(g cell/g glucose feed)은 하기 공식에 의거 계산되었다.
본 발명 호열성 세균 균주들의 세포 성장율은 pH, 온도(T) 및 교반속도(Stirrer speed) 및 기질(s) glucose feed rate(GFR)가 그의 함수이다.
본 발명 세균 균주들(A, B)에 있어서 CDW(g/L)는 wet cell weight(WCW)의 증가에 따라 증가되고 상기 glucose feed rate 가 5 ∼ 7g/L/h 범위에서 증가되었다.
본 발명에 따르면, 발효기 내의 pH 가 저하되면, 유기산 생성이 급격히 증가하고, NaOH 의 pump 량이 급증한다.
또 본 발명에 따른 세균 균주들은 glucose feed rate 가 증가하면서 optical density(OD 580nm)도 증가하였는데 포도당 첨가속도가 증가하면서 다양한 유기산(organic acids)과 세포 성장을 저해하는 다당류( capsular polysaccharides)도 생합성되었다. 전자는 pH저하, 후자는 산소결핍(oxygen limitation)이 각각 기인한 것으로 사료되었다.
산소결핍을 완화하기 위하여 본 발명 세균 균주들의 유가(Fed-batch) 배양에서는 glucose feed rate 5 ∼ 7g(L/h)에서 통기량 1.33(vvm), 교반속도 1,500rpm 이 가장 바람직하였다.
본 발명 세균 균주들은 발효개시 후 34 ∼ 35h 에서 최대 OD(580nm)가 36.4 ∼ 36.7에 이르렀으며 최대 CDW(g/L) 15.0 이상에 이를 수 있었다(도 2).
한편, 본 발명에 따른 세균 균주들(A, B)에 있어서 본 발명 fed-batch 배양용 glucose feed rate 배지에서 lipase 를 비롯하여 Alkaline phosphase(AP 효소)를 다량 생합성하였는데 표준이 되는 AP 효소는 발효시간 16.5h 경과후 최대 활성은 각각 11.6 U/g ∼ 11.2 wet cell weight(g/L)을 나타내었다(도 3).
상기 실험결과는, 본 발명 호열성 세균 균주들의 세포 성장의 극대화와 고온 기계 세정용 세제개발 및 음식물 쓰레기등 음식물 폐기물 처리용 lipase 생합성 극대화를 위한 중요한 단서를 제공하였다.
[실시예 5] 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들의 Lipase 와 AP 효소 생합성 특성
본 발명에 따른 호열성 세균 균주(A, B)의 lipase 와 AP 효소의 생합성 특성을 조사한 결과는 하기 [표 6]과 같다.
Bench-Top Fermenter 를 이용하여 Maltose 함유 기초배지(M)의 5배(M × 5) 배양배지에서 8시간 배양한 후, glucose feed rate 6.0g/L/h 속도로 배양하면서 sample 을 1시간 간격으로 랜덤(random)으로 sampling 하여 lipase activity 와 AP activity 를 각각 spectrophotometer 에서 흡광도(OD 405nm)를 측정, 관찰한 실험결과는 다음 표 6과 같다.
| 배양시간 (h) |
AP 효소 활성 (단위: U/g wet cells) | lipase 효소 활성(단위: U/g wet cells) | ||
| A 균주 | B 균주 | A 균주 | B 균주 | |
| 8 | 2.2 | 2.1 | 100 | 95 |
| 9 | 2.4 | 2.3 | 104 | 106 |
| 10 | 2.3 | 2.4 | 108 | 100 |
| 11 | 2.5 | 2.6 | 110 | 109 |
| 12 | 2.7 | 2.8 | 117 | 115 |
| 13 | 4.8 | 4.5 | 225 | 220 |
| 14 | 5.7 | 5.6 | 472 | 470 |
| 15 | 8.4 | 8.7 | 1,520 | 1,687 |
| 16 | 11.6 | 11.5 | 2,000 | 1,998 |
| 17 | 10.5 | 10.8 | 1,850 | 1,810 |
| 18 | 9.2 | 9.4 | 1,720 | 1,700 |
| 19 | 8.4 | 8.3 | 1,500 | 1,505 |
| 20 | 5.5 | 5.2 | 398 | 462 |
상기 실험결과, 본 발명에 따른 Fed-batch 배양 실험결과, 본 발명 세균 균주들은 40 ∼ 70℃ 범위의 고온에서 기계장비의 세정제 또는 음식물 쓰레기 등 음식물 폐기물 처리제용 생균제제로 이용하기에 매우 유용할 것으로 확인되었다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 호열성 세균 균주(A, B)의 효소특성
본 발명에 따른 호열성 세균 균주들이 분비하는 lipase 및 AP 효소들은 65℃ 에서도 그 활성을 나타냈고, 70℃ 이상에서는 효소 활성이 서서히 저하되었다.
이와 같은 효소 특성은 중온성 Bacillus속 세균 균주들이 통상적으로 40 ∼ 45℃ 에서 최적 활성을 보이고 50℃ 이상에서는 그 효소 활성이 급격히 저하되는 것과 대조적이었다.
상기 본 발명에 따른 호열성 세균 균주(A, B)의 효소 특성은 가공 및 제약 산업상, 널리 사용되는 대표적인 시판용 Cordida cylondraacea 효모균주 유래의 lipase 나 AP 효소들이 50℃ 이상에서 효소 활성을 상실하는 것과도 대조적 이었다.
본 발명에 따른 호열성 세균 균주들(A, B)의 효소 활성에 있어서, Triton X - 100을 첨가하여 초음파 처리한 조효소를 사용한 실험결과에서도 30℃이하 온도에서는 P-nitrophenol 생성이 상대적으로 서서히 방출되고 65℃ 에서는 오히려 신속히 방출되었다.
또한 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들(A, B)의 최적 pH는 45℃ 에서 pH 7.5 그리고, 60℃ 에서는 pH 8.0으로 각각 나타났다.
한편, 또 본 발명에 따른 호열성 세균 균주들(A, B)의 효소 활성에 있어서 1가 및 2가 양이온의 영향은 실험결과, 하기 [표 7]과 같았다.
| 구분 |
Lipase 활성 | AP 활성 | |||
| A균주 조효소액 | B균주 조효소액 | A균주 조효소액 | B균주 조효소액 | ||
| 1가 이온 |
K+ | 100 | 100 | 100 | 100 |
| NH4 + | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Na+ | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Tris/HCL | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 2가 이온 |
Mg2+ | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Ca2+ | 176 | 172 | 172 | 175 | |
| Ba2+ | 121 | 123 | 120 | 123 | |
| Mn2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Cu2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Fe2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| [주] Standard assay; 100 표준 assay 는 최적온도 65℃에서 2분간 수행 | |||||
상기 [표 7]에서, 두 균주(A, B) 유래의 조효소액에서 Lipase 와 AP 효소 활성은 대체로 1가 양이온에서는 안정성이 높았다. 그러나 Na+이온에서 가장 좋았고, 2가 양이온에서는 Ca2+이온이 가장 우수하여 효소 안정성과 활성 중에서 cofactor 로서 유용한 것으로 확인되었다.
[실시예 7] 본 발명 호열성 세균 균주를 이용한 음식물 쓰레기 등 폐기물 처리용 생균제 제조
본 발명의 상기 실시예 1 내지 실시예 4를 통하여 확인된 바와 같이 AP 효소 와 Lipase 효소의 specific activity 가 극대화 된 상태에서 상기 균주 배양물을 원심분리하여 wet cell paste 를 수득하였다.
2.5L 들이 Bench-Top fermenter 에서 배양된 세포들은 J10 Roter 를 사용하고 8,000rpm 에서 30분간 원심분리 된다.
상기 원심분리 결과 얻은 wet cell paste 는 가장 바람직한 바이오 폴리머(biopolymer)를 사용하여 생균제로 제제화된 후, 음식물 쓰레기 또는 폐수 등 음식물 폐기물 처리용 생균제제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 활성도가 높은 AP 및 lipase 효소를 생합성한 세포들은 원심분리하여 회수되고 그 원심분리아여 회수된 wet cell paste 는 미생물 균주 사이에 존재하는 유리수를 일부 포함하고 있는 상태이다. 이들 유리수에도 불구하고 고온성 미생물의 생균제 젤형성에 유리한 겔화제로 발명자들은 펙틴(pectin)을 1차적으로 선택하였다. 그러나, 펙틴의 적정 사용량은 총 조성물 함량의 20 중량%를 넘지 않는 것이 바람직하였다.
젤란검(gelrite)은 70℃ 이상에서 생육 가능한 호열성 세균들의 생균의 겔형성에 유리하지만 고가이며 특히, 점탄성이 약한 것이 결점이다. 이러한 점을 고려하여 본 발명에서는 전체 생균제 조성물의 10 중량% 이하를 2차적으로 사용하는 것이 바람직 한 것으로 확인되었다.
본 발명자들은 광범위한 pH 2.5 ∼ 8.5 범위에서 안정하며 점탄성이 우수하고 이액현상이 적은 biopolymer로서 플루란(pullurans)을 선택하였다. 플루란은 총 생균제 조성물의 10 ∼ 20 중량% 사용하는 것이 바람직하였다. 그러나, 20 중량% 이상에서는 오히려 겔조성물의 경화가 촉진되고 이액현상까지 발생하여 바람직하지 않았다.
본 발명자들은 해조류 유래의 겔화제(gelling agent) 성분으로 카라지난과 한천(agar)을 시도하여 보았으나 본 발명에 따른 호열성 균주들이 60℃ 이상 고온의 생육단계에서 유기산 생합성으로 인하여 pH 저하가 심하여 그 사용이 바람직하지 않은 것으로 확인하였다.
본 발명에 따르면, 음식물 쓰레기등 폐기물 처리용 생균제 조성물의 가장 바람직한 구현예로서 최종 구성성분 및 함량은 [표 8]에 나타냈다.
| 구분 |
성분 |
함량 (g/L) |
비율 (중량%) |
비 고 |
| (1)기초배지 (M)성분 |
maltose(필수) |
30.0 |
3.0 |
[주]0.3중량% 이상의 glucose는 하기 nitrogen source등과 동시에 사용하는 경우 에는 30h 이상 생육지연되므로 사용불가 |
| Tryptone(필수) |
30.0 |
3.0 |
[주]glucose를 Tryptone 과 함께 사용하는 경우 30h 이상 생육지연되므로 사용불가 | |
| Yeast Extract(필수) |
30.0 |
3.0 |
[주]glucose를 Yeast extract 와 함께 사용하는 경우 30h 이상 생육지연되므로 사용불가 | |
| 무기염류용액(필수) 10X stock soln |
100mL |
10.0 |
[주]가장 바람직하기는 무기염류 solution 1/10 배 희석액 사용 | |
| (2)겔화제 |
Pectin |
150.0 |
15.0 |
20 중량% 이하 사용이 바람직함 |
| gelrite |
150.0 |
15.0 |
20 중량% 이하 사용이 바람직함 |
|
| pullurans |
150.0 |
15.0 |
20 중량% 이하 사용이 바람직함 |
|
| (3)통기성 물질 |
Kalolinite | 120.0 | 12.0 | [주]국내산이 바람직함(통기성 증진용) |
| 메밀껍질 분말 (10 ∼50메쉬) |
120.0 |
12.0 |
[주]태우지 않은 것(통기성 증진용) |
|
| (4)겔안정화제 |
β- 사이클로 텍스트린(필수) |
120.0 |
12.0 |
[주]이액현상 및 겔화제 침강 방지용 |
| 총 계 | 100.0 | |||
| 호열성 세균 | A 또는 B 균주 | 1.0 | 0.1 | 1.0 X 105~9 cfu/mL |
| [주] 본 발명 미생물 균주용 기초배지(M) 구성성분을 2L Flask 에 넣어 1L 의 물에 용해 시키고, 상기 용액의 pH를 0.1M NaOH 용액을 첨가하여 pH 7.0으로 조절하고 나머지 구성성분을 첨가한 후 autoclave 에서 121℃/15분간 가열 멸균처리 한 다음, 무균실(clean bench)로 이동하여 60℃ 까지 방냉한 후 Flask cap 을 열고 본 발명 미생물 균주 A 또는 B를 접종하고 Incubator 내에서 shaking 하면서 4 ∼6h동안 진탕배양하여 본 발명 음식물 쓰레기 폐기물 분해용 생균제 조성물을 고화 제조하고 무균 밀봉한다. |
||||
[비교제조예 1 ∼ 3]
본 발명자들은 본 발명에 따른 생균제 조성물 비교예를 제조하였다.
비교제조예 1은 겔화제로 펙틴, 젤란검, 아가를 각각 동량으로,
비교제조예 2는 겔화제로 젤란검, 카라지난, 아가를 각각 동량으로,
그리고 비교제조예 3은 겔화제로 아가, 펙틴, 카라지난을 각각 동량 사용하고 실시예 1 제품과 이화학적 특성을 비교하였다.
[비교제조예 4 ∼ 6]
본 발명자들은 실시예 5에서 첨가 사용한 겔화제 침강 방지제로서 β-사이클로텍스트린을 사용하지 않고 그 대신 CaCl2 분말 용액을 각각 동량 사용하여 본 발명 겔화제를 제조하고 이화학적 특성을 비교 평가하였다.
실험결과는 하기 표 9 에서 확인되는 바와 같이 젤강도, 젤탄력성이 불량하였다.
| 구분 |
젤강도 | 젤탄력성 | 비고 |
||
| 경도(N) | 부서짐성(N) | 탄력성(mm) | 응집성(mm) | ||
| 실시예 7 | 5.7 | 3.4 | 1.3 | 0.7 | |
| 비교예 1 | 3.4 | 1.6 | 1.1 | 0.3 | |
| 비교예 2 | 3.3 | 1.5 | 1.0 | 0.3 | |
| 비교예 3 | 3.5 | 1.7 | 0.9 | 0.3 | |
| 비교예 4 | 3.1 | 1.4 | 0.6 | 0.2 | |
| 비교예 5 | 3.0 | 1.5 | 0.5 | 0.2 | |
| 비교예 6 | 3.1 | 1.2 | 0.6 | 0.2 | |
| [주] 젤강도 및 탄력성은 물성분석기로 측정하고 최대 하중은 5N, 고체배지 두께는 1mm 에 서 가로 × 세로 = 2㎝ × 2㎝ |
|||||
[실시예 8]
본 발명에 따른 호열성 세균 균주의 고형 겔화제 조성물에서의 생육실험
상기 실시예 7(메밀껍질 분말 제외) 및 비교예 1 내지 6에 따라 각각 제조된 본 발명에 따른 생균제 조성물 각 시료의 1 평판(plate)에 본 발명 균주들(A, B)(1.0 × 105~9 cfu/mL)의 10× 희석액 0.1 mL 씩을 무균실(clean bench)에서 plate 상에 각각 도말(streaking)한 후, 60℃ 에서 2일간 Incubater 내에서 배양한 다음 각각 콜로니(colony) 수를 관찰하였다. 실험은 3회 반복 실시하였고 집락수의 평균값을 산출하여 [표 10]에 기재하였다.
| 구분 |
colony 수 |
이상유무 | |
| 부서짐(cracks) | 이액현상 | ||
| 실시예 7 | 102 | 무 | 무 |
| 비교예 1 | 103 | 유 | 무 |
| 비교예 2 | 107 | 유 | 무 |
| 비교예 3 | 47 | 유 | 무 |
| 비교예 4 | 51 | 무 | 유 |
| 비교예 5 | 57 | 무 | 유 |
| 비교예 6 | 61 | 무 | 유 |
| [주] 균주가 도말된 평판 배지페트리디쉬들은 Plastic bag 에 넣어 incubator 에서, 4h ∼ 1동안 진탕배양된 후 4℃냉장고에서 보관시 6개월간 생존가능 하였음. |
|||
실험결과, 본 발명 실시예 7의 생균제 조성물은 젤강도 및 젤탄력성이 우수할 뿐만 아니라, 60 ℃ 이상의 고열에 의해서도 평판 배지의 균열(cracks)이나 이액(離液) 현상이 관찰되지 않았고 본 발명에 따른 호열성 세균 균주의 생육상태가 10h 때 100개 이상 최대치에 도달하였다(도 4d).
Claims (4)
- 생균제 조성물 총중량에 대하여 0.3 ∼ 0.5 중량% 말토스. 0.3 ∼ 0.5 중량% 트립톤, 0.3 ∼ 0.5 중량% 효모 추출물 및 무기염류 용액 0.01 ∼ 0.05 부피% 를 포함하는 호열성 세균 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604(SARC-BSL) 또는 Bacillus pumilus OYR 0108(SARC-BSS) 균주의 생균제 조성물.
- 제1항의 호열성 세균 균주의 생균제 조성물에 겔화제, 통기성 물질 및 겔안정화제가 추가로 더 포함하는 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604(SARC-BSL) 또는 Bacillus pumilus OYR 0108(SARC-BSS) 생균제 조성물.
- 제2항의 호열성 세균 균주의 생균제용 조성물 총중량에 대하여 3.0 중량%의 말토스, 3.0 중량%의 트립톤, 3.0 중양%의 효모추출물, 10 중량%의 무기염류 용액 10 x stock soln. 15.0 중량%의 펙틴, 15.0 중량%의 젤라틴, 15.0 중량%의 플루란, 12.0 중량%의 카올리나이트, 12.0 중량%의 메밀껍질 및 12.0 중량%의 β-사이클로덱스트린으로 이루어진 것이 특징인 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604(SARC-BSL) 또는 Bacillus pumilus OYR 0108(SARC-BSS)(SARC-BSS) 균주의 생균제 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 생균제 조성물을 음식물 총중량에 대하여 0.1 중량% 이상을 첨가한 후, 교반 분해하는 것이 특징인 음식물 쓰레기 처리방법.
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| KR102712042B1 (ko) | 2024-09-30 |
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