KR101236309B1

KR101236309B1 - 바실러스의 고농도 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101236309B1
Application number: KR1020100138621A
Authority: KR
Inventors: 김동운; 김영화; 조성백; 정현정; 이성대; 김상호; 조규호; 황옥화; 김인철; 김수기
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2013-02-26
Also published as: KR20120076873A

Abstract

본 발명은 옥수수전분, 대두분말 및 효모추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 바실러스 고농도 생산 배지 조성물, 이의 제조 방법 및 상기 배지 조성물을 이용하여 바실러스를 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

바실러스의 고농도 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도{Medium composition for high concentration culture of Bacillus and uses thereof}

본 발명은 바실러스의 고농도 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 옥수수전분, 대두분말 및 효모추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 바실러스 고농도 생산 배지 조성물, 이의 제조 방법 및 상기 배지 조성물을 이용하여 바실러스를 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다.

가축의 질병을 예방하고 가축의 생산성을 높이기 위하여 그동안 생장촉진제로 항생제를 오랫동안 사용하여 왔으나, 최근 항생제의 무분별한 사용과 오남용으로 인하여 내성세균의 발생 및 잔류의 위험성 등을 통하여 국민 건강을 위협하고 있는 실정이다.

따라서, 항생제를 사용하지 않은 유기 혹은 무항생제 축산물에 대한 소비자 수요가 증가하고, 농가의 소득 및 경쟁력이 우수하여, 최근 미생물, 효소 및 식물추출물 등의 천연자원 급여를 이용한 축산물 생산에 대한 관심이 집중되고 있는 실정에서, 천연자원은 기존의 항생제와는 달리 가축 및 인체에 있어서 병원성 세균들에 대한 내성을 유발하지 않고 가축의 성장을 촉진시킬 수 있는 항생제 대체제로 각광받고 있다.

항생제의 대체 효과를 기대할 수 있는 천연물질로서 현재까지 허브 등 약용식물에 대하여 주요 관심이 맞추어져 있었다. 그러나, 이들 식물들은 재배량이 적어 수급의 불균형과 약리작용이 강하여 기타 부작용의 위험성이 높을 수 있다.

항생제의 대체효과를 가지는 물질들 중에서 활용가치가 높은 물질 중 하나로 생균제를 들 수 있다. 생균제로 사용되는 미생물들 중 세균에 있어서는 크게 유산균인 락토바실러스(lactobacillus) 속의 세균과 포자를 형성하는 특징을 가진 바실러스(bacillus) 속의 세균들이 많이 이용되고 있다. 특히 그람양성균으로 분류되는 바실러스(bacillus) 속의 포자는 고온에서도 견딜 수 있어 살아있는 미생물의 가공성이 우수하여 생균제로서 뿐만 아니라 농업 전반에 걸친 친환경 소재로서 널리 사용되고 있다. 대부분의 농가에서는 상업화된 배지를 사용하고 있으나 가격이 매우 비싸고, 배양 수율이 낮아 생산성이 낮은 실정으로, 생균제로서 활용이 우수한 바실러스(bacillus)의 대량생산을 위한 고농도 경제적 배지의 개발이 필요한 실정이다.

한국특허공개 제2002-0034755호에는 고농도 세팔로스포린 C 생산을 위한 발효배지조성물 및 고농도 세팔로스포린 C의 생산방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0218233호에는 비피더스균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 바실러스의 고농도 배양을 위한 배지 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 가축의 생산성 향상에 도움이 되는 생균제인 바실러스(bacillus)를 대량 생산할 수 있는 배지 조성 및 배양방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 옥수수전분, 대두분말 및 효모추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 바실러스 고농도 생산 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 옥수수전분, 대두분말 및 효모추출물을 첨가하여 제조하는 것을 특징으로 하는 바실러스 배지의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 상기 바실러스 배지 조성물에 바실러스를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스를 고농도로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 바실러스 배양 배지는 바실러스의 생산에 있어 보다 경제적이면서 생산성 향상에 기여할 수 있으며, 상기 고농도로 생산된 바실러스를 가축의 항생제 대체제로 경제적으로 이용할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 옥수수전분, 대두분말 및 효모추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 바실러스 고농도 생산 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 추가로 제2인산칼륨(K₂HPO₄), 염화마그네슘(MgCl₂), 염화칼슘(CaCl₂) 및 염화나트륨(NaCl)을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 옥수수전분 15~25 g/L, 대두분말 4~6 g/L, 효모추출물 4~6 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1~1 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.01~0.1 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.01~0.1 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.1~1 g/L로 이루어질 수 있으며, 더욱 구체적으로는 옥수수전분 20 g/L, 대두분말 5 g/L, 효모추출물 5 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.2 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.02 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.02 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.2 g/L로 이루어질 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 바실러스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 옥수수전분, 대두분말 및 효모추출물을 첨가하여 제조하는 것을 특징으로 하는 바실러스 배지의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 상기 바실러스 배지에 추가로 제2인산칼륨(K₂HPO₄), 염화마그네슘(MgCl₂), 염화칼슘(CaCl₂) 및 염화나트륨(NaCl)을 첨가할 수 있으며, 구체적으로는 상기 바실러스 배지는 옥수수전분 15~25 g/L, 대두분말 4~6 g/L, 효모추출물 4~6 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1~1 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.01~0.1 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.01~0.1 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.1~1 g/L로 이루어질 수 있으며, 더욱 구체적으로는 옥수수전분 20 g/L, 대두분말 5 g/L, 효모추출물 5 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.2 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.02 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.02 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.2 g/L로 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 바실러스 배지를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 바실러스 배지 조성물에 바실러스를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스를 고농도로 생산하는 방법을 제공한다.

바실러스를 고농도로 생산하는 방법은 구체적으로 옥수수전분 15~25 g/L, 대두분말 4~6 g/L, 효모추출물 4~6 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1~1 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.01~0.1 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.01~0.1 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.1~1 g/L로 이루어진 바실러스 배지 조성물에 바실러스 0.5~1.5%(v/v)를 접종한 후, 교반속도 100~200 rpm 및 25~35℃의 조건에서 20~28시간 동안 배양할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 옥수수전분 20 g/L, 대두분말 5 g/L, 효모추출물 5 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.2 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.02 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.02 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.2 g/L로 이루어진 바실러스 배지 조성물에 바실러스 1%(v/v)를 접종한 후, 교반속도 150 rpm 및 30℃의 조건에서 24시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 경제적 배지 개발을 위한 탄소원의 선발

(1) 실험방법

바실러스 균주로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)를 선택하였고, 바실러스 균주의 경제적 배지선발을 위하여 산업적으로 수급이 용이하고 그 품질의 균일성이 양호한 배지 원료 6가지를 검토하였다. 검토 대상 배지 원료들로는 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 옥수수 전분(corn starch), 대두분말(soybean meal), 소이펩톤(soy peptone) 및 펩톤(peptone)을 선발하였으며, 각각의 최적 배양조건을 탐색을 위한 통계적 방법으로 one factor at one time method를 이용하였고, 각각의 실험구에 대한 조성 및 기초 배지 성분은 표 1에서 보는 것과 같다.

탄소원에 따른 배지의 조성

Ingredients, g/L	Experimental runs
Ingredients, g/L	Run 1	Run 2	Run 3	Run 4	Run 5	Run 6
Glucose	10	0	0	0	0	0
Sucrose	0	10	0	0	0	0
Corn starch	0	0	10	0	0	0
Soy bean meal	0	0	0	10	0	0
Soy peptone	0	0	0	0	10	0
Peptone	0	0	0	0	0	10
Basal medium g/L
Yeast extract	5	5	5	5	5	5
NaCl	5	5	5	5	5	5
K₂HPO₄	1	1	1	1	1	1
MgSO₄	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
CaCl₂	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1

배양조건은 250 ml 용량의 baffle이 형성된 삼각 플라스크에, 배양 개시에 삼각 플라스크에 투입하게 되는 배양액의 액량(working volume)을 50 ml 조건으로 25% 이하의 배양부피를 확보하여 산소공급의 효율성을 유지하였다. 각각의 삼각 플라스크는 30℃ 항온 진탕 배양기에서 180 rpm의 속도로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액의 생균수를 평가하였고, 일원 분산분석을 통하여 통계 분석을 실행하였다.

(2) 실험결과

표 2는 다양한 탄소원에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis)와 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 배양 결과이다. 두 균주 모두 배지 성분에 따른 균체 생성 효율이 다르게 나타났는데, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 옥수수 전분(corn starch), 펩톤(peptone), 수크로스(sucrose), 소이펩톤(soy peptone)의 순으로 높은 균수를 나타내었다. 그리고 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)는 대두분말(soybean meal), 펩톤(peptone), 소이펩톤(soy peptone), 글루코스(glucose), 옥수수 전분(corn starch) 순으로 높은 균수를 나타내었다.

탄소원에 따른 바실러스 서브틸리스와 바실러스 리케니포미스의 배양 수

Experimental runs (Main factor)	Viable cell counts Log₁₀(cfu/ml)
Experimental runs (Main factor)	Bacillus subtilis	Bacillus licheniformis
Run 1(glucose)	8.20±0.06¹	8.63±0.21
Run 2(Sucrose)	8.93±0.07	7.53±0.18
Run 3(corn starch)	9.03±0.11	8.14±0.06
Run 4(Soybean meal)	7.83±0.18	8.90±0.04
Run 5(Soy peptone)	8.91±0.13	8.67±0.09
Run 6(Peptone)	8.94±0.05	8.64±0.14

¹평균 ± 표준편차

실시예 2: 바실러스의 성장에 대한 옥수수 전분의 효과

실시예 1에서 두 가지 균주 모두 옥수수 전분(corn starch)의 이용성이 우수하여 바실러스 배양에 옥수수 전분(corn starch)을 적용하였다. 실험 방법은 바실러스용 배지(LB, Difco, USA)에 1%의 옥수수 전분(corn starch)을 첨가하여 배양한 후 총균수를 측정하였고, 나타난 결과를 t-test를 통하여 검정하였다. 그 결과, 두 가지 균주 모두에서 옥수수 전분(corn starch)을 첨가한 배지의 사용이 옥수수 전분을 첨가하지 않은 배지를 사용한 것보다 높은 균체 생성 효율을 나타내었다(표 3).

바실러스의 성장에 대한 옥수수 전분의 효과

Strains	Viable cell counts, Log₁₀(cfu/ml)
Strains	1% Starch	Non-starch	Probability
Bacillus subtilis	8.44±0.06	8.09±0.12	0.088
Bacillus licheniformis	7.62±0.06	6.97±0.09	0.019

실시예 3: 선발 배지 성분들의 최적 비율의 도출

상기 실시예 1 및 2의 결과를 이용하여 주요 성분 요인으로 옥수수 전분(corn starch), 대두분말(soybean meal) 그리고 효모 추출물(yeast extract)을 선발하고, 3가지 성분들의 최적 혼합비율을 설정하는 실험을 수행하였다. 선발된 3가지 성분들의 최적 혼합비율 설정은 mixture design을 사용하였다. RSM 분석을 위한 일반 실험의 경우 농도의 합에 대한 제약이 없으나 mixture design의 경우 모든 실험구에서 그 합을 일정하게 하여 각 성분들의 변량 범위를 지정할 수 있다. 본 실험에서는 3가지 성분들의 합을 30 g/L로 제한하였고, 옥수수 전분(corn starch)은 5~20 g/L, 대두분말(soybean meal)은 5~20 g/L 그리고 효모 추출물(yeast extract)는 1~5 g/L로 범위를 설정하였다. 각 실험 별 성분들의 구성과 배양 결과는 표 4에서 보는 것과 같다.

배지 성분들의 함량에 따른 배지 구성 및 배양 결과

Runs	Ingredients(g/L)			Viable cell counts, Log₁₀(cfu/ml)
Runs	옥수수 전분	대두 분말	효모 추출물	Bacillus subtillis	Bacillus licheniforms
1	20	9	1	9.43	9.67
2	20	5	5	9.33	9.68
3	9	20	1	8.76	9.37
4	5	20	5	8.54	9.31
5	13.5	13.5	3	8.90	8.85
6	16.75	11.25	2	9.68	9.76
7	16.75	9.25	4	9.32	9.39
8	11.25	16.75	2	9.20	9.81
9	9.25	16.75	4	9.23	9.18
10	13.5	13.5	3	8.88	9.45

상기 최적 배지 조성 산출 결과와 모든 실험들의 성적을 통합적으로 검토하였을 때 최적 배지 조성은 옥수수전분 20 g/L, 대두분말 5 g/L, 효모추출물 5 g/L의 수치를 얻을 수 있었으며, 예측되는 세포 수율(cell yield)은 9.287로 1.9×10⁹ cfu/ml 수준이며, 만족도는 0.8577로 나타났다.

실시예 4: 기존 바실러스 상업용 배지와 본 발명의 배지의 배양효율 분석

상기 실시예에 의해 선발된 배지 조성을 이용하여 시판되고 있는 상업용 배지와 균체 성장 효율을 비교 분석하였다. 본 발명의 배지 조성은 옥수수 전분(corn starch) 20 g/L, 대두 분말(soybean meal) 5 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 5 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.2 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.02 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.02 g/L, 염화나트륨(NaCl) 0.2 g/L로 하였다. 비교용 배지로서는 시판되고 있는 LB broth (Difco)와 Bacillus 용 Gallix 배지를 사용하였다. 각각의 배지에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)를 1% 접종한 후, 30℃ 배양기에서 150 rpm으로 24시간 동안 배양한 후에 배양액 내 총균수를 측정하였다. 각 배지들에서 얻어진 균수에 대한 통계처리는 SAS 9.1의 general linear model의 duncan 방법을 사용하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 모두 본 발명의 배지에서 가장 우수한 균체 성장률을 나타내었으며, LB 배지와 Gallix 배지는 유의적인 차이를 보이지 않았다(표 5).

시판중인 바실러스 배지들과 본 발명의 배지를 이용한 생균수 비교(cfu/ml)

	LB 배지	상업용 배지	개발배지
Bacillus subtillis	2.8±0.1×10^8b	1.8±0.1×10^8b	1.6±0.3×10^9a
Bacilus licheniformis	1.1±1.0×10^8b	2.4±0.5×10^8b	1.2±0.1×10^9a

Claims

옥수수전분 15~25 g/L, 대두분말 4~6 g/L, 효모추출물 4~6 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1~1 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.01~0.1 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.01~0.1 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.1~1 g/L로 이루어진 것을 특징으로 하는 바실러스 고농도 생산 배지 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 바실러스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
바실러스 배지의 제조방법에 있어서, 옥수수전분 15~25 g/L, 대두분말 4~6 g/L, 효모추출물 4~6 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1~1 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.01~0.1 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.01~0.1 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.1~1 g/L를 첨가하여 제조하는 것을 특징으로 하는 바실러스 고농도 생산 배지의 제조방법.
삭제
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제1항의 배지 조성물에 바실러스를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스를 고농도로 생산하는 방법.
옥수수전분 15~25 g/L, 대두분말 4~6 g/L, 효모추출물 4~6 g/L, 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1~1 g/L, 염화마그네슘(MgCl₂) 0.01~0.1 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.01~0.1 g/L 및 염화나트륨(NaCl) 0.1~1 g/L로 이루어진 바실러스 고농도 생산 배지 조성물에 바실러스 0.5~1.5%(v/v)를 접종한 후, 교반속도 100~200 rpm 및 25~35℃의 조건에서 20~28시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스를 고농도로 생산하는 방법.