KR20090050559A - 프로바이오틱 생균 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ｋｕ801균주의 배지 최적화에 의한 대량 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로바이오틱생균 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) KU801 균주의 배지 최적화에 의한 대량생산방법에 관한 것으로, 반응표면분석법을 이용하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 생산 최적 배지를 제공하며 항생물질 대체제를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 발효산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801, Bacillus amyloliquefaciens, 배지, 반응표면분석법

Description

프로바이오틱 생균 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ＫＵ801 균주의 배지 최적화에 의한 대량 생산 방법{A mass production method of probiotic Bacillus amyloliquefaciens KU801 by medium optimization}

본 발명은 프로바이오틱 생균 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801 균주의 배지 최적화에 의한 대량생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 탄소원, 질소원, 무기염의 선택 및 그 함량을 결정하여 상기균의 배지를 최적화함으로써 대량생산이 가능한 방법에 관한 것이다.

미생물, 바이러스 등에 의해 유발되는 가축 전염병의 확산은 국가 경제에 치명적이다. 이러한 전염병의 예방을 위하여 항생제가 광범위하게 사용되고 있으며 항생제의 과다 사용은 새로운 내성균의 출현 및 인체의 항생제 내성을 유발시킨다. 가축의 면역능력 강화를 통한 미생물에 의한 감염에 대한 저항성 증진은 축산업의 질적, 양적 성장 및 인간에게의 전염도 막을 수 있는 방법으로 사료된다. 면역능력의 강화를 통한 병원균에 의한 감염 예방은 내성균의 유발을 막을 수 있는 유일한 방법이다. 면역능력의 강화는 기존의 화학적으로 합성된 물질의 제공을 통한 면역증진 방법보다는 식용 가능한 미생물체에서 대량생산되는 천연 면역능력 강화 물질을 제공하는 것이 더욱 효율적이다. 프로바이오틱스는 동물 성장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거할 수 있는 미생물로 간주되고 있다 [전경동 외 2002]. 프로바이오틱 생균제로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, antigenotoxic 활성, 병성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조 과정 중의 생존성). 그리고 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물이다 [Conway et al. 1987; Jayaprakasha et al. 2005]. 또한, 이러한 면역증진기능을 지닌 기능성물질 및 프로바이오틱스는 현재 오·남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체물질로서 이용이 가능한 특징이 있다.

바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus liquefaciens)는 BamH1 제한효소의 공급원으로 천연 항산화 단백질인 바나제(barnase)를 생산하는 균주이다. 1943년 일본인 후쿠모토(Fukumoto)에 의하여 토양에서 발견되었으며,액화형 아밀라아제(liquefying amylase)를 생산한다고 하여 아미로리퀘파시엔스라 명명되었다.

세균 균체량의 증가는 배지 조성인 탄소원, 질소원, 무기염류 등에 의해, 이 외에도 성장조건인 pH, 배양온도, 진탕속도 등에 영향을 받는다.

바실러스 균주에 관한 종래 연구를 살펴보면, 대부분 다양한 균주의 동정에 초점이 맞추어져 있고, 산업적 이용을 위한 배지 최적화에 관한 기술은 거의 없는 현실이다. 특허등록된 종래 기술을 살펴보면 바실러스 아미로리퀴파시엔스 LX9 및 그 배양방법(대한민국 특허등록 제 10-0472376호), 바실러스 스테아로서머필러스 DL-3 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이의 생산방법(대한민국 특허등록 제 10-0464825호), 항산화활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양상등액(공개번호 10-2007-0054973호) 등만이 배지에 대해 관심을 맞춘 기술들이다. 또한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801을 대상으로 한 배지 최적화 연구는 없는 실정이다.

배지 최적화의 고전적인 방법으로 one factor-at-a time을 들 수 있는데, 이는 다른 조건들은 고정시키고 한가지 인자만 변화시키는 방법이다. 이 방법은 시간과 노력이 많이 소비되는 방법으로 최적화하기 힘들다. 다른 한편으로 실험적 조건에 따라 변할 수 있으므로 비효율적이다. 그러므로, 이 실험방법은 스크리닝의 방법으로 이용하고, 이와 아울러 복합적인 검토를 위해 반응표면분석법으로 factorial design이 요구되어 진다 [Liew et al. 2005; Rodrigues et al. 2006; Sen R. 1997; Tanyildizi et al. 2006].

본 발명자는 종래에 닭 분변으로부터 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801을 분리하고 동정하였으며(기탁번호 KCCM 10792P), 이에 관하여 특허출원한 바 있다(특허출원번호 10-2006-111141호). 상기균은 면역활성 및 위와 담즙에 대한 안정성을 가지고 있으므로 프로바이오틱 균주로서 유용성이 확인되어져 있다.

본 발명자는 프로바이오틱 균주인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801 균주의 생산을 증가시키기 위해 노력한 결과 , 탄소원, 질소원, 무기염으로 one factor-at-a time method를 이용하여 성분을 결정하고, 이들 성분의 최적 함량을 반응표면분석법(RSM)으로 결정함으로써, 대량생산방법을 제공하는 본 발명에 이르게 되었다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명한다.

따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 최적화된 배양 배지를 결정하여 대량생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 선택된 각각의 탄소원, 질소원 및 무기염 중에서 최적의 성분을 선정하고, 반응분석법에 의하여 이의 함량을 결정함으로써 달성하였다.

본 발명은 프로바이오틱 생균 성장의 필수배지성분으로 글루코오스, 효모추출물, 염화나트륨을 함유함을 특징으로 하는 생산최적화방법을 제공함을 특징으로 한다. 상기 프로바이오틱 균주는 바실러스 속 균주들일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 종, 더욱 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 상기 배지 조성물은 글루코오스가 1 중량%, 효모추출물이 1.5 중량%, 염화나트륨이 0.1 중량%를 함유하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801 균주를 포함하는 사료를 제공함을 특징으로 한다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 반응표면분석법을 이용하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 생산 최적 배지를 제공하며 항생물질 대체재를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 발효산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하 본 발명이 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 균주 및 배지

본 발명에서 사용한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주는 3~4회에 걸친 계대배양으로 활성화하였으며, 글리세롤 스탁(글리세롤 stock)법으로 -70℃에서 보존하였고, 실험 배양은 한달에 1회씩 계대배양을 하여 사용하였다. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 배양배지는 Tryptic soy broth(TSB; Difco Laboratories, Detroit, USA)를 사용하였다.

< 실시예2 > 배양조건 및 방법

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주를 50 mL의 TSB에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 진탕배양하여 전배양한 다음, 다시 500 mL 플라스크 (실용량 150 mL)에 1% 접종하여 8시간 동안 본배양을 실시하였다.

< 실시예3 > 균수의 측정

균수는 배양액을 0.1% 펩톤수로 10배씩 연속적인 희석을 시킨 다음, 평판배지에 0.1 mL씩 분주하여 도말한 후 최적온도에서 배양하고 콜로니형성단위(colony forming unit)를 측정하여 총균수를 계산하였다.

< 실시예4 > One factor - at -a time method 에 의한 탄소원 , 질소원, 무기염의 최적화

생산배지로 탄소원의 선정하기 위해 락토오스, 프럭토오스, 글루코오스, 수크로오스, 글리세롤 및 에탄올을 검토하였고, 1% 탄소원에 1% 효모추출물로 배지를 만들어 배양하였다. 정해진 1% 탄소원에 질소원으로 효모추출물, 대두가루, 미트 추출물(meat extract), 펩톤, 트립톤, 카세인 및 말트추출물로 검토하였다. 무기염으로는 0.1%의 농도로 황산마그네슘(MgSO₄), 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), 염화칼슘(CaCl₂) 및 염화나트륨(NaCl)를 이용하였다.

< 실시예5 > 중심합성계획에 따른 반응표면 분석

One factor-at-a time method에서 결정된 글루코오스, 효모추출물, 염화나트륨을 가지고 중심합성계획을 세웠다. 각각 글루코오스(0.5~2.5%), 효모추출물(0.6~2.2%), 염화나트륨(0.1~0.5%)을 -2, -1, 0, 1, 2 등 다섯 단계로 부호화 하 였다(표 1). 변수는 중심합성계획에 따라 16 실험구로 구분하였으며, 이들 요인변수(X_n)에 의해 영향을 받는 반응변수(Y)를 회귀분석에 사용하였다. 회귀분석에 의한 모델식의 예측에는 SAS program이 사용되었다.

[표 1]

실험용 독립변수 단계

Xn	독립변수	단계
		-2	-1	0	1	2
X1	글루코오스(%)	0.5	1.0	1.5	2	2.5
X2	효모추출물(%)	0.6	1.0	1.4	1.8	2.2
X3	염화나트륨(%)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5

< 실시예6 > 최적조건에서 생산검증

SAS 프로그램을 통해 최고점을 얻었고, 최고점의 조건의 글루코오스, 효모추출물, 염화나트륨의 농도로 하여 확인 실험을 하였다.

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 생육곡선은 MRS배지에서 8시간에 최대 생산을 보였고, 그 이후로 유지되었다(도 1). 배지 최적화를 위해 8시간을 기준으로 One factor-at-a time method로 실험 한편,탄소원의 종류에 따라 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 생육을 확인한 결과, 1% 글루코오스와 1% 락토오스에서 비슷한 결과가 나타났으나, 생산비용 측면에서 글루코오스를 채택하였다. 이를 기준으로, 1% 글루코오스에 1% 질소원을 첨가하였을 때, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 생육은 효모추출물> 대두가루> 미트 추출물(meat extract)> 펩톤> 트립톤> 카세인> 말트 추출물의 순으로 나타났다. 1% 글루코오스와 1% 효모 추출물을 첨가해서 무기염 실험을 실시하였다. 염화나트륨와 황산마그네슘에서 비슷한 값을 나타냈으나, 평균적으로는 염화나트륨이 더 높은 값을 나타내었고, 이때 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KU801균주의 생육은 8.4 Log CFU/mL를 나타냈다. (도 2 내지 도 4 참조)

또한, 글루코오스, 효모추출물 및 염화나트륨을 중심합성계획에 따라, 5가지 수준으로 하여 실험한 결과는 [표 2]와 같으며, 이 결과를 이용해 SAS를 통한 회귀분석 결과를 [표 3]에 나타내었다.

[표 2]

탄소원, 질소원, 및 염의 다른 조건에 따른 세포 성장

번호	배지 조성(%)			세포성장(Log CFU/mL)
	글루코오스	효모추출물	염화나트륨
1	-1(1.0)	-1(1.0)	-1(0.2)	8.31
2	-1(1.0)	-1(1.0)	1(0.4)	8.40
3	-1(1.0)	1(1.8)	-1(0.2)	9.08
4	-1(1.0)	1(1.8)	1(0.4)	8.44
5	0(1.5)	0(1.4)	0(0.3)	8.76
6	0(1.5)	0(1.4)	0(0.3)	8.96
7	-2(0.5)	0(1.4)	0(0.3)	8.43
8	2(2.5)	0(1.4)	0(0.3)	-
9	0(1.5)	2(2.2)	0(0.3)	7.69
10	0(1.5)	-1(0.6)	0(0.3)	7.80
11	0(1.5)	0(1.4)	-2(0.1)	8.99
12	0(1.5)	0(1.4)	2(0.5)	9.36
13	1(2.0)	-1(1.0)	-1(0.2)	8.88
14	1(2.0)	-1(1.0)	1(0.4)	8.89
15	1(2.0)	1(1.8)	-1(0.2)	7.99
16	1(2.0)	1(1.8)	1(0.4)	8.24

[표 3]

SAS 회귀 분석 결과

Parameter	standard estimate	t value	Pr > │t│
Intercepter	3.100649	1.55	0.1807
X1	2.895941	2.35	0.0656
X2	6.896866	4.80	0.0049
X3	-7.793121	-1.57	0.1776
X1×X1	-0.468321	-1.55	0.1821
X2×X1	-1.535812	-2.98	0.0308
X2×X2	-1.690048	-4.92	0.0044
X3×X1	2.025714	1.20	0.2856
X3×X2	0.003865	0.00	0.9988
X3×X3	8.371888	1.48	0.1999

[주] R² = 0.9230; Pr>F = 0.0252

본 발명에서, 세가지 조건인 글루코오스, 효모추출물, 염화나트륨이 변할 때 cell 농도에 대한 반응표면 회귀식은 다음과 같았다.

Y (Log CFU/mL) = 3.10+2.90X₁+6.90X₂-7.79X₃+2.03X₁X₃-1.54X₁X₂-0.47X₁ ²

-1.69X₂ ²+8.37X₃ ²

상기 회귀식의 전체 R²는 0.9230였고, 유의성은 0.025로 5% 유의수준에서 인정되었다. 분산분석에서는 t Value의 값은 질소원인 효모추출물에서 가장 높게 나타났고, 1% 유의수준에서 유의성이 인정되어졌고, 글루코오스는 10% 유의수준에서 인정되었다. 결과적으로, standard estimate와 도 5와 도 7를 통해 효모추출물에 의해 가장 크게 영향을 받음을 알 수 있었다. 도 5, 6 및 도 7를 통해서 두 성분 간의 상관관계를 확인하였다. 효모추출물 양이 증가할수록 높은 세포 농도를 얻을 수 있었다.실험결과, 중심합성계획에 따른 maximum response는 1.09% 글루코오스, 1.51% 효모추출물, 0.11% 염화나트륨이었고, maximum 값은 9.23 Log CFU/mL으로 예 측되어졌으며, 실제로 실험한 결과도 이와 유사하게 >9.0 Log CFU/mL로 나타내어 본 발명의 최적화 실험이 성공적으로 이루어졌음이 확인되었다.

도 1은 본 발명 균주의 성장곡선을 보인 그래프이다.

도 2는 본 발명 균주의 세포성장에 미치는 탄소원의 효과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명 균주의 세포성장에 미치는 질소원의 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명 균주의 세포성장에 미치는 염류의 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명 균주에 대한 글루코스와 효모추출물이 세포성장에 미치는 효과로 보인 contour plot이다.

도 6은 본 발명 균주에 대한 글루코스와 NaCl이 세포성장에 미치는 효과로 보인 contor plot이다.

도 7은 본 발명 균주에 대한 효모추출물과 NaCl이 세포성장에 미치는 효과로 보인 contour plot이다.

Claims (4)

1. 프로바이오틱 생균 성장의 필수배지 성분으로서 글루코스, 효모추출물 및 염화나트륨을 함유함을 특징으로 하는 생산최적화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 프로바이오틱 균주가 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) KU801균주임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지에 1 중량%의 글루코스, 1.5 중량%의 효모추출물 및 0.1 중량%의 염화나트륨이 함유된 것이 특징인 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 균주를 포함하는 사료.

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