KR101300191B1

KR101300191B1 - 티라민과 히스타민 분해능을 갖는 바실러스 리케니포미스 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101300191B1
Application number: KR1020110136241A
Authority: KR
Inventors: 김용상; 엄태붕; 정도연
Original assignee: 순창군; 재단법인 순창군발효미생물관리센터
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2013-08-26
Also published as: KR20130068839A

Abstract

본 발명은 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해능을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 장류에서 티라민과 히스타민 분해능을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주, 상기 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류에서 티라민과 히스타민 분해용 미생물 제제 및 상기 균주를 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류에서 티라민과 히스타민을 분해하는 방법에 관한 것이다.

Description

티라민과 히스타민 분해능을 갖는 바실러스 리케니포미스 균주 및 이의 용도{Bacillus licheniformis strain having ablity of decomposing tyramine and histamine and uses thereof}

본 발명은 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해능을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

바이오제닉 아민(biogenic amine)은 염기성 질소화합물로서 식품에서는 미생물의 아미노산 탈카르복시화효소(amino acid decarboxylase) 작용에 의해 아미노산으로부터 형성된다. 이 물질들은 주로 어류 및 해산물과 청국장, 된장, 치즈, 포도주, 맥주와 같은 발효식품에서 주로 발견되는데 세균에서는 에어로모나스(Aeromonas), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리듐(Clostridium), 에세리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등이 아미노산 탈카르복시화효소를 가지는 것으로 보고되고 있다. 음식을 통해 소장에서 흡수 후 이들 바이오제닉 아민들은 인체 또는 미생물의 대사 과정이나 콩팥에서 배출을 통해 제거된다. 인간은 모노아민 산화효소(monoamine oxidase(MAO), EC 1.4.3.4)와 디아민 산화효소(diamine oxidase(DAO), EC 1.4.3.6)가 바이오제닉 아민 분해에 주역할을 하는 것으로 알려져 있다. 히스타민의 경우 인체 내에서 HNMT(histamine N-methyltransferase)를 통해 N-메틸히스타민(N-methylhistamine)으로 전환 후, 모노아민 산화효소(monoamine oxidase)에 의해 N-메틸이미다졸릴아세트산(N-methylimidazolylacetic acid)으로 분해되거나 디아민 산화효소(diamino oxidase)에 의해 이미다졸릴아세트산(imidazolylacetic acid)으로 산화된다. 그러나 식품을 통해 인체 처리 한도 이상을 섭취하든지, 우울증약과 같은 MAO 저해제를 섭취하는 경우, 과도한 알코올 섭취 또는 장 질환이 있는 경우에는 분해되지 않은 바이오제닉 아민들의 약리적 특성에 의해 독성이 나타난다. 히스타민 독성으로는 저혈압, 홍조, 두통, 설사, 구토, 가려움을, 티라민의 경우 고혈압과 두통을, 푸트리신(putricine)과 카데브린(cadeverine)은 질산이온의 존재 하에 발암물질인 니트로소아민(nitrosoamines), 니트로소피롤리돈(nitrosopyrrolidone), 니트로소피페리딘(nitrosopiperidine)이 형성된다. 현재 각국의 식품에서 바이오제닉 아민 전체량에 대한 허용 상한선은 정해져 있지 않으나 일부 생선류, 육류 또는 그 통조림에 대한 히스타민 가이드라인은 정해 놓고 있다. 예를 들어 유럽 연합에서 고등어, 삼치, 청어과 날 생선은 100 mg/kg 이하, 염장 생선은 200 mg/kg 이하의 히스타민을 함유해야 한다고 규제하고 있다.

바이오제닉 아민의 형성은 식품 중의 아미노산 함량과 미생물이 분비하는 L-아미노산 탈카르복시화효소(L-amino acid decarboxylase)의 생성량과 활성도에 의해 결정된다. 탈카르복시화효소 작용에 의해 아미노산 히스티딘은 히스타민, 티로신은 티라민, 트립토판은 트립타민(tryptamine), 아르기닌(arginine)은 푸트리신(putricine), 라이신(lysine)은 카다베린(cadaverine)으로 바뀌게 된다. 세균 아미노산 탈카르복시화효소의 최적 pH는 일반적으로 산성에서 활성이 높고, 산에 대한 방어 기작으로 산성화 되었을 때 미생물이 이 효소 생성량을 늘리는 것으로 알려져 있다. 환경적 요소로서 온도의 영향이 가장 큰데 세균의 최적 증식온도에서는 탈카르복시화효소 활성 증가로 바이오제닉 아민 생산량이 크게 증가하는 반면 온도가 낮아져 증식이 멈추게 되면 효소 활성 또한 급격히 감소하였다. 이러한 이유로 미생물 증식이 잘되고 바이오제닉 아민 생산 조건을 갖춘 식품들은 콜드 체인(cold chain)에 의한 유통 과정이 필요하다. 염화나트륨(NaCl)은 티로신 탈카르복시화효소(tyrosine decarboxylase) 활성을 증가시키는 반면 히스티딘 탈카르복시화효소(histidine decarboxylase) 활성을 억제하며, 산화환원 전위를 낮춘 혐기 상태의 식품에서 히스타민의 생산은 증가하는 것으로 나타났다.

국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민들의 분포를 체계적으로 조사한 결과, 특히 한국인의 주 부식인 전통 된장에서 푸트레신(putrescine)은 99.6~1453.7(평균 462.6) mg/kg, 히스타민은 260.1~952(평균 569.4) mg/kg, 티라민은 284.7~1430.7(평균 669.5) mg/kg으로 분석한 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았으며, 다음으로 멸치 젓갈(푸트레신, 히스타민, 티라민 각 평균 86.5, 624.5, 330.1 mg/kg, 까나리 젓갈(각 평균 84.9, 584.2, 342.7 mg/kg), 시판 간장(각 평균 56.8, 129.8, 594.5 mg/kg), 전통 간장(각 평균 376.9, 225.9, 241.6 mg/kg)들이 높은 수치를 보였다. 김치의 경우 푸트레신, 히스타민, 티라민의 평균 함량은 장류나 젓갈보다 낮은 수준으로 각각 69.7, 50.0, 49.4 mg/kg이었다. 한국인의 음식 특성상 일일 섭취량에서 젓갈보다 장류 섭취량이 많다는 것을 고려하면, 이 결과들은 장류가 바이오제닉 아민의 주공급원이 될 수 있다는 것을 보여주었다. 진뱅크 데이터베이스(GenBank database)를 검색했을 때 콩류 발효에 관여하는 미생물들인 바실러스(Bacillus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 젖산균(Lactic acid bacteria), 효모들은 아미노산 탈카르복시화효소(amino acid decarboxylase) 유전자들을 함유하고 있다. 단백질 함량이 높은 콩과 프로테아제(proteases) 활성이 매우 높은 바실러스 균주(Bacillus sp.)와 아스퍼질러스 균주(Aspergillus sp.)의 존재, 미혐기적 환경과 적당한 발효 온도를 고려할 때 장류는 바이오제닉 아민을 생산하기 좋은 환경이라 할 수 있다. 그러나 장류에서 바이오제닉 아민을 제어할 수 있는 조건들이 확립되어 있지 않아 공장형 된장까지도 비교적 높은 수준의 바이오제닉 아민을 함유(푸트레신, 히스타민, 티라민 각각 평균 46.4, 83.6, 133 mg/kg)한다는 점에서 저감화를 위한 방법 개발이 필요한 실정이다.

장류의 바이오제닉 아민 함량은 환경적 요인과 함께 발효 미생물의 종류와 특성, 개수에 의해 결정되므로 이들을 제어하는 기술이 필요하다. 그러나 pH, 발효, 숙성, 보관 시 온도, 염도 등의 환경적 요소도 미생물의 증식과 바이오제닉 아민 생산 조건과 관련되어 있으므로 결국은 미생물의 고유 특성이 바이오제닉 함량을 결정하는 요인이 된다. 장류 발효에서 주요 발효균은 바실러스(Bacillus)와 아스퍼질러스(Aspergillus)이고 이들에 의한 바이오제닉 아민 생산은 종(species) 수준이 아닌 균주(strain) 수준에서 영향을 받는다는 것을 바이오제닉 아민 비생산 균주들의 선발 동안 발견했다. 따라서 장류의 바이오제닉 아민 생성 제어를 위해서는 장류 발효, 숙성, 보관 조건하에서 이들 물질을 생성하지 않는 발효 균주 선발과 함께 분해까지 할 수 있는 균주 선발이 가장 효과적인 방법이 될 것이다.

본 발명은 장류에 존재하는 높은 농도의 바이오제닉 아민을 줄이기 위한 방법으로서 전통 장류에 존재하는 발효 세균들을 대상으로 바이오제닉 아민 분해능을 갖는 세균들을 분리하여 동정한 결과 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주로 밝혀졌다. 선행기술로 한국등록특허 제1009935호에는 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 라이케니포미스 GB-F2 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법이 개시되어 있지만, 장류 주발효균으로서 바실러스 리케니포미스가 히스타민과 티라민을 동시에 분해하는 현상은 이 발명에서 처음으로 발견되었다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 장류에 존재하는 바이오제닉 아민인 티라민과 히스타민을 동시에 효과적으로 분해할 수 있는 미생물을 분리한 후 그 생리적인 특성을 규명하여 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주가 티라민과 히스타민의 동시 분해 능력을 갖는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해능을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 BaDB7를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine)을 분해시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 장류에 존재하는 높은 농도의 바이오제닉 아민을 줄이기 위한 방법으로서 전통 장류에 존재하는 발효 세균들을 대상으로 바이오제닉 아민 분해능을 갖는 세균들을 분리한 후, 동정한 결과 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주로 밝혀졌으며, 바실러스 리케니포미스가 히스타민과 티라민을 동시에 분해하는 현상은 이 발명을 통해 처음으로 밝혀진 것이며, 이를 통해 보다 효율적으로 장류에 존재하는 바이오제닉 아민을 분해할 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주는 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해 능력을 가지므로, 친환경적이며 안전성이 높은 바이오제닉 아민 분해용 미생물 제제를 제조하는데 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 유일한 탄소원 및 질소원으로서 히스타민과 티라민을 포함한 최소 합성배지에 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 균주의 성장을 보여준다. 화살표는 바이오제닉 아민 이용 BaDB7 균주를 나타낸다.
도 2는 BaDB7 균주의 배양 상층액과 반응 후에 히스타민과 티라민의 분해를 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 BaDB7 균주 콜로니의 형태학상의 유형을 보여준다.
도 4는 16S rRNA 서열에 기초한 도메인 세균 유래의 기준 균주와 정렬된 BaDB7 균주의 계통 관계를 보여주는 Maximum Likelihood tree를 나타낸다. 스케일 바는 1%의 평가된 변화를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해능을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 BaDB7 (KCCM 11233P)를 제공한다. 본 발명의 균주는 티라민과 히스타민을 동시에 분해하는 활성을 가진다. 상기 균주는 삶은콩 20 g에 5 mg의 히스타민과 티라민을 인위적으로 첨가한 청국장의 실증실험에서 히스타민의 경우 약 91%, 티라민의 경우 89%의 높은 분해율을 보여 잠재적으로 장류 제조에 사용할 수 있는 능력을 보였다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해용 미생물 제제를 제공한다. 상기 장류는 청국장, 된장, 간장 또는 고추장일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 티라민과 히스타민 분해용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 균주를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine)을 분해하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 장류에서 히스타민 및 티라민 저감화 균주의 선발

목표 미생물이 아미노산 탈카르복시화효소(amino acid decarboxylase)를 생산할 경우 선택 배지에 첨가된 L-히스티딘(L-histidine) 또는 L-티로신(L-tyrosine)은 염기인 히스타민이나 티라민으로 바꾸며, 이때 변화된 pH는 크레졸 레드(cresol red)의 변색(보라색)으로 확인할 수 있다. 이 원리를 적용한 배지(표 1)를 이용하여 1차적으로 변색이 없거나 최소한의 변색을 보인 균주들을 선발하였다.

바이오제닉 아민 선택 배지를 이용하여 전국에서 수집한 83종의 장류로부터바이오제닉 아민을 생산하지 않는 106개의 균주를 분리하였다. 이들 균들 중 바이오제닉 아민을 분해하는 균주를 선발하는 것은 이미 여러 미생물의 복합적인 발효에 의해 생성된 장류 내 바이오제닉 아민의 제거에 가장 효율적인 방법이라 할 수 있다. 이를 위해 유일한 탄소원 및 질소원으로 각각 1%의 히스타민 및 티라민을 사용한 pH 7의 합성 배지를 개발하였다. 바이오제닉 아민을 생산하지 않았던 이들 균들 중 절반이 넘는 67개 균주가 이 배지에서 자랐고 이들 가운데 성장이 빨라 콜로니 직경이 컸던 26 종을 분리하였다(도 1).

이 균주들을 대상으로 각각 바이오제닉 아민을 첨가한 합성 배지(5 mg의 히스타민 또는 티라민/ml NB)에 접종하고 20일간 37℃에서 배양 후, 먼저 HPLC 상에서 히스타민 또는 티라민 분해 능력이 높았던 균주들을 1차로 선발하였다. 이들이 실제 장류에서도 바이오제닉 아민을 제거하는지 검증하기 위해 청국장을 제조하였다. 청국장 제조 시 사용한 콩은 국내산 백태로서, 하루 전 물에 침지하여 콩이 수분을 흡수하도록 하고, 121℃에서 10분간 삶은 뒤 식혀 사용하였다. 청국장 제조 시 첨가한 바이오제닉 아민은 히스타민 디하이드로클로라이드(histamine dihydrochloride, TCI, Japan), 티라민 하이드로클로라이드(tyramine hydrochloride, SIGMA, Germany)를 사용하였다. 20 g의 삶은 콩(약 30알)에 1차 선발에서 히스타민 분해율이 높았던 균주 배양액(약 1 x 10⁹CFU/ml) 500 ul, 바이오제닉 아민(5 mg in 500 ul Nutrient broth)을 첨가하여 혼합한 뒤 48시간 동안 47℃에서 배양시켰으며 발효 후 실온(25℃)에서 48시간 동안 숙성 단계를 거쳤다. 대조군으로는 같은 양의 삶은 콩에 히스타민과 티라민만을 첨가한 군을 사용하여 최종 HPLC 결과에서 분해한 값만큼을 감하였다. 발효 후 완전히 분쇄한 시료 0.1 g을 취하여 0.1N HCl 용액 0.3 ml을 첨가, 혼합한 후 원심 분리하여 상층액을 취하고, 침전물에 0.1N HCl 용액 0.7 ml을 첨가한 뒤 다시 상층액을 합하여 1 ml이 되도록 하였다. 상층액은 다음과 같이 유도체화 과정을 거쳤다. 시료 0.1 ml, 1% 댄실 클로라이드(dansyl chloride) 아세톤용액 80 ul, 포화 Na₂CO₃ 50 ul, 내부표준용액 50 ul을 섞은 후 45℃에서 1시간 동안 배양하였다. 유도체화된 시료용액은 10% 프롤린(proline) 50 ul를 첨가하여 과잉의 댄실 클로라이드를 제거하였다. 에테르 0.5 ml을 첨가한 후 섞은 뒤 45℃에서 3분 동안 배양한 후 상층액을 분리하여 에테르(ether)를 증발시키고 아세토나이트릴(acetonitrile) 0.1 ml를 넣어 섞었다. 유도체가 끝난 시료는 원심분리 후에 HPLC을 이용하여 분석하였다. 컬럼은 Capcell pak C18 reversed-phased column(150 × 4.6 mm, 5 μm column, Shiseido Fine Chemical. Japan)을 사용하였고 254 nm에서 티라민과 히스타민 검출 흡광도를 측정하였다. 유속은 분당 1 ml이었고 A 용매(0.1% Formic acid in H₂O), B 용매(0.1% Formic acid in ACN)를 사용하여 다음과 같은 조건에서 농도경사를 시행하였다(A:B=45:55, 0~10분; A:B=35:65, 10~15분; A:B=20:80, 15~25분; A:B=10:90, 25~30분; A:B=10:90, 30분). 그 결과 이들 균주들 중 BaDB7 균주가 청국장 발효 동안 삶은 콩 20 g에 함유되었던 총 5 mg 히스타민 중 4.55 mg을 분해(91%)했으며, 같은 양의 티라민 경우 4.45 mg(89%)을 분해하였다(도 2).

상기 BaDB7 균주를 한국미생물보존센터(KCCM)에 2011년 12월 13일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCCM 11233P).

실시예 2: 바이오제닉 아민 분해균주들의 동정

BaDB7 균주의 콜로니 형태는 도 3과 같았다. 분리한 균주들의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 서열 분석과 48종의 생화학 검사를 수행하였다. 16S rRNA 유전자 서열 분석은 유전체 DNA(genomic DNA)를 분리한 뒤, 일반 세균용 508F와 800R의 universal primers를 사용하는 PCR을 수행하여 유전자 염기 서열을 해독하였다. 분석한 서열은 키메라(chimera) 검출용 프로그램인 Pintail(Bioinformatics Toolkit, UK)에서 검증하였고 SeqMatch(RDP II, USA) 및 BLASTN Search(NCBI, USA) 프로그램을 통해 계통수(pylogenetic tree)를 만드는데 필요한 타입 균주(type strain)들의 16S rRNA 서열들을 수집하였다. CLUSTALW2(EMBL-EBI, UK) 프로그램을 사용하여 타입 균주들과 본 균주의 16S rRNA 서열들간 보존 서열들의 위치와 길이를 동일한 길이로 조정한 뒤 MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis, ver 5.0) 프로그램을 통해 Maximum Likelihood tree를 작성하였다. Outgroup으로는 락토바실러스 속(genus Lactobacillus)에 속하는 3종류의 타입 균주들을 사용하였다. 그 결과 BaDB7의 16S rRNA 서열은 타입 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) ATCC14580 균의 유전자 서열과 가장 가까웠다(도 4). 생화학 검사는 그람 양성 포자 형성 세균(Gram positive spore forming bacteria)들을 47종의 생화학 특성에 따라 동정할 수 있는 BCL Card(BioMerieux, France)를 사용하였고 동정 결과, BaDB7 균주는 98% 확률로 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 동정되었다(표 3).

실시예 3: 바이오제닉 아민 분해 효소의 최적 pH

BaDB7을 배양 후 분리한 세포 침전물(cell pellet)을 사용하여 45℃에서 3시간 동안 pH 4.5, pH 7, pH 8.5에서 각각의 기질로서 바이오제닉 아민(biogenic amine)과 반응시켰다. HPLC에서 바이오제닉 분해 정도를 측정한 결과 히스타민 분해율은 각 pH에서 43%, 45%, 42%였고, 티라민 분해율은 71%, 70%, 68%였다. pH에 의한 활성변화율은 큰 변화가 없었지만 히스타민 분해는 중성에서, 티라민 분해는 산성에서 약간 더 높음을 보였다(표 4).

실시예 4: 바이오제닉 아민 분해 효소의 최적 온도

BaDB7을 배양한 후 분리한 세포 침전물(cell pellet)을 사용하여 각 온도에서 3시간 동안 pH 7에서 각각 기질로서 바이오제닉 아민과 반응시켰다. HPLC에서 바이오제닉 아민의 분해 정도를 측정한 결과 히스타민과 티라민 모두 45℃에서 각각 44%, 68%의 분해율을 보여 열안정성이 높은 효소임을 보였다(표 5).

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11233

20111213

Claims

장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해능을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 BaDB7 (KCCM 11233P).
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine) 분해용 미생물 제제.
제2항에 있어서, 상기 장류는 청국장, 된장, 간장 또는 고추장인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류에서 티라민(tyramine)과 히스타민(histamine)을 분해하는 방법.