KR101366577B1 - 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｇｂ－ｓ14 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법 - Google Patents

히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｇｂ－ｓ14 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 GB-S12, GB-S13 및 GB-S14 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히스타민 분해능이 우수한 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S14(KCCM 11003P) 균주, 그리고 이 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법에 관한 것이다.

Description

히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ＧＢ－Ｓ14 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법{Bacillus subtilis GB-S14 strain having improved ability of decomposing histamine, and process for producing fishmeal having decreased content of histamine}
본 발명은 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) GB-S14의 새로운 균주 및 이를 이용하여 히스타민이 저감된 고급 발효어분을 가공하기 위한 방법에 관한 것이다.
단백질 공급원으로 제공되는 어분은 식물성 단백질인 곡물류보다 양적, 질적으로 우수한 단백질을 함유하여 각종 동물의 사료 생산에 필수적인 첨가제로 널리 사용되고 있지만, 어분 가공과정 중 이루어지는 과도한 열처리, 저장 기간 또는 보관 방법 등에 의해 영양소 이용률이 저하되고, 아민 류의 물질이 생성되어 어분의 품질이 크게 저하되는 문제점을 가지고 있다. 특히 국내산 어분의 경우 어분 제조를 위한 생산 시설이 영세하고 인간이 섭취하는 가식부분을 제외한 잔여물을 원료로 하여 제품을 생산하기 때문에 어분의 품질이 일정하지 않으며, 어류의 어획 지역과 어종에 따라서도 품질이 크게 달라질 수 있는 문제가 있다.
특히 우수한 단백질 공급원인 어분을 사용하는 경우의 가장 큰 문제점은 어분이 생체아민(biogenic amine)류 특히, 히스타민과 같은 알레르기 유발 물질을 다량 함유하고 있어 첨가량에 제약이 따른다는 점이다. 히스타민은 생선류에서 특히 문제가 되는 독소로서 등푸른 생선들은 히스티딘이라는 아미노산을 대량 함유하고 있으며, 생선이 죽으면 세균작용에 의하여 이 물질이 히스타민으로 변하여 알레르기를 일으키게 된다. 식품에서 이러한 히스타민은 독소로 관리되고 있으며 인간이 히스타민을 소량 섭취한 경우는 위산 분비를 촉진하는 작용을 하지만, 섭취량이 많아지면 독성을 나타낸다(Taylor, 1986). 이는 소화관 내에 존재하는 디아민 옥시다제(diamine oxidase, DAO) 및 히스타민 메틸트랜스퍼라제(histamine methyltransferase, HMT)와 같은 효소들에 의해 소량의 히스타민은 독성이 없는 물질로 분해되지만, 효소가 분해할 수 있는 한계를 초과하는 경우 히스타민이 혈관으로 들어가 독성을 유발하게 된다. 이에 식품국(National Food Authority, NFA)에서는 호주 식품 표준 코드(Australian Food Standards Code, 1995)에 생선 및 생선가공물에 포함될 수 있는 히스타민의 양을 200mg/kg이하로 규제하고 있으며 미국공인 분석화학회(Association of official agricultural chemists(A.O.A.C), 15판, 1990)에 의하면 히스타민 양이100mg/kg이상인 경우에는 저장 및 가공 공정상에 문제가 있음을 개시하고 있다.
한편, 히스타민 함량은 어분의 등급을 결정할 때 고급, 중급, 저급 어분을 구분하는 기준으로도 사용되고 있으며, 일반적으로 사료로 사용되는 어분 내의 히스타민 함량은 약 1000mg/kg 정도이며 저급 어분의 경우에는 히스타민 함량을 보증하지 않는다(1000mg/kg 이상). 하지만 고급 어분의 경우에는 500mg/kg이하로 각 제조사별로 보증되고 있다. 어분의 히스타민 함량을 감소하기 위한 방안으로써 예를 들어, 가수분해 어분의 경우는 특정 효소를 이용하여 생선의 가공 공정에서 나온 부산물을 가수분해하여 제조되는 것으로 70 중량 %이상의 높은 단백질 함량을 가진다. 그러나, 효소 처리에 사용되는 비용 부담이 크며, 최종 제품에서 히스타민 등의 아민류의 완전한 분해를 보장할 수 없다.
따라서, 알레르기를 유발하는 히스타민이 저감된 어분의 제조를 위한 경제적인 제조방법이 요구되며, 이렇게 생산된 어분의 단백질 자원으로써의 이용효율을 높여 단백질 효율 극대화를 위한 고급 발효 어분 제조기술의 구축이 요구된다.
이에 따라, 본 발명에서는 고상 발효 기술을 이용하여 어분의 소화율을 증대시키고 사용량을 제한하는 요소를 제거함으로써 고품질의 고급 단백질 공급원으로써의 어분 사용을 극대화할 수 있는 대량 생산 기술을 제공한다.
이에 본 발명의 한 측면은, 히스타민 분해능 및 단백질 효소활성이 우수한 바실러스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기와 같은 균주를 이용하여 히스타민이 감소된 어분을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 균주가 제공된다.
상기 균주는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S14(KCCM 11003P)인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기와 같은 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법이 제공된다.
상기 발효는 고상 발효인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
상기 발효는 수분 함량 35~45 중량%에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 발효는 30℃ 이상 40℃ 미만의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 발효는 pH 6.0 내지 8.0에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 발효는 36 시간 내지 60시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 균주 및 이를 이용한 어분의 제조방법을 이용하는 경우 단백질 분해 효소 활성 및 펩타이드 함량이 증가되고 히스타민 분해능이 향상된 어분을 획득할 수 있다. 본 발명에 의하면, 고분자 어분 단백질에서 저분자 어분 펩타이드 및 아미노산으로 전환 수율을 증진시킬 수 있고, 별도의 처리 시설 및 유지가 불필요하여 경제적으로 고품질의 어분을 제조할 수 있다.
도 1은 HPLC를 이용하여 어분원료 및 발효어분의 단백질 패턴을 비교한 것이다.
도 2는 발효어분 및 고급어분의 펩타이드 함량을 비교한 것이다.
도 3은 소화율 분석 방법을 개괄적으로 나타낸 것이다.
도 4는 인비트로(In vitro) 소화율을 평가한 결과이다.
본 발명에 의하면 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주가 제공되며, 이러한 균주의 선별을 위해 국내 젓갈 시장 및 어분공장의 샘플을 대상으로 사료용 생균제로 사용가능한 균주를 목표로 미생물 분리 동정을 실시하였다. 어류 및 어패류의 젓갈샘플에서 균주 선발 방법에 따라 무작위로 바실러스 속(Bacillus spp.)인 진핵 세포류 균주들에 대해 콜로니(colony)의 그람 염색(gram staining) 및 형태학적 특성을 분석하여 바실러스 속으로 판단되는 균주를 히스타민 분해활성 테스트를 위해 선발하였다. 이 후, 선발 균주를 대상으로 각각 프로테아제 활성 및 히스타민 분해능이 우수한 균주를 최종적으로 선발하였다.
본 발명의 상기 균주는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S14(KCCM 11003P)인 것이 바람직하다.
서열목록 1은 본 발명에 의한 분리 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) GB-S14(KCCM 11003P)의 유전자 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
상기와 같이 프로테아제 활성 및 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주를 선별하고 획득하여 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하였으며, 기탁 번호는 GB-S14 균주의 경우 KCCM 11003P이다.
상기와 같이 분리된 신규 균주는 동종의 균주들에 비해 히스타민을 분해하는 능력이 탁월하며, 어패류 젓갈에서 분리한 균주이므로 내염성의 특징도 갖고 있어 어분 발효에 적합하다. 본 발명에 의한 균주는 높은 프로테아제 활성을 가지며, 균체 당 높은 히스타민 감소율을 나타내는 것을 표 1 및 2에서 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 상기와 같이 획득된 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법이 제공되며, 이 때 상기 발효는 고상 발효인 것이 바람직하다. 사료를 생산하는 비용에 고려할 때, 본 발명과 같이 고상 발효 공정으로 생산하는 경우 대량 생산에 적합하고 경제적이다.
발효 어분의 경우 효소 처리와 매우 흡사하게 초기의 고분자 물질이 사라지고 후기의 저분자 물질이 증가하는 패턴을 확인하여 발효를 통한 발효어분의 단백질이 저분자 펩타이드 형태로 분해된 것으로 판단할 수 있다(도 1). 펩타이드화 정도는 펩타이드의 기준을 30kDa 이하의 저분자 펩타이드로 정의 할 때, 막 필터(membrane filter)로 단백질 분획(fraction)을 분리한 후 브래드포드(Bradford) 법으로 단백질을 정량하여 확인할 수 있으며, 본원 발명의 경우 펩타이드 함량이 41%인 원료의 경우 발효어분의 펩타이드 함량은 74%로 30%이상의 개선효과를 확인할 수 있었다(도 2).
본 발명의 의한 상기 발효 공정은 수분 함량이 35 ~ 45중량%인 것이 바람직하며, 38 ~ 42 중량%인 것이 보다 바람직하다. 수분 함량이 35 중량 % 미만인 경우에는 발효가 충분히 되지 않는 경향이 있으며, 45 중량 %를 초과하는 경우에는 어분 원료의 뭉침 현상이 발생되어 대량 생산 공정에서 이송라인의 막힘 또는 오염 문제가 발생할 수 있다. 가장 바람직한 수분 함량은 40 중량 %이다. 표 4에서는 배양 온도를 35℃, pH를 7.0으로 고정한 경우 수분 함량 변화가 미치는 영향을 나타낸다.
본 발명의 의한 상기 발효 공정의 발효 온도는 30℃ 이상 40℃ 미만인 것이 바람직하며, 33℃ 이상 37℃ 미만인 것이 보다 바람직하다. 발효 온도가 30℃ 미만인 경우에는 히스타민 분해능이 저감되거나 곰팡이에 의한 오염이 발생할 수 있으며, 40℃ 이상인 경우에는 균주의 생장이 억제되는 경향이 있다. 가장 바람직한 온도는 35℃이다. 표 5에서는 수분 함량을 40 중량 %, pH를 7.0으로 고정한 경우 온도의 변화가 미치는 영향을 나타낸다.
본 발명의 의한 상기 발효 공정의 pH는 6.0 내지 8.0인 것이 바람직하며, pH는 6.8 내지 7.2인 것이 보다 바람직하다. pH가 6.0 미만인 경우 균주의 생장이 억제될 수 있고 히스타민 분해능이 저감되는 경향이 있으며, 8.0을 초과하는 경우에는 과량의 NaOH가 첨가되는 바 생산 공정비가 상승하고 균주의 생장이 저해되는 경향이 있다. 발효 시 pH는 7.0 인 것이 가장 바람직하다. 표 6에서는 배양 온도를 35℃, 수분 함량을 40 중량%로 고정한 경우 pH 변화가 미치는 영향을 나타낸다.
본 발명의 의한 상기 발효는 36 시간 내지 60시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 40 시간 내지 55 시간 동안 수행되는 것이 보다 바람직하다. 발효 시작 약 24시간 후에 균 수가 108 cfu/g 이상으로 증가하며, 단백질 분해 효소의 활성은 36 시간부터 200 U/g 이상의 효소 활성을 나타내고, 약 48 시간 이후부터는 분해율의 증가가 크지 않으며, 60시간 이후에는 분해율의 변화가 매우 적기 때문에 최소 약 36 시간 내지 최대 약 60시간 동안 발효를 수행하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 48시간 동안 발효한다. 발효 시간이 36 시간 미만인 경우 발효가 충분히 일어나지 않을 수 있으며, 60 시간을 초과하는 경우 비경제적이다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 어분은 히스타민의 함량이 감소되며, 균주에 의한 발효 시에 고분자인 단백질이 저분자인 펩타이드로 전환되어 소화가 용이하므로 어린 일령의 가축에도 공급할 수 있고, 상기 어분은 백색어분, 갈색어분 등을 포함하는 당업계에 잘 알려진 어떠한 어분에 대해서도 적용할 수 있으며, 이에 따라 제조된 히스타민이 감소된 어분은 단독으로 또는 어떠한 다른 사료와 함께 혼합하여 가축용 사료의 단백질 공급원으로 이용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위를 하기 실시예로 한정하려는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1: 후보 균주의 선발
국내 젓갈 시장 및 어분 공장의 샘플을 대상으로 사료용 생균제로 사용가능한 균주를 목표로 미생물 분리 동정을 실시하였다. 어류 및 어패류의 젓갈 샘플에서 균주 선발 방법에 따라 무작위로 바실러스 속(Bacillus spp.)인 진핵 세포류 균주들에 대해 콜로니(colony)의 그람 염색(gram staining) 및 형태학적 특성을 분석하여 바실러스 속으로 판단되는 균주를 히스타민 분해활성 테스트를 위해 선발하였다. 선발 균주를 대상으로 각각 프로테아제의 경우 스킴 밀크(skim milk)배지(Nacl 0.24g/L, 효모 추출물 0.075g/L, KH2PO4 1g/L, ZnSO47H2O 0.7mg/L)에 접종하여 12시간 후 그 환의 지름의 크기(d)를 확인하여, 프로테아제 활성으로 환의 지름이 10mm 이상인 균주를 10종 1차적으로 선발하였다.
히스타민의 경우는 프로테아제 활성이 우수한 것으로 선발된 10개의 균주를 이용하여, 100㎖ 이상의 플라스크 배양 시 70ppm이 되게 첨가하여 사용하였다. 선발 콜로니에 대한 배양 테스트 후 바실러스 속으로 판단되는 균주에 대해서 배양액에서 30% 이상의 히스타민 분해능이 있는 균주 S#12(31.41%)-바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S12, S#13(33.23%)- 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S13, S#14(37.60%)- 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S14의 3종을 2차적으로 선발하였다.
선발 균주는 -70℃의 딥 프리저(deep freezer)에 보관하면서 균주 동정과정을 실시하였다. 균주 동정은 API 카트를 이용한 생화학적 특성 분석 및 PCR을 이용한 16S rDNA의 증폭 및 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종 선발 균주를 동정하였다.
상기 세 종의 프로테아제 활성 균주 탐색 결과 및 히스타민 분해 균주 탐색 결과를 각각 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
시료 프로테아제(d = mm)
S#12 13
S#13 14
S#14 15
시료 히스타민(ppm) 감소율(%)
배양 전 70.80 -
S#12 48.56 31.41
S#13 47.27 33.23
S#14 44.18 37.60
실시예 2: 고상발효 테스트를 통한 프로테아제 활성 및 히스타민 분해능의 확인
본 발명에 대한 프로테아제 활성은 카세인(20mM Tris-HCl 버퍼 내 0.7%, pH 8.0)을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신(tyrosine)을 폴린(Folin)법[Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4 101, 1978]으로 측정하였고, 효소 1U(unit)는 분당 1μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다.
한편, 히스타민 분해 활성은 이온 교환 컬럼(Ion-exchange column)에 히스타민만을 특이적으로 정제하여 발색 반응을 통해 히스타민을 분석하는 방법을 사용하였다. 즉, 어분 2g을 70% 이소프로파놀(isopropanol) 20㎖ 에 현탁하여 와트만(Whatman) NO. 1 필터로 여과 한다. 현탁액 200㎕를 이온 교환 컬럼에 주입한 후, 워싱 버퍼(washing buffer)로 3㎖씩 2회 흘려준다. 이온 교환 컬럼에서의 히스타민의 분리는 일루션 버퍼(elution buffer) 1㎖을 적절히 나누어 흘려서 히스타민 정제액을 회수한다. 정제된 히스타민 200㎕와 색 시약(color reagent) 50㎕를 반응시켜 마이크로티터 플레이트 리더(microtiter plate reader) 450 nm에서 흡광도를 측정한다.
고상 발효를 위한 조건은 실험실 조건에서 100g의 어분 원료를 5N 가성 소다를 이용하여 pH를 7.0으로 보정하고 초기 수분 함량을 40%로 설정하고 48시간 발효를 통해 효소 활성 및 히스타민 분해 정도를 측정하였다.
고상발효 테스트를 통해 어분품질의 변화를 평가하고 단백질 분해효소 및 히스타민 함량의 분석을 한 결과 세가지 후보 균주인 GB-S12, 13 및 14의 프로테아제 활성은 각각 181, 185, 210 U/g으로 나타났고 히스타민 분해능은 각각 31, 33, 37%의 감소율을 보였다(표 3).
Treatments Microbes
(log cfu/g)		 Protease activity
(U/g)		 Histamine (ppm),
(Reduction rate, %)
Fishmeal - - 70.80 (0)
GB-S12 7.64 181 48.56 (31.41)
GB-S13 7.53 185 47.27 (33.23)
GB-S14 8.17 210 44.18 (37.60)
실시예 3: 발효조건 확립을 위한 종균 준비
상기 실시예 1에서 분리한 균주인 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S12(KCCM11001P), S13(KCCM11002P), S14(KCCM11003P)중 프로테아제(protease) 활성이 가장 좋은 GB-S14(KCCM11003P)를 LB broth (BD, USA)를 이용하여 37℃, 200rpm의 조건으로 12시간 동안 진탕 배양하여 고상 발효를 위한 종균으로 사용하였다.
실시예 4: 수분 함량에 따른 어분 발효 특성
고상 발효의 최적 조건을 탐색하기 위해 세 가지 후보 균주 중 GB-S14 균주로 수분 (30, 35, 40, 45, 50%)을 달리하여 최적 발효조 건을 탐색하였다.
원료의 수분 함량에 따른 선발균주의 단백질 분해효소 활성을 측정한 결과 수분 함량 40%일 때 단백질 분해 효소 활성이 207.7 U/g이었으며, 수분 함량이 높아질수록 단백질 분해 활성이 약간 낮아지는 경향을 보였으나 180 U/g 이상을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 수분함량이 많은 상황에서의 최적 발효시간과의 상관관계가 있다고 볼 수 있으며, 수분 함량이 높은 상황에서는 최적 발효시간을 줄일 수 있을 것으로 판단된다. 그렇지만, 현실적으로 어분의 수분 함량을 높일 경우 어분 원료의 뭉침 현상이 심해져 발효 전처리 작업등 작업상에 상당한 제약요인으로 작용하게 되므로 수분함량이 최소인 상황에서 최적의 발효 조건을 찾는 것이 중요하다. 따라서 초기 수분함량이 40~45%인 것이 바람직하다.
조단백질 함량 증가는 수분함량 40%의 처리구에서 가장 높은 1.7% (10% 수분함량기준)의 증가를 보였으며, 수분 균 수 측면에서도 수분 함량이 40% 이상일 경우 108 cfu/g 이상의 균수를 보여 수분함량 40%가 어분발효를 위한 최적의 수분함량인 것으로 확인되었다 (표 5).
수분 함량에 따른 균주 GB - S14 의 어분 발효 특성 조사
수분 조건1 ) GB-S14
균수
(log(cfu/g))		 프로테아제 활성 (U/g) 조단백질2 )
(%)
어분 원료 0.00 58.30
30% 6.89 121.5 58.32
35% 7.72 148.9 58.81
40% 8.17 207.7 59.98
45% 8.71 187.7 59.46
50% 8.79 184.1 59.77
1) 배양 온도 35℃, pH 7.0으로 고정
2) 발효물의 수분을 10%로 하여 계산했을 때의 조단백질 함량
실시예 5: 발효 온도에 따른 어분 발효 특성
고상 발효의 최적 조건을 탐색하기 위해 GB-S14 균주로 온도 (20, 25, 30, 35, 40, 45℃)를 달리하여 최적 발효조건을 탐색하였다.
초기 수분 함량을 40%로 설정하고 발효온도를 20~45℃로 달리하여 48시간 발효한 결과 발효 온도가 30℃이상에서는 모두 108 cfu/g 이상의 균수를 나타내어 발효에는 문제가 없는 것으로 판단되었으며, 프로테아제의 활성이 40℃ 이상일 때부터 감소하기 시작하므로 40℃ 미만의 온도인 것이 바람직하다. 단백질 분해효소 활성 측면에서는 35℃에서의 발효샘플에서 가장 높은 198U/g의 활성을 나타내었으며, 조단백질 함량 증가도 약 2%의 가장 높은 증가율을 보여 최적의 발효온도는 35℃인 것으로 확인되었다 (표 5).
발효온도에 따른 균주 GB - S14 의 어분 발효 특성 조사
온도 조건1 ) GB-S14
균수
(log(cfu/g))		 프로테아제 활성 (U/g) 조단백질2 )
(%)
어분 원료 0.00 58.30
20℃ 6.51 112.1 58.47
25℃ 7.52 121.0 58.45
30℃ 8.45 135.5 58.62
35℃ 8.88 198.8 60.28
40℃ 8.62 182.1 58.69
45℃ 8.68 164.8 58.88
1) 배양 시 수분 함량 40%, pH 7.0으로 고정
2) 발효물의 수분을 10%로 하여 계산했을 때의 조단백질 함량
실시예 6: 초기 배지 pH 에 따른 어분 발효 특성
고상 발효의 최적 조건을 탐색하기 위해 GB-S14 균주로 pH (pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0)을 달리하여 최적 발효조건을 탐색하였다.
초기 pH에 따른 영향을 조사하기 위해 수분 함량을 40%, 발효 온도를 35℃로 세팅한 후 pH를 5 ~ 9로 달리하여 발효 테스트를 실시한 결과 중성 pH인 pH 6~8범위에서는 108cfu/g 이상의 균수를 나타내어 성장에는 문제가 없는 것으로 판단되었다. 그렇지만, 단백질 분해 효소활성 측면에서 pH 6.0 및 7.0에서 212 및 221 U/g의 unit를 각각 나타내었다. 조단백질 함량 증가는 pH 7.0에서 1.3%의 증가를 보여 최적의 pH 조건은 중성인 pH 7.0인 것으로 확인되었다 (표 6).
초기 배지 pH 에 따른 균주 GB - S14 의 어분 발효 양상
pH 조건1 ) GB-S14
균수
(log(cfu/g))		 프로테아제 활성 (U/g) 조단백질2 )
(%)
어분 원료 0.00 58.30
5.0 6.94 130.4 58.27
6.0 8.69 212.1 59.55
7.0 8.97 221.4 59.68
8.0 8.18 184.1 58.42
9.0 6.45 111.5 58.30
1) 배양 온도 35℃, 수분 함량 40% 로 고정함
2) 발효물의 수분을 10%로 하여 계산했을 때의 조단백질 함량
실시예 7: 발효 시간에 따른 어분 발효 특성
고상 발효의 최적 조건을 탐색하기 위해 GB-S14 균주로 발효 시간 (0, 12, 24, 36, 48, 60, 72시간)을 달리하여 최적 발효조건을 탐색하였다.
최적의 배양조건에서 배양시간에 따른 영향을 보기 위해 발효 시간 별 발효를 실시하였다. 총 발효시간을 72시간으로 하고 12시간마다 샘플링하여 효소활성 및 조단백질 변화를 조사하였다. 균 수는 24시간 발효에서 108cfu/g 이상으로 증가하였으며, 단백질 분해효소 활성은 36시간부터 200U/g이상의 효소활성을 보여 최소 36시간의 발효시간을 필요로 하는 것으로 확인되었으며, 조단백질 측면에서는 48시간 이후부터 큰 변화가 없는 것으로 확인되어 어분발효를 위한 최적 발효시간을 48시간으로 설정하였다 (표 7).
배양시간에 따른 분리 균주 B. subtilis GB - S14 의 어분 발효 양상
배양 시간1 )
(Hrs)		 GB-S14
균수
(log(cfu/g))		 프로테아제 활성 (U/g) 조단백질2 )
(%)
0 6.04 0.00 58.30
12 7.11 64.1 58.27
24 8.18 180.4 58.55
36 8.24 212.1 59.28
48 8.32 221.4 59.42
60 8.48 214.1 59.30
72 8.12 211.5 59.45
1) 배양 온도 35℃, 수분 함량 40% 로 고정함
2) 발효물의 수분을 10%로 하여 계산했을 때의 조단백질 함량
실험결과 어분 발효를 위한 최적 발효조건은 초기 원료어분의 수분 함량 40%, 발효 온도는 35℃, 초기 pH는 7.0, 총 발효 시간 48시간임을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 고상발효를 통한 어분의 펩타이드화
고상 발효는 어분원료 100g을 준비하여 원료의 pH를 5N NaOH를 첨가하여 7.0으로 보정한 후 초기 수분함량을 40%로 보정하기 위한 적정 수분을 첨가한 후 121℃에서 30분간 증자한 후, 실온으로 30도까지 냉각한 다음 냉각된 원료에 준비된 바실러스(B. subtilis)GB-S14 종균을 1.2 x 106cfu/g 이상이 되게 접종하였다. 발효용 트레이(tray)에서 접종된 어분은 발효실 내부 온도를 35℃로 조절하여 48시간 동안 발효하였다. 발효시간 별 샘플을 취해 발효 양상을 관찰하였고, 48시간 후 60℃에서의 건조과정을 거쳐 시료로 활용하였다. 발효의 확인을 위해 HPLC와 브래드포드(Bradford)를 이용해 펩타이드화 정도를 확인하였다.
HPLC는 Agilent사의 HPLC 1200 시리즈(Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, 디텍터(detector)는 UV-Visible detection (HP-1200series), 220nm, 컬럼은 TSKgel G2000SWXL(Toso사, 7.8mm x 30cm)를 사용했다. 오븐 온도는 25?이고, 총 러닝 시간은 60분 이었다. 이동 상(Mobile phase)의 경우는 A용매는 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)을 함유한 물을 사용하고 B용매는 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic aicd)을 함유한 아세토니트릴(acetonitrile)을 30분까지 0%~30%로 증가 시킨 뒤, 30%로 유지시켜 흘려주었다. 유속(Flow rate)은 0.3ml/min으로 하였고, 주입량(injection size)은 20℃로 하였다.
HPLC 분석의 경우 고분자 물질의 피크가 먼저 나타나고 시간이 지남에 따라 저분자 물질의 피크가 나타나도록 사이즈 배제 컬럼(size exclusion column)을 사용하였다. 발효 어분의 경우 효소 처리와 매우 흡사한 초기의 고분자 물질이 사라지고 후기의 저분자 물질이 증가하는 패턴을 확인하여 발효를 통한 발효 어분의 단백질이 저분자 펩타이드 형태로 분해된 것으로 판단할 수 있다 (도 1).
펩타이드화 정도는 펩타이드의 기준을 30kDa이하의 저분자 펩타이드로 정의할 때, 막 필터(membrane filter)로 단백질 분획(fraction)을 분리한 후 브래드포드(Bradford) 법으로 단백질을 정량한 결과 원료의 경우 펩타이드 함량이 41%인 반면 발효어분의 펩타이드 함량은 74%로 30%이상의 개선효과를 확인할 수 있었다. 그 결과를 하기 표 8 및 도 2에 나타냈으며, 이 때 대조구는 발효 전 상태를 의미하고, 발효 어분은 발효 과정을 거친 후의 어분을 나타내는 것이며, 고급 어분은 Biocp®로 획득한 칠레산 어류를 가수분해한 단백질원료이다.
발효어분의 펩타이드 함량 비교
Fraction　 펩타이드 함량(%)
대조구 발효어분 고급어분
30kDa 이상 59 26 18
10~30kDa 24 17 9
10kDa 이하 17 57 73
원료 어분에 비해 저분자 펩타이드 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터 발효공정을 통해 단백질 분자들이 저분자 펩타이드 형태로 전환되어 저급어분의 고품질화 측면에서 우수한 품질개선 효과가 있는 것으로 판단된다.
실시예 9: 인비트로 ( In vitro ) 소화율 평가
인비트로 어분 품질 비교분석을 위해 Biosen(1997)의 방법을 통한 소화율 분석방법을 확립을 완료하였다. 분석과정은 도 3에 나타내었다. 본 실험 방법을 이용하여 어분원료 및 본 발명의 어분 펩타이드의 소화율을 비교함으로서 소화율 개선 정도를 평가하였으며, 인티트로 소화율 평가를 통한 발효어분의 소화율 개선효과를 원료 어분과 비교하여 도 4에 나타내었다.
인비트로 소화율 평가에서 원료어분의 가수 분해율이 48% 정도인 반면, 발효어분은 54%로 소화율이 증가한 것을 확인 할 수 있었다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11003P 20091010
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Claims (8)

  1. 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB-S14(KCCM 11003P) 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 발효는 고상 발효인 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 발효는 수분 함량 35~45 중량%에서 수행되는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 발효는 30℃ 이상 40℃ 미만의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 발효는 pH 6.0 내지 8.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 발효는 36 시간 내지 60시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
KR1020110101252A 2011-10-05 2011-10-05 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｇｂ－ｓ14 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법 KR101366577B1 (ko)

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