KR101009936B1 - 히스타민 분해능이 우수한 락토바실러스 에시도필러스 ｇｂ-ｌｃ２ 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법 - Google Patents

히스타민 분해능이 우수한 락토바실러스 에시도필러스 ｇｂ-ｌｃ２ 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히스타민 분해능이 우수한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) GB-LC2(KCCM 10671) 균주 및 상기 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소 된 어분의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 어분 제조방법을 이용하여 경제적으로 어분을 발효함으로써 기존 어분보다 우수한 아미노산 조성을 확보하여 사료회사 및 양축가에 저렴하면서 안전한 단백질원을 제공할 수 있으며, 발효과정 중 제한요소인 히스타민과 같은 알레르기성 아민을 제거하고, 발효 과정 중 고분자의 단백질이 저분자의 펩타이드로 분해되어 어린 일령의 가축에 공급할 수 있는 안전한 고급 발효사료의 제공이 가능하다.

Description

히스타민 분해능이 우수한 락토바실러스 에시도필러스 ＧＢ-ＬＣ２ 균주 및 이를 이용한 히스타민이 감소된 어분의 제조방법{Lactobacillus acidophilus GB-LC2 strain having improved ability of decomposing histamine, and process for producing fishmeal having decreased content of histamine}
본 발명은 신규한 바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis) GB-F2 혹은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) GB-LC2를 이용하여 히스타민이 저감 된 고급 발효 어분의 가공방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis) GB-F2 혹은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) GB-LC2 균주를 저온 침지 한 저급 어분 배지에 접종, 발효하여 어분의 단백질을 펩타이드로 전환하고 히스타민을 감소시킨 고급 발효어분 제조 방법과 상기 고급 어분 펩타이드를 함유하는 가축용 사료에 관한 것이다.
단백질 공급원으로 제공되는 어분은 식물성 단백질인 곡물류보다 양적, 질적으로 우수한 단백질을 함유하여 각종 동물의 사료 생산에 필수적인 첨가제로 널리 사용되고 있지만, 어분 가공과정 중 이루어지는 과도한 열처리, 저장 기간 또는 보관 방법 등에 의해 영양소 이용률이 저하되고, 아민류의 물질이 생성되어 어분의 품질이 크게 저하되는 문제점을 가지고 있다. 특히 국내산 어분의 경우 어분 제조를 위한 생산 시설이 영세하고 인간이 섭취하는 가식 부분을 제외한 잔여물을 원료로 하여 제품을 생산하기 때문에 어분의 품질이 일정하지 않으며, 어류의 어획 지역과 어종에 따라서도 품질이 크게 달라질 수 있는 문제가 있다.
특히 우수한 단백질 공급원인 어분을 사용하는 경우의 가장 큰 문제점은 어분이 생체아민(biogenic amine)류 특히, 히스타민과 같은 알레르기 유발 물질을 다량 함유하고 있어 첨가량에 제약이 따른다는 점이다. 히스타민은 생선류에서 특히 문제가 되는 독소로서 등 푸른 생선들은 히스티딘이라는 아미노산을 대량 함유하고 있으며, 생선이 죽으면 세균작용에 의하여 이 물질이 히스타민으로 변하여 알레르기를 일으키게 된다. 식품에서 이러한 히스타민은 독소로 관리되고 있으며 인간이 히스타민을 소량 섭취한 경우는 위산 분비를 촉진하는 작용을 하지만, 섭취량이 많아지면 독성을 나타낸다(Taylor, 1986). 이는 소화관 내에 존재하는 디아민 옥시다제(diamine oxidase, DAO) 및 히스타민 메틸트랜스퍼라제(histamine methyltransferase, HMT)와 같은 효소들에 의해 소량의 히스타민은 독성이 없는 물질로 분해되지만, 효소가 분해할 수 있는 한계를 초과하는 경우 히스타민이 혈관으로 들어가 독성을 유발하게 된다. 이에 식품국(National Food Authority, NFA)에서는 호주 식품 표준 코드(Australian Food Standards Code, 1995)에 생선 및 생선 가공물에 포함될 수 있는 히스타민의 양을 200mg/kg이하로 규제하고 있으며 미국공인 분석화학회(Association of official agricultural chemists(A.O.A.C), 15판, 1990)에 의하면 히스타민 양이 100mg/kg 이상인 경우에는 저장 및 가공 공정상에 문제가 있음을 개시하고 있다.
한편, 히스타민 함량은 어분의 등급을 결정할 때 고급, 중급, 저급 어분을 구분하는 기준으로도 사용되고 있으며, 일반적으로 사료로 사용되는 어분 내의 히스타민 함량은 약 1000mg/kg 정도이며 저급 어분의 경우에는 히스타민 함량을 보증하지 않는다(1000mg/kg 이상). 하지만 고급 어분의 경우에는 500mg/kg 이하로 각 제조사별로 보증되고 있다. 어분의 히스타민 함량을 감소하기 위한 방안으로써 예를 들어, 가수분해 어분의 경우는 특정 효소를 이용하여 생선의 가공 공정에서 나온 부산물을 가수분해하여 제조되는 것으로 70 중량 %이상의 높은 단백질 함량을 가진다. 그러나, 효소 처리에 사용되는 비용 부담이 크며, 최종 제품에서 히스타민 등의 아민류의 완전한 분해를 보장할 수 없다.
따라서, 알레르기를 유발하는 히스타민이 저감 된 어분의 제조를 위한 경제적인 제조방법이 요구되며, 이렇게 생산된 어분의 단백질 자원으로서의 이용효율을 높여 단백질 효율 극대화를 위한 고급 발효 어분 제조기술의 구축이 요구된다.
이에 따라, 본 발명에서는 고체 발효 기술을 이용하여 어분의 소화율을 증대시키고 사용량을 제한하는 요소를 제거함으로써 고품질의 고급 단백질 공급원으로서의 어분 사용을 극대화할 수 있는 대량 생산 기술을 제공한다.
이에, 본 발명의 한 측면은 어분의 발효에 이용할 수 있는 히스타민 분해능이 우수한 균주를 제공하는 것이다.
이에 본 발명의 또 다른 측면은 히스타민 분해능이 우수한 균주를 이용한 히스타민이 감소 된 어분의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면 히스타민 분해능이 우수한 것을 특징으로 하는 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) GB-F2(KCCM 10874) 및 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) GB-LC2(KCCM 10671) 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) GB-F2 (KCCM 10874) 또는 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) GB-LC2(KCCM 10671) 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소 된 어분의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 의한 어분 제조방법을 이용하여 경제적으로 어분을 발효함으로써 기존 어분보다 우수한 아미노산 조성을 확보하여 사료회사 및 양축가에 저렴하면서 안전한 단백질원을 제공할 수 있다. 또한, 발효과정 중 제한요소인 히스타민과 같은 알레르기성 아민을 제거하고, 미생물이 생산하는 여러 효소를 이용함으로써 효소의 첨가비용을 절감할 수 있으며, 발효 과정 중 고분자의 단백질이 저분자의 펩타이드로 분해되어 수산 제품 가공 시 버려지는 부산물을 효율적으로 이용하고 품질의 균일성 확보 및 국내 저급 어분의 고급화를 추진할 수 있을 것이다.
도 1은 어분에 포함된 알레르기성 아민류를 분해하는 우수한 능력을 가진 미생물 균주를 선발하기 위한 모식도를 나타낸다.
도 2 는 본 발명에 의한 분리 균주들의 고체 발효 시간에 따른 어분 내 히스타민 분해능을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 발효 어분과 시판되는 최고급 어분의 펩타이드를 비교한 것이다. 레인 1은 크기 마커, 레인 2는 발효 어분(L.acidophilus GB-LC2), 레인 3은 시판되는 최고급 어분(BIO-CP), 그리고 레인 4는 저급 어분 원료(국내산)를 나타낸다.
본 발명에서는 히스타민과 같은 알레르기성 아민류의 분해능이 우수한 균주가 제공되며, 이러한 균주의 선별 방법은 도 1에 도시된 바와 같다. 즉, 어류 및 어패류의 젓갈이나 발효된 과일 샘플에서 무작위로 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.) 진핵 세포류 균주들을 무작위로 선별하여, 단일 탄소원으로 히스타민이 첨가된 최소 배지가 들어있는 96 딥 웰(deep well)에서 배양한다. 배양 후 배양액에서 히스타민 분해능이 우수한 균주들을 1차적으로 선발하고 상기 동일한 최소 배지가 들어있는 플라스크에서 진탕 배양하여 히스타민 분해능이 우수한 균주들을 2차 선발한다. 본 발명에 의해 제조된 제품은 생균제이므로 안정성이 보장된 균주를 사용해야 한다. 따라서 2차 선발된 균주가 GRAS(Generally Recognized as safe) 균주인지 API 키트(50CHB, 50CHE)를 이용하여 생화학적 특성의 분석을 통해 균주를 동정하고, 동시에 고체 어분 발효를 통해 히스타민 감소율을 조사한다. API 키트 동정 결과를 토대로 GRAS이면서 히스타민 분해활성이 높은 균주를 최종 균주로 선발하고 16s rDNA 서열 분석을 통해 최종적으로 동정한다. 서열목록 1은 본 발명에 의한 분리 균주인 바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis) GB-F2(KCCM 10874P)의 유전자 염기서열 분석 결과 상동율 97%인 것을 나타낸다. 서열목록 2는 본 발명에 의한 분리 균주인 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) GB-LC2(KCCM 10671P)의 유전자 염기서열 분석 결과 상동율 95%인 것을 나타낸다.
상기와 같이 선별한 결과 히스타민 분해능이 우수한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) GB-F2(KCCM 10874P) 및 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) GB-LC2(KCCM 10671P) 균주를 획득하여, 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하였다. 상기 분리된 신규 균주들은 동종의 균주들에 비해 히스타민을 분해하는 능력이 탁월하며, 어패류 젓갈에서 분리한 균주이므로 내염성의 특징도 가지고 있어서 어분 발효에 적합하다. 본 발명에 의한 균주가 공지의 균주에 비해 균체당 높은 히스타민 감소율을 나타내는 것을 표 1에서 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 상기 균주 중 어느 하나를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소 된 어분의 제조방법이 제공되며, 어분에 첨가되는 상기 균주의 양은 발효 시작 전에 106 cfu/g 내지 107 cfu/g의 양으로 접종하는 것이 바람직하며, 106 cfu/g 미만인 경우 발효 시간이 길어져 대량 생산 공정에 부적합한 경향이 있으며, 107 cfu/g 이상 접종할 경우에는 발효 시간은 단축되지만 히스타민을 충분히 분해하지 못하는 경향이 있다. 가장 바람직하게는 약 1.2 X 106 cfu/g이 되도록 접종한다.
본 발명의 균주를 첨가한 어분을 발효하기 위한 바람직한 발효 조건은 표2에 나타난 바와 같다.
수분 함량은 35 ~ 45중량%인 것이 바람직하며, 수분 함량이 35 중량 % 미만인 경우에는 발효가 충분히 되지 않는 경향이 있으며, 45 중량 %를 초과하는 경우에는 어분 원료의 뭉침 현상이 발생 되어 대량 생산 공정에서 이송라인의 막힘 또는 오염 문제가 발생할 수 있다. 가장 바람직한 수분 함량은 40 중량 %이다. 표 2에서는 배양 온도를 35℃, pH를 7.0으로 고정한 경우 수분 함량 변화가 미치는 영향을 나타낸다.
발효 온도는 30℃ 내지 40℃인 것이 바람직하며, 발효 온도가 30℃ 미만인 경우에는 히스타민 분해능이 저감되거나 곰팡이에 의한 오염이 발생할 수 있으며, 40℃를 초과하는 경우에는 균의 생장이 억제되는 경향이 있다. 가장 바람직한 온도는 35℃이다. 표 2에서는 수분 함량을 40 중량 %, pH를 7.0으로 고정한 경우 온도의 변화가 미치는 영향을 나타낸다.
발효 시 pH는 6.0 내지 8.0인 것이 바람직하며, pH가 6.0 미만인 경우 균의 생장이 억제되고 히스타민 분해능이 저감되는 경향이 있으며, 8.0 을 초과하는 경우에는 과량의 NaOH가 첨가되는바 생산 공정 비가 상승하고 균의 생장이 저해되는 경향이 있다. 발효 시 pH는 7.0인 것이 가장 바람직하다. 표 2에서는 배양 온도를 35℃, 수분 함량을 40 중량%로 고정한 경우 pH 변화가 미치는 영향을 나타낸다.
또한, 본 발명의 신규한 바실러스 및 락토바실러스의 경우, 발효 시작 약 24시간 후부터 히스타민을 분해하기 시작하며, 약 40 시간 이후부터는 분해율의 증가가 크지 않으며 72시간 이후에는 분해율의 변화가 매우 적기 때문에 최소 약 40 시간 내지 최대 약 72 시간 동안 발효를 수행하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 72시간 동안 발효한다.
나아가, 본 발명의 균주를 이용한 어분의 발효 시에 곡물 배지를 추가하는 경우 발효 효과가 향상되는 경향이 있으며, 특히 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 대두박을 첨가한 경우에서는 어분의 중량 대비 약 20 중량 % ~ 25 중량 % 첨가 시에 바실러스와 락토바실러스 처리구 모두에서 균에 의한 히스타민 감소 효과가 가장 컸으며, 소맥피를 첨가한 경우에서는 어분의 중량 대비 약 20 중량 % ~25% 중량 첨가 시에 바실러스의 처리구에서만 균에 의한 히스타민 감소효과가 있었다. 대두박 또는 소맥피의 첨가량이 20 중량% 미만이거나 25%를 초과하는 경우에는 균에 의한 히스타민의 감소율이 저하되는 경향이 있다.
상기에서 첨가될 수 있는 대두박은 시중에서 구할 수 있는 어떠한 대두박을 이용할 수 있다. 바람직한 대두박의 입자도는 약 600~800 마이크론이며, 수분은 약 12 중량 %이하, 조단백질 함량은 약 46~47 중량 %인 것을 사용할 수 있다. 상기에서 첨가되는 대두박의 양은 어분을 포함한 최종 총 질량을 기준으로 20-50 중량 %를 첨가하는 것이 바람직하며, 첨가량이 20 중량 % 미만인 경우 및 25 중량 %를 초과하는 경우에는 균에 의한 히스타민 분해율이 저감되는 경향이 있다.
또한, 상기에서 첨가될 수 있는 소맥피는 시중에서 구할 수 있는 어떠한 소맥피를 이용할 수 있으며, 예를 들어 수분 14중량 %이하, 조섬유 12 중량 %이하, 조단백질 13 중량% 이상의 소맥피를 사용할 수 있다. 상기에서 첨가되는 소맥피의 양은 어분을 포함한 최종 총 질량을 기준으로 20-50 중량%를 첨가하는 것이 바람직하며, 첨가량이 20 중량 % 미만인 경우 및 25 중량 %를 초과하는 경우에는 균에 의한 히스타민 분해율이 저감되는 경향이 있다.
상기와 같이 곡물을 첨가하는 경우, 소맥피 또는 대두박 등의 곡물의 양을 어분의 최종무게 기준으로 상기와 같이 결정하고 발효 전에 첨가하여 수분이 40 중량 %가 되게 가수 한 후 30분간 침지하고 121도에서 30분간 멸균하여 배지로 사용한다. 상기에서 사용되는 대두박과 소맥피는 그래뉼과 같은 입자를 갖는 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 어분은 히스타민의 함량이 감소되며, 균주에 의한 발효 시에 고분자인 단백질이 저분자인 펩타이드로 전환되어 소화가 용이하므로 어린 일령의 가축에도 공급할 수 있고, 상기 어분은 백색어분, 갈색 어분 등을 포함하는 당업계에 잘 알려진 어떠한 어분에 대해서도 적용할 수 있으며, 이에 따라 제조된 히스타민이 감소된 어분은 단독으로 또는 어떠한 다른 사료와 함께 혼합하여 가축용 사료의 단백질 공급원으로 이용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위를 하기 실시예로 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1: 우수한 히스타민 분해능을 갖는 미생물의 선발
어류 및 어패류의 젓갈에서 샘플을 취해 LB(Luria-Bertani) Miller(BD, USA)에서는 바실러스류를, PDA(Potato dextrose agar)(BD, USA)에서는 진핵세포류를, MRS agar(BD, USA)에서는 유산균류를 분리하기 위해 이용하였다. 그 후 히스타민 분해능을 가진 균주를 탐색하기 위한 배지에서 히스타민 분해능이 우수한 균주를 선발하였으며, 상기 배지는 글루코스 1g/L, 효모 추출물 3g/L, 박토 펩톤(bacto peptone) 3g/L, NaCl 5g/L, 트윈(Tween) 80 1g/L, MgSO4 0.25g/L, MnSO4 0.038g/L, FeSO4 0.08g/L, pH 7.0로 보정한다. 상기 배지에는, 플라스크에서 배양하는 경우에는 히스타민의 최종 농도가 300ppm이 되도록 첨가하며, 96 딥웰(deep well)에서 배양하는 경우에는 히스타민의 최종 농도가 30ppm이 되도록 첨가한다.
히스타민 분해능을 가진 균주 선발에 대한 보다 상세한 선발 방법은 [도 1]에 도시된 바와 같이, 어류 및 어패류의 젓갈이나 발효된 과일 샘플에서 무작위로 락토바시러스 종(Lactobacillus spp.) 바실러스 종(Bacillus spp.) 진핵 세포류의 균주들을 무작위로 선별하여 단일 탄소원으로 히스타민이 첨가된 최소 배지가 들어있는 96 딥 웰(deep well)에서 37℃, 200rpm, 48시간 동안 진탕 배양하였다. 96 딥 웰의 배양액에서 히스타민 분해능이 우수한 균주들을 1차적으로 선발하고 상기 동일한 최소 배지가 들어있는 플라스크에서 진탕 배양하여 단위 세포당 히스타민 분해능이 우수한 균주들을 2차 선발하였다. 본 발명에 의해 제조된 제품은 생균제이므로 안정성이 보장된 균주를 사용해야 한다. 따라서 2차 선발된 균주가 GRAS(Generally Recognized as safe) 균주인지 API kit(50CHB, 50CHE)를 이용하여 생화학적인 특성분석을 통해 균주 동정하고, 동시에 고체 어분 발효를 통해 히스타민 감소율을 조사하였다. 그 결과 최종 선발된 균주는 바실러스 종(Bacillus spp.), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.)이다 (표 1).
젓갈 및 발효된 과일에서 분리한 균주들의 히스타민 감소율
분리 균주 상동율1 )
(%)		 감소율
(중량 %)		 Specific degradation rate2 )
Bacillus licheniformis(KCCM11237)
B. subtilis(KCCM11881)		 99.9
99.9		 5.47
4..88		 1.95
1.22
Bacillus pumilus F1 99.9 9.58 3.52
B. subtilis / amyloliquefaciens P2 99.4 9.26 3.57
B. licheniformis F2(KCCM 10874) 91.0 10.99 3.82
B. subtilis / amyloliquefaciens F-3 94.9 6.89 2.42
L. acidophilus (KCTC3171)
L. platarum (KCCM11322)
L. acidophilus GB-LC2(KCCM 10671)		 99.9
99.9
98.7		 4.88
4.15
12.53		 0.66
0.58
3.77
L. brevis LC3 99.5 5.63 2.11
L. platarum LC4 98.6 9.35 2.29
1) 생화학적 특성을 이용한 균주 동정(API kit) 결과
2) Specific degradation rate= 히스타민 감소량(ppm)/ 배양 후 균수(log(CFU/g))
상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 분리 균주들은 KCCM또는 KCTC에서 분양되는 일반 균주들을 대조구로 하여 비교할 때 단위 균체당 히스타민 감소율이 높은 특징을 나타낸다.
실시예 2: 우수한 히스타민 분해능을 가진 균주를 이용한 어분의 발효 배양
균주의 고체 발효 조건을 결정하기 위해 초기 수분함량, 배양 온도 및 PH에 따른 조단백질 함량의 증가 및 히스타민 분해율을 조사하였다. 단백질 사료원에서 조단백질의 증가는 긍정적인 평가 대상이며, 1 중량 %의 조단백질 증가는 단백질 사료 원료에서 산업규모 생산량을 기준으로 판단하면 큰 장점이 된다. 일반적으로 고체 발효 시 단백질 함량이 증가하는데, 이는 미생물이 배지 내의 탄소원(일반적으로 탄수화물)을 이용하여 호흡을 통해 배지 내의 탄소를 CO2형태로 날려버려 상대적으로 어분 내의 조단백질 함량은 증가하게 된다. 이는 본 발명에서 발효에 의해 획득할 수 있는 유리한 효과 중 하나이다. 분리한 균주인 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) GB-F2는 LB broth(BD, USA)를 이용하고, 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) GB-LC는 MRS broth(BD, USA)를 이용하여 36℃, 200rpm의 조건으로 12시간 동안 진탕 배양하여 고체 발효를 위한 종균으로 사용하였으며, 이 때 균의 종류에 따라 최적 생장을 유도하도록 다른 배지를 사용하였다.
수분 함량의 결정을 위해 수분 함량이 8 중량 %인 원료 어분의 수분 함량을 30 중량 %, 35 중량 %, 40 중량 %, 45 중량 %, 50 중량 %로 각각 조절하며, 이때 pH는 1N가성소다를 적절히 혼합하여 7.0으로 보정한다. 수분 함량별로 어분 원료 300g을 스테인레스 스틸(stainless steel) 트레이에 담아 121℃에서 30분간 멸균한 후 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) F2 종균을 어분의 3 중량 %가 되게 접종하여(최종 어분 내 균 수 1.2 X 106 CFU/g), 35℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양물은 50℃ 건조기에서 수분 함량이 8 중량 %이하가 될 때까지 건조하여 최종 균 수, 조단백질 함량 및 히스타민 함량을 각각 분석하였다. 그 결과 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 35 중량 % 내지 45 중량 %의 수분 함량 범위가 바람직하며, 약 40 중량 %의 수분 함량이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
고체 발효 온도의 결정을 위해 초기 수분 함량을 40 중량 %로 고정하고, 배양 온도를 제외한 다른 조건은 상기와 동일하게 한 후 배양 온도를 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃로 달리하여 72시간의 발효 과정과 후속적인 50℃ 건조 과정을 거친 후 최종 균 수, 조단백질 함량 및 히스타민 함량을 각각 분석하였다. 그 결과 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 30 ℃ 내지 40 ℃의 배양 온도 범위가 가장 바람직하며, 약 35℃의 온도가 가장 바람직한 것으로 나타났다.
발효의 pH 결정을 위해 초기 수분 함량은 40 중량 %로 배양온도는 35℃ 고정하고 pH를 제외한 다른 조건은 상기와 동일하게 한 후 1N 가성소다를 적절히 첨가하여 pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0으로 보정한다. 그 결과 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 pH 6.0 ~8.0이 바람직하며, pH 7.0이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
상기 조건에 의한 발효는 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 최적의 발효 조건인 수분 40 중량 %, pH 7.0, 온도 35℃에서 신규한 균주들을 배양했을 때, 발효 시작 약 24시간 후부터 히스타민을 분해하기 시작하며, 약 40 시간 이후부터는 분해율의 증가가 크지 않으며 72시간 이후에는 분해율의 변화가 매우 적기 때문에, 최소 약 40 시간 내지 최대 약 72 시간 동안 발효를 수행하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 72시간 동안 발효한다.
본 실험에서 각 시료 샘플의 균 수는 도말 평판 배양법을 이용하여 산출하였으며, 히스타민 함량 분석은 비색법으로(r-biopharm kit) 확인하였고, 조단백질 함량 분석은 켈달 습식분석 방법으로 각각 분석하였다. 실험 결과인 균수는 신규 분리 균주의 수를 나타내며, 균수가 많을수록 히스타민의 분해율이 높았다. 히스타민 분해율은 초기 히스타민 양에 대한 잔존 히스타민 양의 퍼센트인 것을 나타내며, 분해율이 클수록 히스타민의 분해능이 뛰어난 조건을 의미한다.
수분, 온도, 및 pH에 따른 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) GB-F2와 락토바실러스 에시도필러스(L.acidophilus GB-LC2)의 어분 발효 양상
조건 바실러스 라이케니포미스
(B. licheniformis) GB-F2		 락토바실러스 에시도필러스
(L. acidophilus) GB-LC
균수
(log(cfu/g))		 히스타민
분해율
(중량 %)		 조단백질
(중량 %)1) 		균수
(log(cfu/g))		 히스타민
분해율
(중량 %)		 조단백질
(중량 %)
어분 원료 58.30 58.30
수분2 )
30 중량 % 6.89 12.44 58.32 7.73 19.77 58.30
35 중량 % 7.72 45.81 58.81 7.34 37.18 58.81
40 중량 % 8.88 46.84 60.28 9.11 48.88 59.88
45 중량 % 8.71 34.56 59.46 8.89 44.56 59.46
50 중량 % 8.79 33.88 59.77 8.88 41.44 59.77
온도3 )
20℃ 6.51 10.25 58.47 6.76 15.00 58.24
25℃ 7.52 24.34 58.45 8.94 30.34 58.55
30℃ 8.45 32.11 58.62 8.34 37.11 58.48
35℃ 8.88 46.84 60.28 9.11 48.88 59.88
40℃ 8.62 38.04 58.69 8.26 35.24 59.09
45℃ 8.68 35.74 58.88 6.43 5.11 58.28
pH4 )
5.0 6.94 9.77 58.27 8.83 36.99 59.56
6.0 8.69 32.26 59.55 8.84 36.26 59.65
7.0 8.88 46.84 60.28 9.11 48.88 59.88
8.0 8.18 46.34 58.42 8.04 45.34 58.30
9.0 6.45 5.11 58.30 6.28 4.77 58.27
1) 발효물의 수분을 10 중량 %로 하여 계산했을 때의 조단백질 함량 2) 배양 온도 35℃, pH 7.0으로 고정 3) 배양 시 수분 함량 40 중량 %, pH 7.0으로 고정 4) 배양 온도 35℃, 수분 함량 40 중량 % 로 고정함
실험 결과 상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) F-2 및 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) GB-LC2의 발효 조건은 수분 약40 중량 %, 배양 온도 약 35℃, 약 pH 7.0 일 때 균 수가 가장 많았으며, 히스타민 분해율과 조단백질의 함량이 최대였다.
실시예 3: 곡물 배지가 추가로 첨가된 어분의 발효 배양
바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) GB-F2와 락토바실러스 에시도필러스 GB-LC2를 이용한 어분 발효 시에 배양 온도는 35℃, pH는 7.0, 배양 시 수분 함량은 40 중량 %로 고정하고, 곡물을 첨가하지 않은 경우를 대조구로 하여 곡물배지를 추가한 경우의 결과를 살펴보았다. 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 대두박을 첨가한 경우에서는 20 중량 % 내지 25 중량% 첨가시에 바실러스와 락토바실러스 처리구에서 균에 의한 히스타민 감소 효과가 가장 컸으며, 소맥피를 첨가한 경우에서는 20 중량 % 내지 25 중량% 첨가 시에 바실러스의 처리구에서 균에 의한 히스타민 감소효과를 확인할 수 있었다 (표 3). 본 발명에서 사용된 대두박은 식용유 가공 후 부산 산물인 대두박으로, 수분 12 중량 %, 조단백질 함량은 46~47 중량 %인 것을 사용하였으며, 소맥피는 수분 15 중량 %이하, 조섬유 12 중량 %이하, 조회분 6 중량 %이하인 소맥피를 사용하였다.
사료 곡물 첨가에 따른 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis) GB-F2와 락토바실러스 에시도필러스 GB-LC2의 히스타민 분해능 비교.
히스타민 감소율 (중량 %)1)
발효조건 바실러스 라이케니포미스
(B. licheniformis) GB-F2		 락토바실러스 에시도필러스
(L. acidophilus) GB-LC
대조구 46.84 48.88
히스타민 총감소율
(중량 %)1 		희석에의한
감소율(중량 %)2 		균에 의한 감소율(중량 %)3 ) 총감소율
(중량 %)		 희석에의한
감소율(중량 %)		 균에 의한 감소율(중량 %)3
대두박
첨가구		 5 중량 % 49.04 2.34 46.70 50.12 2.44 47.68
10 중량 % 48.41 4.68 43.73 52.77 4.88 47.88
15%
중량%		 50.21 7.03 43.18 54.22 7.03 47.19
20 중량 % 58.20 9.37 48.83 61.99 9.78 52.21
25%
중량		 60.15 11.71 48.44 64.72 11.71 53.01
50 중량 % 66.74 23.42 43.32 67.08 24.44 42.64
소맥피
첨가구		 5 중량 % 48.44 2.34 46.10 49.75 2.44 47.31
10 중량 % 47.49 4.68 42.81 52.77 4.89 47.88
15%
중량%		 50.04 7.03 43.01 53.91 7.03 46.88
20 중량 % 58.80 9.37 49.43 56.88 9.78 47.10
25%
중량%		 60.7 11.71 48.99 58.92 11.71 47.21
50 중량 % 65.78 23.42 42.36 70.75 24.44 46.31
1)히스타민 감소율, 총감소율= 100-((발효어분의 히스타민 농도*100)/어분원료내의 히스타민 농도)
2)희석에 의한 감소율= 대조구의 히스타민 감소량*곡물첨가량(중량 %, w/w)
3)균에 의한 감소율= 총감소율-희석에 의한 감소율
실시예 4: 본 발명에 의한 발효 어분과 고급 어분의 효소 역가 , 히스타민, 그리고 펩타이드의 비교
본 발명의 히스타민 분해 균주로 발효한 어분과 현재 시판되는 최고급 어분(고급 어분의 기준은 주로 조단백질 함량 최소 70 중량 %이상, 히스타민 500ppm이하로 함(일반기준))의 특성을 비교하였다. 본 실험에서 사용한 최고급 어분 A는 BIO-CP(Chile)로 단백질 함량 70 중량 %를 보증하며 효소 처리하여 가수분해 한 어분이다.
하기 표에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 의한 발효 어분들은 최고급 어분 보다 더 낮은 히스타민 함량을 나타내었으며, 효소 활성은 더 높게 관찰되었다. 특히 프로테아제의 활성은 고분자 어분 단백질을 소화하기 쉬운 저분자 펩타이드로 전환하여 가축의 높은 소화율을 기대할 수 있으며, 하기 표4는 본 발명의 분리균에 의한 발효 어분의 특징을 나타낸다(표 4).
발효어분과 시판되는 최고급 어분의 비교
　 히스타민
(ppm)1) 		프로테아제 활성(U/g) 아밀라제 활성(U/g)
락토바실러스 에시도필러스
(L. acidophilus) GB-LC 발효샘플		 160.26 2.05 ± 0.49 11.01 ± 0 .08
바실러스 라이케니포미스
(B. licheniformis) GB-F2발효 샘플		 62.60 3.25 ± 0.35 7.63 ± 0.06
최고급 어분 A 556.89 1.05 ± 0.35 N.D2 )
1) 발효물의 수분을 10 중량 %로 하여 계산했을 때 히스타민 농도 2) N.D: 관찰되지 않음
또한 도 3의 SDS PAGE 분석 결과에서는 발효 어분이 최고급 어분과 동일한 저분자 펩타이드 위치를 나타내었다. 상기 결과들은 통상적으로 유통되는 저급 어분을 히스타민 분해 균주를 이용한 발효를 통해 최고급 어분과 비슷한 품질의 어분 펩타이드를 저렴하게 공급이 가능성을 뒷받침한다. 상기 실험에서 본 발명에 의한 발효 어분의 제조를 위해 사용되는 원료는 750원/kg, 최고급 어분 A의 경우 4000원/kg, 그리고 아사의 발효 어분은 2000원/kg인 것에 비추어, 본 발명에 의해 어분을 생산하는 경우 품질뿐만 아니라 가격에서도 경쟁력을 지니는 것을 확인할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 라이케니포미스 GB-F2 또는 락토바실러스 에시도필러스 GB-LC2로 발효 처리한 어분 제조방법은 효율적이면서 비용이 저렴한 펩타이드 가공방법이며, 양질의 저렴한 사료 원료를 공급할 수 있다. 또한 어분 원료에 높은 농도로 존재하는 알레르기 물질인 히스타민을 경제성을 유지하면서 효과적으로 감소시켜 안전한 단백질원을 제공할 수 있다.
본 발명의 어분 제조방법은 미생물을 이용한 발효에 의해 어분의 질적 개선 및 영양소 이용률 극대화하여 특히 어분 단백질의 저분자 펩타이드화를 통해 고급 단백질 원으로서 어분의 사료적 가치를 증대시킬 수 있으며, 따라서 양식용 사료 원료 등의 새로운 수요 창출을 유도할 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM10874P 20070709 한국미생물보존센터(국외) KCCM10671P 20050816
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Claims (5)

  1. 히스타민 분해능이 우수한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) GB-LC2(KCCM 10671) 균주.
  2. 제 1항의 균주를 어분에 첨가하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 균주는 106 cfu/g 내지 107 cfu/g 의 양으로 어분에 첨가되는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 발효는 수분 함량 35~45 중량 %, 온도 30~40℃, pH 6.0 내지 8.0에서, 40 시간 내지 72시간 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 어분에 대두박을 어분의 중량 대비 20 중량 % 내지 25 중량 % 의 양으로 혼합하여 발효하는 것을 특징으로 하는 히스타민이 감소된 어분의 제조방법.
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