KR101859006B1 - 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 뱀장어 고형오물에서 항균성을 갖는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균을 분리하고, Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물 자체와 미강을 혼합한 뒤, 1단발효 내지 3단발효의 발효과정을 거쳐서 유산발효사료 조성물을 제조함으로써 고형오물 자체를 사료화 시키는 과정에서 발생하는 악취를 저감시킬 수 있는 장점이 있으며, 유산균을 추가로 배양하여 사료 조성물을 제조하는 과정에서 첨가하는 과정을 생략할 수 있으므로 생산효율성을 증진시킬 수 있는 장점이 있고, 유산균이 지니는 항균성으로 인해 유산발효사료 조성물에 잡균이 번식하는 것을 억제하여 품질이 뛰어난 유산발효사료 조성물을 제조할 수 있는 장점이 있는 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법{LACTIC ACID FERMENTATION COMPOSITION WITH LACTIC ACID BACTERIA SEPARATED FORM THE ANGUILLA JAPONICA EXCREMENT, AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 뱀장어 고형오물에서 항균성을 갖는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균을 분리하고, Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물 자체와 미강을 혼합한 뒤, 1단발효 내지 3단발효의 유산발효과정을 거쳐서 제조되는 것을 특징으로 하는 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
최근 양식어류 또는 양식가축의 생산성향상을 위하여 많은 연구가 시작되고 있으며, 이에 따라 해수어류 또는 가축의 양식경영비의 절반이상을 차지하고 있는 사료의 양적인 면과 질적인 면에서 개선을 통한 품질이 뛰어난 사료의 개발이 활발히 진행되고 있고, 위생 문제나 환경오염의 우려가 없는 사료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그 중의 하나가 생균제를 이용한 유산발효사료에 관한 것이다. 생균제(probiotics)는 숙주의 장내 미생물 균형 향상과 같은 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물 첨가제를 말하며, 대표적인 생균제로 유산균을 들 수 있다. Probiotics는 그리스어로 ‘for life’를 뜻하며, Lilly와 Stillwell(1965)은 다른 숙주의 성장을 촉진하는 특정 미생물에 의해 생산되는 성장 촉진물로 정의하였고(Lilly DM and Stillwell RH. Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms, Science 147, 747-748 (1965)), Parker(1974)는 장내 미생물의 균형을 유지시키는 미생물과 그 대사물질로 정의하였다(Parker RB. The other half of the antibiotics story. Animal. Nutr. Health 29, 4-8 (1974)). Fuller(1989)는 숙주의 장내 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 유익한 효과를 갖는 살아있는 미생물로 정의하여 probiotics 개념을 확정하였다. Havenaar와 Huis in't Veld(1992)는 사람이나 동물에게 건조된 세포형태나 발효된 형태로 투여하여 숙주의 장내 균총의 특성을 개선하여 숙주에 유익한 작용을 하는 단독 또는 혼합 생균이라 정의하여 생균제의 범위를 확장시켰다(Havenaar R and Huis in't Veld JHJ. Probiotics: a general view. In: The Lactic Acid Bacteria, vol. 1: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. (Wood, B. J. B., ed.), pp 209~224, Chapman & Hall, New York, NY. (1992)). 생균제에 대한 정의는 계속해서 변화하고 있으나, 숙주에 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물을 보편적인 개념으로 하고 있다. 생균제로 가장 많이 사용되고 있는 미생물은 Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus 등과 같은 유산균이다.
유산균과 같은 생균제를 이용하여 제조된 사료로는 대한민국 등록특허 제10-0495864호에 자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품 및 동물사료용 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0541379호에 생균제를 첨가하여 발효시켜서 제조된 사료 첨가물 및 그 제조방법에 대해 개시되어 있다.
현재 우리나라 해산어류 양식은 1970년대부터 각종 어류에 대한 양식기술이 개발되면서 어종별 양식 생산량은 지금까지 지속적으로 증가하고 있으며, 국민의 단백질 식량산업으로 자리를 굳히고 있다. 또한, 우리국민의 식생활 패턴과 삼면이 바다인 우리나라의 입지적 여건으로 보아 수산물 생산에 있어 수요가 공급을 초과하고 있는 실정이다.
따라서, 유산균과 같은 생균제를 이용하여 사료의 품질을 증진시키는 것도 중요하지만, 해산여류 양식이 발전함에 따라 육상순환양식시스템에서 배출된 고형오물이 많이 발생하게 되었고, 발생된 고형오물을 자원화할 수 있는 방안에 대한 개발도 필요한 실정이다.
육상순환양식시스템에서 배출된 고형오물을 자원화하기 위하여 대한민국 등록특허 제10-1394837호에 수산물과 수산부산물을 이용한 친환경 사료 및 기능성 비료의 제조방법과 대한민국 공개특허 제10-2015-0054056호에 갈조류 부산물을 유효성분으로 포함하는 발효사료 등이 개시되어 있다.
그러나, 육상순환양식시스템에서 배출된 고형오물자체를 사료의 원료로 사용함으로써 육상순환양식시스템에서 배출된 폐기물인 고형오물을 환경친화적으로 처리할 수 있을 뿐만 아니라, 항균성 물질을 생성하는 유산균과 같은 생균제를 별도로 첨가하지 않고 고형오물 자체에 포함된 유산균을 통해 항균성이 뛰어난 유산발효사료 조성물을 제조하는 기술은 아직까지 개발되지 않았다.
대한민국 등록특허 제10-0495864호 대한민국 등록특허 제10-0541379호 대한민국 등록특허 제10-1394837호 대한민국 공개특허 제10-2015-0054056호
본 발명은 상술한 것과 같은 문제점을 해결하고, 필요한 기술을 제공하기 위하여 안출된 것으로서,
본 발명은 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균에 관한 것으로, 뱀장어 고형오물에서 항균성을 갖는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균을 분리하여 제공함에 목적이 있다.
또한, 본 발명은 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 발효사료 및 그 제조방법에 관한 것으로, Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물 자체와 미강을 혼합한 뒤, 1단발효 내지 3단발효의 발효과정을 거쳐서 유산발효사료 조성물을 제조함으로써 고형오물 자체를 사료화 시키는 과정에서 발생하는 악취를 저감시킬 수 있는 장점이 있으며, 유산균을 추가로 배양하여 사료 조성물을 제조하는 과정에서 첨가하는 과정을 생략할 수 있으므로 생산효율성을 증진시킬 수 있는 장점이 있고, 유산균이 지니는 항균성으로 인해 유산발효사료 조성물에 잡균이 번식하는 것을 억제하여 품질이 뛰어난 유산발효사료 조성물을 제조할 수 있는 장점이 있는 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물과 그 제조방법을 제공함에 다른 목적이 있다.
아울러, 본 발명은 뱀장어 고형오물 자체를 사료의 원료로 사용함으로써 육상순환양식시스템에서 배출된 폐기물인 고형오물을 환경친화적으로 처리할 수 있을 뿐만 아니라, 해삼과 같은 해양생물의 사료자원으로 이용할 수 있다는 장점이 있으며, 항균성 물질을 생성하는 유산균을 별도로 첨가하지 않고도 뱀장어 고형오물 자체에 포함된 유산균(Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균)을 통해 항균성이 뛰어난 유산발효사료 조성물을 제공함에 또 다른 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시형태로서,
본 발명의 실시형태는 뱀장어 고형오물에서 분리한 항균성을 갖는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 뱀장어 고형오물에서 분리한 항균성을 갖는 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물과 미강을 혼합한 뒤, 정치 발효시켜서 1단발효물을 제조하는 1단발효단계; 상기 1단발효단계에서 제조된 1단발효물과 2단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 2단발효물을 제조하는 2단발효단계; 상기 2단발효단계에서 제조된 2단발효물과 3단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 3단발효물을 제조하는 3단발효단계; 및 상기 3단발효단계에서 제조된 3단발효물을 열풍건조기를 이용하여 50 내지 80℃의 온도를 유지하면서 수분함량이 15% 이하가 되도록 건조시켜서 유산발효사료 조성물을 제조하는 건조단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 1단발효단계에서는, 뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 15 내지 30℃의 온도에서 3 내지 11일 동안 정치 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2단 발효단계에서는, 1단발효물과 2단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 2단발효단계의 2단종배양물은, 탈지대두박, 물 및 황국균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 배양하여 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 3단발효단계에서는, 2단발효물과 3단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 3단발효단계의 3단종배양물은, 탈지대두박, 물 및 NB(Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 전배양 한 고초균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 배양하여 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기의 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따라 뱀장어 고형오물에서 분리된 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균은 항균성이 뛰어난 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물은, Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물 자체와 미강을 혼합한 뒤, 1단발효 내지 3단발효의 발효과정을 거쳐서 유산발효사료 조성물을 제조함으로써 고형오물 자체를 사료화 시키는 과정에서 발생하는 악취를 저감시킬 수 있는 장점이 있으며, 유산균을 추가로 배양하여 사료 조성물을 제조하는 과정에서 첨가하는 과정을 생략할 수 있으므로 생산효율성을 증진시킬 수 있는 장점이 있고, 유산균이 지니는 항균성으로 인해 유산발효사료에 잡균이 번식하는 것을 억제하여 품질이 뛰어난 사료를 제조할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 뱀장어 고형오물 자체를 사료의 원료로 사용함으로써 육상순환양식시스템에서 배출된 폐기물인 고형오물을 환경친화적으로 처리할 수 있을 뿐만 아니라, 해삼과 같은 해양생물의 사료자원으로 이용할 수 있다는 장점이 있으며, 항균성 물질을 생성하는 유산균을 별도로 첨가하지 않고도 뱀장어 고형오물 자체에 포함된 유산균(Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균)을 통해 항균성이 뛰어난 유산발효사료 조성물을 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 M17-GL 배지에 배양된 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균을 나타내는 사진이다.
도 2는 BCP PCA 배지에 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균을 배양시킴으로써, yellow zone이 형성된 유산균 확인 배지를 나타내는 사진이다.
도 3은 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균의 16s rRNA sequencing 분석결과이다.
도 4는 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균의 16s rRNA sequencing 분석결과이다.
도 5는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)의 항균성 검증 시험 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 시험구 1 내지 4를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 7은 시험구 1 내지 4의 항균성 검증 시험 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시형태에 따른 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물의 제조방법을 공정 단계 별로 나타내는 순서도이다.
이하, 본원의 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명의 일 실시형태에 따른 뱀장어 고형오물에서 분리한 항균성을 갖는 유산균인 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균과, 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물에 대해 실시예를 들어 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 뱀장어 고형오물에서 분리한 항균성을 갖는 유산균과 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물은 후술하는 실시예에 의하여 보다 명확하게 이해될 수 있다.
[시료채취]
뱀장어 고형오물은 2015년 8월 충북 충주시 금가면 중부수산에서 육상양식 중인 뱀장어 양식조에 슬러지 상태로 침강된 것을 전용 수거기로 채취하여 미강과 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 후, 기밀성이 높은 비닐(PE)에 담아 실온에서 약 10일 동안 유산발효 시켰다. 유산발효된 발효물은 수분함량이 약 15% 이하가 되도록 건조시킨 후 실온에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
상기 미강은 벼에서 왕겨를 뽑고 난 다음 탈곡 후 탈피과장을 거친 현미를 백미로 도정하는 과정에서 발새오디는 고운 속겨를 말하며, 2015년 8월 경남 고성군 상리면 생명환경쌀에서 제공받아서 사용하였다.
[유산균 분리]
뱀장어 고형오물을 미강과 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 후, 기밀성이 높은 비닐(PE)에 담아 실온에서 약 3~11일 동안 유산발효 시킨 뒤, 유산발효된 발효물은 보관 중 미생물의 증식을 억제하기 위하여 수분함량이 약 15% 이하가 되도록 건조시킨다. 건조된 시료 1g과 멸균증류수 9㎖을 혼합하여 교반 후 M17-GL(M17 broth에 1% glucose와 1% lactose 첨가: Scharlau, European Union)배지에 도말하고 30℃에서 2일간 배양하여 형성된 콜로니로부터 2종의 유산균을 분리하였다. M17-GL 배지에 배양된 2종의 유산균은 도 1에 나타내었다.
[유산균 동정]
분리된 2종의 유산균을 BCP PCA 배지를 사용하여 30℃에서 배양시켜서 유산균을 확인하였으며, yellow zone이 형성된 유산균 확인 배지는 도 2에 나타내었다.
분리된 2종의 유산균은 유전자 상동성 분석을 위해 16s rRNA sequencing 분석을 실시하였다.
분석결과 1종은 상동성이 Pediococcus pentosaceus와 유사한 것으로 분석이 되었으며, 16s rRNA sequencing 분석결과를 토대로 Pediococcus pentosaceus SG-L1로 유산균을 동정하였다. 동정된 Pediococcus pentosaceus SG-L1 유산균은 한국미생물보존센터(KCCM : Korean Culture Center of Microorganisms)에 균주를 기탁하였으며, 유산균기탁번호(KCCM11680P)를 부여받았다.
또한, 분석결과 나머지 1종은 상동성이 PLactobacillus brevis와 유사한 것으로 분석이 되었으며, 16s rRNA sequencing 분석결과를 토대로 Lactobacillus brevis SG-S1으로 유산균을 동정하였다. 동정된 Lactobacillus brevis SG-S1으로 유산균은 한국미생물보존센터(KCCM : Korean Culture Center of Microorganisms)에 균주를 기탁하였으며, 유산균기탁번호(KCCM11679P)를 부여받았다.
Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)의 16s rRNA sequencing 분석결과는 도 3에 나타내었으며, Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)의 16s rRNA sequencing 분석결과는 도 4에 나타내었다.
[유산균의 항균성 검증 시험 - 1]
Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)의 항균성 검증 시험을 실시하였다.
Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)은 P. pentosaceus으로 표기하였으며, Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)은 L. brevis로 표기하였다.
액상배지(M17GL)에 배양한 균액의 농도가 약 108cfu/㎖인 P. pentosaceus와 L. brevis 각각을 M17GL 평판배지에 100㎕씩 분주하여 배지 표면 전체에 도말하고, 기존 나이신 생성 유산균(Lactococcus lactis ssp. lactis IFO12007)을 각각 획선(얇은 획선 및 굵은 획선)으로 접종하여 30℃에서 48h 배양하는 방식으로 항균성 물질에 대한 내성을 관찰하였으며, 유산균 검증 시험 결과는 도 5와 같다.
30℃에서 48h 배양한 결과, P. pentosaceus상에 획선한 IFO12007은 가장 자리에 clear zone을 형성하였고, L. brevis상에서는 IFO12007의 얇은 획선은 colony 증식이 억제되었으나 굵은 획선은 clear zone이 관찰되지 않았다. 이는 IFO12007이 생성하는 유산균 유래의 항균성 물질로 인해 P. pentosaceus의 증식 억제에 영향을 끼쳤으나 L. brevis는 이에 내성을 가지고 영향을 받지 않은 것을 확인 할 수 있다. 그러나 P. pentosaceus 또한 증식 억제에 대해서 뚜렷한 영향을 받지 않는 것으로 보여 L. brevis보다는 약하지만 항균성 물질에 대한 내성을 가지는 것으로 확인된다.
[유산균의 항균성 검증 시험 - 2]
Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)이 항균성 물질을 생성하는 Lactococcus lactis ssp. lactis IFO12007에 대한 내성을 가지는 것을 관찰하였으므로, P. pentosaceus와 L. brevis가 실제 다른 잡균에 대한 항균성을 가지는지 확인하기 위하여 항균성 검증 시험을 실시하였다.
Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)은 P. pentosaceus으로 표기하였으며, Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)은 L. brevis로 표기하였다.
미강과 물을 1:2(w/w)의 비율로 혼합하는 과정에서, 물은 M17GL 액상배지에 배양한 농도 약 108cfu/㎖의 P. pentosaceus 또는 L. brevis를 미강의 2%(w/w)의 비율이 되도록 넣어 혼합한 것을 사용하여 다양한 시험구를 설정하였으며, 설정된 시험구는 하기 표 1에 나타내었으며, 시험구를 육안으로 관찰한 결과는 도 6과 같다.
시험구 1 미강 : D.W(Blank 1) = 1 : 2 (w/w)
시험구 2 미강 : L1 = 1 : 2 (w/w)
시험구 3 미강 : S1 = 1 : 2 (w/w)
시험구 4 미강 : L1+S1 = 1 : 2 (w/w)
상기 D.W(Blank 1)는 일반 증류수를 의미하며, 상기 L1은 미강의 2%(w/w) 비율에 해당하는 P. pentosaceus가 혼합된 증류수를 의미하고, 상기 S2는 미강의 2%(w/w) 비율에 해당하는 L. brevis가 혼합된 증류를 의미하며, 상기 L1+S1은 미강의 1%(w/w) 비율에 해당하는 P. pentosaceus와 미강의 1%(w/w) 비율에 해당하는 L. brevis가 혼합된 증류수를 의미한다.
상기 표 1과 같이 설정된 시험구는 30℃에서 48h 배양하는 방식으로 항균성 검증 시험 결과를 관찰하였으며, 항균성 검증 시험 결과는 도 7과 같다.
상기 P. pentosaceus와 L. brevis를 접종하여 배양한 미강을 각각 1g 씩 9㎖의 증류수에서 추출하여 생균수를 측정하였다. 그 결과 상기 2종의 유산균을 첨가하지 않은 시험구 1에서는 특정되지 않은 다수의 잡균이 나타나는 것으로 확인되지만, P. pentosaceus를 첨가한 시험구 2구에서는 P. pentosaceus만 나타나는 것으로 확인되었고, L. brevis를 첨가한 시험구 3에서는 L. brevis만 나타나는 것으로 확인되었으며, P. pentosaceus와 L. brevis를 모두 첨가한 시험구 4에서는 2종의 유산균만 나타나고 다른 잡균은 나타나지 않는 것으로 확인되어, P. pentosaceus와 L. brevis와 같은 2종의 유산균이 생성하는 항균성 물질로 인해 잡균의 증식이 억제되었다는 것을 확인 할 수 있었다.
[유산발효사료 조성물의 제조방법]
본 발명은 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뱀장어 고형오물을 분리한 유산균 발효사료 조성물의 제조방법은 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물과 미강을 혼합한 뒤, 정치 발효시켜서 1단발효물을 제조하는 1단발효단계; 상기 1단발효단계에서 제조된 1단발효물과 2단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 2단발효물을 제조하는 2단발효단계; 상기 2단발효단계에서 제조된 2단발효물과 3단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 3단발효물을 제조하는 3단발효단계; 및 상기 3단발효단계에서 제조된 3단발효물을 열풍건조기를 이용하여 50 내지 80℃의 온도를 유지하면서 수분함량이 15% 이하가 되도록 건조시켜서 유산발효사료 조성물을 제조하는 건조단계;를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시형태에 따른 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물의 제조방법을 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물(이하, ‘유산발효사료 조성물’은 후술하는 제조방법에 의하여 보다 명확하게 이해될 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시형태에 따른 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물의 제조방법을 공정 단계 별로 나타내는 순서도이다.
우선, 1단발효단계를 수행할 수 있다(S100).
Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물과 미강을 혼합한 뒤, 정치 발효시켜서 1단발효물을 제조하는 1단발효단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 1단발효단계에서는, 뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 15 내지 30℃의 온도에서 3 내지 11일 동안 정치 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
슬러지 상태의 뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합하는 이유는 뱀장어 고형오물에 포함된 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)과 같은 유산균의 함유 비율이 미강과 혼합한 시료의 2~5%(포화상태의 균액 108~9cfu/㎖) 가 되도록 하기 위함이며, 미강을 첨가함으로써 유산균의 확대배양을 시킴과 동시에 뱀장어 고형오물에서 나는 악취를 저감시킬 수 있어 유산발효사료 자체의 품질을 증진시킬 수 있기 때문이다. 또한, 뱀장어 고형오물에 포함된 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)이 배양물에서 우점균으로 형성되기 위해서는 기존의 함유되어 있는 균(잡균)의 1000배 만큼 첨가해 주어야 하며, 이론상 대부분의 잡균은 시료 1g 당 103cfu를 이루고 있기 때문에 우점균으로 형성되고자 하는 균이 시료에 최소 106cfu/g은 포함되어야만 우점균으로 증식 될 수 있기 때문이다. 따라서 포화상태의 균액을 시료의 2~5% 첨가해 주면 시료는 106cfu/g의 상태가 되어 우점균으로 증식할 수 있기 때문에, 슬러지 상태의 뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합하여 유산발효사료를 제조하는 것이 바람직하며, 균을 과하게 첨가하게 될 경우 한정되어 있는 영양분에 오히려 균의 활성이 떨어질 우려가 있으므로 바람직하지 않다.
뱀장어 고형오물과 미강을 적당한 비율로 혼합한 뒤, 15 내지 30℃의 온도에서 3 내지 11일 동안 정치 발효시키는 이유는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)이 15 내지 30℃의 저온에서 활성되기 때문이며, 악취를 저감시키기 위하여 3 내지 11일 동안 정치 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
다음으로, 2단발효단계를 수행할 수 있다(S200).
상기 1단발효단계에서 제조된 1단발효물과 2단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 2단발효물을 제조하는 2단발효단계를 수행할 수 있다.
1단발효단계 이후 제조된 1단발효물에, 유산균에 내성을 가지는 황국균을 접종하는 2단 발효를 통해, 단백질 분해율을 높이고 유산균의 활성을 떨어뜨리기 위하여 2단발효단계를 수행한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 2단발효단계에서는, 1단발효물과 2단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
1단발효물과 2단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합하는 이유는 1단발효물에서 2단종배양물에 포함된 균이 우점균으로 형성되기 위해서는 기존의 함유되어 있는 균의 1000배 만큼 첨가해 주어야 하며, 이론상 대부분의 균은 시료 1g 당 103cfu를 이루고 있기 때문에 우점균으로 형성되고자 하는 균이 시료에 최소 106cfu/g은 포함되어야만 우점균으로 증식 될 수 있기 때문이다. 따라서 포화상태의 균액인 2단종배양물을 1단발효물의 2~5% 첨가해 주면 시료는 106cfu/g의 상태가 되어 우점균으로 증식할 수 있기 때문이며, 균을 과하게 첨가하게 될 경우 한정되어 있는 영양분에 오히려 균의 활성이 떨어질 우려가 있으므로 , 1단발효물과 2단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 1단발효물과 2단종배양물을 적당한 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 발효시키는 이유는 2단종배양물에 포함된 황국균의 배양효율이 가장 뛰어나도록 하기 위함이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 2단발효단계의 2단종배양물은, 탈지대두박, 물 및 황국균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 배양하여 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
탈지대두박, 물 및 황국균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합하는 이유는 황국균의 증식이 가장 활발하도록 설정한 혼합비율이며, 탈지대두박, 물 및 황국균을 적당한 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 배양하는 이유는 황국균의 적정 배양온도와 배양시간을 따르기 위함이다.
다음으로, 3단발효단계를 수행할 수 있다(S300).
상기 2단발효단계에서 제조된 2단발효물과 3단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 3단발효물을 제조하는 3단발효단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 3단발효단계에서는, 2단발효물과 3단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
2단발효물과 3단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합하는 이유는 2단발효물에서 3단종배양물에 포함된 균이 우점균으로 형성되기 위해서는 기존의 함유되어 있는 균의 1000배 만큼 첨가해 주어야 하며, 이론상 대부분의 균은 시료 1g 당 103cfu를 이루고 있기 때문에 우점균으로 형성되고자 하는 균이 시료에 최소 106cfu/g은 포함되어야만 우점균으로 증식 될 수 있기 때문이다. 따라서 포화상태의 균액인 3단종배양물을 2단발효물의 2~5% 첨가해 주면 시료는 106cfu/g의 상태가 되어 우점균으로 증식할 수 있기 때문이며, 균을 과하게 첨가하게 될 경우 한정되어 있는 영양분에 오히려 균의 활성이 떨어질 우려가 있으므로 , 2단발효물과 3단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 2단발효물과 3단종배양물을 적당한 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 발효시키는 이유는 3단종배양물에 포함된 고초균의 배양효율이 가장 뛰어나도록 하기 위함이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 3단발효단계의 3단종배양물은, 탈지대두박, 물 및 NB(Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 전배양 한 고초균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 배양하여 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
탈지대두박, 물 및 NB(Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 전배양 한 고초균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합하는 이유는 고초균의 증식이 가장 활발하도록 설정한 혼합비율이며, 탈지대두박, 물 및 NB(Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 전배양 한 고초균을 적당한 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 배양하는 이유는 고초균의 적정 배양온도와 배양시간을 따르기 위함이다.
다음으로, 건조단계를 수행할 수 있다(S400).
상기 3단발효단계에서 제조된 3단발효물을 열풍건조기를 이용하여 50 내지 80℃의 온도를 유지하면서 수분함량이 15% 이하가 되도록 건조시켜서 유산발효사료 조성물을 제조하는 건조단계를 수행할 수 있다.
유산발효사료 제조과정에서 3단 발효 이후 배양물의 수분함량이 15% 이하가 되도록 건조시켜서 최종적으로 유산발효사료를 제조하는 것은 유산발효사료 보관 중 미생물의 증식을 억제하기 위함이며, 50 내지 80℃의 온도를 유지하면서 열풍건조기를 이용하여 건조시키는 이유는, 유산발효사료 조성물에 포함된 유산균 활성율이 손실되는 것을 최대한 방지하기 위함이다.
[유산발효사료 조성물 제조]
슬러지 상태의 뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 혼합물을 저온 정치 발효 시 나타나는 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P)과 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P)을 이용해 혼합물 자체적으로 확대배양 하여 1단발효물을 제조하면서 악취를 저감 시킨다.
즉, 뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 약 20℃의 온도에서 약 10일 동안 정치 발효시켜서 1단발효물을 제조한다.
확대배양을 하기 위해서 경남 산청군 오부면 성축농장에서 발효사료제조기를 이용해 대량발효를 실시하였다. 유산균을 배양한 1단발효물과 2단 발효를 위한 2단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 약 30℃의 온도에서 약 45시간 동안 2단 발효를 진행하여 황국균을 확대배양 하였다. 2단 발효가 종료되면 2단발효물과 3단 발효를 위한 3단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 약 40℃의 온도에서 약 24 동안 3단 발효를 진행하여 고초균을 다량 배양시킨 뒤, 약 55℃ 열풍건조로 overnight하여 수분함량을 15% 이하로 건조시켜서 최종적으로 유산발효사료를 제조한다.
상기 2단 발효를 위한 2단종배양물은, 탈지대두박에 각각 물과 종균을 섞어 배양 시킨 것으로서, 2단 발효를 위한 황국균의 종배양은 첨가하는 물의 비율을 탈지대두박의 75%로 하며 황국균은 탈지대두박의 약 0.5~1%를 첨가하고 약 30℃의 온도에서 약 45시간 동안 배양하여 제조된 2단종배양물이다.
또한, 상기 3단 발효를 위한 3단종배양물은, 탈지대두박에 각각 물과 종균을 섞어 배양 시킨 것으로서, 3단 발효를 위한 종배양을 하기 위해서는 물의 비율을 탈지대두박의 90%로 하여 NB(Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 전배양 한 고초균액을 마찬가지로 약 0.5~1%로 미리 물과 섞어서 탈지대두박에 접종시켜 약 40℃의 온도에서 약 24시간 동안 배양하여 제조된 3단종배양물이다.
유산발효사료 조성물을 3단 발효법을 실시하여 최종 발효물에 우수한 특성을 가지는 특정 고초균을 효과적으로 배양시키며 단백질 분해율이 높은 장점이 있다. 무균이 아닌 상태에 그대로 노출되어 있던 재료들은 야생 고초균 및 잡균을 함유하고 있으므로 이를 억제해 주기 위해서 항균성 물질을 생성하는 유산균(P. pentosaceus와 L. brevis)이 포함되어 있는 뱀장어 고형오물 자체를 원료로 사용하여 1단발효단계를 수행한다. 1단발효단계 이후 유산균에 내성을 가지는 황국균을 접종하는 2단발효단계를 통해 단백질 분해율을 높이고 유산균의 활성을 떨어뜨리게 한 뒤, 최종적으로 특정 고초균을 접종하여 3단발효단계를 거쳐 유산발효사료 조성물을 제조함으로써 정상 발효를 유도할 수 있는 장점이 있다.
결론적으로, 본 발명의 일 실시형태에 따라 뱀장어 고형오물에서 분리된 Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균은 항균성이 뛰어난 장점이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물은, Pediococcus pentosaceus SG-L1(유산균기탁번호:KCCM11680P) 유산균 및 Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물 자체와 미강을 혼합한 뒤, 1단발효 내지 3단발효의 발효과정을 거쳐서 유산발효사료 조성물을 제조함으로써 고형오물 자체를 사료화 시키는 과정에서 발생하는 악취를 저감시킬 수 있는 장점이 있으며, 유산균을 추가로 배양하여 사료 조성물을 제조하는 과정에서 첨가하는 과정을 생략할 수 있으므로 생산효율성을 증진시킬 수 있는 장점이 있고, 유산균이 지니는 항균성으로 인해 유산발효사료에 잡균이 번식하는 것을 억제하여 품질이 뛰어난 사료를 제조할 수 있는 장점이 있음을 확인할 수 있었다.
이상, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있고, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다. 또한, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. Lactobacillus brevis SG-S1(유산균기탁번호:KCCM11679P) 유산균이 포함된 뱀장어 고형오물과 미강을 혼합한 뒤, 정치 발효시켜서 1단발효물을 제조하는 1단발효단계;
    상기 1단발효단계에서 제조된 1단발효물과 2단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 2단발효물을 제조하되, 2단종배양물로는 탈지대두박, 물 및 황국균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 배양하여 제조된 배양물을 사용하는 2단발효단계;
    상기 2단발효단계에서 제조된 2단발효물과 3단종배양물을 혼합하고 발효시켜서 3단발효물을 제조하되, 3단종배양물로는 탈지대두박, 물 및 고초균을 100:70~90:0.5~1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 배양하여 제조된 배양물을 사용하고, 3단종배양물 제조시에 사용된 고초균은 NB(Nutrient Broth, Difco, USA)배지에서 전배양한 것임을 특징으로 하는 3단발효단계; 및
    상기 3단발효단계에서 제조된 3단발효물을 열풍건조기를 이용하여 50 내지 80℃의 온도를 유지하면서 수분함량이 15% 이하가 되도록 건조시켜서 유산발효사료 조성물을 제조하는 건조단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산발효사료 조성물의 제조방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 1단발효단계에서는,
    뱀장어 고형오물과 미강을 1:1(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 15 내지 30℃의 온도에서 3 내지 11일 동안 정치 발효시키는 것을 특징으로 하는 유산발효사료 조성물의 제조방법.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 2단발효단계에서는,
    1단발효물과 2단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 25 내지 37℃의 온도에서 28 내지 45시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 유산발효사료 조성물의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 3에 있어서,
    상기 3단발효단계에서는,
    2단발효물과 3단종배양물을 100:2~5(w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 35 내지 45℃의 온도에서 20 내지 48시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 유산발효사료 조성물의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 청구항 3, 청구항 4, 청구항 5 및 청구항 7 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 유산발효사료 조성물.
KR1020160027445A 2016-03-08 2016-03-08 뱀장어 고형오물에서 분리한 유산균을 이용한 유산발효사료 조성물 및 그 제조방법 KR101859006B1 (ko)

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이중수. 일본산 뱀장어(Anguilla japonica)에서 Lactobacillus pentosus PL11의 분리와 후보 생균제의 특성. 2009, 경북대학교 대학원 석사학위 논문.

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