KR102272415B1 - 락토바실러스 브레비스 kcc-44 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균용 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KCC-44 균주 및 상기 균주를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 대장균(E. coli), 녹농균(P. aeruoginosa), 황색포도상구균(S. aureus) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(E. faecalis)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있다.

Description

락토바실러스 브레비스 KCC-44 및 이를 포함하는 조성물{Lactobacillus brevis KCC-44 and composition containing the same}

본 발명은 락토바실러스 브레비스 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항균 활성이 우수한 신규한 락토바실러스 브레비스 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지에 관한 것이다.

가축의 세균성 질병 발생률이 증가하면 가축 건강과 생산성에 영향을 미친다. 소의 유선염과 설사는 박테리아 감염에 의한 것이다. 대장균, 녹농균, 황색포도상구균, 및 엔테로코쿠스 페칼리스는 가축 건강에 영향을 미치는 일반적인 병원체이다. 또한 녹농균은 가축과 애완 동물 모두에게 많은 질병을 일으켜 동물 건강에 영향을 미친다.

감염성 병원체는 현재의 항균제에 내성이 있어 사망을 유발할 수 있는 질병을 치료하는 데 어려움을 겪을 수 있다. 감염을 예방하기 위한 항생제의 실패는 부작용없는 새로운 작용 기전을 갖는 대체 물질의 발견을 요구한다.
이와 관련하여, 프로바이오틱스 균주들이 주목받고 있으며, 프로바이오틱스에는 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있다. 특히 이들 중 주로 유산균들이 프로바이오틱스의 주요 균주로 이용되고 있다.
유산균은 자연계에 널리 존재하며 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 유산을 생산한다. 유산균이 발견되는 자연환경은 다양한데, 사람이나 동물의 장내에 존재할 뿐 아니라, 다양한 채소와 과일에서도 발견되며 우리나라의 김치나 요구르트, 및 독일의 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품에서 그 발효과정에 중요한 역할을 담당한다. 이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해미생물의 장 정착을 방지하고 항균물질을 분비함으로써 유해미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용, 및 혈청 콜레스테롤 저하 등의 작용을 수행한다.
종래의 항균 조성물과 관련된 특허문서로서, 대한민국특허 등록특허 10-22015240000에서는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주와 식물추출물 및 꽃황새냉이 추출물을 혼합하여 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 토마토 시들음병균(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 및 벼 잎집무늬마름병원균(Rhizoctonia solani)에 항균 활성을 갖는 항균 조성물을 개시하였다.
종래의 사일리지 관련 특허문서로서, 대한민국특허 공개특허 10-2020-0113149에서는 가축먹이 첨가사료에 관한 것으로, 락토바실러스브레비스, 락토바실러스프렌타룸, 피디오코사이, 및 바실러스코아그런스를 포함하는 효소생균제를 개시하였다.

본 발명은 높은 항균성을 갖는 양질의 사일리지 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예는 항균용 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KCC-44 균주(수탁번호 : KACC 92277P) 및 상기 균주를 포함하는 항균용 조성물을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 대장균(E. coli), 녹농균(P. aeruoginosa), 황색포도상구균(S. aureus) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(E. faecalis)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주 및/또는 이를 포함하는 항균용 조성물은 사일리지 발효용 미생물 첨가제로 이용될 수 있다. 여기서, 상기 미생물 첨가제는 트리티케일 사일리지를 발효하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 사일리지 제조 방법을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 사일리지 제조 방법은, 목초에 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주를 첨가함으로써 제조될 수 있다.

구체적으로, 상기 사일리지 제조 방법은 목초를 준비하는 단계, 상기 목초에 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 처리하는 단계, 및 상기 사일리지 발효용 미생물 첨가제가 처리된 목초를 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 목초는 트리티케일일 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 항균 활성을 갖는 프로바이오틱 젖산 박테리아를 포함하며, 프로바이오틱 젖산 박테리아는 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주일 수 있다. 여기서, 항균 활성의 대상은 대장균(E. coli), 녹농균(P. aeruoginosa), 황색포도상구균(S. aureus) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(E. faecalis)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로바이오틱 젖산 박테리아로서, 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주를 목초에 처리함으로써 높은 항균성을 갖는 양질의 사일리지를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주로 처리되어 제조된 사일리지를 제공한다.

도 1a 내지 도 1c는 다양한 수분함량에서 실험 사일리지의 발효 대사 산물 프로파일을 도시한 것이다.
도 2는 Man Rogosa 및 Sharpe agar 배지 (MRS) 브로스의 유기산 생산량을 백분율로 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 시간 의존적 사멸 분석법에 의해 측정된 병원성 박테리아에 대한 TC48의 ECS의 항균 효과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 시간 의존적 사멸 분석법에 의해 측정된 병원성 박테리아에 대한 TC50의 ECS의 항균 효과를 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 병원성 박테리아의 260 nm 흡수 물질의 방출 속도에 대한 TC48 및 TC50의 영향을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6f는 시험관 내(in vitro) TC48 및 TC50의 생균제 기능을 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명하고자 한다.

본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-45 (Pediococcus pentosaceus KCC-45; 수탁번호 : KACC 92276P)와 락토바실러스 브레비스 KCC-44 (Lactobacillus brevis KCC-44; 수탁번호 : KACC 92277P)에 관한 것으로서, 본 발명은 특히 락토바실러스 브레비스 KCC-44을 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-45 및 락토바실러스 브레비스 KCC-44의 동정을 위한 염기 서열은 본 명세서에 염기서열 1 및 2로 각각 첨부되었다. 상기 조성물은 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주 자체, 이의 배양액, 제형, 또는 이들 모두를 유효 성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-45과 락토바실러스 브레비스 KCC-44은 서로 다른 수분 정도에서 트리티케일 사일리지 발효에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 높은 항균 활성을 갖는다. 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-45과 락토바실러스 브레비스 KCC-44은 발효된 트리티케일 사일리지에서 분리될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 트리티케일 파우더에 있어서 이러한 분리물의 발효능은 엔사일링(ensiling) 방법으로 확인될 수 있다.

KCC-45은 KCC-44보다 사일리지의 젖산 함량을 증가시켜 사일리지 분말을 발효시키는 능력이 더 높다. KCC-45 및 KCC-44의 세포외 상청액 (extracellular supernatant ; ECS)은 각각 5.0-10mg / mL 및 -20 mg / mL의 최소 억제 / 최소 살균 농도 (MIC / MBC) 값으로 시험된 소 병원성 박테리아에 대해 강력한 항균 효과 (억제 구역 직경 : 18-28mm)를 나타낸다. KCC-45 및 KCC-44의 세포 외 상청액 (ECS)은 생존력이 감소되는 것으로 확인할 수 있는 막의 파괴를 통해 대장균(E. coli), 녹농균(P. aeruoginosa), 황색포도상구균(S. aureus) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(E. faecalis)에 대한 항균 활성을 나타내었으며, 병원성 두 균주의 ECS에 노출된 병원성 박테리아 배양 여과 액에서 260 nm 흡수 물질을 증가시킨다. KCC-45 및 KCC-44 균주는 인공 위장액, 십이지장액, 및 장액에 대해 높은 내성을 나타냈다. KCC-45은 우수한 소수성 및 자동 응집 특성을 나타내며, KCC-45 및 KCC-44은 시간-의존적 방식으로 대장균, 녹농균, 황색포도상구균, 및 엔테로코쿠스 페칼리스와 현저하게 공동으로 응집(co-aggregate)될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 모든 박테리아는 발효 과정 동안 사일리지의 하나 이상의 기능적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 페디오코커스 펜토사세우스(KCC-45)와 락토바실러스 브레비스(KCC-44) 중 적어도 하나를 첨가하면 항균 및 생균성이 높은 사일리지 품질을 얻을 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-48 및 이를 포함하는 조성물은 천연으로부터 유래한 것이다. 천연 유래의 제품은 다양한 활성 성분과 작용 메커니즘을 제공할 수 있다. 천연 제품 중에서, 프로바이오틱 박테리아는 인간과 동물 건강에 중요한 기능을 한다. 생균제는 적절한 양으로 투여될 때 숙주에 건강상의 이점을 주는 살아있는 미생물이다. 프로바이오틱 젖산 박테리아 (Probiotic lactic acid bacteria ; LAB)는 풀, 콩과 식물 및 기타 식물에서 동물 사료로 사일리지 생산에 중요한 역할을 한다. 엔사일링(ensiling) 방법을 통한 사료 보존은 동물 생산에 일관되고 신뢰할 수 있으며 예측 가능한 사료 공급을 제공하기 때문에 더욱 주목을 받고 있다. 식물 산화, 식물의 미생물 개체수, 단백질 가수 분해 활성, 클로스트리디아 발효, 미생물 탈아미노화 및 아미노산의 탈카르복실화로 인한 소화 가능한 영양소의 피할 수 없는 손실은 보존 효율에 부정적인 영향을 줄 수 있으며 에너지 및 영양소 손실을 증가시키고 사일리지 샘플에 영양 화합물의 축적을 유발한다. 프로바이오틱 젖산 박테리아를 첨가하여 샘플을 채취하는 동안 엔사일링은 사일리지의 산성화를 높인다. 사일리지의 산성화 여부는 젖산, 아세트산, 부티르산, 숙신산 등의 다른 유형의 유기산을 생산하는 주요 기준이다. 산성화된 환경은 발효 동안 효모, 곰팡이 및 리스테리아 종과 같은 사일리지에서 바람직하지 않은 미생물 성장을 방지한다. 부패 미생물은 사일리지의 영양적 품질뿐만 아니라 동물 건강 및 그 제품에도 영향을 미친다. 프로바이오틱 젖산 박테리아는 전 세계적으로 저수분 / 고수분 사일리지 품질을 개선하고 우유 생산을 개선하고 체중을 늘리며 사료 섭취 효율을 높이기 위해 접종원으로 오랫동안 사용되어 왔다. 프로바이오틱 젖산 박테리아는 이차 대사 산물에 의해 인간 및 동물 병원체에 대한 항균 및 항진균 활성을 발휘한다. 프로바이오틱 젖산 박테리아에 의해 생성된 과산화수소(H₂O₂), 이산화탄소(CO₂), 디아세틸 및 박테리오신은 또한 바람직하지 않은 미생물 성장을 억제할 수 있다.

트리티케일은 밀과 호밀 사이의 품종 작물로서, 19 세기 독일 연구소에서 처음으로 재배되었다. 트리티케일이 사용되는 방식은 종의 특성에 기초한다. 대부분의 종의 화학적 조성은 밀에 더 가까우며 인간과 동물의 영양에 사용된다. 트리티케일은 전분에 비해 높은 총 단백질을 가지므로 인해 반추 동물과 비반추 동물 모두에 대한 농축 동물 사료로서 사용될 수 있다. 현재 트리티케일은 가축 및 가축 동물의 식이요법에 사용되며, 보리 및 기타 곡물의 사용을 대체할 수 있다.

트리티케일의 장점은 다른 것에 비해 더 높은 생물량(biomass)을 갖는다는 것, 봄에 빠른 성장을 한다는 것, 및 더 오랫동안 깎을 수 있다는 것이다.

본 발명의 실시예에서는 효과적인 생균제 젖산 박테리아 (프로바이오틱 젖산 박테리아)를 확인하여 특성화하고 트리티케일 사일리지 발효 및 소 병원성 박테리아 성장에 미치는 영향을 조사한 것을 개시하였다.

축산, 인간, 농업 및 양식업에서 다른 항생제를 자주 사용하는 것은 항균제 내성 발달에 기여했다. 전염병은 동물 건강과 생산성에 심각한 문제를 일으키고 있다. 사일리지는 발효된 형태의 동물 사료로 생 / 비발효 사료보다 가축에게 필요한 영양소를 공급한다.

천연 미생물수, 화학 성분 및 수용성 탄수화물 및 미생물 성장을 위한 기타 질소 성분과 같은 영양소 가용성의 변동성을 보여주는 매우 복잡한 발효 과정이다. 원하는 사일리지 발효의 발생은 식물에 존재하는 미생물의 양, 유형, 및 사일리지의 수용성 탄수화물 (WSC) 수준과 밀접한 관련이 있다. 본 발명은 가축의 동물용 첨가제로 프로바이오틱 젖산 박테리아를 사용함으로써 높은 항균성을 갖는 양질의 사일리지를 만들 수 있다. 프로바이오틱 젖산 박테리아는 일반적으로 안전 (generally recognized as safe ; GRAS) 상태로 인식되어 생치료제 및 면역 예방제로서 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 일 실시예에 따르면 프로바이오틱 젖산 박테리아는 젖산 생산을 늘림으로써 장기간 사일리지를 보존하고 품질을 향상시키는 중요한 첨가제로 사용될 수 있다. 또한, 프로바이오틱 젖산 박테리아의 첨가는 주변 장소의 pH를 감소시킴으로써 바람직하지 않은 사일리지에서의 미생물 성장을 방지한다.

본 발명의 실험예에서는, 트리티케일 식물로부터 새로운 젖산 박테리아 (프로바이오틱 젖산 박테리아)를 분리하고 특성화하고, 시험 관내의 다른 수분 조건에서 사일리지 생산에서의 잠재적 역할을 분석하였다. 접종된 사일리지에서 관찰된 프로바이오틱 젖산 박테리아 수는 빠르게 증가하였으며, 이는 프로바이오틱 젖산 박테리아 균주가 착생 식물(epiphytic) 커뮤니티간에 경쟁력이 있음을 나타내었다. 장내 세균이 약화되고 프로바이오틱 젖산 박테리아가 우세하게 되는 것은 사일리지의 성공적인 발효를 나타내며, 미생물 성장 속도는 pH 감소 속도 및 젖산 생산 속도와 밀접한 관련이 있다. 사일리지의 pH 감소는 엔사일링된 물질의 전환과 관련이 있다. 초기의 빠른 산성화는 식물 자체의 효소 매개 단백질 분해 활성의 감소를 촉진하고 장내 세균 및 클로스트리디아 성장을 방지하는 바, 장내 세균 및 클로스트리디아는 비-해리된 산의 억제 농도 및 충분하게 낮은 pH에 도달할 때까지 성장한다.

본 발명에서, 대조군 사일리지에서 천연 프로바이오틱 젖산 박테리아 발효에 의해 유도된 산성화는 더 높은 pH로 유지된다. 대조군 사일리지에서 가장 높은 pH 값은 LAB의 더 낮은 개체수와, 사일리지에 접종된 LAB에 비해 발효 개시 및 원하지 않는 미생물 성장을 방지에 대해 낮은 효율성을 보여주었다. 젖산, 아세트산 및 부티르산은 사일리지의 주요 산이다.

일반적으로, 젖산은 실링 공정 중 사일리지에서 가장 높은 농도로 발견되었으며 발효 중 pH 감소에 가장 크게 기여했는 데, 젖산은 다른 주요 산보다 약 10-12배 더 강하기 때문이다.

여기서, 더 낮은 프로바이오틱 젖산 박테리아 개체수와 발효를 주도하는 능력을 반영한 대조 사일리지에서 더 낮은 젖산 수준을 나타냈다. 일반적으로, 균질 세균 처리는 접종되지 않은 사일리지보다 사일리지의 pH를 빠르게 감소시켰다. 단일종 발효 박테리아가 접종된 KCC-45에서 이종 발효 박테리아로 처리된 사일리지인 KCC-44보다 프로바이오틱 젖산 박테리아 수가 적게 관찰되었으나, KCC-45에서 영양소 이용 능력 및 균주의 산성화 지속성을 나타내는 더 높은 젖산 수치(lactic acid value)가 생성되었다. 그러나, KCC-45 및 KCC-44 사일리지는 다른 접종 된 사일리지보다 더 높은 젖산 생산량을 가졌다.

이에 더해, 프로바이오틱 젖산 박테리아를 사용한 발효 사일리지는 한천 확산법으로 억제 구역에 기초한 소 병원성 박테리아의 패널에 대해 더 높은 항균 활성을 나타냈다. 프로바이오틱 젖산 박테리아는 다른 병원성 박테리아에 대해 중요한 항균 활성을 나타낸다. 전술한 바와 같이, KCC-45 및 KCC-44은 젖산을 증가시키고 사일리지의 pH를 감소시켜 저 수분 및 고수 분 레벨에서 트리티케일 사일리지를 효과적으로 발효시킨다. KCC-45 및 KCC-44을 사용한 발효 사일리지 추출물은 처리되지 않은 사일리지 추출물보다 테스트 된 박테리아에 대해 강력한 항균 활성을 나타낸다. 특히 60 % 및 70 % 수분으로부터의 발효 발효 사일리지는 대조군 및 기타 수분 사일리지보다 강력한 항균 활성을 나타 냈다. 이러한 항균 활성은 KCC-45 및 KCC-44이 대조군 및 기타 수분보다 60 % 및 70 % 수분 사일리지에서 한계 수준의 아세트산 및 부티르산으로 많은 양의 젖산을 생성했기 때문일 수 있다.

KCC-45 및 KCC-44 균주의 세포외 대사 산물은 억제 구역을 기본으로 하여 한천 확산 방법, MIC / MBC, 타임 킬링 분석 및 핵산 방출 방법으로 대장균, 녹농균, 황색 포도상구균, 엔테로코쿠그 페칼리스에 대한 항균 활성을 보여준다. KCC-45 및 KCC-44의 ECS에 노출시킴으로써 대장균, 황색포도상구균, 녹농균 및 엔테로코쿠스 페칼리스 생존 세포 수를 완전히 억제하거나 감소시킨다. 앞서 논의한 바와 같이, 프로바이오틱 젖산 박테리아의 유기산 및 기타 대사 산물은 병원성 박테리아 성장 조절에 주요한 역할을 한다. 마찬가지로 KCC-45 및 KCC-44은 MRS 배지에서 아세트산 및 부티르산 함량이 적으면서 많은 양의 젖산을 생성한다. ECS의 열 분해 후, 강력한 항균 활성을 나타내었음에도 불구하고 단백질 및 펩티드 이외의 항균 활성도 포함된다. 또한 기존 발명에서는 프로바이오틱 젖산 박테리아가 대장균, 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis) 및 황색포도상구균에 대해 강력한 억제 활성을 보였다는 것을 확인했다. 다음 우리는 그들의 세포 무결성 상태를 확인하기 위해 처리되지 않은 및 ECS 처리 병원성 박테리아에서 핵산 방출을 분석했다. 박테리아의 원형질막은 철분 수송을 포함한 중요한 장벽 기능을 수행하는데, 이는 세포막의 많은 기능과 필수 효소 활동에 관여한다. 높은 수준의 철분 누출은 박테리아 세포막 파괴를 유발할 수 있으므로 에너지 상태와 생존을 유지하기 위해서는 필수 철분의 평형을 유지하기 위해 박테리아의 세포 무결성이 필요하다. 현재의 연구에서, MIC에서 KCC-45 및 KCC-44의 ECS는 병원성 박테리아로부터 260nm 흡수 물질의 방출에 대한 악화 효과를 나타냈으며, 이는 KCC-45 및 KCC-44이 박테리아 세포 무결성의 파괴를 통해 병원성 미생물의 성장을 억제함을 확인시켜 주었다.

동물의 위장관은 낮은 pH 및 높은 농도의 담즙 염에 유리한 환경이며 위장관 (GIT)에서 섭취 한 박테리아의 생존율은 프로바이오틱스의 선택 및 개발에 중요하다. 유익한 미생물의 프로바이오틱 기능의 기본 메커니즘. 본 연구에서, KCC-45 및 KCC-44의 생존율이 결정되었고, 결과는 상당수의 KCC-45 및 KCC-44이 위액, 십이지장 및 장액 하에서 생존한 것으로 나타났다. 낮은 pH 및 펩신은 모의 위액에서 젖산 박테리아의 생존에 영향을 미쳤으며, 모든 액에서 프로바이오틱 젖산 박테리아 콜로니의 전반적인 감소를 관찰했다. 이는 시뮬레이션된 액에 포도당이 없을 때 ATP 생산이 감소하기 때문으로 판단되었다. 포도당은 F0-F1 ATPase에 의한 최적 H + 방출을 허용하는 데 필요한 ATP 풀을 제공한다. F0-F1 ATPase의 기능은 세포 외에서의 pH를 낮은 수준으로 세포 내 pH를 증가시킴으로써 박테리아의 생존율과 밀접한 관련성을 갖는다. 또한, 십이지장 액에서 KCC-45 및 KCC-44 생존율은 담즙 염으로 인해 담즙 염과 관련이 있는데, 이는 세균에 해로운 영향을 미친다. 다만, 위액에 비해 KCC-45과 KCC-44의 생존율은 십이지장 액에서 약간 증가했다. 이는 이러한 균주가 이전의 스트레스 (위액과 십이지장)에서 더 견딜 수 있는 특성을 가지며 이후의 불리한 조건에서 생존 능력이 있기 때문이며, 이를 교차 보호 스트레스 반응이라고 한다. 담즙 염은 세포벽과 미생물의 완전성을 유지하는 역할을 하는 유전자의 발현을 자극한다. 장액에서 KCC-45 및 KCC-44 생존율의 감소는 pH 상승의 증가와 관련이 있다. 이는 프로바이오틱 젖산 박테리아가 세포를 외부 스트레스로부터 보호하는 게놈 수준에서 담즙 내성 특성을 얻음을 나타낸다. KCC-45 및 KCC-44은 시뮬레이션된 GIT 조건에 대해 가장 내성이 있는 박테리아로 간주되었다.

높은 소수성을 갖는 박테리아가 점막 또는 상피 세포와 강력한 상호 작용을 가질 것으로 예상될 때 박테리아의 접착력은 세포 표면의 소수성을 결정하는 데 사용된다. 본 연구에서, KCC-45 및 KCC-44은 크실렌 및 클로로포름의 존재 하에서 더 높은 소수성을 나타냈다. KCC-45 및 KCC-44은 장에서 부착되고 콜로니화 될 수 있음을 나타냈다.

자동 응집은 장내 콜로니 화를 돕고 병원체 부착을 제어하는 장 상피와 결합하는 생물막 형성의 필수 인자이다. 본 명세서에서, KCC-45 및 KCC-44은 3 시간에 최대응집율 (%)을 나타내었고, 이는 세포의 덩어리를 나타낸다. 또한, 대장균, 황색포도상구균, 녹농균 및 엔테로코쿠스 페칼리스의 공동 응집(co-aggregation) 특성이 분석되었는 바, KCC-45 및 KCC-44은 다른 시험된 병원성 박테리아보다 대장균에 강하게 응집하였다. KCC-45은 대장균과 더 강력하게 공동 응집하였으며, KCC-44은 대장균 및 녹농균과 매우 많이 응집된다. KCC-45과 KCC-44 모두 장을 콜로니화 할 가능성이 있음을 나타냈다.

병원성 박테리아와 프로바이오틱스의 공동 응집은 프로바이오틱스로부터 생산된 항균제의 작용으로 이들을 죽인다.

결론적으로, 시험된 모든 새로운 균주는 상이한 수분 조건에서 트리티케일 사일리지 발효에 긍정적인 영향을 미쳤다. 그러나 페디오코커스 펜토사세우스(KCC-45)와 락토바실러스 브레비스(KCC-44)의 첨가는 시험된 모든 매개 변수와 변화된 사일리지 특성에 긍정적인 영향을 미쳤다. 특히, 균주는 한계량의 아세트산 및 부티르산으로 젖산 생산을 향상시켰다.

또한, 이들 균주의 첨가는 사일리지의 pH를 감소시켰으며, 이는 발효 동안 바람직하지 않은 미생물 성장을 악화시키고 더 높은 생균제 특성을 갖는 강력한 항균 활성을 나타내었고, 이는 상업적 접종원을 개선시키는 더 나은 사일리지 품질을 제공한다.

상기한 내용을 상세하게 실험한 결과는 다음과 같다.

1. 젖산 박테리아의 샘플 수집 및 분리

트리티케일 목초는 대한민국 장수에서 채집되었다. 젖산균 (프로바이오틱 젖산 박테리아)의 분리를 위해 샘플을 실험실에 무균적으로 가져왔다. 1g의 샘플을 10mL 증류수에 용해시키고 로터리 혼합기(shaker)기에서 150rpm으로 30분 동안 유지시켰다. 그 후, 10 배로 연속 희석(serial delution)되었다. 연속 희석된 샘플을 Man Rogosa 및 Sharpe 한천 배지 (MRS 한천; CONDA, 스페인 마드리드)에 뿌렸다. 플레이트를 30 ℃에서 72 시간 동안 배양하고, 박테리아 성장을 관찰한 후 MRS 한천에서 정제 하였다. 프로바이오틱 젖산 박테리아 콜로니를 브로모 크레졸 퍼플 한천 배지 (BCP)에 추가로 스트리킹하였다. 상기 배지는 프로바이오틱 젖산 박테리아 균주의 동일성을 확인하기위한 선택적 배지이다. 모든 균주를 짧은 시간 저장을 위해 4 ℃에서 MRS 한천 배지에서 유지시켰다.

2. 사일리지 생산을위한 접종원 준비

선택된 균주를 24 시간 동안 MRS 브로스 (CONDA, 마드리드, 스페인)에서 배양 한 다음 4000 ℃에서 4 분 동안 30 분 동안 원심 분리하였다. 무-세포(cell-free) 상청액을 제거하고 펠릿을 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 2 회 세척하고 동일한 완충액으로 희석하였다. 박테리아 콜로니는 퀀텀 토탈 세포 착색 키트(Quantom total cell staining kit ; Logos biosystem, 경기도, 한국)와 퀀텀 Tx 미생물 세포 카운터(Quantom Tx Microbial cell counter)에 의해 열거되었다. 간단히 말하면, 1 마이크로리터 퀀텀 토탈 세포 착색제, 1 마이크로리터 총 세포 염색 증강제, 및 10 개의 마이로리터 희석된 샘플을 잘 혼합하고 실온에서 30분 동안 유지시켰다. 이어서, 8 마이크로리터의 세포 로딩 완충액을 혼합물에 첨가하고 기포없이 완전히 혼합하였다. 6 μl의 준비된 시료를 퀀텀 M50 세포 카운터 슬라이드에 로딩하고 300xg에서 10 분 동안 원심 분리한 다음, 대부분의 박테리아 세포에 대해 광 강도 수준이 5로 설정된 퀀텀으로 박테리아 수를 카운트했다. 트리티케일 분말 (이삭이 팰 시기)는 장수에서 얻었므며, 멸균 조건에서 멸균 증류수를 사용하여 수분 함량 (40 %, 50 % 60 % 및 70 %)이 다른 시료로 준비되었다. 상이한 수분 수준의 각 샘플 100g을 28 x 36cm 크기의 폴리에틸렌 백 (Aostar Co., Ltd., Seoul)에 채취하여 4 개의 그룹으로 분류하였으며, 각각은 3 개의 복제물로 구성되었다. 그룹 I은 접종원이 없는 대조군, 그룹 II는 S-대조군(에틸렌 옥사이드 가스로 멸균됨), 그룹 III 상이한 수분에서 프로바이오틱 젖산 박테리아로 처리되었며, 그룹 IV는 표준 젖산 박테리아 로 처리되었다.

그룹 I 및 그룹 II 샘플은 PBS 단독으로 처리되었으며, 그룹 III은 분리된 유산균 (1 x 10⁵)로 처리되었으며, 그룹 IV는 집단 유산균 으로 처리되었으며 진공 실러 (Food saver V48802, MK corporation, Korea)를 사용하여 백으로부터 공기를 배출시켰다. 실험실에서 30일 동안 총 210 개의 백을 준비하고 실온 (범위, 25-28 ° C)에서 보관했다. 발효 후, 추가 분석을 위해 백을 개방하였다.

1) 발효 프로파일

탈 이온수 80mL에 20g의 사일리지를 계량하여 사일리지 샘플의 물 추출물을 제조하고 150 xg (한국 대전, 비전 과학사) 비전 인큐베이터에서 4 ℃에서 30 분 동안 유지시켰다. 이어서, 모든 샘플을 4 분 동안 4000 x g에서 20 분 동안 원심 분리 하였다. 수성 추출물을 두 부분으로 나누었다 : 한 부분을 조합 전극 (이노랩 pH 측정기, 미국 뉴저지 주 토마스 사이언티픽 (Thomas Scientific))을 사용하여 pH를 측정하고 HPLC (HP1100)를 사용하여 젖산, 아세트산 및 부티르산의 농도를 측정 하였다. (Agilent Co, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라 소재).

2) 미생물 집단의 정량

수성 추출물의 제 2 부분을 사용하여 프로바이오틱 젖산 박테리아, 효모 및 진균 집단을 정량화 하였다. 박테리아 콜로니는 퀀텀 tx 미생물 세포 카운터와 퀀텀 토탈 세포 착색 키트로 초기에 기술 된 바와 같이 하나하나 계산되었다 (대한민국 경기도 로고스 바이오 시스템). 곰팡이 및 효모의 배양은 각각 감자 포도당 한천 배지 (Fisher Scientific, MD, USA, Frederick Scientific) 및 페트리 필름 (Thermofisher Scientific, Coon Rapids, MN, USA)에서 수행되었다.

3) 항균 연구를 위해 발효된 트리티케일 사일리지에서 추출물 제조

각 그룹으로부터 발효 분말의 3 개의 복제물 모두를 70 % 메탄올에 담그고 150 x g에서 24 시간 동안 혼합 배양기에서 유지시켰다. 추출물을 여과포, 이어서 Whatman No. 4 및 Whatman No. 2 여과지를 사용하여 여과 하였다. 추출물 중의 용매를 회전식 진공 증발기 (Buchi Rotavapor R-114, Marshall Scientific, Hampton, UK)로 증발시켰다. 농축된 추출물을 동결 건조하고 동결 건조기 (조건 : 50 T 및 -80 ℃에서 가압; 한국 경기도 일신 바이오베이스)에 의해 동결 건조시켰다. 동결 건조된 펠릿을 멸균수 10 mg / mL에 용해시키고 항균 연구에 사용하였다.

4) 생화학적 방법 및 분자적 방법에 의한 분리물의 특성

상기 실험에 기초하여 강력한 균주를 선택하고, API 50 CH 및 API-ZYM 키트를 각각 사용하여 이들의 생화학적 특성 및 효소 생산을 분석 하였다 (Marcy l' Etoile, France). 항생제 감도는 전술 한 바와 같이 디스크 확산 방법으로 테스트하였다. 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 Sanger 방법을 사용하여 Solgent Co. (서울, 한국)에서 수행되었다. QIAquick® 키트 (Qiagen Ltd., Crawley, Microorganisms 2019, 7, 318 4 of 19 UK)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하고 정제하였다. 앰플리콘은 범용 프라이머 27F (50AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG 30) 및 1492R (30GCT TAC CTT GTT ACG ACT T 50)을 사용하여 시퀀싱되었다. 정렬된 KCC-29 16S rRNA 서열을 BLAST 검색 ((GenBank 비-중복 데이터베이스 (NCBI))에 적용 하였다. TC48 (KCC-45) 및 TC50 (KCC-44) 분리물로부터 얻은 16S rRNA 서열을 GenBank에 기탁(수탁 번호 : MN049503 및 MN049504)하였다.

3. 세포 내 상청액 (ICS) 및 세포 외 상청액 (ECS) 준비

TC48 및 TC50을 500mL 원뿔 플라스크에 MRS 브로스에 접종하고 150 x g에서 혼합 배양기에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다 (대한민국 대전시, 비전 과학). 그 후, 브로스를 4 시간 동안 4000 x g에서 30 분 동안 원심 분리하였다. 하부 프로바이오틱 젖산 박테리아 펠렛을 프로테아제 억제제를 함유하는 PBS에 현탁시키고, 비드 (Analytik Jena, 독일)를 이용하여 Speed Mill PLUS로 용해시켰다. 원심 분리 후 상청액을 수집하였다. 모든 상청액을 동결 건조기 (조건 : 50 T 및 -80 ℃에서 가압; 한국 경기도 일신 바이오베이스)로 여과 및 동결 건조시켰다. 이러한 동결 건조된 펠릿을 항균 연구를 위해 PBS에 20 mg / mL의 농도로 용해시켰다.

4. 항균 활성-웰 확산, MIC / MBC 및 타임 킬링 분석 방법

녹농균 (KACC-10185), 엔테로코쿠스 페칼리스 (KACC-11304), 대장균 (KACC-1005), 황색포도상구균 (KACC-10768)와 같은 병원균은 한국 농업 문화 회관 (KACC)에서 입수했다. , 대한민국. 잘 확산 분석하기 위해, 녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균 및 황색포도상구균과 같은 24 시간 생 병원성 박테리아 100 uL를 영양 한천 플레이트에 뿌렸다. 웰 커터를 사용하여 한천에 웰을 만들었다. 제조된 추출물 100 uL를 각각의 웰에 로딩하고 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한 후, 억제 구역 (mm)을 모니터링하고 계산하였다. 추출물의 최소 억제 농도 (MIC) 및 최소 살균 농도 (MBC)를 약간의 변형으로 기재된 방법에 따라 분석 하였다. 간략히, 프로바이오틱 젖산 박테리아의 ECS의 2 배 연속 희석물을 96-웰 플레이트의 영양 배지에서 제조 하였다. 0.5 McFarland 표준 박테리아 접종원을 각 웰에 첨가 하였다. 이어서 플레이트를 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 대조용 웰과 배양액도 포함되었다. MIC와 MBC는 퀀텀 세포 착색 키트 (Logos biosystem, 경기도, 한국)와 함께 퀀텀 Tx 미생물 세포 카운터를 사용하여 분석되었다. 약간 변형하여 타임-킬링 분석을 수행하였다. 생박테리아 배양물을 영양 브로스에 현탁시키고 대략 10⁶ CFU / mL의 광학 밀도로 조정 하였다. 상이한 농도의 ECS (1.25 내지 20 mg / mL)의 TC48 및 TC50을 접종물 현탁액에 첨가하고 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 12, 24, 36 및 48 시간 후 실험 웰로부터 분취량을 제거하고 600 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 260-nm- 흡수 물질의 방출에 대한 TC48 및 TC50의 ECS의 영향도 분석하였다.

5. 실험실의 생균제 특성

1) 시뮬레이션된 위장관 내성 시험을 위한 액(juice)의 제조

1M HCl 또는 1M NaOH를 사용하여 PBS의 pH를 2.5, 5.0 및 8.0으로 조정한 후, 121 ℃에서 15 분 동안 오토 클레이브하였다. PBS (pH 2.5)를 3 mg / mL 펩신 (세인트루이스, 미국)과 혼합한 후 0.2 uM 막 필터 (Acrodisc, Pall Corporation, NY, USA)로 여과하여 시뮬레이션된 위액 (GJ)을 제조하였다. 0.3 % 담즙 염 (Sigma-Aldrich St. Louis, USA) 및 0.1 % 트립신을 PBS (pH 5)에 첨가하여 십이지장액 (DJ)를 제조 하였다. 장액 (IJ)은 PBS (pH 8)에 0.1 % 트립신 (Gibco- Thermo Fisher Scientific, MO, USA)을 보충 한 다음 0.2 uM 막 필터로 여과하여 제조 하였다.

2) 위액, 십이지장액 및 장액에서 프로바이오틱 젖산 박테리아의 생존 능력

TC48 및 TC53의 위장관 내성을 약간 변형하여 분석하였다. 간략하게, TC48 및 TC53을 37 ℃에서 24 시간 동안 MRS 배지에서 성장시켰다. 펠렛을 4 시간 동안 15 분 동안 4000 x g에서 15 분 동안 원심 분리하여 얻었다이들 세포를 PBS (pH 7.4)로 2 회 세척하고, PBS에 재현탁시키고, 퀀텀 생세포 착색 키트를 사용하여 카운트하였다. 재현탁된 (1 x 10⁶) 박테리아를 첨가하여 GJ를 시뮬레이션하고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양 하였다. 그 후, 1mL의 세포 현탁액을 GJ에서 9mL의 시뮬레이션된 DJ로 옮기고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, 1mL의 세포 현탁액을 DJ로부터 9mL의 시뮬레이션된 IJ로 옮기고 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 3 시간 전후에, 각 액의 TC48 및 TC50을 퀀텀 생세포 착색 키트 (한국 경기도 로고스 바이오 시스템) 및 퀀텀 Tx 미생물 세포 카운터로 분석하였다.

6. TC48 및 TC50의 소수성

탄화수소에 대한 미생물 부착은 박테리아가 장벽에 부착하는 능력을 결정한다. 탄화수소로서 클로로포름 및 크실렌의 존재 하에서 박테리아의 소수성이 측정되었다.

7. TC48 및 TC50의 용혈 활성

용혈 활성을 평가했다. 대장균은 용혈의 대조군으로 사용되었다.

8. 자동응집 및 응집 분석

상호 작용하는 표면을 갖는 세포막의 응집을 조사 하였다. 간단히 말해서, 박테리아 세포를 5000 x g에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 수확하였다. 이어서, 박테리아 펠렛을 포스페이트 완충 식염수 용액 (pH 7.2)으로 2 회 세척하고, 포스페이트 완충액에 재현탁시키고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 분취량 (100uL)을 상층으로부터 1 시간 간격으로 회수하고 3.9mL의 인산 완충 식염수와 혼합하였다. 600 nm의 파장에서 흡광도를 판독하였다. 자동 응집은 1-(A_t/A₀) x 100으로 계산되었으며, 여기서 At는 시간 At=1, 2 3 에서의 흡광도이고, A₀는 t = 0에서의 흡광도였다. 동시 응집의 경우, 시료 준비는 자동 응집과 동일하게 준비되었다. 동일한 부피의 세포 현탁액(프로바이오틱 젖산 박테리아 및 병원성 박테리아)을 10 초 동안 회전교반(vortexing) 하여 혼합 하였다. 이어서, 실온에서 3 시간 동안 인큐베이션한 후 600 nm에서 흡광도를 판독하였다. 대조균 튜브도 동시에 개별적으로 포함했다. 응집에 대해서는 ((Ax + Ay) / 2)-A (x + y) Ax + Ay) / 2 x 100으로 계산되었는 바, 여기서 x와 y는 두 균주에 대한 개별적인 광학 밀도이고 x + y는 혼합 균주의 광학 밀도이다.

9. 통계 분석

모든 수치 데이터는 3 개의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다. 결과는 평균 ± STD로 제시되었다. 분산 분석 (일방 ANOVA, 다변량 분석으로서 사후 분석, Duncan 및 설명 분석 매개 변수 포함)을 사용하여 SPSS16 소프트웨어를 사용하여 유의미한 차이를 분석한 후 최소 유의차 테스트를 수행하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

10. 트리티케일 사일리지의 항균 활성 및 발효 개선에 기초한 강력한 균주의 분리 및 선택

본 연구에서, 발효된 트리티케일 사일리지에서 여러 개의 유산균 (프로바이오틱 젖산 박테리아)을 분리했다. 사전 연구에 따르면 58 프로바이오틱 젖산 박테리아(이하 TC1-TC58로 명명 됨)는 병원성 대장균 및 황색포도상구균에 대해 상당한 항균 활성을 나타냈다 (데이터는 미도시). 또한 이 연구의 모든 균주는 40 %에서 70 % 범위의 다양한 수분 조건에서 사일리지의 pH를 낮추고 트리티케일 사일리지의 발효 품질을 향상시킬 수 있었다. 이들 58 개 균주 중에서 TC2, TC10, TC16, TC48 및 TC50은 대조군 사일리지보다 실험군 사일리지의 충분한 성장 및 강항상된 산성화 정도를 나타내었다.

표 1은 발효 후 미생물 접종원의 함수로서 트리 미칼 사일리지의 평균 미생물 군집 및 pH를 나타낸 것이다.

여기서, CFU는 단위당 콜로니이며, S-대조군은 에틸렌 옥사이드 가스로 멸균됨된 것이며, 데이터는 표준 편차의 평균으로 표시(평균 ± STD, n = 3)되었다. a, b는 대조군과 프로바이오틱 젖산 박테리아 처리 사일리지 사이에서 유의차를 나타낸다. (p <0.05) pH는 사일리지의 산성화도이며, 하나의 컬럼 내에서 a, b, c 글자가 다른 평균값은 5 % 수준에서 크게 다른 것을 나타낸다.

도 1a 내지 도 1c는 다양한 수분함량에서 실험 사일리지의 발효 대사 산물 프로파일을 도시한 것이다. 도 1a 내지 도 1c에 있어서, 도 1a는 젖산, 도 1b는 아세트산, 도 1c는 부티르산의 비율(percentage)을 나타낸 것이며, 발효 사일리지에서 HPLC로 정량화되었다. S-대조군은 에틸렌 옥사이드 가스로 멸균된 것이다. DM은 건조물을 의미하며, 데이터는 표준 편차의 평균으로 표시되었다. (평균 ± STD, n = 5) 하나의 컬럼 내에서 서로 다른 글자 a, b, c, d, e 및 f 평균은 5 % 수준에서 유의차를 가지는 것을 의미한다.

표 2는 다른 수분 수준에서 TC48 및 TC50으로 발효 된 사일리지 추출물의 항균 활성을 나타낸 것이다.

표 2에 있어서, 데이터는 표준 편차 (평균 ± STD, n = 3)의 평균으로 표시되었으며, 억제 구역은 밀리미터 (mm)로 언급하였다. # p <0.05는 대조 사일리지와 프로바이오틱 젖산 박테리아 처리 사일리지 추출물 사이에 유의차를 의미한다.

도 1a 내지 도 1c을 참조하면, 주로 TC48 및 TC50은 발효 동안 TC2, TC10, TC16보다 소량의 아세트산 및 부티르산으로 더 많은 양의 젖산 (p <0.05)을 생성했다. 트리티케일의 발효 사일리지 추출물의 항균 활성을 분석한 바, 그 결과는 TC48 및 TC50으로 발효된 사일리지 추출물이 대조군 사일리지보다 시험된 박테리아에 대해 더 높은 항균 활성을 나타냄을 보여주었다. 특히, 표 2를 참조하면, 60 % 및 70 % 수분 추출물은 다른 수분량으로부터 제조된 추출물보다 더 높은 항균 활성을 나타냈다.

전반적으로, TC48 및 TC50은 다른 분리물보다 현저한 항균 활성을 갖는 잠재적 발효 능력을 나타냈다. 따라서, 소 병원성 박테리아 및 이들의 생균제 가능성에 대한 추가 항균 연구를 위해 이들 균주를 선택하였다. 기본적인 물리-화학적 결과는 TC48 및 TC50이 그람-양성, 비이동성, 카탈라제-음성 및 중온성(mesophilic)이라는 것을 보여 주었다. TC48 및 50의 형태는 각각 원형 및 막대 형상이었다. 16srRNA 서열 결과는 TC48은 P. pentosaceus에 상응하며 TC50은 L brevis에 속하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 균주는 d- 글루코스, d- 과당, d- 만노스, l- 소르보스, d- 몰토스, d- 락토오스, 이눌린 및 d- 포커스 등의 다른 유형의 당을 강력하게 발효시켰는 바, 이는 표 3에 개시된 바와 같다.

표 3은 TC48 및 TC50의 시험 관내(in vitro)에서 다른 탄수화물 기질 발효를 나타낸 것이다.

표 3에 있어서 표시된 기호는 각각 다음과 같은 의미를 갖는다.

+++ (강한 발효); ++ (중간 발효); + (저 발효); 0 (발효 없음).

또한, TC48 및 TC50은 상이한 단백질 분해, 지방분해 및 당분해 효소를 포함하는 산업적으로 중요한 세포외 효소를 생산하였는 바, 이는 표 4에 개시되었다.

표 4는 시험 관내 TC48 및 TC50으로부터의 세포 외 효소 생산을 나타낸 것이다.

표 4에 있어서 표시된 기호는 각각 다음과 같은 의미를 갖는다.

+++ (높은 생산량); ++ (중간 생산량); + (낮은 생산량); 0 (발효 없음).

표 5는 시험 관내 TC48 및 TC50의 항생제 감수성 패턴을 나타낸 것으로, TC48 및 TC50의 항생제 감수성을 스크리닝하고 중간 감수성 (M), 강한 감수성 (S) 및 내성 (R)으로 분류하였다. 표 5에 도시된 바와 같이, 이 균주는 일반적으로 사용되는 항생제에 대해 높은 감도를 나타냈다. TC48 및 TC50은 용혈 활성을 나타내지 않았다.

여기서, 8 mm는 보통 감수성으로 MS로 표시되었으며, > 10 mm의 경우 강한 감수성으로 SS로 표시되었으며, 저항성은 R로 표시되었다.

11. 소 병원성 박테리아에 대한 생세포 및 변성 세포 외 상청액 (ECS)과 세포 내 상청액 (ICS)의 효과

결과는 TC48과 TC50이 모든 수분 조건에서 트리티케일 사일리지를 발효시킬 수 있는 능력을 가지고 있으며 바람직하지 않은 미생물의 성장을 통제한다는 것을 보여주었다. 다음으로 녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균 및 황색포도상구균을 포함한 소 병원성 박테리아에 대한 ECS 및 TC48 및 TC50의 항균 활성을 조사했다. TC48 및 TC50의 생세포 ECS는 모든 시험된 병원성 박테리아에 대해 강력한 억제 효과를 나타냈다. TC48은 녹농균 및 황색포도상구균보다 대장균과 엔테로코쿠스 페칼리스에 대해 가장 높은 억제 영역을 보인 반면, TC50은 대장균, 엔테로코쿠스 페칼리스 및 녹농균에 대해 최대 항균 활성을 보였다. 반면, 두 박테리아의 ICS는 ECS보다 테스트된 박테리아에 대해 훨씬 약한 항균 활성을 나타내었는 바, 이는 표 6에 개시되었다.

표 6은 병원성 박테리아에 대한 TC48 및 TC50의 생 및 변성 ICS 및 ECS의 항균 활성을 나타낸 것으로, 웰 확산 방법 이용한 것이다.

ECS는 세포 외 상청액이며, ICS는 세포 내 상청액이며, 억제 구역은 밀리미터 (mm)로 언급되었다. 결과는 평균 ± STD, n = 3)으로 표현되었으며, a, b 및 c는 병원성 박테리아 사이의 프로바이오틱 젖산 박테리아 처리에서 유의미한 차이를 나타내고; * # p <0.05 병원성 박테리아에서 프로바이오틱 젖산 박테리아의 ICS와 ECS 사이의 유의미한 차이를 나타낸다.

또한, 선택된 병원성 박테리아에 대해 90 ℃에서 1 시간 동안 변성 된 ECS 및 ICS의 효과를 분석하였다. ECS 및 ICS를 고온에 노출시키면 TC48 및 TC50에 의해 MRS 배지에서 생산된 펩타이드 및 단백질이 변성 / 비활성화되었을 수 있다. 마찬가지로, 열처리는 모든 테스트된 병원성 박테리아에 대한 TC48 및 TC50의 항균 활성을 감소시켰다. 그러나 변성이 녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균 및 황색포도상구균에 대해 항균성도 나타낸 후, 단백질 및 펩타이드 이외의 다른 것 또한 항균 활성에 관여한다는 것이 입증 되었는데, 이들 균주가 더 많은 양의 젖산을 생산하기 때문에 이는 이러한 균주들이 MRS 브로스 내에 브로스 경계 수준의 아세트산과 부티르산과 상당한 양의 젖산이 생성되었기 때문인 바, 이는 도 2에 개시되었다. 또한 변성 후 ECS의 항균 작용의 원인이었다. 모든 균주의 생 / 변성 ECS는 생/변성 ICS보다 모든 실험된 병원성 박테리아에 대해 더 큰 활성을 나타냈는 바, 이는 상술한 표 6에 개시되었다.

도 2는 Man Rogosa 및 Sharpe agar 배지 (MRS) 브로스의 유기산 생산량을 백분율로 나타낸 것이다. MRS 브로스 내의 젖산, 아세트산, 및 부티르산의 백분율은 HPLC에 의해 정량화되었다. 하나의 열 내의 a, b 문자로 표시된 평균값은 5 % 수준에서 유의차가 있는 것을 나타낸다.

12. 최소 억제 농도 ( Minimum Inhibitory Concentration ; MIC) 및 최소 살균 농도 ( Minimum Bactericidal Concentration ; MBC)

녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균 및 황색포도상구균에 대해 TC48 및 TC50의 ECS의 MIC 및 MBC (20 mg / mL 내지 1.25 mg / mL, 2 배 연속 희석)를 측정 하였다. TC48은 엔테로코쿠스 페칼리스 및 대장균에 대해 5 mg / mL의 MIC와 10 mg / mL의 MBC를 보여주었고, 녹농균과 황색포도상구균에 대한 MIC와 MBC는 각각 10과 20 mg / mL였다. TC50은 하기 표 7에 나열된 균주들 중 엔테로코쿠스 페칼리스(E. faecalis), 대장균(E. coli), 및 녹농균(P. aeruginosa)에 대해 5 mg / mL의 MIC 및 10 mg / mL의 MBC를 나타냈고, 하기 표 7에 나열된 균주들 중 황색포도상구균(S. aureus)에 대해 10 mg / mL의 MIC 및 20 mg / mL의 MBC를 나타냈다.

표 7은 상이한 병원성 박테리아에 대한 TC48 및 TC50의 MIC 및 MBC ECS를 나타낸 것이다.

여기서, ECS는 세포 외 상청액; MIC는 최소 억제 농도; MBC 는 최소 살균 농도를 나타낸다.

13. ECS 처리에 의한 병원성 박테리아의 시간 의존적 사멸

녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균 및 황색포도상구균을 다른 농도 (20-1.25 mg / mL)의 TC48 및 TC50의 ECS로 처리하고 48 시간 동안 배양하였다. 이어서 병원성 박테리아의 성장을 상이한 시점(12 시간마다)에서 분석하였다. 20 mg / mL 농도의 ECS 처리는 배양 기간 동안 녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균, 및 황색포도상구균의 성장을 완전히 정지시켰다. 이러한 내용은 도 3a 내지 도 3d, 그리고, 도 4a 내지 도 4d에 도시되었다. 그러나, ECS 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여 ECS의 농도가 현저히 감소하였으나 (p <0.05), 박테리아 성장은 ECS의 농도가 감소될 때 증가하였다 (p <0.05).

도 3a 내지 도 3d는 시간 의존적 사멸 분석법에 의해 측정된 병원성 박테리아에 대한 TC48의 ECS의 항균 효과를 나타낸 것이다. TC48의 ECS는 도 3a에서 대장균, 도 3b는 엔테로코쿠스 페칼리스, 도 3c는 녹농균, 도 3d는 황색포도상구균에 대해 다른 농도 20-1.25 mg / mL 범위를 갖는다. 데이터는 평균 ± STD를 나타낸다(n = 5).

도 4a 내지 도 4d는 시간 의존적 사멸 분석법에 의해 측정된 병원성 박테리아에 대한 TC50의 ECS의 항균 효과를 나타낸 것이다. 도 4a에서 대장균, 도 4b는 엔테로코쿠스 페칼리스, 도 4c는 녹농균, 도 4d는 황색포도상구균에 대해 다른 농도 20-1.25 mg / mL 범위를 갖는다. 데이터는 평균 ± STD를 나타낸다(n = 5).

14. 260 nm 재료의 방출에 대한 ECS의 영향

특정 항균제로 처리된 실험 세포에서 260nm 흡수 물질 (핵산)을 분석하는 것은 박테리아 세포막 손상의 지표일 수 있다. 따라서 MIC에서 ECS로 처리 된 녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 대장균 및 황색포도상구균으로부터의 260 nm 흡수 물질의 방출에 대한 TC48 및 TC50의 ECS의 영향이 분석되었다. 결과를 보면 모든 시험된 박테리아가 시간-의존적 방식으로 펩톤 수에 260 nm 흡수 물질의 방출이 급격히 증가한 반면, 시험된 병원체의 방제에서는 변화가 나타나지 않았다. 260nm 흡수 물질의 최대 방출은 60 분 배양에서 TC48 및 TC50의 ECS로 기록되었다. 이러한 내용은 도 5a 및 도 5b에서 확인할 수 있다.

도 5a 및 도 5b는 병원성 박테리아의 260 nm 흡수 물질의 방출 속도에 대한 TC48 및 TC50의 영향을 나타낸 것으로서, 도 5a는 TC48 처리 된 병원성 박테리아의 ECS에 의한 260 nm 흡수 물질 방출의 배수를 나타낸 것이며, 도 5b는 TC50 처리 된 병원성 박테리아의 ECS에 의해 260 nm 흡수 물질 방출의 배수를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± STD (n = 5), * p <0.05 수준에서 처리 된 그룹과 처리되지 않은 그룹 사이의 유의차를 나타낸다.

15. 시뮬레이션된 위장관에서 프로바이오틱 젖산 박테리아의 생존율

프로바이오틱 젖산 박테리아는 우수한 항 박테리아 활성 병원성 박테리아를 보여 주었으므로, 본 발명자들은 강한 생균제 균주의 선택 / 개발을 위해 이러한 프로바이오틱 젖산 박테리아가 시뮬레이션된 위장관 조건에서 생존할 수 있는지 여부를 결정하였다. 3 시간 배양 후 시뮬레이션된 위장액 (GJ), 십이지장액 (DJ) 및 내장액 (IJ)에서 모든 균주의 생존율이 전반적으로 감소하는 것을 관찰하였다. TC48과 TC50은 GJ, DJ 및 IJ의 가혹한 조건에서 생존 능력을 가졌다. 이러한 결과는 도 6a 내지 도 6f에 도시되었는 바, 도 6a 내지 도 6f는 시험관 내(in vitro) TC48 및 TC48의 생균제 기능을 나타낸 것으로서, 도 6a는 위액 (GJ)에서 TC48 및 TC50의 생존율을, 도 6b는 십이지장 액 (DJ)에서 TC48 및 TC50의 생존율을, 도 6c는 장액 (IJ)에서 TC48 및 TC50의 생존율을 나타낸다. 또한, 도 6d는 TC48 및 TC50에 대한 소수성 백분율을, 도 6e는 TC48 및 TC50에 대한 자동 응집 백분율을, 도 6f는 병원성 박테리아와 TC48 및 TC50에 대한 공동 응집의 백분율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± STD (n = 5, p 값 0.05)를 나타내었다. *은 크실렌과 클로로포름 (CHL) 사이의 p <0.05의 유의차를 나타내고, #는 p <0.05는 30 분 내지 60 분의 유의차를 나타낸다. 동일 컬럼 내에서 다른 문자 a, b 및 c는 병원성 박테리아 사이에 따른 상당한 유의차를 나타낸다.

16. 프로바이오틱 젖산 박테리아의 소수성

프로바이오틱 젖산 박테리아의 소수성은 탄화수소 클로로포름 및 크실렌을 사용하여 측정하였다. TC48에 대한 크실렌 및 클로로포름의 존재 하에서 소수성의 백분율은 60 분 인큐베이션에서 39.22 ± 7.8 % 및 27.10 ± 1.4 %이고 TC50은 45.73 ± 6.5 % 및 28.94 ± 7.5 %였다 (도 6d 참조).

17. 프로바이오틱 젖산 박테리아의 응집 속성

자동 응집의 경우, TC50은 더 높은 자동 응집 특성 (%)을 보였고, 즉시 응집하여 바닥에 침전물을 형성하여 투명한 용액을 생성하였다. 그러나 TC48은 즉시 자동 응집하지 않았다. 이의 현탁액은 침전물 및 일정한 탁도 둘 다를 나타냈다. TC48은 TC50보다 응집에 더 많은 배양 시간이 필요했다 (도 6e 참조) 공동 응집 연구에서 TC48과 TC50은 녹농균, 엔테로코쿠스 페칼리스, 황색포도상구균보다 대장균과 강력하게 공동 응집된다. 동시에, TC50은 대장균과 녹농균과의 높은 응집 능력을 보여 주었다 (도 6f 참조).

<110> REPUBLIC OF KOREA, REPUBLIC OF KOREA <120> Pediococcus pentosaceus TC48 and composition containing the same <130> FP-1908086-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> Pediococcus pentosaceus <400> 1 gaacttccgt taattgatta tgacgtactt gtactgattg agattttaac acgaagtgag 60 tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccagaa gtaggggata acacctggaa 120 acagatgcta ataccgtata acagagaaaa ccgcatggtt ttcttttaaa agatggctct 180 gctatcactt ctggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca 240 aggcagtgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc 300 ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga 360 gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt aaagaagaac 420 gtgggtaaga gtaactgttt acccagtgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa 540 agcgagcgca ggcggtcttt taagtctaat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg 600 cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgcaactga 720 cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt 780 aaacgatgat tactaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta 840 agtaatccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaagaattg acgggggccc 900 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt 960 gacatcttct gacagtctaa gagattagag gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt 1020 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttattact agttgccagc attaagttgg gcactctagt gagactgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200 1200 <210> 2 <211> 1421 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 2 gagcttccgt tgaatgacgt gcttgcactg atttcaacaa tgaagcgagt ggcgaactgg 60 tgagtaacac gtgggaaatc tgcccagaag caggggataa cacttggaaa caggtgctaa 120 taccgtataa caacaaaatc cgcatggatt ttgtttgaaa ggtggcttcg gctatcactt 180 ctggatgatc ccgcggcgta ttagttagtt ggtgaggtaa aggcccacca agacgatgat 240 acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 300 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaatgccgc 360 gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac acctttgaga 420 gtaactgttc aagggttgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 540 ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggcttaac cggagaagtg catcggaaac 600 tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag 660 atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctagt ctgtaactga cgctgaggct 720 cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag 780 tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 840 ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900 tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcttct 960 gccaatctta gagataagac gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt gcatggttgt 1020 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc 1080 agttgccagc attcagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200 cggtacaacg agtcgcgaag tcgtgaggct aagctaatct cttaaagccg ttctcagttc 1260 ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320 tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg 1380 taacacccaa agccggtgag ataaccttcg ggagtcagcc g 1421

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주(수탁번호: KACC 92277P)를 포함하고,
   상기 균주는 트리티케일에 처리되는 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
5. 삭제
6. 트리티케일에 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주(수탁번호: KACC 92277P)를 첨가하는 사일리지 제조 방법.
7. 제6 항에 있어서,
   상기 사일리지 제조 방법은
   상기 트리티케일을 준비하는 단계;
   상기 준비된 트리티케일에 상기 락토바실러스 브레비스 KCC-44 균주(수탁번호: KACC 92277P)를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 처리하는 단계; 및
   상기 사일리지 발효용 미생물 첨가제가 처리된 트리티케일을 발효하는 단계를 포함하는 사일리지 제조 방법.
8. 삭제
9. 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항의 사일리지 제조 방법으로 제조된 사일리지.
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