KR102158642B1

KR102158642B1 - 글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102158642B1
Application number: KR1020200055390A
Authority: KR
Inventors: 최지훈; 김민수; 표은지; 이명희; 신상익; 이재환; 심재헌
Original assignee: 주식회사 한국야쿠르트
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2020-09-22

Abstract

본 발명은 글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 락토코커스 락티스 HY7803은 글루탐산을 고발현하는 신규 균주로서 글루탐산을 생산하는데 이용될 수 있으며, 이로부터 생산된 글루탐산 및 이를 포함하는 여러 아미노산을 식품의 감칠맛, 깊은 맛 등의 전체적인 맛을 증진시키는 식품 조미료로 활용할 수 있다.

Description

글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도 {Strain of Lactococcus lactis expressing glutamic acid highly and use thereof}

본 발명은 글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 HY7803 및 이를 이용한 글루탐산의 생산 방법, 상기 방법으로 제조된 글루탐산을 포함하는 식품 조미료에 관한 것이다.

조미료는 음식 맛을 돋우는데 쓰는 물질로, 단맛을 내는 감미료, 짠맛을 내는 함미료, 신맛을 내는 산미료, 감칠맛을 내는 지미료, 그리고 더 깊은 맛을 내는 코쿠미(kokumi)로 나눌 수 있다. 감칠맛을 내는 대표적인 지미료로는 MSG(monosodium glutamate)가 있다. MSG는 주성분이 글루탐산(glutamate 또는 glutamic acid)이며, 핵산 조미료인 이노신산나트륨(sodium inosinate; IMP), 구아닐산나트륨(sodium guanylate; GMP)과 혼합 사용할 때 감칠맛이 더 증대되는 것으로 알려져 있다. 코쿠미의 경우, 본연이 갖는 고유한 맛은 없으나 다른 맛을 강화시킨 역할을 하여 진한 맛, 농후한 맛을 부여하는 역할을 한다. 이러한 코쿠미로 알려진 물질로는 칼슘, 히스티딘(histidine), 글루타치온(glutathione) 등이 있다.

이와 같이 감칠맛, 깊은 맛을 더 해주는 조미료는 완성된 음식의 맛을 돋우거나 부족한 맛을 보강하는 물질로 사용될 수 있으며, 요리에 미숙하거나 제대로 된 요리를 할 수 없는 환경에서 일정한 맛과 향을 내어 음식의 질을 향상시키는 효과를 낼 수 있다. 따라서, 조미료의 사용은 바쁜 현대를 살아가는 젊은 세대에게 있어서, 음식 재료의 맛을 증진시켜 음식을 소비하는 당사자들의 기호성을 높여준다는 장점이 있다.

한편, 조미료 성분으로 널리 사용되는 글루탐산, 글루타치온, IMP 등의 물질은 주로 유전자 조작을 통해 목적 물질의 생산능이 향상된 미생물을 통해 생산된다. 그러나, 유전자 조작 미생물로부터 생산된 물질은 안전성, 안정성과 관련된 문제가 발생될 수 있는 여지가 존재한다.

이에, 본 발명자들은 인위적으로 유전자가 조작된 미생물을 사용하지 않고, 자연에서 유래된 천연 물질만을 사용하여 감칠맛과 깊은 맛을 내는 글루탐산을 포함하는 식품 조미료를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1744958호 한국등록특허 제10-0824457호

본 발명은 글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 HY7803 (수탁번호: KCTC 14161BP)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 락토코커스 락티스 HY7803 (수탁번호: KCTC 14161BP)을 이용한 글루탐산의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 제조된 글루탐산을 포함하는 식품 조미료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 글루탐산을 고발현하는 락토코커스 락티스 HY7803을 제공한다.

상기 락토코커스 락티스 HY7803은 우유 등 식품에서 분리된 여러 락토코커스 락티스 균주 중 본 발명자에 의해 가장 글루탐산 생산량이 우수한 균주로 선발된 것으로, 본 발명자가 한국생명공학연구원에 2020년 4월 2일자로 기탁 (수탁번호: KCTC 14161BP)한 것이다. 이러한 락토코커스 락티스 HY7803은 서열번호 1로 기재된 16S rRNA 염기서열을 가지며, 락토코커스 락티스 표준 균주와 서열 상동성 99%를 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 일 양상은 상기 락토코커스 락티스 HY7803을 이용한 글루탐산의 생산 방법을 제공한다.

상기 방법은 HY7803 균주를 이용한 단백질 공급원의 발효를 통해 고함량의 글루탐산을 생산할 수 있다. 이때, HY7803 균주가 단백질 공급원을 효율적으로 이용하여 글루탐산 생산량을 증대시킬 수 있도록 단백질의 펩티드 결합을 가수분해하는 단백질 분해 효소를 더 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 방법은 콩과 락토코커스 락티스 HY7803 (수탁번호: KCTC 14161BP)을 발효하여 균주 발효물을 제조하는 단계; b) 콩과 단백질 분해 효소를 반응시켜 효소 분해물을 제조하는 단계; 및 c) 균주 발효물과 효소 분해물을 혼합하여 후발효하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 a) 내지 c) 단계를 구체적으로 설명하면, 다음과 같다.

상기 a) 단계는 단백질 공급원인 콩에 HY7803 균주를 접종하여 발효함으로써 글루탐산을 생산하는 과정이다.

상기 콩은 단백질을 30% 이상 함유하는 고단백질 식품으로, 저렴한 비용으로 손쉽게 구할 수 있는 대표적인 단백질 공급원이다. 이러한 콩은 가공되지 않은 원재료 상태이거나, 또는 건조, 가열, 추출, 분쇄 등의 당업계에 알려진 식품 가공 방법을 통해 가공된 상태일 수 있다. 이때, HY7803 균주가 콩의 단백질을 효율적으로 이용하여 발효가 원활하게 진행될 수 있도록 가열 및 분쇄 처리된 콩인 것이 바람직하다.

이러한 콩은 미생물에 의한 오염을 예방하기 위해 멸균 처리된 것일 수 있다. 구체적으로는, 110 내지 140℃에서 5 내지 60분 동안 증자된 것일 수 있으며, 콩의 함수율 및 발효율을 조절하기 위해 증자시 콩과 물을 1:1~4의 중량비로 혼합하여 증자될 수 있다.

상기 HY7803 균주는 콩의 전체 중량 대비 10⁵ ~ 10⁹ CFU/g로 접종되는 것일 수 있다.

이와 같이 콩과 HY7803 균주를 혼합하여 발효함으로써 글루탐산을 생산하고, 이러한 글루탐산을 포함하는 균주 발효물을 제조할 수 있다. 이때, HY7803 균주의 활성을 유지 또는 향상시키기 위해 20 내지 40℃에서 1 내지 5일 동안 발효하는 것이 바람직하다.

상기 b) 단계는 단백질 공급원인 콩에 단백질 분해 효소를 처리하여 반응시킴으로써 글루탐산을 생산하는 과정이다.

상기 콩은 a) 단계에서 기재된 바와 동일하다.

상기 단백질 분해 효소(protease)는 단백질의 펩티드를 가수분해하는 효소로서 펩티드 사슬의 N 말단, C 말단, 또는 내부에 작용하여 펩티드 결합을 절단할 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등의 미생물로부터 유래된 것일 수 있다. 이때, 콩의 단백질을 효과적으로 가수분해할 수 있도록 펩티드 사슬을 무작위적으로 절단하는 효소인 것이 바람직하다.

또한, 단백질 분해 효소는 콩의 단백질을 분해하기 위해 콩 1 g 당 1 내지 50 unit이 사용될 수 있으며, 글루탐산 생산량을 증대시키기 위해 콩 1 g 당 10 내지 30 unit을 사용하는 것이 바람직하다.

이와 같이 콩과 단백질 분해 효소를 혼합하여 반응시킴으로써 글루탐산을 생산하고, 이러한 글루탐산을 포함하는 효소 분해물을 제조할 수 있다. 이때, 단백질 분해 효소의 활성을 유지 또는 향상시키기 위해 30 내지 60℃에서 8 내지 48시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.

상기 c) 단계는 균주 발효물과 효소 분해물의 후발효를 통해 글루탐산 생산량을 증대시키는 과정이다.

상기 후발효에서, 효소 분해물에 포함된 단백질 분해 효소는 균주 발효물 내 HY7803 균주가 이용하지 못한 단백질 또는 아미노산을 더 작은 분자의 형태로 절단하여 HY7803 균주에게 제공할 수 있으며, 균주 발효물에 포함된 HY7803 균주는 단백질 분해 효소를 통해 가수분해된 저분자 물질을 이용하여 글루탐산을 생산할 수 있다. 이때, HY7803 균주 및 단백질 분해 효소의 활성을 모두 유지 또는 향상시키기 위해 30 내지 60℃에서 1 내지 5일 동안 발효하는 것이 바람직하다.

이러한 후발효는 단독으로 HY7803 균주 또는 단백질 분해 효소를 통해 생산된 글루탐산의 양에 비해 많은 양의 글루탐산을 생산할 수 있으며, 글루탐산의 양을 1.5배 이상 증대시킬 수 있다.

이후, 후발효를 통해 고함량의 글루탐산을 포함하는 발효물을 수득할 수 있다. 상기 발효물은 HY7803 균주 및 단백질 분해 효소로부터 생산된 글루탐산과 함께, 아스파라긴, 글루타민, 페닐알라닌 등을 포함하는 아미노산, IMP 등을 포함할 수 있다. 특히, 콩에 존재하지 않거나 극소량으로 존재하는 글루타민, 트레오닌, 프롤린 또한 포함할 수 있다.

이러한 발효물로부터 생산된 글루탐산 및 이를 포함하는 아미노산을 회수할 수 있다. 이때, 회수 방법은 당업계에 공지된 통상의 회수 방법에 따라 실시할 수 있다. 아미노산만을 선택적으로 회수하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 정제 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 그 일례로는 등전점을 이용한 직접 결정법, 이온 교환 수지법, 액체 크로마토그래피법 등일 수 있다. 또는, 상기 발효물을 건조하여 아미노산 및 발효물에 포함된 유효성분을 모두 회수할 수 있다. 발효물의 건조 방법은 당업계에 공지된 통상의 건조 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 그 일례로는 동결 건조, 진공 건조, 통기 건조, 송풍 건조, 열풍 건조, 유동 건조, 분무 건조, 적외선 건조, 고주파 건조 등일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양상은 상기 방법으로 제조된 글루탐산을 포함하는 식품 조미료를 제공한다.

본 발명에서, "식품 조미료"는 음식을 조리하거나 가공 식품을 제조할 때 식품의 맛을 변화 또는 증진시키기 위해 사용되는 물질을 의미한다. 이러한 식품 조미료는 HY7803 균주의 발효 및 단백질 분해 효소의 분해 작용을 통해 생산된 글루탐산 및 여러 아미노산을 포함하는 복합 아미노산의 형태일 수 있다.

이러한 식품 조성물은 글루탐산을 포함한 여러 아미노산을 포함함으로써 식품의 감칠맛, 깊은 맛을 증가시켜 우수한 관능을 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스 HY7803은 글루탐산을 고발현하는 신규 균주로서 글루탐산을 생산하는데 이용될 수 있으며, 이로부터 생산된 글루탐산 및 이를 포함하는 여러 아미노산을 식품의 감칠맛, 깊은 맛 등의 전체적인 맛을 증진시키는 식품 조미료로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 글루탐산 생산의 공정도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서, 기질 (a: 카제인나트륨염, b: 볶은 콩가루)에 따른 단백질 분해 효소의 단백질 분해능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, 발효 조건 (a: 효소량, b: 반응 온도, c: pH, d: 반응 시간)에 따른 글루탐산 생산량을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서, (a) EL2 시료의 아미노산 조성을 PCA 로딩 플롯(loading plot)으로 확인한 그래프이며, (b) HY7803 균주의 사용 유무에 따라 생산된 아미노산 조성을 PCA 스코어(score)로 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서, 사골육수에 HY7803 균주 및 단백질 분해 효소를 통해 제조된 글루탐산 함유 조미료 또는 소금을 처리한 후 실시된 관능검사 결과를 나타낸 그래프이다. *는 유의적인 차이가 있음을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서, 사골육수에 HY7803 균주 및 단백질 분해 효소를 통해 제조된 글루탐산 함유 조미료를 처리한 후 실시된 관능검사 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

1. 균주 선발

서치엔진 (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 글루탐산 생산 균주로 언급된 유산균 중 식약처 식품원료 데이터베이스를 근거로 하여, 실험실에서 보유하고 있는 식품 유래 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 12개를 후보 균주로 선발하였다. 이후, 각 균주에 대해 시트르산(citrate) 발효능을 확인할 수 있는 KM(Kempler and Mckay) 배지와 글루탐산 분석 키트(Glutamate assay kit) (Sigma제조, MAK004)를 사용하여 글루탐산 활성능을 분석하였다. 이때, 대조군으로 락토코커스 락티스 MG1363을 사용하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이, HY7803 균주가 KM 배지에 활성이 있으면서 글루탐산 생성능이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

균주(strain)	시트르산 발효능	글루탐산 활성능
MG1363	-	9.10 ng/ul
Y2	-	8.66 ng/ul
Y4	-	7.04 ng/ul
Y6	-	6.91 ng/ul
Y7	-	7.16 ng/ul
Y8	-	9.35 ng/ul
HY7803	+	17.31 ng/ul
Y19	-	9.38 ng/ul
Y20	-	7.92 ng/ul
Y21	-	6.81 ng/ul
Y22	-	7.12 ng/ul
Y23	-	6.51 ng/ul
Y25	+	9.19 ng/u

HY7803 균주를 대상으로, M17 액상배지(broth)에 균주의 생육에 영향을 주지 않는 조건으로 글루탐산의 전구체인 시트르산 (0.5%) 또는 글루타민 (0.5%)을 첨가하여 배양한 후 글루탐산 생성량을 하기 표 2와 같은 조건으로 HPLC 분석하였다.

HPLC 시스템		JASCO HPLC system
컬럼		AccQ.Tag Column 3.9 * 150 mm
이동상	시간	AccQ.Tag Eluent A	60% ACN in Water
	초기	100	0
	0.5	98	2
	15.0	93	7
	19.0	90	10
	32.0	67	33
	33.0	67	33
	34.0	0	100
	37.0	0	100
	38.0	100	0
유량		1 mL/min
주입량		10 uL
컬럼 온도		37℃
검출		PDA, 254 nm

그 결과, 하기 표 3과 같이, HY7803 균주의 글루탐산 생산량이 대조군에 비해 증가한 것으로 확인되었으며, 특히 시트르산을 첨가한 경우가 글루타민을 첨가한 경우에 비해 많은 양의 글루탐산을 생산하는 것으로 나타났다.

배지 첨가	균주	글루탐산/배양액(medium) (umol/ml)
시트르산	MG1363	0.599 ± 0.029
시트르산	HY7803	0.734 ± 0.002
글루타민	MG1363	0.324 ± 0.002
글루타민	HY7803	0.524 ± 0.000

또한, HY7803 균주에 대해 감칠맛을 부여하는 IMP, GABA 생성능을 하기 표 4와 같은 조건으로 HPLC 분석하였다.

HPLC 시스템		Dionex Ultimate 3000
컬럼		Inno C18 column 4.6 mm * 150 mm, 5 um
이동상	시간	이동상 A (40 mM Sodium phosphate, pH 7)	이동상 B (3DW:Acetonitrile:Methanol = 10:45:45 v/v%)
	초기	95	5
	3.0	95	5
	24.0	45	55
	25.0	10	90
	31.0	10	90
	34.5	95	5
	35.0	95	5
유량		1.5 mL/min
주입량		0.5 uL
컬럼 온도		40℃
FL 검출		Agilent 1260 infinity - OPA: Emission 450 nm, Excitation 340 nm - FMOC: mission 305 nm , Excitation 266 nm
UV 검출		338 nm

그 결과, 하기 표 5와 같이 HY7803 균주의 IMP 생성능이 대조군에 비해 우수한 것으로 나타났다.

(mg/L)	L. lactis HY7803			L. lactis MG1363
(mg/L)	M17 배지	M17 배지+ 0.5% 시트르산	M17 배지+ 0.5% 글루타민	M17 배지	M17 배지+ 0.5% 시트르산	M17 배지+ 0.5% 글루타민
GABA	2.01	2.12	1.71	1.94	1.98	2.13
IMP	25.67	28.22	27.61	n.a	n.a	n.a

이후, HY7803 균주에 대해 16S rRNA 서열분석(sequencing)을 수행하였고, 서열 분석 결과를 토대로 BLAST 프로그램으로 Genbank 데이터베이스에 등록된 다른 표준 균주(Lactococcus lactis 및 Lactococcus lactis subsp.)와 서열의 상동성(%)을 비교하였다. 비교 결과, HY7803 균주는 신규 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로, 표준 균주와의 유사성은 99%인 것으로 나타났다. 본 발명자들은 L. lactis HY7803 균주를 2020년 4월 2일 한국생명공학연구원에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14161BP를 부여받았고, 이후 글루탐산을 대량 생산하는데 사용하였다.

2. 단백질 분해 효소의 반응 조건 설정

2-1. 단백질 분해 효소 선발

효소의 종류에 따른 단백질 분해능을 측정하기 위해, 무작위로 펩티드 결합을 절단하는 Aspergillus oryzae 유래 단백질 분해 효소 (protease A) 또는 글루탐산의 카르복실기를 절단하는 Staphylococcus aureus V8 유래 펩티드내부가수분해효소(endoltodinase)인 Glu-C 효소 (protease B)를 사용하여 글루탐산 생산을 분석하였다. 이때, 기질로는 시판 중인 카제인나트륨염(Casein sodium salt from bovine milk) 또는 볶은 콩가루를 사용하여 효소와 기질을 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

그 결과, 도 2와 같이, 기질로 카제인나트륨염을 사용한 경우에는 효소의 종류와 관계없이 효소에 의한 단백질 분해능을 확인할 수 없었다. 반면, 기질로 볶은 콩가루를 사용한 경우에는 효소 B의 단백질 분해능이 효소 A에 비해 높은 것으로 확인되었으나, 그 차이가 크지 않았다.

따라서, 효소의 단백질 분해능과 경제적인 측면을 고려하여, 기질로 볶은 콩가루와 Aspergillus oryzae 유래 단백질 분해 효소를 선택하여 이후 실험을 수행하였다.

2-2. 최적 조건 설정

Aspergillus oryzae 유래 단백질 분해 효소에 대한 최적의 반응 조건을 찾기 위해, 효소량, 반응 온도, pH, 반응 시간을 다양한 조건으로 하여 글루탐산 생성량을 확인하였다.

그 결과, 도 3과 같이, 효소에 대한 최적 조건으로 효소량은 50 unit (콩가루 1 g 당 약 20 unit), 반응 온도는 50℃, pH는 7, 반응 시간은 24시간인 것으로 확인되었다.

위 실험에서 확인된 최적의 조건을 바탕으로 콩가루의 함수율에 따른 글루탐산 생산량을 비교하기 위해, 콩가루 증자시 콩과 물의 혼합 비율을 다양한 조건으로 설정하였다.

먼저, 볶은 콩가루에 1~4배의 물을 첨가한 후 121℃에서 20분 동안 증자하였다. 증자된 콩가루 20 g에 소금 20 g, 물 80 g을 첨가한 후 Aspergillus oryzae 유래 단백질 분해 효소 (콩가루 1 g 당 18 unit)를 첨가하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.

그 결과, 하기 표 6과 같이, 콩가루 증자시 콩가루와 물의 비율이 1:1일 때, 글루탐산의 생산량이 가장 높은 것으로 확인되었다.

시료	증자 조건 (콩가루:물)	글루탐산/콩가루 (umol/g)
E1:1	1:1	2.207 ± 0.159
E1:2	1:2	1.617 ± 0.091
E1:3	1:3	1.636 ± 0.050
E1:4	1:4	1.346 ± 0.090

이후, 콩가루와 물을 1:1의 중량비로 혼합하여 증자된 콩가루를 사용하여 실험을 수행하였다.

온도에 변화에 따른 글루탐산 생산량을 비교하기 위해, 증자된 콩가루 20 g에 소금 20 g, 물 80 g을 첨가한 후 단백질 분해 효소 (콩가루 1 g 당 18 unit)를 첨가하여 실온 또는 45℃에서 48시간 동안 배양하였다.

그 결과, 하기 표 7과 같이, 반응 온도가 높을수록 글루탐산 생산량이 높은 것으로 확인되었다.

시료	발효 온도	글루탐산/콩가루 (umol/g)
E_RT	실온	1.606 ± 0.023
E_45	45℃	2.207 ± 0.159

발효 기간에 따른 글루탐산 생산량을 비교하기 위해, 증자된 콩가루 20 g에 소금 20 g, 물 80 g을 첨가한 후 단백질 분해 효소 (콩가루 1 g 당 18 unit)를 첨가하여 30℃에서 3일 또는 6일 동안 배양하였다.

그 결과, 하기 표 8과 같이, 3일 동안 반응시켰을 때 글루탐산 생산량이 높은 것으로 확인되었다.

시료	발효 기간	글루탐산/콩가루 (umol/g)
E_3D	3일	2.207 ± 0.159
E_6D	6일	2.186 ± 0.127

위 실험 결과를 토대로, 증자된 콩가루 20 g에 소금 20 g, 물 80 g을 첨가한 후 단백질 분해 효소 (콩가루 1 g 당 18 unit) 및/또는 HY7803 균주 (콩가루 대비 10⁷ CFU/g)를 접종하여 45℃에서 3일 동안 배양하였다.

그 결과, 하기 표 9와 같이, HY7803 균주와 단백질 분해 효소를 함께 발효시 단백질 분해 효소만을 처리한 경우에 비해 글루탐산 생산량이 증가한 것으로 확인되었다.

시료	단백질 분해 효소	HY7803	글루탐산/콩가루 (umol/g)
대조군	-	-	2.308±0.108
E	○	-	2.207±0.159
EL	○	○	3.060±0.147

3. HY7803 균주 및 단백질 분해 효소를 이용한 글루탐산 생산

3-1. 글루탐산을 포함하는 아미노산 조성

증자된 콩가루 200 g에 Aspergillus oryzae 유래 단백질 분해 효소 (콩가루 1 g 당 18 unit)를 첨가한 후 50℃에서 24시간 동안 배양하여 효소 반응물을 준비하였다. 이후, 효소 반응물에 하기 표 10과 같이 소금, 물을 처리하여 45℃에서 3일 동안 더 발효하였다.

또한, 증자된 콩가루 200 g에 HY7803 균주 (콩가루 대비 10⁷ CFU/g)를 접종한 후 30℃에서 48시간 배양하여 균주 발효물을 준비하였다. 이후, 효소 반응물과 균주 발효물을 혼합하고, 하기 표 10과 같이 소금, 물을 처리하여 45℃에서 3일 동안 더 발효하였다.

그 결과, 하기 표 10과 같이, HY7803 균주와 단백질 분해 효소를 함께 발효시 단백질 분해 효소만을 처리한 경우에 비해 글루탐산 생산량이 증가한 것으로 확인되었다.

시료	효소	HY7803	소금 (g)	물 (g)	글루탐산/콩가루 (umol/g)
대조군	-	-	200	800	1.551±0.291
E1	○	-	50	950	1.887±0.171
E2	○	-	100	900	1.901±0.086
E3	○	-	200	800	1.851±0.016
EL1	○	○	50	950	2.011±0.071
EL2	○	○	100	900	2.154±0.088
EL3	○	○	200	800	2.131±0.003

이후, 글루탐산을 포함한 아미노산 생산량을 상기 표4와 같은 조건으로 측정하여 PCA(principal component analysis)를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 11 및 도 4와 같다.

하기 표 11과 같이, HY7803 균주 또는 단백질 분해 효소에 의해 콩가루에 존재하지 않거나 극소량으로 존재하는 아미노산인 글루타민, 트레오닌 및 프롤린이 생산되는 것으로 확인되었다.

또한, 도 4의 (b) PCA score에 나타낸 바와 같이, HY7803 균주 없이 단백질 분해 효소로만 분해된 시료 (E1, E2, E3)는 제2사분면에서 제1사분면으로 이동한 것으로 확인되었고, 특히 E2가 가장 많이 이동하였다. 반면, HY7803 균주로 발효된 시료 (EL1, EL2, EL3)는 모두 제2사분면에서 제4사분면으로 이동한 것으로 확인되었다.

이러한 결과를 통해, HY7803균주의 사용이 아미노산 생성량에 결정적인 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

아미노산 (mg/L)	대조군	E1	E2	E3	EL1	EL2	EL3
Aspartic acid	98.75	890.21	958.19	775.41	960.64	816.53	683.27
Glutamic acid	61.28	2335.92	2497.67	2092.43	2618.12	2212.66	1927.78
Asparagine	30.95	1340.03	1423.71	1159.96	1292.22	1193.84	984.94
Serine	8.93	1243.81	1277.72	1041.02	992.94	1037.05	892.70
Glutamine	n.a.	1339.72	1418.18	1215.26	1203.40	1342.25	1104.95
Histidine	10.51	633.07	711.29	534.55	598.73	560.88	496.37
Glycine	4.17	420.44	409.36	316.15	394.54	317.44	275.06
Threonine	n.a.	1196.62	1259.54	1106.37	1103.10	1059.27	956.88
Arginine	322.26	2290.07	2466.51	2220.49	111.60	1179.71	1816.57
Alanine	27.35	996.16	1041.72	871.53	1007.68	885.95	797.10
Tyrosine	19.40	519.10	635.58	524.72	15.85	718.73	768.46
Valine	7.59	1326.30	1406.59	1206.66	1261.57	1169.24	1035.79
Methionine	2.16	255.98	269.47	199.58	294.97	276.43	192.37
Novaline	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.
Tryptophane	33.75	449.45	442.05	332.89	595.67	462.74	301.59
Phenylalanine	16.85	1380.51	1428.82	1225.67	653.18	1292.27	1094.91
Isoleucine	5.51	1323.26	1376.52	1175.51	1233.12	1164.04	1010.66
Leucine	6.14	2195.89	2278.88	2002.81	2129.13	1994.43	1751.05
Lysine	10.51	1561.77	1259.64	964.71	1300.91	973.73	1109.00
Proline	n.a.	563.99	821.21	692.54	882.36	772.81	571.17
GABA	13.38	14.86	13.30	12.63	13.18	11.43	12.05
IMP	4.67	12.21	13.00	12.28	12.09	11.68	9.74

3-2. 후발효 유무에 따른 아미노산 생산

45℃에서 3일 동안 배양하는 후발효의 영향을 확인하기 위해, 후발효되지 않은 시료와 후발효된 시료를 대상으로 아미노산 생산량을 분석하였다. 이때, 후발효된 시료로는 E2, EL2를 선택하였다.

그 결과, 하기 표 12와 같이, 후발효를 통해 글루탐산을 포함한 대부분의 아미노산 함량이 증대된 것으로 확인되었다.

아미노산 (mg/L)	대조군	E2		EL2
아미노산 (mg/L)	대조군	-	후발효	-	후발효
Aspartic acid	98.75	575.86	958.19	420.51	816.53
Glutamic acid	61.28	1390.29	2497.67	1032.27	2212.66
Asparagine	30.95	881.67	1423.71	582.39	1193.84
Serine	8.93	761.38	1277.72	522.77	1037.05
Glutamine	n.a.	1015.31	1418.18	654.45	1342.25
Histidine	10.51	365.36	711.29	240.92	560.88
Glycine	4.17	215.00	409.36	170.19	317.44
Threonine	n.a.	825.36	1259.54	535.93	1059.27
Arginine	322.26	1646.18	2466.51	1027.13	1179.71
Alanine	27.35	667.36	1041.72	509.57	885.95
Tyrosine	19.40	710.11	635.58	461.10	718.73
Valine	7.59	900.20	1406.59	599.58	1169.24
Methionine	2.16	149.45	269.47	101.17	276.43
Novaline	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.
Tryptophane	33.75	262.40	442.05	200.79	462.74
Phenylalanine	16.85	990.91	1428.82	605.45	1292.27
Isoleucine	5.51	868.98	1376.52	569.31	1164.04
Leucine	6.14	1597.18	2278.88	985.80	1994.43
Lysine	10.51	715.64	1259.64	602.90	973.73
Proline	n.a.	509.59	821.21	420.73	772.81
GABA	13.38	8.97	13.30	15.93	11.43
IMP	4.67	11.15	13.00	8.14	11.68

4. 관능검사

시료 EL2로부터 제조된 최종 발효물을 압력 4 Pa 이하, 온도 -40℃의 조건에서 3일 동안 동결 건조하여 분말 형태의 글루탐산 함유 조미료을 제조하였고, 관능검사를 수행하였다.

1차 관능검사에서는, 30명을 대상으로 글루탐산 함유 조미료를 0.5% 함량 수준으로 첨가한 사골육수 또는 아무것도 처리되지 않은 사골육수에 대해 3점 차이 식별검사를 실시하였다. 그 결과, 30명 중 7명은 차이를 인식하지 못한 (23%) 반면, 나머지 23명은 차이가 있다고 인식하였으며 (77%, α < 0.001), 그 중 18명이 글루탐산 함유 조미료가 첨가된 사골육수가 좋다고 평가하였다 (78%).

2차 관능검사로, 30명을 대상으로 글루탐산 함유 조미료 또는 소금을 0.5% 함량 수준으로 첨가한 사골육수에 대해 전체적인 맛, 육수간, 감칠맛을 1~7점으로 평가하는 관능검사를 실시하였다. 그 결과, 도 5와 같이, 실시예를 통해 전체적인 맛이 좋아지고, 육수간 및 감칠맛이 개선된 것을 알 수 있었다. 특히, 글루탐산 함유 조미료에 의한 전체적인 맛과 감칠맛은 소금 대비 유의적인 차이가 있음이 확인되었다.

3차 관능검사로, 30명을 대상으로 글루탐산 함유 조미료를 0.5% 함량 수준으로 첨가한 사골육수에 대해 세분화된 맛을 1~7점으로 평가하는 관능검사를 실시하였다. 그 결과, 도 6과 같이, 글루탐산 함유 조미료의 사용은 전반적인 맛을 포함한 전체적인 맛의 지표에 대해 5.8 이상의 긍정적인 평가를 얻을 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC14161BP

20200402

<110> Korea Yakult Co., Ltd. <120> Strain of Lactococcus lactis expressing glutamic acid highly and use thereof <130> PN200053 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactococcus lactis HY7803 16S rRNA <400> 1 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt tgagcgctga aggttggtac 60 ttgtaccaac tggatgagca gcgaacgggt gagtaacgcg tggggaatct gcctttgagc 120 gggggacaac atttggaaac gaatgctaat accgcataaa aactttaaac acaagtttta 180 agtttgaaag atgcaattgc atcactcaaa gatgatcccg cgttgtatta gctagttggt 240 gaggtaaagg ctcaccaagg cgatgataca tagccgacct gagagggtga tcggccacat 300 tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttcggcaatg 360 gacgaaagtc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaaactc 420 tgttggtaga gaagaacgtt ggtgagagtg gaaagctcat caagtgacgg taactaccca 480 gaaagggacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtccc gagcgttgtc 540 cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg tggtttatta agtctggtgt aaaaggcagt 600 ggctcaacca ttgtatgcat tggaaactgg tagacttgag tgcaggagag gagagtggaa 660 ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa caccggtggc gaaagcggct 720 ctctggcctg taactgacac tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc tagatgtagg gagctataag ttctctgtat 840 cgcagctaac gcaataagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag 900 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960 aaccttacca ggtcttgaca tactcgtgct attcctagag ataggaagtt ccttcgggac 1020 acgggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080 ccgcaacgag cgcaacccct attgttagtt gccatcatta agttgggcac tctaacgaga 1140 ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200 ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtc gcgagacagt gatgtttagc 1260 taatctctta aaaccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg 1320 gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380 accgcccgtc acaccacggg agttgggagt acccgaagta ggttgcctaa ccgcaaggag 1440 ggcgcttcct aaggtaagac cgatgactgg ggtgaagtcg ta 1482

Claims

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a) 콩과 락토코커스 락티스 HY7803 (수탁번호: KCTC 14161BP)을 발효하여 균주 발효물을 제조하는 단계;
b) 콩과 단백질 분해 효소를 반응시켜 효소 분해물을 제조하는 단계; 및
c) 상기 균주 발효물과 상기 효소 분해물을 혼합하여 후발효하는 단계
를 포함하는 글루탐산의 생산 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 a) 단계 또는 b) 단계의 콩은 110 내지 140℃에서 5 내지 60분 동안 증자된 것인 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 a) 단계의 락토코커스 락티스 HY7803은 콩 중량 대비 10⁵ ~ 10⁹ CFU/g로 접종되는 것인 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 a) 단계의 발효는 콩과 락토코커스 락티스 HY7803을 20 내지 40℃에서 1 내지 5일 동안 발효되는 것인 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 b) 단계의 단백질 분해 효소는 콩 1 g 당 1 내지 50 unit으로 처리되는 것인 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 b) 단계의 반응은 콩과 단백질 분해 효소를 30 내지 60℃에서 8 내지 48시간 동안 반응되는 것인 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 c) 단계의 후발효는 균주 발효물과 효소 분해물을 혼합하여 30 내지 60℃에서 1 내지 5일 동안 발효되는 것인 방법.
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