KR101707067B1 - 된장에서 분리된 내염성 효모 자이고사카로마이세스 멜리스 ｔｋ－０１ 균주 및 그 배양물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 된장에서 분리된 내염성 효모 Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주와 그 활용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고농도 식염을 함유한 전통 된장에서 내염성 효모를 분리하고 분리된 균주를 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01)균주를 분리 동정하고 상기 균주의 배양물을 이용하여 글루타미나제 및 글루타밀트랜스퍼라제 활성을 평가하고, 이를 활용하여 식물성 단백질의 가수분해에 관한 것이다.

Description

된장에서 분리된 내염성 효모 자이고사카로마이세스 멜리스 ＴＫ－０１ 균주 및 그 배양물{Salt-tolerant Yeast (Zygosaccharomyces mellis TK-01) Isolated from Soy Paste and Characterization Thereof}

본 발명은 염농도가 높은 전통식품인 된장에서 내염성 효모 Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주의 분리에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 효모 Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주 또는 그 배양물을 이용한 식물성 단백질의 가수분해물을 제조에 관한 것이다.

식품의 맛은 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛 4가지 맛을 기본으로 감칠맛을 더한 총 5가지로 구성되어있다. 감칠맛은 식품의 맛의 조화를 결정하는 주요 인자로, 글루탐산염(Mono Sodium Glutamate, MSG)이나 핵산계인 이노신산나트륨(IMP)과 구아닐산나트륨(GMP)등이 대표적인 감칠맛을 내는 것으로 알려져 있다. 이중 MSG는 식품의 맛을 향상시키기 위해 보편적으로 사용되는 물질로, 초기 다시마를 원료로 하여 추출하여 제조하였다. 그러나 대량생산을 위해 1920년대부터 소맥 글루텐을 산 가수분해하여 제조하였으나, 1950년대 미생물발효에 의해 글루탐산을 만들수 있게 되면서 발효법에 의해 글루탐산을 만들어 수용성을 좋게 하기 위하여 나트륨을 붙여 글루탐산나트륨으로 만들고 있다.

식물 단백질을 원료로 한 가수분해물 (Hydrolyzed Vegetable Protein, HVP)을 조미료로 사용하기 위하여 산(acid)으로 가수분해 단백질 (aHVP)은 공정 중 원료에 미량 존재하는 유지의 구성성분인 글리세린과 염산(염소)가 반응하여 생성되는 모노클로로프로판올 (3 - chloro - 1, 2 - propanediol, MCPD)과 디클로로프로판올 (1, 3 - dichloro - 2 - propanal, DCP)과 같은 클로로하이드린이 유해성 논란이 일어나고 있어 식품으로 문제시 되고 있다. 또한 소비자의 천연에 대한 선호도가 증가함에 따라, 대부분 콩 단백질, 옥수수 단백질과 소맥 글루텐 등과 같은 식물성 단백질을 이용한 효소(enzyme)가수분해 단백질 (eHVP)의 사용이 증가하고 있다. 그러나 상업적으로 구매가 가능한 단백질 분해효소를 이용한 eHVP의 생산은 단백질의 불완전 분해로 인한 쓴맛 물질 생성 및 경제성이 떨어진다는 한계가 있다.

또한 상업적으로 구매가 가능한 단백질 분해효소의 endo-/exo-protease의 활성이 미약하여 glutamic acid 함량이 적고, 불완전 분해된 단백질에 의한 short/medium peptides 의한 flavor 특성의 변화에 따른 (예, bitter peptides) quality 저하로, 단백질 분해 및 amino group 전환 능력을 가지고 있는 미생물을 분리 동정하여 전형적인 hyper-protease 및 glutaminase활성을 가진 우수 균주를 개발하여 단백질 분해에 사용하고 있다. 그러나 사용되는 균주의 대부분이 Aspergillus 속의 곰팡이류로 균주의 보관 및 효율적인 발효 생산 공정 개발에 어려움이 있어 (예; Sporulation & Degeneration) 이 또한 제한적으로 적용되고 있다.

식물 단백질을 원료로 한 가수분해물 (HVP)은 간장 및 된장 등의 전통 발효 식품의 주된 맛의 근원으로, 이는 단백질의 가수분해산물인 유리 아미노산과 short/medium 펩타이드를 기반으로 구성되어 있다. 이러한 아미노산 및 펩타이드 용액을 발효를 통하여 생산하기 위해 다양한 방법이 시도되고 있으나, 식물 단백질 원료로부터 단백 가수분해물 제조 공정에서 잡균 증식이 빈번하여 가수분해물의 품질과 수율이 저하되는 문제가 있다. 이를 해결하기 위해 다량의 염이나 알코올 등의 정균 물질을 첨가하는 것이 일반적이며, 이 첨가물들은 효소의 작용을 저해하여 분해시간을 길어지게 한다.

내염성 또는 호염성 미생물이 생산하는 효소는 상대적으로 내염성을 가지므로 이러한 내염성 효소들은 효소 생산공정 및 효소분해 공정에서 잡균의 오염을 줄일 수 있는 장점이 있다. 그러나 내염성 미생물은 Zygosacchromyces rouxii 와 일부 Candida 속을 비롯한 몇몇 균주만이 알려져 있을 뿐 이들을 식품용으로 사용하거나 식품용 균체외 효소 생산에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다.

된장은 콩을 주원료로 높은 염농도에서 곰팡이, 세균 그리고 효모에 의해 생성된 효소가 콩 단백질을 펩타이드와 아미노산으로 분해하는 과정에서 특유의 맛과 향을 생성하는 대한민국 고유의 전통발효식품으로, 음식의 맛을 내기 위한 식물성 조미료로서 애용되어 왔다. 특히, 된장의 숙성에 관여하는 효모는 내염성 환경에서 된장의 깊은 향미 생성에 관여하여 된장의 품질을 좌우하는 것으로 알려져 있다.

효모는 일반적으로 안전한 것으로 인정 (GRAS, generally recognized as safe) 되는 범주에 포함되는 안전한 미생물로 제빵, 양조를 비롯한 다양한 식품에 이용될 뿐만 아니라, 균체 내 단백질, 핵산, 각종 비타민과 미네랄을 함유하고 있다. 효모로부터 제조되는 효모 추출물은 같은 강도의 풍미를 내는 다른 소재에 비해 가격이 비교적 저렴하여 천연 풍미소재로 널리 사용되고 있다. 또한 효모 추출물은 아미노산뿐만 아니라 핵산 및 펩타이드의 성분이 함유되어 있어 복잡한 정미성과 농후한 맛을 지니고 있다. 따라서 이미, 이취를 마스킹하는 등 다른 조미료에서 볼 수 없는 기능을 가진다.

효모는 다양한 proteolytic enzyme(예; protease A, protease B, amino-peptidase, carboxy-peptidase)을 가지고 있어 자가소화 시 효모 자체의 단백질뿐 아니라 첨가된 non-yeast protein (예; wheat gluten, bran, soya bean meal 등)을 분해할 수 있으며, 이를 통해 새로운 peptides profile을 형성함으로써 천연의 조미 소재 개발에 기여할 수 있다. 또한 효모 추출물은 제조 방법에 따라 제품의 향미와 조성의 차이가 매우 크기 때문에 가격의 편차 또한 매우 다양하여, 우수한 향미를 갖는 효모 추출물은 고부가 조미 소재로 사용될 수 있다.

된장, 간장 및 기타 단백질 가수분해물을 함유하는 천연 조미료를 제조할 때, 보다 강한 우마미(umami)를 내기 위하여 각종 맛을 내는 물질 중에서 글루탐산의 양을 증가 시키는 것이 중요하다. 글루탐산은 2가지 경로로 제조되는데, 일차적으로 프로테아제에 의해 단백질에서 글루타민이 유리되면, 그 다음 유리된 글루타민이 글루타미나제에 의해 가수분해되어 글루탐산이 생성된다. 글루타미나제는 생물계에서 널리 분포하고 있는 효소로 L-글루타민에 작용하여 아미드그룹을 가수분해시킴으로서 L-글루탐산과 암모니아를 형성시킨다. 단백가수분해시 총 글루탐산의 함량에 대한 글루탐산의 유리율이 그다지 높지 않은 경우, 이는 불충분한 글루타미나제 활성에 인한 것으로 간주된다. 따라서 프로테아제 활성이 높은 균주 및 글루타미나제 활성이 높은 균주의 세포 융합에 의한 프로테아제 및 글루타미나제의 활성이 높은 균주의 개량이 시도되어왔다(Ushijima S. et al. Biochem. 1987).

글루타밀트랜스퍼라제는 γ-Glutamyl compound와 반응하여 중간체를 형성하게 되며, 이 중간체는 pH에 따라서 반응 특이성(reaction selectivity)를 갖는다고 알려져 있다. 이 중간체가 물과 반응하면 가수분해가 일어나 글루탐산이 생성되고, 다른 아미노산이나 펩타이드와 반응하게 되면 Transpeptidation이 일어나 새로운 γ-Glutamyl compound가 만들어진다(도1). γ-Glutamyl compound를 일반적으로 용해도(Solubility)가 높고, Peptidase에 저항성을 가지며, 맛을 좋게 한다고 알려져 있다. 그 예로 theanine(γ-L-glutamlethylamide)의 경우 Japanese green-tea의 grade를 결정하는 umami key-compound로 잘 알려져 있으며, 또한 bitter amino acid의 γ-glutamylation은 bitter taste를 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라 상쾌함을 주는 lemons-like sour taste를 부여하는 것으로 알려져 있다.

감마글루타밀트랜스퍼라제(Gamma-Glutamlytransferase; GGT)는 hetero-dimeric enzyme이며 glutathion 대사에 관여하는 효소로 지금까지 동물 유래의 것과 미생물 유래의 것이 공지되어 있다. 전자는 칼슘 의존성 효소이며 동물의 장기, 피부, 혈액 등에 분포되어 있으며(K. Ikura et al. Biochemistry 1988, M.A.Philips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990, A. Ichinose et al. Biochemistry 1990), 후자에 관해서는 Streptoverticilium 속의 균으로부터 칼슘 비의존성이 발견되어 있다(유럽 공개특허 0 481 504 A1). 그러나 미생물 유래 글루타밀트랜스퍼라제는 균류의 배양물로부터 정제 조작을 하여 제조되고 있으므로 공급량 및 효율 등의 문제점이 있어, 유전공학적 방법에 의한 글루타밀트랜스퍼라제의 제조가 시도되고 있다. 따라서 글루타밀트랜스퍼라제와 관련된 단백질 및 유전자에 관해서 보고되고 있으며, 이들 정보와 함께 E. coli에서 상기의 단백질을 발현시켜 생산하는 방법이 보고되고 있다. 그러나 이러한 분비 발현에서는 발현량이 대단히 적다는 문제점이 지적된다.

본 발명은 된장에서 분리된 무기염에 저항성이 있는 균주를 확인하고, 그 중에서 선별된 효모 균주를 자이고사카로마이세스 멜리스TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01)균주로 명명하였으며, 내염성, 글루타미나아제, 글루타밀트랜스퍼라아제, 단백질분해효소 활성이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 목적은 된장에서 분리된 내염성 효모 자이고사카로마이세스 멜리스TK-01(Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 선별 균주 및 그 배양물의 자가소화 효소를 이용하여 효모 자체의 단백질뿐 아니라 첨가된 non-yeast protein (예; wheat gluten, bran, soya bean meal 등)을 가수분해하는 방법에 관한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 내염성, 글루타미나아제 활성, 글루타밀트랜스퍼라제 활성을 가지는 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주(기탁번호 : KCCM-11605P)을 제공한다.

또한, 내염성, 글루타미나아제 활성, 글루타밀트랜스퍼라제 활성을 가지는 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주(기탁번호 : KCCM11605P)의 배양물을 제공한다.

또, 목적을 달성하기 위하여 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주의 유효성분을 활용한 식물성 단백질 가수분해 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다

본 발명은 자이고사카로마이세스 속 (Zygosaccharomyces sp.) 균주를 제공한다. 구체적으로 5종의 시판 된장으로부터 분리한 자이고사카로마이세스 속 균주, 바람직하게는 시판 된장으로부터 분리한 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주를 제공한다.

본 발명의 자이고사카로마이세스 속 (Zygosaccharomyces sp.) 균주를 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 이라고 명명하고, 본 발명에 따른 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주는 2014년 11월 20일자로 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korea Culture Center of Microorganisms)에 기탁하고 수탁번호 KCCM11605P를 부여 받았다.

또한, 본 발명은 된장으로부터 자이고사카로마이세스 속 (Zygosaccharomyces sp.) 균주를 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 발명자들은 된장으로부터 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01을 분리하고 이 균주를 배양하여 배양물을 수득하였다.

더불어, 본 발명의 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주의 내염성, 글루타미나아제활성, 글루타밀트랜스퍼라제 활성으로 인하여 식물성 단백질을 분해하는 기능을 제공한다. 본 발명은 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 또는 이 균주의 추출물 제조와 동시에 식물 단백질 가수분해를 제공한다.

도 1은 감마글루타밀트랜스펩티다제의 반응 기작을 나타낸 것이다.
도 2는 된장에서 분리된 효모의 집락을 나타낸 것이다.
도 3은 효모 균주의 위상차 현미경 사진 (x400배)을 나타낸 것이다.
도 4는 효모 균주의 내염성 평가를 나타낸 사진이다.
도 5는 18s RNA 분석을 통한 효모 균주의 동정
도 6은 Zygosaccharomyces mellis TK-01의 염 저항성 평가 그래프이다.
도 7은 감마글루타밀트랜스펩티다제 검량선을 나타낸 것이다.
도 8은 18S rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다

[실시예 1] 내염성 효모의 선별

본 발명은 목적하는 제품이 식품 용도임을 고려하여 종래부터 식품 또는 양조 분야에 이용되는 미생물 중에서 선별하였다. 사용된 효모(yeast)는 시판 건조 효모 6종(Saf-Instant Red, Saf-Instant Gold, Bakels Instant Active Dride Yeast, Vega Instant Yeast, Mauripan Instant Dry Yeast, E-mart Instant Dry Yeast)과 미생물 기탁 보존주 2종(Saccharomyces cerevisiae KCTC 7951, Zygosaccharomyces rouxii KCCM 50054) 그리고 5 종의 시판 된장에서 분리된 효모 3종(SJ 07, SJ 09, SJ 21)을 사용하였다 (표 1, 2).

상기에서 사용된 균주는 YMPD(yeast extract 3g/L, malt extract 3g/L, peptone 5g/L, dextrose 10g/L, pH 5.5) broth에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후, YMPD agar plate에 streaking 하여 단일 colony를 얻었으며, 분리된 균주는 YMPD broth에 접종하여 30 ℃에서 180rpm으로 48시간 배양한 후, 배양액의 20% 글리세린을 첨가하여 -80 ℃ deep freezer에 동결 보존하며 다음 실험에 사용하였다.

상기 분리된 균주의 내염성을 측성하기 위하여 YMPD배지에 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 M의 염화칼륨(KCl)을 각각 첨가하여 고체배지를 제조하였고 동결보존 된 균주를 해동하여 1 백금이를 YMPD agar plate에 30℃에서 72시간 배양하였다.

구체적으로 도 4에 나타난 것과 같이 11종의 효모 모두 1.5 M KCl 농도까지는 집략을 형성하였으나, Saccharomyces cerevisiae KTCT 7915와 Bakels Instant Active Dride Yeast (Austria)는 1.0 M KCl 농도부터 형성된 집락의 수가 급격히 감소하였다. 2.0 M KCl 농도에서는 된장분리균 3종과 Zygosaccharomyces rouxii KCCM 50054 만이 집락을 형성하였으며, 2.5 M KCl에서는 된장분리균 SJ 07과 Zygosaccharomyces rouxii KCCM 50054의 집락이 관찰되었다. 이러한 결과로 신규 분리된 된장분리균 SJ 07의 내염성을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 내염성을 가진 균주 SJ 07의 18S rRNA sequencing에 동정한 결과 자이고사카로마이세스 멜리스 균주와 99% 상동성이 있는 것으로 확인되었으며(도 5), SJ 07을 자이고사카로마시에스 멜리스 TK-01(Zygosaccharomyce mellis TK-01)로 명명하고 이후의 실험에 이용하였다.

상기의 결과로부터 본 발명에 따른 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01(Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주를 2014년 11월 20일자로 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁완료하고 기탁번호 KCCM11605P호를 부여받았다.

1. 형태학적 특성

형태학적 특성은 Zygosaccharomyces sp. 효모가 갖는 일반적인 특성과 유사하다. 즉, YMPD agar plate에서 흰색 크림 집락(colony)을 형성하고, 현미경으로 관찰하였을 때 균사(pseudohyphae)를 지니지 않으며 난형(ovoid)에 가까운 구형(subglobe)의 형태를 보였다.

2. 배양학적 특성

분리된 미생물은 20℃에서 30℃까지의 범위에서 생육이 가능하며, pH 3.5 - pH 6.5 범위에서 생육이 가능하나 최적 pH 범위는 pH 4.5 - pH 6.0 였다.

3. 생리학적 특징

미생물 Zygosaccharomyces mellis의 당류 등 기질 이용특성은 다음과 같다.

또한, 18S rRNA sequencing 비교결과 99%의 상동성을 나타냄을 보여주는 sequencing 비교 데이터는 도 8에 도시하였다.

[실시예 2] Zygosaccharomyces mellis TK-01 특성 조사

본 발명의 상기 Zygosaccharomyces mellis TK-01 형태학적 특성은 Zygosaccharomyces sp. 효모가 갖는 일반적인 특성과 유사하다. 즉, YMPD agar plate에서 흰색 집락(colony)을 형성하고, 현미경으로 관찰하였을 때 균사(pseudohyphae)를 지니지 않으며 난형(ovoid)에 가까운 구형(subglobe)의 형태를 나타낸다.

또한 분리된 미생물은 20℃에서 30℃까지의 범위에서 생육이 가능하며, pH 3.5 - pH 6.5 범위에서 생육이 가능하나 최적 pH 범위는 pH 4.5 - pH 6.0로 판단된다.

[실시예 3] Zygosaccharomyces mellis TK-01 내염성 평가

본 발명의 Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주의 염농도와 균체량의 관계를 조사하기 위하여, YMPD배지에 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0M의 염화칼륨(KCl)을 각각 첨가하고, 동결보존 균주를 1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 균체를 회수하기 위해 8,000 x g로 10분간 원심분리하고 증류수를 이용하여 2회 세척하였다. 회수된 균체는 80℃에서 24시간 동안 건조시켜 건조균체량(dry cell weight, DCW)을 측정하였다.

그 결과 된장에서 분리된 Zygosaccharomyces mellis TK-01은 염을 첨가하지 않은 대조군의 균체량을 100%라 하였을 때, 염 농도를 0.5 M씩 증가할 때 92, 84, 76, 68, 65, 64 % 로 감소하였으며, 3 M(22%)의 KCl농도 존재하에도 성장이 가능한 것으로 판단되었다. (도 6).

[실시예 4] Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주의 단백분해 효소 활성 측정

본 발명에서는 Zygosaccharomyces mellis TK-01의 효소활성 측정을 위해 2.5M KCl이 첨가된 YM agar plate에 배양한 후, single colony를 yeast extract 7g/L, malt extract 3g/L, amiga plus 18 15g/L, ammonium sulfate(NH4)2SO4) 5g/L, potassium phosphate monobasic 1g/L, potassium chloride(KCl) 223.62g/L, glucose 30g/L로 조성된 배지에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 48시간 배양하여 사용한 후 배양액의 20% 글리세린을 첨가하여 -80℃ deep freezer에 동결 보관 한 균주를 해동하여 yeast extract 7g/L, malt extract 3g/L, amiga plus 18 15g/L, ammonium sulfate(NH4)2SO4) 5g/L, potassium phosphate monobasic 1g/L, potassium chloride(KCl) 223.62g/L, glucose 30g/L로 조성된 배지에 1% 접종하여 30℃에서 180rpm으로 48시간 배양하여 사용하였다.

단백분해효소 활성 평가는 균체 배양액을 원심분리하여 상등액을 효소액으로 이용하였으며, Azo-Casein(Megazyme ACS 2/99)을 기질 용액 (100 mM sodium acetate buffer, pH 4.5 또는 sodium phospahte buffer, pH 6.0)으로 사용하였다. 활성 측정에 알맞은 농도로 희석된 효소액 1mL와 기질 1mL를 혼합하여 40℃에서 10분간 반응시킨 후 5% trichloroacetic acid (TCA) 6mL을 넣어 상온에서 5분간 방치하여 반응을 종결시켰다. 반응이 종결된 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 분리된 상등액을 파장 440nm에서 흡광도를 측정하였으며, protease activity의 계산은 아래의 계산식 1 에 따랐다.

[계산식 1]

Protease (mUnit/mL) = 146 x Abs.(440nm) - 4

R = 0.99 (Linear absorbance range = 0.1 to 1.0)

*Fungal protease (Aspergillus niger from Sigma Chemical Co.)

이 결과를 표 4에 나타내었다.

표 4의 결과 단백분해효소의 활성이 나타났으며, pH가 산성조건일 때 보다 중성조건일 때 단백분해효소 활성이 높게 나타났다. 따라서 효과적인 단백분해를 위해서는 pH를 중성으로 맞춘 후 자가소화를 실시하는 것이 바람직한 것으로 판단된다.

[실시예 5] Zygosaccharomyces mellis TK-01의 글루타미나아제 활성 측정

본 발명의 Zygosaccharomyces mellis TK-01의 글타미나아제 효소 활성을 측정하기 위해서 실시예 4의 방법으로 준비된 효모 배양액에 글루타민 0.1g/L 첨가하여 24시간 반응 후 상등액을 분리하고, YSI Biochemistry Analyzer를 이용하여 생성된 글루탐산을 측정함으로써 효소활성을 평가하였다. 이 결과를 표 5에 나타내었다.

글루타민 첨가 24시간 후 0.31g/L의 글루탐산이 생성됨을 확인 하였으며, 첨가된 글루타민의 양보다 글루탐산이 많이 생성된 이유는 배지 내 질소원으로 사용된 eHVP에서 유래된 글루타민이 전환된 것으로 판단되며, 이러한 결과에 따라 글루타미나아제 활성이 있는 것으로 나타났다.

[실시예 6] Zygosaccharomyces mellis TK-01의 글루타밀트랜스퍼라아제 활성 측정

본 발명의 Zygosaccharomyces mellis TK-01의 글루타밀트랜스퍼라제(γ- Glutamyl transpeptidase; GGT; EC 2.3.2.2) 활성 측정의 측정은 실시예 4와 같이 배양된 균체 배양액을 10,000 x g 에서 20분간 원심분리하여 상등액을 분리한 후 효소액으로 이용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 1 mmol/L γ-Glutamyl-p-nitroanilide, 20 mmol/L glycylglycine, enzyme solution(미생물 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액)과 완충용액을 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 0.1mol/L HCl을 첨가하여 반응을 종결시키고, 410nm에서 흡광도를 측정하였다. p-nitroaniline을 표준용액으로 하여 γ-Glutamyltranspeptidase의 standard curve를 그리고 아래의 계산식 2을 이용하여 역가를 계산하는데 사용하였다(도 7).

동시에 실시예 5와 같이 글루타미나아제 활성 또한 측정하였다.

[계산식 2]

글루타밀트랜스퍼라아제 역가(GTU/Ml) = (As-Ab) x F x D

As: 효소 시험 용액의 흡광도

Ab: Blank의 흡광도

F: 표준곡선에서 얻어진 흡광도 차가 1.000일 때의 p-nitroaniline 농도 (F=0.011 μmol/mL)

D: 검체의 희석 배수

* 1 glutamyltrasferase unit(GTU): 1분간 1umol의 p-nitroaniline을 유리시키는 효소의 양

이 결과를 표 6에 나타내었다.

표 6의 결과 pH 4.5인 경우, 글루타밀트랜스퍼라제 활성은 없었으나 글루타미나제 활성이 나타나 글루탐산을 생성하였고 pH 8.0일 때, 글루탐산을 생성하지 않아 글루타미나제 활성은 없었으나 글루타밀트랜스퍼라제 활성이 나타났다. 이러한 결과는 하나의 효소가 pH 조건에 따라 글루타미나제 또는 글루타밀트랜스퍼라제 활성을 나타낸다는 선행 연구와 동일한 결과이며, 이는 분리균주인 Zygosaccharomyces mellis TK-01이 산성조건에서는 글루타미나제 활성을 나타내고 알칼리 조건에서는 글루타밀트랜스퍼라제 활성을 타나 낸다는 것을 확인하였다.

[실시예 7] Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주의 효소활성을 이용한 식물 단백질 가수분해물 제조

본 발명의 Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주를 이용하여 식물성 단백질의 가수분해물을 제조하기 위하여 동결 보관한 균주를 해동하여 yeast extract 7g/L, malt extract 3g/L, amiga plus 18 15g/L, ammonium sulfate(NH4)2SO4) 5g/L, potassium phosphate monobasic 1g/L, potassium chloride(KCl) 223.62g/L, glucose 30g/L로 조성된 배지에 균주 배양액 1% 접종하여 rotary shaking incubator에서 180rpm으로 30℃에서 48시간 배양 한 후, 소맥 글루텐 분말(신송산업㈜, 대한민국) 1g/L 를 첨가하였다. 식물 단백질을 첨가하기 전, 1M KOH를 사용하여 pH 6.0으로 조정하고 50℃에서 180 rpm으로 24시간 진탕 교반하면서 자가소화를 유도하였다. 분해과정중 6시간 마다 시료를 채취하여 글루타미나아제, 글루타밀트랜스퍼라아제, 단백분해효소 활성의 측정은 실시예 4, 5, 6와 같은 방법으로 측정 하였다. 반응이 완료된 효모추출물은 80℃에서 30 분간 가열하여 반응을 종료시키고, Celite bed Filtration을 통하여 균체 및 고형분이 제거된 정제 효모추출물을 취득하였다.

이 결과를 표 7에 나타내었다.

표 7의 결과 식물성단백질을 가수분해 분해시간이 증가 할수록 글루탐산의 함량이 증가하는 경향을 보였으며, 또한 글루타밀트랜스퍼라제 활성이 나타나 이를 이용하여 식물성 단백질을 가수분해한다면 γ-Glutamyl compound를 생산할 수 있을 것으로 판단된다. 이러한 결과로 보아 Zygosaccharomyces mellis TK-01 균주는 자가소화시 자체의 단백질뿐 아니라 첨가된 non-yeast protein 을 분해하여 감칠맛의 주 성분인 글루탐산을 생산하여 천연의 정미 소재 개발에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11605P 20141120

Claims (5)

1. 시판 된장으로부터 분리한 내염성 효모인 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주(기탁번호 : KCCM11605P)
2. 제 1항에 있어서, 내염성 효모인 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01(Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주는 글루타미나아제 활성 및 글루타밀트랜스퍼라제 활성 및 프로테아제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 균주
3. 제1항의 내염성 효모인 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주(기탁번호 : KCCM11605P)를 배양하여 글루타미나아제 활성을 가지는 효모 배양물을 생산하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항의 자이고사카로마이세스 멜리스 TK-01 (Zygosaccharomyces mellis TK-01) 균주 또는 그의 배양물과 단백질을 반응시킴을 특징으로 하는, 가수분해된 단백질의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 가수분해된 단백질은 글루탐산인 것을 특징으로 하는, 가수분해된 단백질의 제조방법.

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