CN100558244C

CN100558244C - 饮食品的口味和/或风味的改善方法

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Publication number: CN100558244C
Application number: CNB2004800147551A
Authority: CN
Inventors: 坂本知大; 中村奈巳; 小寺智博; 丹尾式希; 山田律彰; 若林秀彦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-05-27
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2024-05-26
Also published as: EP1629719B1; EP1629719A1; CN1794920A; JPWO2004105503A1; US7255888B2; US20060068056A1; WO2004105503A1; JP4529183B2; EP1629719A4

Abstract

本发明公开了一种通过使表现以下酶特性的微生物来源的氨肽酶作用于蛋白原料，需要时与蛋白酶共同作用于蛋白原料，制造口味和/或风味得到改善的饮食品的方法：(a)具有催化从肽和/或蛋白质的N末端特异性游离出谷氨酸、天冬氨酸的反应的活性；(b)在pH6.0-9.0内的活性为最适pH下的活性的50%或50%以上；(c)在pH7.5、25-60℃、加热30分钟时，其活性为未加热时的活性的40%或40%以上；(d)由SDS-PAGE测定的分子量约为40-60KD，由未变性-PAGE测定的分子量约为300-480KD；以及(e)对Glu-Glu二肽的分解活性5U/mg或以上，优选10U/mg或以上。

Description

饮食品的口味和/或风味的改善方法

技术领域

本发明涉及调味料、调味香料等饮食品的口味和/或风味的改善方法.

背景技术

利用酶来改善口味和/或风味的方法已多有报道。例如，作为增强美味的方法，已知有通过联合使用蛋白酶、肽酶来增加游离氨基酸的手段.这种手段不仅在天然调味料制造，而且在肉的质量和口味的改良中使用(特开平05-276899)。此外，也有如特开平11-075765、特开平07-115969中记载的利用特异作用于脯氨酸的酶的方法。在蛋白酶反应时通过利用γ-GTP(γ谷氨酰转移酶)增加谷氨酸的方法(特开平07-099923)，以谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转换为谷氨酸，增强美味的方法也已为人所知.本发明所述的肽酶也曾报道由于特异游离谷氨酸、天冬氨酸而具有增强美味的作用(特开平2000-325090)。

例如，曲霉被用于制造酱油、豆酱和其他包含蛋白水解物的天然调味料。例如，酱油是经过制曲和发酵2个阶段制造的.原料主要是在制曲阶段由曲霉菌(曲霉属(Aspergillus)丝状菌)所产生的酶来分解。此时，为了改善酱油的口味，增加未过滤的酱油中的游离氨基酸、尤其重要的是游离谷氨酸的量.

氨基酸一般是由原料蛋白质经过2个阶段生成。第一是在蛋白酶的作用下由蛋白质释放出肽，第二是在肽酶的催化作用下由肽水解生成氨基酸.

浅野等人注意到大豆在其发芽过程中，种子中的贮存蛋白在非常短时间分解为氨基酸，并从大豆子叶中找到肽酶类(有效分解含有酸性氨基酸的氨肽酶、以及亮氨酸氨肽酶类)，成功实现了大豆蛋白的有效分解(特开平9-294583号).

大豆氨肽酶从其酶学诸性质看，已经清楚其是目前尚未报道过的新的氨肽酶，并且也只知道其存在于发芽大豆.大豆氨肽酶具有从N末端带有谷氨酸等酸性氨基酸的肽有效游离出N末端酸性氨基酸的活性.已经知道在酱油等含有蛋白水解物的天然调味料中，含有大量难分解性肽-由2个谷氨酸残基构成的二肽.因而，在大豆氨肽酶作用下，将该难分解性二肽分解，可制造谷氨酸游离率高、口味佳的调味液。

二宫等人采用基因组重组技术成功地大量生产了大豆氨肽酶(特开2000-325090)，但由于尚未证实大豆来源的肽酶可作为食品用酶，因而，将由该方法生产的大豆氨肽酶GX用于调味液制造时，在实用化上存在困难。此外，基因重组大豆的温度稳定性差，不适于在50℃以上进行反应，因而，存在实用方面的问题。

有关包括多种食品用微生物的曲霉菌来源的肽酶，已有米曲霉、酱油曲霉来源的肽酶(特开平11-346777号、DE95-1952648、WO98/51163、WO96/28542、WO96/15504、WO98/51803、WO98/14599)的报道.其中，对亮氨酸氨肽酶的报道很多，但未见如大豆氨肽酶GX那样高效率、良好地游离出口感好的谷氨酸的酶活性的肽酶的报道.例如，鲤浏等人以和大豆氨肽酶具有同源性的构巢曲霉(A.nidulans)EST为探针，对构巢曲霉的基因组DNA文库进行筛选，获得了编码来自构巢曲霉的新的氨肽酶的DNA(WO02/077223)。但是，得到的新的氨肽酶，尽管和大豆GX序列同源性接近40％，但其是活性需要钴或锌离子的亮氨酸氨肽酶(LAP).由此，具有大豆氨肽酶样特性的酶，仍不能从大豆以外的来源获得.此外，如上述显示，仅依据序列同源性并不能判断出大豆氨肽酶样活性的有元.

另外，2003年3月31日独立行政法人酒类综合研究所HP公开了曲霉菌(米曲霉RIB40)的EST数据库，序列检索成为可能。

另一方面，作为甜味增强法，通过利用糖分解酶、具有这种酶的微生物，或者将这种酶和其他别的手段并用，来改善甜味和风味的方法已为人所知.例如，在特开平09-299094中，使糖和酶或微生物反应后，进行醇发酵来改善风味.此外特开平09-299094中，通过糖分解酶和糖转移或缩合反应，成功实现了甜味品质的改善。进而，在特开2003-153651中，通过使降解单宁、多糖、蛋白质的分解酶作用于涩味重的茶原料、干燥茶叶，减轻了涩味，增强了甜味、美味。但是通过肽酶的单独作用增强甜味的方法还未见报道.

作为减少盐饱和度(saltiness edge)感的方法，已经报道有以各种抽提物(特开2002-034496)、酶(特开平11-276113)进行处理的方法，或添加大豆矿物质浓缩物(特开平05-049439)等。但是还未见通过肽酶处理减低盐edge感的例子.

此外，有关通过酶全方面改善风味和/或口味的方法，已报道了下面的手段.卵黄的风味改善法中使用了磷酸酯酶，特开2002-325559中明确记载了磷脂酶A1的效果。特开2002-253171中，以γ-谷氨酰转移酶将苦味氨基酸γ-谷氨酰化，成功实现了苦味减轻、酸味增加和口味的改善.此外，特开2000-327692中，在糖转移酶的作用下，改善异黄嘌呤的口味和溶解性.除这些以外，还知道有利用谷氨酸脱羧酶进行口味改善的食品原材料制造法(特开2000-166502)，以谷氨酰胺酶合成茶氨酸、提供口味改善组合物的方法(特开平09-313129)，使用β-primevelosidase改善食品风味的方法(特开平08-140675)，使用脂酶制剂改善油脂风味的改质法(特开平07-135972)，通过并用乳酸菌和脂酶、蛋白酶的面包风味改善法等各种措施，但还未见仅通过使用肽酶来改善风味和/或口味的方法。

发明内容

本发明目的在于，提供谷氨酸、天冬氨酸含量高、口味和/或风味得到改善的饮食品的制造方法。

本研究人员为解决上述技术问题，以和大豆来源的氨基酸肽酶GX基因具有同源性的构巢曲霉(Aspergillus.nidulans)EST为基础，用5’RACE法获得编码大豆来源的氨肽酶样活性的构巢曲霉来源的新的氨肽酶的DNA，进而基于得到的信息，获得编码大豆来源的氨肽酶样活性的米曲霉(Aspergillus·oryzae)、黑曲霉(Aspergillus·niger)、酵母、棒杆菌(Coryneform bacteria)来源的新的氨基肽的DNA.进而发现，根据需要，通过在蛋白酶共存下使这些氨肽酶作用于蛋白质原料，能够制造游离谷氨酸量尤其增加、口味和/或风味增强的饮食品。

即，本发明如下所述.

(1)一种口味和/或风味得以改善的饮食品的制造方法，其包括使表现以下酶特性的微生物来源的氨肽酶作用于蛋白原料，需要时与蛋白酶共同作用于蛋白原料：

(a)具有催化从肽和/或蛋白质的N末端特异性游离出谷氨酸、天冬氨酸的反应的活性；

(b)在pH6.0-9.0内的活性为最适pH下的活性的50％或50％以上；

(c)在pH7.5、25-60℃、加热30分钟时，其活性为未加热时的活性的40％或40％以上；

(d)由SDS-PAGE测定的分子量约为40-60KD，由未变性-PAGE测定的分子量约为300-480KD；以及

(e)对Glu-Glu二肽的分解活性5U/mg或以上，优选10U/mg或以上.

(2)根据(1)所述的方法，氨肽酶是由具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的核酸分子编码的，或者是由能够和具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的核酸分子在严紧条件下进行杂交的核酸分子编码的氨肽酶.

(3)根据(1)所述的方法，氨肽酶是由具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的核酸分子编码的，或者是由能够和具有SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列的核酸分子在严紧条件下进行杂交的核酸分子编码的氨肽酶.

(4)根据(1)所述的方法，氨肽酶是由具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的核酸分子编码的，或者是由能够和具有SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列的核酸分子在严紧条件下进行杂交的核酸分子编码的氨肽酶.

(5)根据(1)所述的方法，氨肽酶是由具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的核酸分子编码的，或者是由能够和具有SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列的核酸分子在严紧条件下进行杂交的核酸分子编码的氨肽酶.

(6)一种口味和/或风味得以改善的饮食品的制造方法，其包括使由具有SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的核酸分子编码的，或者由能够和具有SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的核酸分子在严紧条件下进行杂交的核酸分子编码的氨肽酶作用于蛋白原料，需要时，与蛋白酶共同作用于蛋白原料.

(7)根据(1)-(6)任一项所述的方法，氨肽酶是由经转化的微生物生产的酶.

(8)根据(1)-(7)任一项所述的方法，饮食品是调味料或蛋白水解物或乳酪或含有番茄果汁的饮料或含有豆乳的饮料。

附图说明

图1是表示EAP底物特异性的图表，图1A：米曲霉EAP、图1B：黑曲霉EAP、图1C：棒杆菌EAP、图1D：酵母EAP。

图2是表示EAP温度反应特性的图表，横轴是温度，纵轴是以37℃时的活性值为100时的氨肽酶活性的相对值，图2A：米曲霉EAP、图2B：构巢曲霉EAP、图2C：黑曲霉EAP、图2D：棒杆菌EAP、图2E：酵母EAP。

图3是表示EAP温度稳定性的图表，横轴是保存时间、纵轴是以保存时间0分时的活性值为100时的氨肽酶活性的相对值，图3A：米曲霉EAP、图3B：构巢曲霉EAP、图3C：黑曲霉EAP、图3D：棒杆菌EAP、图3E：酵母EAP.

图4是表示EAP的pH反应特性的图表，横轴是pH、纵轴是以pH7.5时的活性值为100时的氨肽酶活性的相对值，图4A：米曲霉EAP、图4B：构巢曲霉EAP、图4C：黑曲霉EAP、图4D：棒杆菌EAP、图4E：酵母EAP.

图5是表示EAP的pH稳定性的图表，横轴是保存的缓冲液的pH、纵轴是以保存前的活性值为100时的氨肽酶活性的相对值，图5A：米曲霉EAP、图5B：构巢曲霉EAP、图5C：黑曲霉EAP、图5D：棒杆菌EAP、图5E：酵母EAP。

图6是表示EAP对各种长度的肽的反应特性的图表，横轴显示的A、B、C、D表示底物的种类，分别代表A：Glu-Glu、B：Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly、C：Glu-Gly-Val-Tyr-Val-His-Pro-Val、D：Asp-Glu，图6A：米曲霉EAP、图6B：黑曲霉EAP、图6C：棒杆菌EAP、图6D：酵母EAP.

图7是表示EAP对抽提物调味料的口味增强效果的图表。

图8是表示EAP对分离大豆蛋白经市售蛋白酶制剂-蛋白酶M和肽酶制剂-鲜味强化酶(Umamizyme)分解得到的蛋白水解液的添加效果的图表，纵轴表示水解液中所含的游离Glu的量，图8A：米曲霉EAP、图8B：构巢曲霉EAP；1：鲜味强化酶1％+蛋白酶M1％，2：鲜味强化酶2％，3：蛋白酶M2％。

图9是表示EAP对分离大豆蛋白经市售蛋白酶制剂-碱性蛋白酶和肽酶制剂-风味蛋白酶(Flavourzyme)分解得到的蛋白水解液的添加效果的图表，纵轴表示水解液中所含的游离Glu的量，图8A：米由霉EAP、图8B：构巢曲霉EAP；1：碱性蛋白酶1％+风味蛋白酶2％，2：碱性蛋白酶1％+风味蛋白酶1％，3：碱性蛋白酶2％.

具体实施方式

本发明是一种改善饮食品口味和/或风味的方法，其是通过使表现上述酶特性的微生物来源的氨肽酶作用于蛋白质原料，需要时与蛋白酶的共同作用于蛋白质原料来实现的.本发明中使用的氨肽酶尤其是微生物来源的谷氨酸和/或天冬氨酸特异性氨肽酶.

本发明中使用的氨肽酶被由于认为是上述大豆氨肽酶GX在曲霉菌中的对应物，因而在本说明书中有时将本发明中使用的微生物来源的谷氨酸和/或天冬氨酸特异性氨肽酶蛋白记作“EAP”或“氨肽酶EAP”，将编码EAP的基因记作“EAP基因”.此外，在上下文语义清楚的情况下，本发明中使用的微生物来源的谷氨酸和/或天冬氨酸特异性氨肽酶EAP有时也简称作“氨肽酶”.例如，米曲霉来源的谷氨酸和/或天冬氨酸特异性氨肽酶，和构巢曲霉来源的谷氨酸和/或天冬氨酸特异性氨肽酶，有时分别记作米曲霉EAP、构巢曲霉EAP.另一方面，前述大豆来源的氨肽酶(特开2000-325090)有时记作“GX”或“大豆的氨肽酶GX”或“大豆GX”.

此外，本说明书中，“氨肽酶”是指具有催化从肽的N-末端游离出谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸的反应的活性的蛋白质。

编码本发明中使用的氨肽酶EAP的核酸分子可从米曲霉和构巢曲霉等曲霉，例如构巢曲霉A26株的染色体DNA或cDNA按下述方法获得.

以发芽大豆来源的氨肽酶(特开2000-325090)的基因序列和构巢曲霉EST数据库中同源性高的EST片段的核苷酸序列作为参考，制备PCR(聚合酶链式反应)引物，以构巢曲霉cDNA或构巢曲霉染色体DNA作为模板，由PCR法可获得包含编码能够在本发明方法中使用的氨肽酶EAP的核酸分子的克隆。

核酸分子可从由构巢曲霉的Poly(A)RNA制备的cDNA文库获得，例如，可通过以具有SEQ ID NO：17和18所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物的PCR，然后再由以SEQ ID NO：19和20所示寡核苷酸作为引物的5’-RACE而获得。作为用于获得包含全部开放阅读框(ORF)的序列的引物，可以举出具有SEQ ID NO：22和23所示核苷酸序列的寡核苷酸.如上述得到的包含编码构巢曲霉A26来源的氨肽酶基因的基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。此外，cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：2，氨基酸序列示于SEQ IDNO：3。将基因组DNA和cDNA的核苷酸序列进行比较后的结果是，基因组DNA中未发现内含子.

此外，编码本发明中使用的氨肽酶的核酸分子也可从属于曲霉属的其他种的微生物，例如米曲霉的染色体DNA或cDNA获得。具体来说，从米曲霉，例如米曲霉RIB40(ATCC42149)的cDNA由PCR法获得.可通过以上述构巢曲霉来源的氨肽酶的核苷酸序列为基础，合成PCR用的寡核苷酸引物，以由米曲霉RIB40菌株制备的cDNA为模板，由PCR来制备.作为用于该目的的PCR用引物，可以举出dT引物、SEQ ID NO：24所示寡核苷酸序列、用于5’-RACE的SEQID NO：25和26所示寡核苷酸序列、用于得到全部ORF的含有SEQID NO：27和28所示序列的寡核苷酸.

编码如上述得到的米曲霉RIB40的EAP的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：6，氨基酸序列示于SEQ ID NO：7。SEQ ID NO：3所示构巢曲霉EAP的氨基酸序列和SEQ ID NO：7所示米曲霉的氨肽酶的氨基酸序列约具有83％的同源性，约有85个氨基酸不同。米曲霉EAP基因和构巢曲霉EAP基因的同源性，以分析软件GENETYX-MAC Ver.10分析的结果是，在编码区域约为76％，在氨基酸序列水平约为80％.此外，基因组DNA和cDNA的核苷酸序列比较的结果是，米曲霉的基因组DNA中，包含5处内含子。编码米曲霉EAP的基因组核苷酸序列示于SEQ ID NO：4.

依据同样方法，可得到编码黑曲霉、棒杆菌、酵母来源的各氨肽酶EAP的核酸分子.黑曲霉、酵母、棒杆菌来源的各氨肽酶EAP基因的基因组序列分别记于SEQ ID NO：8、11和14，编码区域的核苷酸序列分别记于SEQ ID NO：9、12和15。备EAP的氨基酸序列分别记于SEQ ID NO：10、13和16。

对于SEQ ID NO：6所示cDNA序列中所含ORF，即编码本发明使用的氨肽酶的核苷酸序列，在米曲霉的EST数据库中记载了其全序列。进而，基于前述数据库，还公开了作为该ORF编码的蛋白质的推定功能的“天冬氨酰氨肽酶.然而，业已清楚，本发明人实际得到的酶具有和天冬氨酰氨肽酶显著不同的功能.例如，天冬氨酰氨肽酶游离谷氨酸的活性比天冬氨酸要弱(Cheung，H.S.and Cushman，D.W.B.B.A.242，190-193(1971))。另一方面，本发明的一个特征在于，本发明使用的天冬氨酰氨肽酶游离天冬氨酸的活性和游离天冬氨酸的活性是同等程度.此外，天冬氨酰氨肽酶被认为几乎没有分解二肽这样的短底物的活性(S.Wilk，E.Wilk，R.P.Magnusson，Arch，Biochem.Biochem.Biophys.407(2002)176-183)，因而，本发明的又一个特征在于本发明使用的氨肽酶有效分解包含在酱油酿造过程中常见的难分解性二肽在内的短肽。

这样，本发明是利用与基于米曲霉的EST数据库推测的假想的蛋白质的功能和性质明显不同的功能和性质的方法.

本发明使用的氨肽酶只要是其上述氨肽酶活性不受到损害，也可以是在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列中的1个或1个以上位置进行了1个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨肽酶。此处，“多个”的含义虽然根据氨肽酶蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置和种类有所不同，但通常是指2-85个，优选是2-50个，更优选是2-10个。米曲霉来源的氨肽酶和构巢曲霉来源的氨肽酶之间，虽然有85个氨基酸发生了取代，但如实施例所表明的那样，两者均维持同等程度的活性。因而，只要是上述范围内的氨基酸取代，就可期待氨肽酶活性和特性均维持在足够供本发明方法使用的程度。

编码本发明中使用的氨肽酶EAP的基因包含具有由SEQ IDNO：6所示核苷酸序列中1-1494位碱基构成的核苷酸序列的DNA。此外，该序列也可包含遗传密码子简并性所产生的修饰.进而，编码具有和EAP同等性质的蛋白质的核酸分子，例如可通过位点特异性突变法、对特定位点的氨基酸进行取代、缺失、插入、添加以改变EAP基因的核苷酸序列的方法来得到。此外，上述那样修饰的核苷酸，也可以通过通常所知的突变处理获得。突变处理可以举出将编码氨肽酶的DNA以羟胺等进行体外处理的方法，以及将携带编码氨肽酶的DNA的埃希氏菌属(Escherichia)细菌以紫外线照射、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等在人工突变中通常使用的突变剂进行处理的方法.

此外，上述那样的碱基取代、缺失、插入或添加等中包含曲霉种类或菌株所致的差异等、也包含自然产生的变异.通过使具有上述变异的核酸分子在适当细胞中表达，研究表达产物的EAP活性，可以得到编码和EAP实质上相同的蛋白质的核酸分子.此外，通过从编码发生了变异的EAP的核酸分子或携带其的细胞中，例如序列表的SEQ ID NO：6中所示的核苷酸序列中，分离出和具有由1-1494位碱基构成的核苷酸序列的核酸分子在严紧条件下杂交，并且编码具有EAP活性的蛋白质的核酸分子，也可得到编码和EAP蛋白质实质上相同的蛋白质的核酸分子。此处的“严紧条件”是指所说的特异性杂交形成的条件.该条件由于有赖于各序列的GC含量、重复序列的有无等，难于明确量化表示，但若举例的话，可以举出同源性高的核酸分子之间，例如同源性65％或以上的核酸分子之间进行杂交，而同源性较之要低的核酸分子之间不进行杂交的条件，或在通常的Southern杂交的清洗条件即60℃、相当于1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下，进行杂交的条件.在该种条件下杂交的基因中，有可能包含中间具有终止密码子的基因，由于活性中心的变异而丧失活性的基因，对于这些，可将其通过插入到市售活性表达载体，以下面所述方法测定EAP活性而容易地除去。

此外，本发明使用的构巢曲霉、米曲霉、黑曲霉来源的氨肽酶EAP的同源性以分析软件GENETYX-MAC Ver.10分析的结果是，任意2种氨肽酶的氨基酸序列水平都80％或以上。

编码本发明中使用的氨肽酶的核酸分子，可用于生产本发明中使用的氨肽酶。

使用编码本发明中使用的氨肽酶(EAP)的核酸分子，可用于曲霉等丝状菌的育种或生产EAP.例如，通过将编码EAP的DNA，优选以多拷贝导入到丝状菌(例如米曲霉)细胞内，可使丝状菌的EAP活性增加.此外，通过使编码EAP的核酸分子在适当宿主内表达，可生产EAP.

对导入了编码本发明中使用的氨肽酶的核酸分子的丝状菌，可以举出米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉等曲霉属、脉孢菌(Neurospora crassa)等脉孢霉属(Neurospora)、Rhizomucor miehei等根毛霉属(Rhizomucor)的丝状菌.尤其优选曲霉属丝状菌.

用于将上述核酸分子导入上述丝状菌的载体，没有特别限制，可以使用在丝状菌的育种等中通常使用的载体.例如，米曲霉使用的载体可以举出，pUNG(Lee，B.R.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，44，425-431(1995))、pMARG(Tsuchiya，K.等，Appl.Microbiol.，Biotechnol.，40，327-332(1993))、pUSC(Gomi，K.等，Agric.Biol.Chem.51，2549-2555(1997))等.PUNG具有与米曲霉niaD300(Minetoki，T.等，Curr.Gene.30，423-438(1996))的niaD^-(硝酸同化能力却失)互补的标记，pMARG具有与米曲霉M2-3(Gomi，K.等，Agric.Biol.Chem.，51(9)，2549-2555(1987))的argB^-(需要精氨酸)互补的标记，pUSC具有与米曲霉NS4(Yamada，O.等，Biosci.Biotech.Biochem.，61(8)，1367-1369(1997))的sC^-(硫化酶欠缺)互补的标记.

此类载体中，当使用含有启动子的载体时，通过在该启动子下游符合读框地插入编码EAP的DNA分子，能够使EAP表达.例如，pUNG和pMARG由于具有葡萄糖淀粉酶基因(glaA)的启动子和α-淀粉酶基因(amyB的终止子)，通过在该启动子的下游符合读框地插入编码EAP的DNA(例如SEQ ID NO：6中包含1-1497位碱基的区域)，能够在该启动子控制下使EAP表达。此外，当使用不含启动子的载体时，例如pUCS等，通过将插入有上述DNA的pUC19等质粒和pUSC共转化(co-transformation)导入到宿主丝状菌中，能够使EAP表达。得到的宿主丝状菌和EAP可用在本发明的方法中。

此外，下述表1所示的文献中所示的载体、启动子和标记可根据宿主丝状菌选择使用.表1中，启动子的名称以其自然调控的基因编码的酶的名称表示.

表1

丝状菌的转化除上述文献记载的方法外，还可采用任意公知方法。例如，米曲霉可采用下述方法进行转化。

将菌体(分生孢子)接种于DPY培养基(葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母抽提物0.5％、pH5.0)，30℃剧烈振荡培养24小时左右。将培养液以Myracloth(CALBIO CHEM Co.)或灭过菌的纱布等过滤，回收菌体，用灭菌水清洗，将水分尽量排干。将该菌体装入试管，添加1.0％酶液(丝状菌细胞壁溶解酶(Yatalase)，宝酒造(株)生产)，或0.5％NovoZyme(NovoNordisk)和0.5％纤维素酶(例如，CellulaseOnozuka，Yakult公司生产)，0.6M(NH₄)₂SO₄，50M苹果酸，pH5.5)，30℃轻轻振荡3小时左右.用显微镜观察原生质化的程度，若良好则保存于冰上.

接着将上述酶反应液以Myracloth过滤除去菌体残渣，在含有原生质体的滤液中加入等量缓冲液A(1.2M山梨醇、50mM CaCl₂、35mMNaCl₂、10mM Tris-HCl、pH7.5)，置于冰上.将其在0℃以1500-2500rpm离心5-10分钟后，缓慢停止，将沉淀团块以缓冲液A清洗后，悬浮在适量缓冲液A中.在100-200μl原生质体悬浮液中加入20μ以下的DNA溶液(5-10μg)，置于冰上20-30分钟.加入250μl缓冲液B(60％聚乙二醇6000、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl、pH7.5)，轻轻混合，再加入250μl缓冲液B，轻轻混合后，再加入缓冲液B 850μl，轻轻混合后，于室温静置20分钟.此后，加入缓冲液A 10ml，翻转试管，于0℃、1500-2500rpm离心5-10分钟，将沉淀团块悬浮于500μl缓冲液A中.

将适量上述悬浮液加入到预先分装保温的5ml的上层中，层叠于下层培养基(含有山梨醇1.2M、根据标记配置的选择培养基)之上，于30℃培养.将发育菌体在选择培养基中传代，以确认是转化体。进而，也可以由菌体制备重组DNA，通过限制性酶分析或Southern分析等，确认编码EAP的DNA的导入情况.

通过在启动子的适用条件下培养如上述那样得到的转化体，表达EAP基因，生产EAP.例如在将米曲霉作为宿主，使用葡萄糖淀粉酶启动子作为启动子时，通过将米曲霉转化体的孢子悬浮于含有小麦麸、磷酸钾等的培养基中，在大约30℃下大约培养3天，可生产EAP.根据需要，通过将培养物以蒸馏水等稀释，再以匀浆器等处理，可得到含有EAP的酶粗提液.得到的粗提液通过使用凝胶过滤、各种色谱等可对EAP进一步纯化.得到的EAP再由盐析、等电点沉淀、凝胶过滤、离子色谱、逆向色谱等进一步纯化后，可用于从肽中游离酸性氨基酸。

此外，通过将EAP活性得到增强的微生物转化体的培养物直接，或必要时和蛋白分解酶(蛋白酶)一起，与蛋白原料直接混合，作用于蛋白或其混合物，也可得到游离氨基酸含量高、口味和/或风味得到改善的调味料，蛋白水解物等饮食品。作为作用对象的蛋白原料，例如可以举出，大豆、小麦、小麦面筋、玉米粉(cornmeal)、奶酪、鲣鱼(bonito)、干鲣鱼(dried bonito)、鱼肉、用于食品的所有蛋白质，也可以是脱脂大豆或经过膨化或可溶化等加工的各种蛋白质，或从这些各种原料分离得到的分离蛋白质。使用蛋白分解酶时，可以是市售的酶制剂，也可以包含细胞壁分解酶等其他酶.可以使用曲霉属或杆菌(Bacillus)属生产的蛋白分解酶，例如可以使用，鲜味强化酶、蛋白酶M、风味蛋白酶和碱性蛋白酶等市售酶制剂.

能够通过谷氨酸和/或天冬氨酸特异性肽酶的作用改善风味和/或口味的含有蛋白质或肽的食品，例如包括，酱油、豆酱等酿造或发酵食品，乳酪、酸奶等乳制品，蔬菜汁、果汁等饮料，豆乳、豆腐等大豆食品，面包、面条等小麦食品，鱼糕、圆筒状鱼糕等鱼糕和水制造的食品，香肠、火腿等畜内品等，包括的食品范围广泛，并不局限于这些.

作为转化体微生物的培养物或粗制酶作用于蛋白质的实用条件，例如，可在0.2-50％，优选1-20％浓度的蛋白原料中添加纯化酶或根据需要再添加蛋白分解酶，混合，于5-55℃，优选30-55℃反应1分钟-10天，优选1小时-10天。

反应结束后，未反应的蛋白原料、菌体等不溶物可采用离心分离、过滤等常用分离方法除去.此外，根据需要，可通过减压浓缩、反渗透等进行浓缩，浓缩产物也可通过冷冻干燥、减压干燥、喷雾干燥等干燥处理而粉末化或颗粒化.由此，可得到游离谷氨酸含量高、口味和/或风味改善的调味料、蛋白质分解物等饮食品。

实施例

实施例1.编码构巢曲霉EAP的基因组DNA的克隆

以发芽大豆来源的氨肽酶的序列为基础，用构巢曲霉的cDNA数据库(http://www.genome.ou.edu/fungal.html)进行了同源检索，找到了同源性高的ESTp0f10a1.f1。

基于该情报，由构巢曲霉cDNA如下进行构巢曲霉EAP的克隆。

构巢曲霉A26株(可从Fungal Genetics Stock Center，Departmentof Microbiology，University of Kansas Medical Center购买)以YG培养基(0.5％酵母抽提物、2.5％葡萄糖、0.1％微量元素^＊、pH6.5)50ml于30℃振荡培养48小时(微量元素^＊：0.1％FeSO₄·7H₂O、0.88％ZnSO₄·7H₂O、0.04％CuSO₄·5H₂O、0.015％MnSO₄·4H₂O、0.01％Na₂BO₄·10H₂O、0.005％(NH₄)₆MoO₂₄·4H₂O)。

回收菌体，于液氮中冻干后，以研钵粉碎.用RNA easy Plant MiniKit(QIAGEN公司)从粉碎物制备总RNA，用OligotexdT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa公司)制备mRNA.用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(TaKaRa公司)由该mRNA合成cDNA.以得到的cDNA为模板，使用具有依据构巢曲霉ESTp0f10a1.f1序列设计的下述序列的寡核苷酸作为引物，由PCR和5’RACE法克隆全长cDNA.

(5’末端引物)

CGC ATT CCG ACG TTG GCT ATC C(SEQ ID NO：17)

(3’末端引物)

ATG TTG GAA GAG CTC TTG AAG AG(SEQ ID NO：18)

PCR反应是在94℃热变性3分钟后，以94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒为一个循环，共进行25个循环。其结果是，由于扩增得到预想大小的DNA片段，插入到了质粒pUC19中。以该质粒转化大肠杆菌JM109，从该转化体制备质粒DNA，以确定核苷酸序列.其结果表明，是和EST数据库所示序列相同的序列。

接着，为了得到构巢曲霉总ORF序列，采用5’RACE法和3’RACE法。PCR的反应条件是，在94℃热变性9分钟后，以94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行30个循环，再在72℃反应5分钟.其结果是，利用SEQ ID NO：19和20作为引物，由5’RACE法确定了5’侧的总ORF序列，利用SEQ ID NO：21，由3’RACE法确定了3’侧的总ORF序列。利用SEQ ID NO：22和23作为引物，由PCR得到约为1500bp的包含总ORF的扩增片段.这些DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO：2，由核苷酸序列预想的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。

将上述构巢曲霉EAP的cDNA片段插入到pUC19的HincII位点.此外，在插入序列的上游连接trp启动子，构建pUCtrpnidGX。获得以得到的质粒转化的大肠杆菌JM109株.

(5’RACE用引物)

TAG GGA ACA GTT GAG TCT C(SEQ ID NO：19)

(5’RACE用引物)

TCC GTG TGA GCC CCG ATC ATG(SEQ ID NO：20)

(3’RACE用引物)

TCC CGC TAC AAC TCT TTG TCG T(SEQ ID NO：21)

(5’末端引物)

ATG ACG TCT AAT CTA ACG AAG(SEQ ID NO：22)

(3’末端引物)

GAT TCA CTA GCC CTC GCA CTA C(SEQ ID NO：23)

实施例2.米曲霉来源的和构巢曲霉EAP相同的cDNA的克隆

(1)米曲霉来源的cDNA的获得

米曲霉RIB40(ATCC42149)以含有50ml的1.5％分离大豆的培养基于30℃培养64小时.过滤收集菌体，回收1g.立即以液氮冻干该菌体，用研钵粉碎后，使用Plant Mini Kit(QIAGEN公司)制备总RNA，用oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa公司)制备mRNA.使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(TaKaRa公司由该mRNA合成cDNA.

(2)与构巢曲霉来源EAP相当的米曲霉来源氨基肽的克隆

以实施例1得到的构巢曲霉的EAP序列作为参考，由使用SEQ IDNO：24所示寡核苷酸和dT引物接头引物的3’RACE，和使用SEQ IDNO：25和26的5’RACE，克隆与构巢曲霉的氨肽酶EAP同源的米曲霉来源的cDNA克隆.

(3’RACE用5’末端引物)

TCC ACC TTG ATC GCC AGG AGA CTT(SEQ ID NO：24)

(5’RACE用引物)

TAG GGA ACA ATT GGG TCT C(SEQ ID NO：25)

(5’RACE用引物)

GGC TTC CAT TTC TTG CCG(SEQ ID NO：26)

3’RACE的PCR反应是在94℃热变性9分钟后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟为一个循环，进行35个循环.由此得到约800bp的与构巢曲霉来源的氨肽酶EAP同源的基因片段.5’RACE的PCR反应是以94℃30秒、53℃30秒、72℃1分钟为一个循环，进行35个循环.由此分别得到约300bp的与构巢曲霉来源的氨肽酶EAP同源的基因片段。使用SEQ ID NO：27和28所示序列，通过PCR反应，得到约1500bp的含有总ORF的核苷酸序列.PCR反应是以94℃30秒、54℃30秒、72℃45秒为一个循环，进行25个循环.

(5’末端引物)

ATG ACT TCG AAA ATC GCC CAA AAT TTG AAG(SEQ IDNO：27)

(3’末端引物)

TCA GTC AAC AAA GAT TGT CTT TGA CGTG(SEQ IDNO：28)

由于确定上述基因片段的核苷酸序列后显示，该序列含有与构巢曲霉来源的氨肽酶EAP同源的全长序列，因而推定该基因是在米曲霉中编码与构巢曲霉EAP对应的氨肽酶的基因.此外，以米曲霉基因组DNA为模板，使用SEQ ID NO：27和28所示引物，进行PCR可得到含有5个内含子的约1800bp的核苷酸序列.含有该内含子的米曲霉的基因组序列示于SEQ ID NO：4.此外，编码米曲霉来源氨肽酶的全长cDNA核苷酸序列示于SEQ ID NO：6，米曲霉来源的氨肽酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO：7.

以将该片段插入到质粒pUC19得到的质粒转化大肠杆菌JM109株.此外，在cDNA上游连接trp启动子，获得表达用载体pUCtrpoGX。以得到的载体转化大肠杆菌JM109株.

实施例3.与构巢曲霉和米曲霉来源EAP同源的黑曲霉来源的EAP的cDNA的克隆

(1)黑曲霉来源的氨肽酶cDNA的获得

将黑曲霉(JCM2261)以50ml含有1.5％分离大豆的培养基于30℃培养64小时.过滤收集菌体，回收1g.立即以液氮冻干该菌体，用研钵粉碎后，使用Plant Mini Kit(QIAGEN公司)制备总RNA，用oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa公司)制备mRNA。使用TakaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(TaKaRa公司由该mRNA合成cDNA.

(2)与构巢曲霉和米曲霉来源EAP同源的黑曲霉来源的EAP的克隆

对应于实施例1得到的构巢曲霉和实施例2得到的米曲霉的EAP的序列间具有100％同源性的序列部位，设计SEQ ID NO：29和SEQID NO：30所示引物.利用两个引物，获得黑曲霉来源氨肽酶EAP的部分cDNA。以其为模板，通过利用SEQ ID NO：31所示寡核苷酸和dT接头引物(adapter primer)的3’RACE，和利用SEQ ID NO：32的5’RACE，克隆与构巢曲霉和米曲霉来源EAP同源的黑曲霉来源EAP的cDNA。3’RACE使用3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends(Invitrogen公司)，5’RACE使用5’RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen公司).

(部分cDNA获得用5’侧引物)

TTG TCC TTT GTC AAT GC(SEQ ID NO：29)

(部分cDNA获得用3’侧引物)

CGG ATA CTG TGC ATG CTT(SEQ ID NO：30)

(3’RACE用引物)

CAA CAA GGG CCC TGT TAT C(SEQ ID NO：31)

(5’RACE用引物)

CTT TGC CGA CTG AAC GGC(SEQ ID NO：32)

3’RACE的PCR反应是在94℃热变性9分钟后，以94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟为一个循环，进行35个循环。由此得到约120bp的与构巢曲霉和米曲霉来源的EAP同源的基因片段。5’RACE的PCR反应是以94℃30秒、53℃30秒、72℃1分钟为一个循环，进行35个循环.由此分别得到约100bp的与构巢曲霉和米曲霉来源的EAP同源的黑曲霉基因片段。使用SEQ ID NO：33和34所示序列，通过PCR反应，得到约1500bp的含有总ORF的核苷酸序列.PCR反应是以94℃30秒、54℃30秒、72℃45秒为一个循环，进行25个循环。

(3’末端引物)

GTA AGG AGG TTT AAA ATG ACT TCG AAA ATC GCC C(SEQ ID NO：33)

(5’末端引物)

CTA ATC AAC AAA GAT GGT CTT GGA AAG ATT GGC G(SEQ ID NO：34)

以上述基因片段为基础，确定编码黑曲霉来源EAP的全长cDNA的核苷酸序列，示于SEQ ID NO：9.此外，黑曲霉来源的EAP的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10.

以将该片段插入到质粒pUC19得到的质粒转化大肠杆菌JM109株.此外，在cDNA上游连接trp启动子，获得表达用载体pUCtrpnigGX.以得到的载体转化大肠杆菌JM109株.

实施例4.与酵母属(Saccharomyces)来源的大豆GX同源的基因的克隆

(1)酵母属来源基因组DNA的获得

将酵母菌YPH500(IF010506)以由YPD(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)和腺嘌呤构成的培养基50ml，于30℃培养过夜.用Gen Toru-Kun(酵母用)(TaKaRa公司)由培养液提取基因组DNA。

(2)与大豆GX相当的酵母属来源EAP的克隆

从酵母属的基因组数据库中检索与特开平9-294583记载的大豆GX序列具有同源性的序列后，确认了具有43％同源性的序列，并确定了起始密码子和终止密码子的位置.以其为基础，设计SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示引物，利用这两个引物，由基因组DNA克隆酵母属来源EAP的基因片段.

(5’侧引物)

CTA TGT TCA GGA TAC AAC TGA GAA(SEQ ID NO：35)

(3’侧引物)

CAG TTT AGA CAA CAA TTT CAG ATT(SEQ ID NO：36)

以上述基因片段为基础，确定编码酵母属来源EAP的全长DNA的核苷酸序列，示于SEQ ID NO：12.此外，酵母属来源的EAP的氨基酸序列示于SEQ ID NO：13.

以将该片段插入到质粒pUC19得到的质粒转化大肠杆菌JM109株。此外，在cDNA上游连接trp启动子，获得表达用载体pUCtrpnigGX.以得到的载体转化大肠杆菌JM109株.

实施例5.棒杆菌来源的与大豆GX同源的基因的克隆

(1)棒杆菌来源基因组DNA的获得

将棒杆菌(ATCC13869)以由LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、1％氯化钠)50ml，于30℃培养过夜。用Gen Toru-Kun(酵母用)(TaKaRa公司)由培养液提取基因组DNA。

(2)与大豆GX相当的棒杆菌来源的氨肽酶的克隆

从棒杆菌的基因组数据库中检索与特开平9-294583记载的大豆GX序列具有同源性的序列后，确认了和编码天冬酰胺氨肽酶的序列有48％同源性的序列。以其为基础，设计SEQ ID NO：37和SEQ IDNO：8所示引物，利用这两个引物，由基因组DNA克隆棒杆菌来源EAP的基因片段.

(5’侧引物)

GTA AGG AGG TTT AAA ATG CAT GTA ACT GAC GAT TTCTTA AGT TTT ATT GCC C(SEQ ID NO：37)

(3’侧引物)

TTA ATT TAC CAG ATA GGC TTC CAG GGC TT(SEQ IDNO：38)

以上述基因片段为基础，确定编码棒杆菌来源EAP的全长DNA的核苷酸序列，示于SEQ ID NO：15.此外，棒杆菌来源的EAP的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16.

以将该片段插入到质粒pUC19得到的质粒转化大肠杆菌JM109株.此外，在cDNA上游连接trp启动子，获得表达用载体pUCtrpnigGX.以得到的载体转化大肠杆菌JM109株。

实施例6.构巢曲霉EAP和米曲霉EAP、黑曲霉EAP、酵母EAP以及棒杆菌EAP在大肠杆菌JM109株中的大量表达

(1)构巢曲霉EAP和米曲霉EAP、黑曲霉EAP、酵母EAP以及棒杆菌EAP的纯化

将以pUCtrpGX转化的菌以新鲜培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)，于30℃振荡培养8小时。接着，将得到的培养液5ml加入到350ml酪蛋白氨基酸培养基(Na₂HPO₄0.6％、KH₂PO₄ 0.3％、NH₄Cl 0.1％、NaCl 0.05％、酪蛋白氨基酸1％、硫胺素0.0002％、MgSO₄ 1mM、CaCl₂ 1mM、葡萄糖0.1％)，于37℃培养20小时.只有棒杆菌的培养温度是34℃。将得到的菌体依据常规方法破碎，得到细胞抽提液。在该细胞抽提液中添加硫酸铵，收集40％-65％硫酸铵沉淀部分。但是，仅酵母是收集0％-40％的部分。将上述部分以50mM磷酸缓冲液(pH7.5)悬浮，以预先以前述磷酸缓冲液平衡的凝胶过滤柱(Sephadex 200，Amersham Biotech公司生产)分离，可得到粗制EAP.将得到的酶液以超滤浓缩.再将粗制EAP用阴离子交换柱(mono Q，Amersham Biotech公司生产)再次分离，得到纯化EAP.

得到的纯化EAP在未变性聚丙烯酰胺凝胶上显示约300-480KD的分子量，在变性聚丙烯酰胺凝胶上显示约40-60KD的分子量。

实施例7.氨肽酶EAP的特性分析

上述制备的酶纯化液中的氨肽酶活性如下测定。即，在5mMGlu-Glu(50mM HEPES缓冲液，pH7.5)0.16ml中添加酶纯化液0.02ml，于37℃反应10分钟后，添加20％醋酸0.02ml，使反应停止.反应液中游离Glu量用谷氨酸测定试剂盒(Yamasa酱油公司生产)测定。活性是以每分钟生成1μmol Glu的酶活性作为1个单位(U)。

其结果是，得到的纯化氨肽酶表现出酶学各性质.

(i)底物特异性

EAP的活性测定可用Glu-pNA作为底物.即，在1mM Glu-pNA(50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)0.75ml中，添加酶液0.02ml，于37℃反应10分钟后，添加40％醋酸0.25ml，使反应停止。测定反应液在405nm的吸光度，测定活性.活性是以每分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶活性作为1个单位(U)。用X-pNA代替Glu-pNA，测定各种X-pNA的分解活性.以最大分解活性值为100，相对活性值示于图1.表明本酶特异性有效分解N末端酸性氨基酸，即谷氨酸和天冬氨酸这两种氨基酸.

(ii)温度反应特性

在以上述Glu-Glu作为底物的活性测定法中，测定了在各温度下EAP的活性.以37℃的活性值为100，相对活性值示于图2。图2表明，在30℃-60℃范围，更优选37℃-50℃范围，相对活性高。

(iii)温度稳定性

在以上述Glu-Glu作为底物的活性测定法中，在各温度保存EAP10、20、30、40、60分钟后，以上述活性测定方法测定EAP活性。以保存时间0分钟时的活性值为100，相对活性值示于图3。

米曲霉EAP、构巢曲霉EAP和黑曲霉EAP在pH7.5、25℃-40℃保存1小时后，残存活性80％或以上。此外，棒杆菌EAP和酵母EAP在pH7.5、25℃-50℃保存1小时后，残存活性80％或以上，在pH7.5、25℃-60℃加热30分钟时，活性是未加热时活性的40％或其以上.

(iv)pH反应特性

在以上述Glu-Glu为底物的活性测定中，代替50mM HEPES缓冲液(pH7.5)，而在反应液中加入总浓度为50mM的各pH的GTA缓冲液。以pH7.5时EAP活性为100。各pH时的活性示于图4.根据图4，在pH6.0-pH9.0范围内，活性是最适pH时的活性的50％或其以上。

(v)pH稳定性

将纯化酶在50mM的各种pH的GTA缓冲液中于0℃保存24小时后，以上述活性测定方法(pH7.5)测定EAP活性。以保存前的活性值为100，相对位示于图5.

米曲霉EAP、构巢曲霉EAP、黑曲霉EAP和酵母EAP，在pH6.0-10.0范围于0℃保存24小时，残存活性均90％或以上.此外，棒杆菌EAP在pH7.0-8.0范围于0℃保存24小时，残存活性也90％或以上。

(vi)对应于肽长度的反应特性

代替Glu-Glu底物，使用在N末端带有Glu、氨基酸残基数不同的其他底物，测定氨基肽的活性。即，在5mM各底物(50mM HEPES缓冲液，pH7.5)0.16ml中，添加酶纯化液0.02ml，于37℃反应10分钟后，添加20％醋酸0.02ml，使反应停止.反应液中的游离Glu量用谷氨酸测定试剂盒(Yamasa酱油公司)测定.活性是以每分钟生成1μmol Glu的酶活性作为1个单位(U)，计算出单位重量的活性值，即比活性(U/mg)，示于图6。使用的底物包括以下四种：(a)Glu-Glu(Bachem公司)、(b)Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly(Bachem公司)(SEQ ID NO：39)、(c)Glu-Gly-Val-Tyr-Val-His-Pro-Val(Bachem公司)(SEQ ID NO：40)、(d)Asp-Glu(Bachem公司)。根据图6，与对二肽的活性比较，对长链肽的活性有增高的倾向。

实施例8.对天然调味料的口味增强效果

在“本造リ一番だし極味かつお”(味之素公司)中添加备种纯化EAP 0.1mg/ml，于37℃反应，在第0、60、120分钟时取样.样品反应液中的游离Glu量用谷氨酸测定试剂盒(Yamasa酱油公司)测定。此外，将反应120分钟后的样品稀释20倍，进行感官评价.

其结果是，米曲霉EAP、黑曲霉EAP和酵母EAP在反应120分钟后，游离Glu量大约增加了300mg/l(参照图7).另一方面，棒杆菌EAP引起的增加为其三分之一左右.此外，感官评价中的美味度与游离Glu量成比例(参照表2)。

表2

-：无变化；+：稍微增强；++：增强；+++：显著增强

实施例9.口味强的蛋白水解物的制备

将5％分离大豆蛋白溶液调制到pH8.0，通过121℃20分钟高压灭菌，进行热变性.在得到的蛋白溶液中添加1％鲜味强化酶(AmanoEnzyme公司)(相对于大豆蛋白质量)，1％蛋白酶M(Amano Enzyme公司)(相对于大豆蛋白质量)，于50℃反应48小时.此后，添加米曲霉EAP 0.2％(质量％)，于37℃反应24小时。米曲霉EAP添加样品和未添加样品中所含的游离Glu量用谷氨酸测定试剂盒(Yamasa酱油公司)测定的结果是，游离Glu量因米曲霉EAP的添加而大约增加了1.5倍(参照图8).

在和上述一样处理的大豆蛋白溶液中，添加1％碱性蛋白酶(Novozymes公司)，于50℃反应48小时.此后，置于121℃10分钟，使碱性蛋白酶失活，再添加1％风味蛋白酶(Novozymes公司)，于37℃反应24小时。接着，添加米曲霉EAP，再在37℃反应24小时.添加米曲霉EAP的样品和未添加样品中所含的游离Glu量，采用和上述一样的方法测定的结果是，游离Glu量因米曲霉EAP的添加而大约增加了2.2倍(参照图9)。

实施例10.乳制品的口味和/或风味的改善

研究米曲霉EAP的添加对乳酪的效果.原料乳使用相同生乳(约35L)。以常规方法脱脂后，脂肪率调到3％.添加规定量的乳酸菌发酵剂(starter)后，将原料乳加热到32℃，添加凝乳酶0.003％(相对于原料)。在确认原料乳凝固后，切割、搅拌以除去大约1/3的乳清蛋白.接着，以1℃/2min的速度缓慢升温至34℃，并搅拌除去另外1/3的乳清蛋白.之后，以1℃/2min的速度缓慢升温至38℃，搅拌1小时后，排除乳清得到凝乳(curd)。米曲霉EAP的添加量是相对于每100g凝乳为0.5mg.此时对照组不添加酶.将酶直接添加到凝乳1500g中，充分搅拌均匀.使用的乳酸菌是Christian Hanson公司的4种混合乳酸球菌(戈达乳酪(Gouda cheese))。添加3％的食盐(相对于凝乳重量)。由于是高温(10℃)熟成，因而在原料乳中添加抑制酪酸菌的硝酸钠0.002％。在预先干燥至生产日起第2天早晨后，在模具中添加乳酪约为375g的凝乳。为了缩短试验周期，在真空包装后保管于10℃熟成室进行熟成.保管140天后，进行感官评价.

米曲霉EAP添加所致的熟成率(可溶化氮元素比例)的增加，与未添加的对照组比较，未见显著差别.可溶化氮元素比例是以在12％三氯乙酸中可溶性部分的氮元素量占总氮元素量的比例而求得.另一方面，由米曲霉EAP添加所致的游离谷氨酸的增加量是1mg/100乳酪.感官评价结果表明，由于米曲霉EAP添加使得乳酪风味增强，产生整体一致感，口感细滑等.此外，乳酪的苦味也因米曲霉EAP添加而消失，推测这是游离谷氨酸增加带来的效果.

实施例11.饮料的口味和/或风味的改善(I)

将番茄(桃太郎、及小番茄)洗净后，以家庭用搅拌机粉碎，制备番茄汁.在该番茄汁100ml中添加米曲霉EAP为3mg/l浓度.添加预加热失活的米曲霉EAP作为对照。反应在37℃进行1小时，反应后对果汁进行感官评价.

由米曲霉处理，游离谷氨酸增加约3％.但是由于果汁中原本存在0.2％(W/W)的游离谷氨酸，因而未见3％游离谷氨酸含量增加对美味度的影响.另一方面，酶处理组由于甜味得到增强，酸味得到抑制，因而，番茄独特的不良口味减弱.该口味和/或风味改善效果未在对照组见到.米曲霉EAP对番茄的效果在小番茄、成熟番茄上尤为显著.

实施例12.饮料口味和/或风味的改善(II)

在市售豆乳饮料(国产豆乳；太子食品工业株式会社)100ml中，添加米曲霉EAP至3mg/l浓度。以预先加热失活的肽酶作为对照。将这些于37℃反应1小时后，用于感官评价.

未见到因对豆乳进行米曲霉EAP处理所致的谷氨酸量的增加.因而，未见美味增强.但是，酶添加组和对照组比较，豆乳独特的清臭味(己醛味)减弱，并且变温和，对豆乳的口味和/或风味的改善效果能够得到确认.

根据本发明，提供游离氨基酸量增加，口味增强的饮食品的制造方法。尤其能够有效分解酱油酿造等条件下存在Glu-Glu之类难分解性肽，制造口味强化的调味液.通过和市售蛋白酶、肽酶制剂一起使用，可增加蛋白水解物中的游离Glu量。这被认为是由于市售蛋白酶、肽酶制剂中几乎不含具有EAP样活性的酶，Glu-Glu之类难分解肽原样存留的缘故.这样，根据本发明，通过使用氨肽酶EAP，可进一步增强酱油、蛋白水解物等饮食品的口味.

序列表

<110>Ajinomoto Co.，Inc.

<120>饮食品的口味和/或风味的改善方法

<130>OP05128

<150>JP 2003-148917

<151>2003-05-27

<160>40

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1474

<212>DNA

<213>Aspergillus nidulance

<400>1

atgcctctcc tactcccttt cacgccgtca attcggccag gaatctcctc gcaaatgcgg 60

gtttccaaga gatcaaggag aaagactcgt gggcttctac ttgccgccct ggtggaaaat 120

attacttgac tcgcaaccag tcaactatag tggctttcgc agttggcaag aaatggaagc 180

ctggaaatgc gatcgccatg atcggggctc acacggactc ccccgtgctg aggatcaagc 240

ccgttagtaa taaacgtggt gaaggttaca tccaagtcgg cgtcgagact tacggcggcg 300

gtatttggca tacttggttt gatcgtgatc ttggagttgc aggtcgcgcg atggttcgaa 360

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tgttccctat cgcaggcatg attgctgcgg aactaaaccg tactggccaa gccgagggtg 540

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ctatcacaga gcgccaccac ccgcatattg tagagctcat cgctgccgag gcaggtgtgg 660

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<220>

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100 105 110

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65 70 75 80

Pro Gly Asn Pro Ile Ser Met Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Val

85 90 95

Leu Arg Ile Lys Pro Val Ser Asn Lys Arg Gly Glu Gly Phe Val Gln

100 105 110

Val Gly Val Glu Thr Tyr Gly Gly Gly Ile Trp His Thr Trp Phe Asp

115 120 125

Arg Asp Leu Gly Val Ala Gly Arg Ala Met Val Arg Thr Gly Asp Gly

130 135 140

Ser Ile Val Gln Lys Leu Val Lys Ile Asp Arg Pro Ile Leu Arg Ile

145 150 155 160

Pro Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Arg Gln Glu Thr Phe Ala Phe Asn

165 170 175

Lys Glu Thr Gln Leu Phe Pro Ile Ala Gly Leu Val Ala Ala Glu Leu

180 185 190

Asn Arg Thr Ala Asp Ser Thr Ala Thr Gly Glu Lys Thr Ala Ala Asn

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Asn Glu Thr Glu Lys Gly Asp Phe Ala Pro Leu Lys Ser Val Thr Glu

210 215 220

Arg His His Pro Tyr Leu Val Glu Leu Ile Ala Ala Glu Ala Gly Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Asp Ile Leu Asp Phe Glu Met Ile Leu Phe Asp Thr Gln

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Lys Ser Cys Leu Gly Gly Leu Leu Glu Glu Phe Val Phe Ser Pro Arg

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Leu Asp Asn Leu Asn Ser Ser Phe Cys Ala Thr Val Gly Leu Ile Asp

275 280 285

Ser Val Ala Asp Ala Ser Ala Leu Asp Asp Glu Pro Ser Ile Arg Leu

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Ile Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Ile Gly Ser Arg Thr Ala Gln Gly

305 310 315 320

Ala Asp Ser Asn Val Leu Pro Ala Ile Ile Arg Arg Leu Ser Val Leu

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Pro Ser Ser Thr Ser Gly Asn Glu Asp Leu Ala Thr Ala Phe Glu Glu

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Thr Leu Ser Thr Ser Phe Leu Leu Ser Ala Asp Met Ala His Ala Val

355 360 365

His Pro Asn Tyr Ala Ala Lys Tyr Glu Asn Asp His Arg Pro Glu Ile

370 375 380

Asn Lys Gly Pro Val Ile Lys Ile Asn Ala Asn Ala Arg Tyr Ala Thr

385 390 395 400

Asn Ser Pro Gly Ile Val Leu Leu Gln Glu Val Ala Arg Lys Ala Ala

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420 425 430

Asp Ser Ser Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Met Leu Ser Ala Ala Leu

435 440 445

Gly Ala Arg Thr Leu Asp Leu Gly Asn Pro Gln Leu Ser Met His Ser

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Ile Arg Glu Thr Gly Gly Thr Tyr Asp Val Gly His Ser Ile Arg Leu

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Val Asp

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<212>DNA

<213>黑曲霉

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<220>

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<400>9

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Arg Asn Gln Ser Thr Ile Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys Lys Trp Lys

65 70 75 80

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Pro Gly Asn Pro Ile Ser Met Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Val

85 90 95

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Ser Ile Val Gln Lys Leu Ile Lys Ile Asp Arg Pro Ile Leu Arg Ile

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Asn Arg Thr Gly Ala Ser Glu Glu Thr Asp Lys Ala Ala Lys Glu Ala

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Ala Arg Thr Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile

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act gga ttc ttc aag cac tac gcc aat ctt tcc aag acc atc ttt gtt 1488

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Asp

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Leu Ser Phe Val Asn Ala Ser Pro Thr Pro Phe His Ala Val Gln Ser

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Ala Lys Glu Leu Leu Ala Lys Ala Gly Phe Gln Glu Ile Lys Glu Lys

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Arg Asn Gln Ser Thr Ile Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys Lys Trp Lys

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Pro Gly Asn Pro Ile Ser Met Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Val

85 90 95

Leu Arg Val Lys Pro Val Ser Asn Lys Arg Gly Glu Gly Tyr Val Gln

100 105 110

Val Gly Val Glu Thr Tyr Gly Gly Gly Ile Trp His Thr Trp Phe Asp

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165 170 175

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180 185 190

Asn Arg Thr Gly Ala Ser Glu Glu Thr Asp Lys Ala Ala Lys Glu Ala

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210 215 220

His His Pro Tyr Leu Val Glu Leu Ile Ala Ala Glu Ala Gly Val Lys

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Pro Leu Asp Val Leu Asp Phe Glu Met Ile Leu Phe Asp Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Asn Leu Gly Gly Leu Leu Glu Glu Phe Ile Phe Ser Pro Arg Leu

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Asp Asn Leu Asn Ser Ser Phe Cys Ala Thr Val Gly Leu Ile Asp Ser

275 280 285

Val Ala Asp Ser Ser Ala Leu Asp Glu Glu Pro Ala Ile Arg Leu Ile

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Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Ile Gly Ser Arg Thr Ala Gln Gly Ala

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Ser Pro Gly Ile Val Leu Leu Gln Glu Val Ala Arg Lys Ala Gly Glu

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Ser Ser Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Met Leu Ser Ala Ala Leu Gly

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Ala Arg Thr Ser Asp Leu Gly Asn Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile

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Arg Glu Thr Gly Gly Thr Leu Asp Val Ala His Ser Ile Arg Leu Phe

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Asp

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actgaagcga aaactgaaaa ggaaattaat aacggtgagt ttacctccat aaaaacgata 660

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attgaagaca ttgaagactt cgaattgatc ctttatgatc ataatgcatc cactctaggt 780

gggttcaacg atgagtttgt cttctctggt cgattggata atttgacatc ttgtttcaca 840

tcaatgcacg gtttaacgtt ggcggctgac acagaaattg accgagaatc aggcattaga 900

ttgatggcat gctttgatca tgaggagatt ggctcatcct ccgcccaagg ggcagattct 960

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actaaacctt tgtttcactc ggcaatattg gaaacttccg ctaagtcgtt tttcctttca 1080

tctgatgttg ctcatgcagt tcatccaaac tatgcaaaca aatacgaaag ccaacacaaa 1140

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tcaccagggt tggtcttggt gaaaagacta gcagaggctg ctaaagtccc tttgcaattg 1260

tttgtcgtag ctaacgactc accatgcggt tctaccatcg gccccatttt ggcctcaaag 1320

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<211>1473

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Gly Lys Tyr Phe Val Thr Arg Asn Gly Ser Ser Ile Ile Ala Phe Ala

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gtt ggt gga aag tgg gag cct ggt aat cca att gcc att acg ggt gct 288

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Ser Glu Lys Tyr Leu Gln Val Gly Val Glu Thr Tyr Gly Gly Ala Ile

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Ile Gly Gly Leu Gln Glu Asp Lys Thr Glu Ala Lys Thr Glu Lys Glu

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att gaa gac att gaa gac ttc gaa ttg atc ctt tat gat cat aat gca 768

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aac ttc ttg cct aat ata ttg gaa agg ttg tcc atc ctg aag ggg gac 1008

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Gly Ser Asp Gln Thr Lys Pro Leu Phe His Ser Ala Ile Leu Glu Thr

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Ser Ala Lys Ser Phe Phe Leu Ser Ser Asp Val Ala His Ala Val His

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Gly Gly Pro Val Ile Lys Ile Asn Ala Asn Gln Arg Tyr Met Thr Asn

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Pro Leu Gln Leu Phe Val Val Ala Asn Asp Ser Pro Cys Gly Ser Thr

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Gly Asn Pro Val Leu Ser Met His Ser Ile Arg Glu Thr Gly Gly Ser

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gca gac ctg gag ttc caa atc aag tta ttt aag gaa ttt ttt gaa cgc 1440

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Ser Glu Lys Tyr Leu Gln Val Gly Val Glu Thr Tyr Gly Gly Ala Ile

115 120 125

Trp His Ser Trp Phe Asp Lys Asp Leu Gly Val Ala Gly Arg Val Phe

130 135 140

Val Lys Asp Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Ala Arg Leu Val Asp Leu

145 150 155 160

Asn Arg Pro Leu Leu Lys Ile Pro Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Arg

165 170 175

Asp Val Asn Gln Lys Phe Glu Phe Asn Arg Glu Thr Gln Leu Leu Pro

180 185 190

Ile Gly Gly Leu Gln Glu Asp Lys Thr Glu Ala Lys Thr Glu Lys Glu

195 200 205

Ile Asn Asn Gly Glu Phe Thr Ser Ile Lys Thr Ile Val Gln Arg His

210 215 220

His Ala Glu Leu Leu Gly Leu Ile Ala Lys Glu Leu Ala Ile Asp Thr

225 230 235 240

Ile Glu Asp Ile Glu Asp Phe Glu Leu Ile Leu Tyr Asp His Asn Ala

245 250 255

Ser Thr Leu Gly Gly Phe Asn Asp Glu Phe Val Phe Ser Gly Arg Leu

260 265 270

Asp Asn Leu Thr Ser Cys Phe Thr Ser Met His Gly Leu Thr Leu Ala

275 280 285

Ala Asp Thr Glu Ile Asp Arg Glu Ser Gly Ile Arg Leu Met Ala Cys

290 295 300

Phe Asp His Glu Glu Ile Gly Ser Ser Ser Ala Gln Gly Ala Asp Ser

305 310 315 320

Asn Phe Leu Pro Asn Ile Leu Glu Arg Leu Ser Ile Leu Lys Gly Asp

325 330 335

Gly Ser Asp Gln Thr Lys Pro Leu Phe His Ser Ala Ile Leu Glu Thr

340 345 350

Ser Ala Lys Ser Phe Phe Leu Ser Ser Asp Val Ala His Ala Val His

355 360 365

Pro Asn Tyr Ala Asn Lys Tyr Glu Ser Gln His Lys Pro Leu Leu Gly

370 375 380

Gly Gly Pro Val Ile Lys Ile Asn Ala Asn Gln Arg Tyr Met Thr Asn

385 390 395 400

Ser Pro Gly Leu Val Leu Val Lys Arg Leu Ala Glu Ala Ala Lys Val

405 410 415

Pro Leu Gln Leu Phe Val Val Ala Asn Asp Ser Pro Cys Gly Ser Thr

420 425 430

Ile Gly Pro Ile Leu Ala Ser Lys Thr Gly Ile Arg Thr Leu Asp Leu

435 440 445

Gly Asn Pro Val Leu Ser Met His Ser Ile Arg Glu Thr Gly Gly Ser

450 455 460

Ala Asp Leu Glu Phe Gln Ile Lys Leu Phe Lys Glu Phe Phe Glu Arg

465 470 475 480

Tyr Thr Ser Ile Glu Ser Glu Ile Val Val

485 490

<210>14

<211>1263

<212>DNA

<213>棒杆菌

<400>14

atgcatgtaa ctgacgattt cttaagtttt attgccctaa gcccaagttc ctatcacgcg 60

gccgcggcgg tggagcgcag gttgctccat gaggggttca ttcgtcagga agataccgat 120

gaatgggatg cccgccctgg tgggcatgtg acggtgcgtg ggggagcagt agtggcgtgg 180

tgggtgcctg aggatgcttc gccagattcc gggttccgca tcattgggtc acatactgat 240

tcaccgggtt tcaagttaaa gccccgtggg gatctttcct cacacggttg gcagcaggcc 300

ggcgtcgagg tttacggcgg accgatcctg ccaagctggc tggatcgcga gctggcctta 360

gccggtcgca ttgtgcttgc cgacgggtcc gtcaagcttg tcaacaccgg cccgattctg 420

cgcatcccgc acgtggctat tcatttggac cgtactgtta attcccaact cacccttaat 480

ccacagcgtc acctgcagcc tgtgtttgct gttggtgagc ccgacgtatc aattctggat 540

gtcattgctg gtgctgcggt agtggatcct gcagatattg tcagccatga tctgatcacg 600

gtggctaccc aagatgctga agtatttggc gcacatgggg atttcttggc gtctggtcgc 660

ctggataacc tgagcagcgt gcatccatcc atgactgcat tgattgcggc ttcgcaatct 720

gacgatactg gttcggatat tttggttctt gctgcattcg atcatgaaga agtaggaagt 780

aattccacct cgggtgccgg cggccccctg ttggaggatg tactcaaccg tactgctcgc 840

gcgttgggtg cagatgaaga tgagcgacgc cggatgttta accgttccac catggtctca 900

gctgacgcgg cacactccat tcaccccaac ttccccgaga agcatgatca agctaattac 960

cccatcattg gtaaaggtcc tgtattgaag gtcaacgcca accagcgcta cacctccgat 1020

gcagtcactt caggcatgtg gatcagggca tgtcagattg ccggtgtgcc acaccaggtg 1080

tttgccggca acaacgatgt gccgtgtggt tccaccatcg gcccgatcag tgcgactcgc 1140

ctgggtatcg attctgtcga tgtcggtatt ccattgctgt ccatgcactc cgcacgcgaa 1200

atggccggcg tgaaggatct gatgtggttt gaacaagccc tggaagccta tctggtaaat 1260

taa 1263

<210>15

<211>1263

<212>DNA

<213>棒杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1260)

<400>15

atg cat gta act gac gat ttc tta agt ttt att gcc cta agc cca agt 48

Met His Val Thr Asp Asp Phe Leu Ser Phe Ile Ala Leu Ser Pro Ser

1 5 10 15

tcc tat cac gcg gcc gcg gcg gtg gag cgc agg ttg ctc cat gag ggg 96

Ser Tyr His Ala Ala Ala Ala Val Glu Arg Arg Leu Leu His Glu Gly

20 25 30

ttc att cgt cag gaa gat acc gat gaa tgg gat gcc cgc cct ggt ggg 144

Phe Ile Arg Gln Glu Asp Thr Asp Glu Trp Asp Ala Arg Pro Gly Gly

35 40 45

cat gtg acg gtg cgt ggg gga gca gta gtg gcg tgg tgg gtg cct gag 192

His Val Thr Val Arg Gly Gly Ala Val Val Ala Trp Trp Val Pro Glu

50 55 60

gat gct tcg cca gat tcc ggg ttc cgc atc att ggg tca cat act gat 240

Asp Ala Ser Pro Asp Ser Gly Phe Arg Ile Ile Gly Ser His Thr Asp

65 70 75 80

tca ccg ggt ttc aag tta aag ccc cgt ggg gat ctt tcc tca cac ggt 288

Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Pro Arg Gly Asp Leu Ser Ser His Gly

85 90 95

tgg cag cag gcc ggc gtc gag gtt tac ggc gga ccg atc ctg cca agc 336

Trp Gln Gln Ala Gly Val Glu Val Tyr Gly Gly Pro Ile Leu Pro Ser

100 105 110

tgg ctg gat cgc gag ctg gcc tta gcc ggt cgc att gtg ctt gcc gac 384

Trp Leu Asp Arg Glu Leu Ala Leu Ala Gly Arg Ile Val Leu Ala Asp

115 120 125

ggg tcc gtc aag ctt gtc aac acc ggc ccg att ctg cgc atc ccg cac 432

Gly Ser Val Lys Leu Val Asn Thr Gly Pro Ile Leu Arg Ile Pro His

130 135 140

gtg gct att cat ttg gac cgt act gtt aat tcc caa ctc acc ctt aat 480

Val Ala Ile His Leu Asp Arg Thr Val Asn Ser Gln Leu Thr Leu Asn

145 150 155 160

cca cag cgt cac ctg cag cct gtg ttt gct gtt ggt gag ccc gac gta 528

Pro Gln Arg His Leu Gln Pro Val Phe Ala Val Gly Glu Pro Asp Val

165 170 175

tca att ctg gat gtc att gct ggt gct gcg gta gtg gat cct gca gat 576

Ser Ile Leu Asp Val Ile Ala Gly Ala Ala Val Val Asp Pro Ala Asp

180 185 190

att gtc agc cat gat ctg atc acg gtg gct acc caa gat gct gaa gta 624

Ile Val Ser His Asp Leu Ile Thr Val Ala Thr Gln Asp Ala Glu Val

195 200 205

ttt ggc gca cat ggg gat ttc ttg gcg tct ggt cgc ctg gat aac ctg 672

Phe Gly Ala His Gly Asp Phe Leu Ala Ser Gly Arg Leu Asp Asn Leu

210 215 220

agc agc gtg cat cca tcc atg act gca ttg att gcg gct tcg caa tct 720

Ser Ser Val His Pro Ser Met Thr Ala Leu Ile Ala Ala Ser Gln Ser

225 230 235 240

gac gat act ggt tcg gat att ttg gtt ctt gct gca ttc gat cat gaa 768

Asp Asp Thr Gly Ser Asp Ile Leu Val Leu Ala Ala Phe Asp His Glu

245 250 255

gaa gta gga agt aat tcc acc tcg ggt gcc ggc ggc ccc ctg ttg gag 816

Glu Val Gly Ser Asn Ser Thr Ser Gly Ala Gly Gly Pro Leu Leu Glu

260 265 270

gat gta ctc aac cgt act gct cgc gcg ttg ggt gca gat gaa gat gag 864

Asp Val Leu Asn Arg Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ala Asp Glu Asp Glu

275 280 285

cga cgc cgg atg ttt aac cgt tcc acc atg gtc tca gct gac gcg gca 912

Arg Arg Arg Met Phe Asn Arg Ser Thr Met Val Ser Ala Asp Ala Ala

290 295 300

cac tcc att cac ccc aac ttc ccc gag aag cat gat caa gct aat tac 960

His Ser Ile His Pro Asn Phe Pro Glu Lys His Asp Gln Ala Asn Tyr

305 310 315 320

ccc atc att ggt aaa ggt cct gta ttg aag gtc aac gcc aac cag cgc 1008

Pro Ile Ile Gly Lys Gly Pro Val Leu Lys Val Asn Ala Asn Gln Arg

325 330 335

tac acc tcc gat gca gtc act tca ggc atg tgg atc agg gca tgt cag 1056

Tyr Thr Ser Asp Ala Val Thr Ser Gly Met Trp Ile Arg Ala Cys Gln

340 345 350

att gcc ggt gtg cca cac cag gtg ttt gcc ggc aac aac gat gtg ccg 1104

Ile Ala Gly Val Pro His Gln Val Phe Ala Gly Asn Asn Asp Val Pro

355 360 365

tgt ggt tcc acc atc ggc ccg atc agt gcg act cgc ctg ggt atc gat 1152

Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Ile Ser Ala Thr Arg Leu Gly Ile Asp

370 375 380

tct gtc gat gtc ggt att cca ttg ctg tcc atg cac tcc gca cgc gaa 1200

Ser Val Asp Val Gly Ile Pro Leu Leu Ser Met His Ser Ala Arg Glu

385 390 395 400

atg gcc ggc gtg aag gat ctg atg tgg ttt gaa caa gcc ctg gaa gcc 1248

Met Ala Gly Val Lys Asp Leu Met Trp Phe Glu Gln Ala Leu Glu Ala

405 410 415

tat ctg gta aat taa 1263

Tyr Leu Val Asn

420

<210>16

<211>420

<212>PRT

<213>棒杆菌

<400>16

Met His Val Thr Asp Asp Phe Leu Ser Phe Ile Ala Leu Ser Pro Ser

1 5 10 15

Ser Tyr His Ala Ala Ala Ala Val Glu Arg Arg Leu Leu His Glu Gly

20 25 30

Phe Ile Arg Gln Glu Asp Thr Asp Glu Trp Asp Ala Arg Pro Gly Gly

35 40 45

His Val Thr Val Arg Gly Gly Ala Val Val Ala Trp Trp Val Pro Glu

50 55 60

Asp Ala Ser Pro Asp Ser Gly Phe Arg Ile Ile Gly Ser His Thr Asp

65 70 75 80

Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Pro Arg Gly Asp Leu Ser Ser His Gly

85 90 95

Trp Gln Gln Ala Gly Val Glu Val Tyr Gly Gly Pro Ile Leu Pro Ser

100 105 110

Trp Leu Asp Arg Glu Leu Ala Leu Ala Gly Arg Ile Val Leu Ala Asp

115 120 125

Gly Ser Val Lys Leu Val Asn Thr Gly Pro Ile Leu Arg Ile Pro His

130 135 140

Val Ala Ile His Leu Asp Arg Thr Val Asn Ser Gln Leu Thr Leu Asn

145 150 155 160

Pro Gln Arg His Leu Gln Pro Val Phe Ala Val Gly Glu Pro Asp Val

165 170 175

Ser Ile Leu Asp Val Ile Ala Gly Ala Ala Val Val Asp Pro Ala Asp

180 185 190

Ile Val Ser His Asp Leu Ile Thr Val Ala Thr Gln Asp Ala Glu Val

195 200 205

Phe Gly Ala His Gly Asp Phe Leu Ala Ser Gly Arg Leu Asp Asn Leu

210 215 220

Ser Ser Val His Pro Ser Met Thr Ala Leu Ile Ala Ala Ser Gln Ser

225 230 235 240

Asp Asp Thr Gly Ser Asp Ile Leu Val Leu Ala Ala Phe Asp His Glu

245 250 255

Glu Val Gly Ser Asn Ser Thr Ser Gly Ala Gly Gly Pro Leu Leu Glu

260 265 270

Asp Val Leu Asn Arg Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ala Asp Glu Asp Glu

275 280 285

Arg Arg Arg Met Phe Asn Arg Ser Thr Met Val Ser Ala Asp Ala Ala

290 295 300

His Ser Ile His Pro Asn Phe Pro Glu Lys His Asp Gln Ala Asn Tyr

305 310 315 320

Pro Ile Ile Gly Lys Gly Pro Val Leu Lys Val Asn Ala Asn Gln Arg

325 330 335

Tyr Thr Ser Asp Ala Val Thr Ser Gly Met Trp Ile Arg Ala Cys Gln

340 345 350

Ile Ala Gly Val Pro His Gln Val Phe Ala Gly Asn Asn Asp Val Pro

355 360 365

Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Ile Ser Ala Thr Arg Leu Gly Ile Asp

370 375 380

Ser Val Asp Val Gly Ile Pro Leu Leu Ser Met His Ser Ala Arg Glu

385 390 395 400

Met Ala Gly Val Lys Asp Leu Met Trp Phe Glu Gln Ala Leu Glu Ala

405 410 415

Tyr Leu Val Asn

420

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>17

cgcattccga cgttggctat cc 22

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>18

atgttggaag agctcttgaa gag 23

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>19

tagggaacag ttgagtctc 19

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>20

tccgtgtgag ccccgatcat g 21

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>21

tcccgctaca actctttgtc gt 22

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>22

atgacgtcta atctaacgaa g 21

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>23

gattcactag ccctcgcact ac 22

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>24

tccaccttga tcgccaggag actt 24

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>25

tagggaacaa ttgggtctc 19

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>26

ggcttccatt tcttgccg 18

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>27

atgacttcga aaatcgccca aaatttgaag 30

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>28

tcagtcaaca aagattgtct ttgacgtg 28

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>29

ttgtcctttg tcaatgc 17

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>30

cggatactgt gcatgctt 18

<210>31

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>31

caacaagggc cctgttatc 19

<210>32

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>32

ctttgccgac tgaacggc 18

<210>33

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>33

gtaaggaggt ttaaaatgac ttcgaaaatc gccc 34

<210>34

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>34

ctaatcaaca aagatggtct tggaaagatt ggcg 34

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>35

ctatgttcag gatacaactg agaa 24

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>36

cagtttagac aacaatttca gatt 24

<210>37

<211>52

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>37

gtaaggaggt ttaaaatgca tgtaactgac gatttcttaa gttttattgc cc 52

<210>38

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>38

ttaatttacc agataggctt ccagggctt 29

<210>39

<211>6

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>氨肽酶的底物

<400>39

Glu His Phe Arg Trp Gly

1 5

<210>40

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>氨肽酶的底物

<400>40

Glu Gly Val Tyr Val His Pro Val

1 5

Claims

1.一种口味和/或风味得以改善的食品和/或饮料的制造方法，其包括使以下的氨肽酶作用于蛋白质原料，所述的氨肽酶为序列如SEQID NO：6所示的核酸分子编码的氨肽酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的氨肽酶是由经转化的微生物产生的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，食品和/或饮料选自蛋白质水解物、乳酪、含有番茄果汁的饮料以及含有豆乳的饮料。