JPWO2004105503A1 - 飲食品の呈味および／または風味の改善方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、以下の酵素特性を示す微生物由来のアミノペプチダーゼを、必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることによって、呈味、風味の改善された飲食品を製造する方法を開示する：（ａ）ペプチド及び／又はタンパク質のＮ末端からグルタミン酸、アスパラギン酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する、（ｂ）ｐＨ６．０〜９．０において至適ｐＨでの活性の５０％以上の活性を有する、（ｃ）ｐＨ７．５、２５〜６０℃３０分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有する、（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＦにより測定した分子量が約４０〜６０ｋＤであり、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約３００〜４８０ｋＤである、（ｅ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕペプチドに対する分解活性が５Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０Ｕ／ｍｇ以上を示す。
Description
本発明は、調味料、調味料素材等の飲食品の呈味および／または風味の改善方法に関する。
酵素を用いた呈味および／または風味の改質法として既に多くの報告がある。例えばうま味を強化する方法としてプロテアーゼやペプチダーゼを併用して遊離アミノ酸を増加する手段が知られている。この様な手段は天然系調味料製造だけでなく、肉質味改良の際にも用いられる（特開平０５−２７６８９９）。また特開平１１−０７５７６５や特開平０７−１１５９６９で報告されているようにプロリンに特異的に作用する酵素を使用する方法がある。プロテアーゼ反応時にγ−ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）を利用してグルタミン酸を増強する方法（特開平０７−０９９９２３）や、グルタミンをグルタミナーゼでグルタミン酸に変換し、うま味を増強する方法も知られている。本特許記載のペプチダーゼもグルタミン酸やアスパラギン酸を特異的に遊離するため、うま味強化の作用を有することを既に報告している（特開２０００−３２５０９０）。
例えば、醤油、味噌、その他のタンパク質加水分解物を含む天然調味料の製造に、麹菌が利用されている。たとえば、醤油は、製麹および発酵の２段階を経て製造される。主として、製麹段階において、麹菌（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌）が生産する酵素によって原料が分解される。その際、醤油中の呈味性をよくするためには、諸味中の遊離アミノ酸の量、特にグルタミン酸の遊離量を上昇させることが重要である。
一般にアミノ酸は、原料タンパク質から２つの段階を経て生成される。第一は、プロテアーゼによるタンパク質からのペプチドの放出であり、第二はペプチダーゼによって触媒されるペプチドの加水分解によるアミノ酸の生成である。
浅野らはダイズが、その発芽過程において、種子中の貯蔵タンパク質を非常に短時間にアミノ酸まで分解することに着目し、ダイズ子葉中よりペプチダーゼ類（酸性アミノ酸含有ペプチドを効率的に分解するアミノペプチダーゼ、及びロイシンアミノペプチダーゼ群）を見出し、ダイズタンパク質の効率的な加水分解を、行うことに成功した（特開平９−２９４５８３号）。
ダイズのアミノペプチダーゼはその酵素学的諸性質から、それまでに報告されていない新規なアミノペプチダーゼであることが明らかにされた酵素であり、発芽ダイズ以外にはその存在は知られていなかった。ダイズのアミノペプチダーゼはＮ末端にグルタミン酸などの酸性アミノ酸を有するペプチドから、効率的にＮ末端の酸性アミノ酸を遊離する活性を有する。醤油等のタンパク質加水分解物を含む天然調味料には、難分解性のペプチドとしてグルタミン酸２残基からなるジペプチドが多量に含まれていることが知られている。従って、ダイズのアミノペプチダーゼの作用により、このような難分解性ジペプチドを分解し、グルタミン酸の遊離率が高く呈味性の優れた調味液の製造が可能である。
二宮らはダイズのアミノペプチダーゼを遺伝子組換え技術を用いて大量生産することに成功した（特開２０００−３２５０９０）が、この方法により生産したダイズのアミノペプチダーゼＧＸを調味液製造に利用することは、ダイズ由来ペプチダーゼが食品用酵素として認められていないために実用化は困難である。また、組換え体ダイズは、温度安定性が悪く、５０℃以上での反応を行うことに適さず、実用面での課題も残っている。
食品用微生物種を多く含む麹菌のペプチダーゼについては、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ソーヤ由来のもの（特開平１１−３４６７７７号、ＤＥ９５−１９５２６４８、ＷＯ ９８／５１１６３、ＷＯ ９６／２８５４２、ＷＯ ９６／１５５０４、ＷＯ ９８／５１８０３、ＷＯ ９８／１４５９９）について報告されている。そのなかで、ロイシンアミノペプチダーゼについての報告は多いが、ダイズのアミノペプチダーゼＧＸのような、呈味性に優れるグルタミン酸を効率良く遊離する酵素活性を有するペプチダーゼの報告はない。例えば、鯉渕らは、ダイズのアミノペプチダーゼと相同性のあるアスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＳＴをプローブとしてアスペルギルス・ニジュランスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、アスペルギルス・ニジュランスの新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得した（ＷＯ ０２／０７７２２３）。しかし、得られた新規アミノペプチダーゼは、ダイズＧＸと４０％近い配列相同性があるにもかかわらず活性化にコバルトイオン、或いは亜鉛イオンを必要とするロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性を有する酵素であった。このように、ダイズのアミノペプチダーゼ様の特性を有する酵素はダイズ以外からは取得されていない。また、上述のように、配列の相同性からだけではダイズのアミノペプチダーゼ様活性の有無は判断できないことが示されている。
なお、２００３年３月３１日、独立行政法人酒類総合研究所ＨＰにて、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０）のＥＳＴデータベースが公開になり配列の検索が可能となっている。
一方、甘味の増強法として糖質分解酵素や当該酵素を有する微生物を利用して、あるいは当該酵素に更に別の手段を併用して、甘味並びに風味を改質する方法が知られている。例えば特開平０９−２９９０９４では糖質と酵素または微生物を反応させた後、アルコール発酵を行って風味を改質している。また特開平０９−２９９０９４では糖分解酵素と糖転移・縮合反応作用により甘味質の改善に成功している。更に特開２００３−１５３６５１では渋味の多い茶葉原料や乾燥茶葉にタンニン分解、多糖類分解、タンパク質分解を行う分解酵素を作用させて渋味を少なくして、甘みや旨味を増加している。しかしペプチダーゼ単独の作用により甘味を増強する方法は報告されていない。
塩カド感の低減法として各種エキス（特開２００２−０３４４９６）や酵母で処理（特開平１１−２７６１１３）する方法、あるいはダイズミネラル濃縮物（特開平０５−０４９４３９）の添加などが報告されている。しかしペプチダーゼ処理により塩カド感を低減した例は知られていない。
また、酵素による風味・呈味の全般的な改質方法に関しては以下の手法が報告されている。卵黄の風味改善法にはホスホリパーゼが使用されており、特開２００２−３２５５５９ではホスホリパーゼＡ１の効果が明記されている。特開２００２−２５３１７１ではγ−グルタミルトランスペプチダーゼで苦味アミノ酸をγ−グルタミル化し、苦味低減、酸味増加、及び呈味性改善に成功している。また特開２０００−３２７６９２では糖転移酵素を作用させてイソフラボンの味質と溶解性を改善している。これら以外にもグルタミン酸脱炭酸酵素による呈味改善食品素材製法（特開２０００−１６６５０２）、グルタミナーゼ酵素でテアニンを合成し風味改善組成物を提供する方法（特開平０９−３１３１２９）、β−プリメベロシダーゼを用いた食品フレーバー改善法（特開平０８−１４０６７５）、リパーゼ酵素剤を用いる油脂風味の改質法（特開平０７−１３５９７２）、乳酸菌とリパーゼ、プロテアーゼ併用によるパンの風味改善法など様々な手段が知られているが、ペプチダーゼのみの使用で風味・呈味を改質する方法は知られていない。
例えば、醤油、味噌、その他のタンパク質加水分解物を含む天然調味料の製造に、麹菌が利用されている。たとえば、醤油は、製麹および発酵の２段階を経て製造される。主として、製麹段階において、麹菌（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌）が生産する酵素によって原料が分解される。その際、醤油中の呈味性をよくするためには、諸味中の遊離アミノ酸の量、特にグルタミン酸の遊離量を上昇させることが重要である。
一般にアミノ酸は、原料タンパク質から２つの段階を経て生成される。第一は、プロテアーゼによるタンパク質からのペプチドの放出であり、第二はペプチダーゼによって触媒されるペプチドの加水分解によるアミノ酸の生成である。
浅野らはダイズが、その発芽過程において、種子中の貯蔵タンパク質を非常に短時間にアミノ酸まで分解することに着目し、ダイズ子葉中よりペプチダーゼ類（酸性アミノ酸含有ペプチドを効率的に分解するアミノペプチダーゼ、及びロイシンアミノペプチダーゼ群）を見出し、ダイズタンパク質の効率的な加水分解を、行うことに成功した（特開平９−２９４５８３号）。
ダイズのアミノペプチダーゼはその酵素学的諸性質から、それまでに報告されていない新規なアミノペプチダーゼであることが明らかにされた酵素であり、発芽ダイズ以外にはその存在は知られていなかった。ダイズのアミノペプチダーゼはＮ末端にグルタミン酸などの酸性アミノ酸を有するペプチドから、効率的にＮ末端の酸性アミノ酸を遊離する活性を有する。醤油等のタンパク質加水分解物を含む天然調味料には、難分解性のペプチドとしてグルタミン酸２残基からなるジペプチドが多量に含まれていることが知られている。従って、ダイズのアミノペプチダーゼの作用により、このような難分解性ジペプチドを分解し、グルタミン酸の遊離率が高く呈味性の優れた調味液の製造が可能である。
二宮らはダイズのアミノペプチダーゼを遺伝子組換え技術を用いて大量生産することに成功した（特開２０００−３２５０９０）が、この方法により生産したダイズのアミノペプチダーゼＧＸを調味液製造に利用することは、ダイズ由来ペプチダーゼが食品用酵素として認められていないために実用化は困難である。また、組換え体ダイズは、温度安定性が悪く、５０℃以上での反応を行うことに適さず、実用面での課題も残っている。
食品用微生物種を多く含む麹菌のペプチダーゼについては、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ソーヤ由来のもの（特開平１１−３４６７７７号、ＤＥ９５−１９５２６４８、ＷＯ ９８／５１１６３、ＷＯ ９６／２８５４２、ＷＯ ９６／１５５０４、ＷＯ ９８／５１８０３、ＷＯ ９８／１４５９９）について報告されている。そのなかで、ロイシンアミノペプチダーゼについての報告は多いが、ダイズのアミノペプチダーゼＧＸのような、呈味性に優れるグルタミン酸を効率良く遊離する酵素活性を有するペプチダーゼの報告はない。例えば、鯉渕らは、ダイズのアミノペプチダーゼと相同性のあるアスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＳＴをプローブとしてアスペルギルス・ニジュランスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、アスペルギルス・ニジュランスの新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得した（ＷＯ ０２／０７７２２３）。しかし、得られた新規アミノペプチダーゼは、ダイズＧＸと４０％近い配列相同性があるにもかかわらず活性化にコバルトイオン、或いは亜鉛イオンを必要とするロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性を有する酵素であった。このように、ダイズのアミノペプチダーゼ様の特性を有する酵素はダイズ以外からは取得されていない。また、上述のように、配列の相同性からだけではダイズのアミノペプチダーゼ様活性の有無は判断できないことが示されている。
なお、２００３年３月３１日、独立行政法人酒類総合研究所ＨＰにて、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０）のＥＳＴデータベースが公開になり配列の検索が可能となっている。
一方、甘味の増強法として糖質分解酵素や当該酵素を有する微生物を利用して、あるいは当該酵素に更に別の手段を併用して、甘味並びに風味を改質する方法が知られている。例えば特開平０９−２９９０９４では糖質と酵素または微生物を反応させた後、アルコール発酵を行って風味を改質している。また特開平０９−２９９０９４では糖分解酵素と糖転移・縮合反応作用により甘味質の改善に成功している。更に特開２００３−１５３６５１では渋味の多い茶葉原料や乾燥茶葉にタンニン分解、多糖類分解、タンパク質分解を行う分解酵素を作用させて渋味を少なくして、甘みや旨味を増加している。しかしペプチダーゼ単独の作用により甘味を増強する方法は報告されていない。
塩カド感の低減法として各種エキス（特開２００２−０３４４９６）や酵母で処理（特開平１１−２７６１１３）する方法、あるいはダイズミネラル濃縮物（特開平０５−０４９４３９）の添加などが報告されている。しかしペプチダーゼ処理により塩カド感を低減した例は知られていない。
また、酵素による風味・呈味の全般的な改質方法に関しては以下の手法が報告されている。卵黄の風味改善法にはホスホリパーゼが使用されており、特開２００２−３２５５５９ではホスホリパーゼＡ１の効果が明記されている。特開２００２−２５３１７１ではγ−グルタミルトランスペプチダーゼで苦味アミノ酸をγ−グルタミル化し、苦味低減、酸味増加、及び呈味性改善に成功している。また特開２０００−３２７６９２では糖転移酵素を作用させてイソフラボンの味質と溶解性を改善している。これら以外にもグルタミン酸脱炭酸酵素による呈味改善食品素材製法（特開２０００−１６６５０２）、グルタミナーゼ酵素でテアニンを合成し風味改善組成物を提供する方法（特開平０９−３１３１２９）、β−プリメベロシダーゼを用いた食品フレーバー改善法（特開平０８−１４０６７５）、リパーゼ酵素剤を用いる油脂風味の改質法（特開平０７−１３５９７２）、乳酸菌とリパーゼ、プロテアーゼ併用によるパンの風味改善法など様々な手段が知られているが、ペプチダーゼのみの使用で風味・呈味を改質する方法は知られていない。
本発明はグルタミン酸、アスパラギン酸の含量が高く、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法を提供することを目的とする。
本研究者らは上記課題を解決するために、ダイズ由来アミノペプチダーゼＧＸ遺伝子と相同性のあるアスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＳＴを基に、５’ＲＡＣＥ法を用いてダイズ由来アミノペプチダーゼ様活性を有するアスペルギルス・ニジュランス由来の新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得し、さらに、得られた配列情報に基づいてダイズ由来アミノペプチダーゼ様活性を有するアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、酵母、コリネ菌由来の新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得した。さらに、これらのアミノペプチダーゼを必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることにより、特に遊離グルタミン酸量が増加し、呈味および／または風味の増強された飲食品を製造し得ることを見いだした。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の酵素特性を示す微生物由来のアミノペプチダーゼを、必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法：
（ａ）ペプチド及び／又はタンパク質のＮ末端からグルタミン酸、アスパラギン酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する；
（ｂ）ｐＨ６．０〜９．０において至適ｐＨでの活性の５０％以上の活性を有する；
（ｃ）ｐＨ７．５、２５〜６０℃、３０分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有する；
（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約４０〜６０ｋＤであり、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約３００〜４８０ｋＤである；および、
（ｅ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕジペプチドに対する分解活性が５Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０Ｕ／ｍｇ以上を示す。
（２）アミノペプチダーゼが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（３）アミノペプチダーゼが、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（４）アミノペプチダーゼが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（５）アミノペプチダーゼが、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（６）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼを必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法。
（７）アミノペプチダーゼが形質転換微生物により生産されるものである（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法。
（８）飲食品が調味料又はタンパク質加水分解物又はチーズ又はトマト果汁含有飲料又は豆乳含有飲料である（１）〜（７）のいずれか１に記載の方法。
本研究者らは上記課題を解決するために、ダイズ由来アミノペプチダーゼＧＸ遺伝子と相同性のあるアスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＳＴを基に、５’ＲＡＣＥ法を用いてダイズ由来アミノペプチダーゼ様活性を有するアスペルギルス・ニジュランス由来の新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得し、さらに、得られた配列情報に基づいてダイズ由来アミノペプチダーゼ様活性を有するアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、酵母、コリネ菌由来の新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得した。さらに、これらのアミノペプチダーゼを必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることにより、特に遊離グルタミン酸量が増加し、呈味および／または風味の増強された飲食品を製造し得ることを見いだした。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の酵素特性を示す微生物由来のアミノペプチダーゼを、必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法：
（ａ）ペプチド及び／又はタンパク質のＮ末端からグルタミン酸、アスパラギン酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する；
（ｂ）ｐＨ６．０〜９．０において至適ｐＨでの活性の５０％以上の活性を有する；
（ｃ）ｐＨ７．５、２５〜６０℃、３０分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有する；
（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約４０〜６０ｋＤであり、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約３００〜４８０ｋＤである；および、
（ｅ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕジペプチドに対する分解活性が５Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０Ｕ／ｍｇ以上を示す。
（２）アミノペプチダーゼが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（３）アミノペプチダーゼが、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（４）アミノペプチダーゼが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（５）アミノペプチダーゼが、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、（１）記載の方法。
（６）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼを必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法。
（７）アミノペプチダーゼが形質転換微生物により生産されるものである（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法。
（８）飲食品が調味料又はタンパク質加水分解物又はチーズ又はトマト果汁含有飲料又は豆乳含有飲料である（１）〜（７）のいずれか１に記載の方法。
図１は、ＥＡＰの基質特異性を示したグラフである。図１Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図１Ｂ：アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、図１Ｃ：コリネＥＡＰ、図１Ｄ：酵母ＥＡＰ。
図２は、ＥＡＰの温度反応特性を示したグラフである。横軸は温度（℃）、縦軸は３７℃における活性値を１００としたときのアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図２Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図２Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図２Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図２Ｄ：コリネＥＡＰ、図２Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図３は、ＥＡＰの温度安定性を示したグラフである。横軸は保存時間、縦軸は保存時間０分の場合の活性値を１００としたときのアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図３Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図３Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図３Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図３Ｄ：コリネＥＡＰ、図３Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図４は、ＥＡＰのｐＨ反応特性を示したグラフである。横軸はｐＨ、縦軸はｐＨ７．５における活性値を１００としたときのアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図４Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図４Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図４Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図４Ｄ：コリネＥＡＰ、図４Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図５は、ＥＡＰのｐＨ安定性を示したグラフである。横軸は保存した緩衝液のｐＨ、縦軸は保存前の活性値を１００とした場合のアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図５Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図５Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図５Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図５Ｄ：コリネＥＡＰ、図５Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図６は、ＥＡＰの種々の長さのペプチドに対する反応特性を示したグラフである。横軸に示したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは基質の種類を表し、それぞれ、Ａ：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｂ：Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ、Ｃ：Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｄ：Ａｓｐ−Ｇｌｕを意味する。図６Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図６Ｂ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図６Ｃ：コリネＥＡＰ、図６Ｄ：酵母ＥＡＰ。
図７は、かつおエキス調味料に対するＥＡＰの呈味増強効果を示したグラフである。
図８は、分離ダイズタンパクを市販のプロテアーゼ製剤であるプロテアーゼＭと、ペプチダーゼ製剤であるウマミザイムで分解したタンパク加水分解液に対するＥＡＰの添加効果を示したグラフである。縦軸は、加水分解液中に含まれる遊離Ｇｌｕ量を示す。図８Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図８Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ。１：ウマミザイム１％＋プロテアーゼＭ １％；２：ウマミザイム２％；３：プロテアーゼＭ ２％。
図９は、分離ダイズタンパクを市販のプロテアーゼ製剤であるアルカラーゼと、ペプチダーゼ製剤であるフレーバーザイムで分解したタンパク加水分解液に対するＥＡＰの添加効果を示したグラフである。縦軸は、加水分解液中に含まれる遊離Ｇｌｕ量を示す。図９Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図９Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ。１：アルカラーゼ１％＋フレーバーザイム２％；２：アルカラーゼ１％＋フレーバーザイム１％；３：アルカラーゼ１％。
図２は、ＥＡＰの温度反応特性を示したグラフである。横軸は温度（℃）、縦軸は３７℃における活性値を１００としたときのアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図２Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図２Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図２Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図２Ｄ：コリネＥＡＰ、図２Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図３は、ＥＡＰの温度安定性を示したグラフである。横軸は保存時間、縦軸は保存時間０分の場合の活性値を１００としたときのアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図３Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図３Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図３Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図３Ｄ：コリネＥＡＰ、図３Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図４は、ＥＡＰのｐＨ反応特性を示したグラフである。横軸はｐＨ、縦軸はｐＨ７．５における活性値を１００としたときのアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図４Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図４Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図４Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図４Ｄ：コリネＥＡＰ、図４Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図５は、ＥＡＰのｐＨ安定性を示したグラフである。横軸は保存した緩衝液のｐＨ、縦軸は保存前の活性値を１００とした場合のアミノペプチダーゼ活性の相対値である。図５Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図５Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、図５Ｃ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図５Ｄ：コリネＥＡＰ、図５Ｅ：酵母ＥＡＰ。
図６は、ＥＡＰの種々の長さのペプチドに対する反応特性を示したグラフである。横軸に示したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは基質の種類を表し、それぞれ、Ａ：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｂ：Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ、Ｃ：Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｄ：Ａｓｐ−Ｇｌｕを意味する。図６Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図６Ｂ：アルペルギルス・ニガーＥＡＰ、図６Ｃ：コリネＥＡＰ、図６Ｄ：酵母ＥＡＰ。
図７は、かつおエキス調味料に対するＥＡＰの呈味増強効果を示したグラフである。
図８は、分離ダイズタンパクを市販のプロテアーゼ製剤であるプロテアーゼＭと、ペプチダーゼ製剤であるウマミザイムで分解したタンパク加水分解液に対するＥＡＰの添加効果を示したグラフである。縦軸は、加水分解液中に含まれる遊離Ｇｌｕ量を示す。図８Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図８Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ。１：ウマミザイム１％＋プロテアーゼＭ １％；２：ウマミザイム２％；３：プロテアーゼＭ ２％。
図９は、分離ダイズタンパクを市販のプロテアーゼ製剤であるアルカラーゼと、ペプチダーゼ製剤であるフレーバーザイムで分解したタンパク加水分解液に対するＥＡＰの添加効果を示したグラフである。縦軸は、加水分解液中に含まれる遊離Ｇｌｕ量を示す。図９Ａ：アルペルギルス・オリゼＥＡＰ、図９Ｂ：アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ。１：アルカラーゼ１％＋フレーバーザイム２％；２：アルカラーゼ１％＋フレーバーザイム１％；３：アルカラーゼ１％。
本発明は、上述した酵素特性を示す微生物由来のアミノペプチダーゼを、必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることによって呈味および／または風味の改善された飲食品を製造する方法である。特に本発明において使用するアミノペプチダーゼは微生物由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼである。
本発明において使用するアミノペプチダーゼは上述したダイズのアミノペプチダーゼＧＸの麹菌における対応物と考えられるので、本明細書においては、本発明において使用する微生物由来グルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼタンパク質を「ＥＡＰ」または「アミノペプチダーゼＥＡＰ」と記載し、ＥＡＰをコードする遺伝子を「ＥＡＰ遺伝子」と記載することがある。また、文脈上明らかな場合は、本発明で使用する微生物由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼＥＡＰを単に「アミノペプチダーゼ」と称することがある。例えば、本発明で使用する、アスペルギルス・オリゼ由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼ、およびアスペルギルス・ニジュランス由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼは、それぞれアスベルギルス・オリゼＥＡＰおよびアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰと記載することがある。一方、前述したダイズ由来のアミノペプチダーゼ（特開２０００−３２５０９０）は「ＧＸ」または「ダイズのアミノペプチダーゼＧＸ」または「ダイズＧＸ」と記載することがある。
また、本明細書において、特に「アミノペプチダーゼ」とは、ペプチドのＮ−末端からグルタミン酸やアスパラギン酸等の酸性アミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。
本発明に使用するアミノペプチダーゼＥＡＰをコードする核酸分子は、アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス、例えばアスペルギルス・ニジュランスＡ２６株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから以下のようにして取得することができる。
発芽ダイズ由来のアミノペプチダーゼ（特開２０００−３２５０９０）の遺伝子配列とアスペルギルス・ニジュランスＥＳＴデータベース中の相同性の高いＥＳＴ断片のヌクレオチド配列を参考に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）プライマーを作製し、アスペルギルス・ニジュランスｃＤＮＡもしくはアスペルギルス・ニジュランス染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により本発明の方法に使用し得るアミノペプチダーゼＥＡＰをコードする核酸分子を含むクローンを取得することができる。
アスペルギルス・ニジュランスのポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号１７及び１８に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ、さらに配列番号１９及び２０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとする５’−ＲＡＣＥによって、取得することができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を完全に含む配列を得るためのプライマーとして配列番号２２及び２３に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。上記のようにして得られるアスペルギルス・ニジュランスＡ２６由来のアミノペプチダーゼをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。また、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号３に示す。ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡのヌクレオチド配列を比較した結果、ゲノムＤＮＡ中にはイントロンは見出されなかった。
また、本発明に用いるアミノペプチダーゼをコードする核酸分子は、アスペルギルス属の他の種に属する微生物、例えばアスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することもできる。具体的には、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のｃＤＮＡからＰＣＲ法により取得することができる。上記アスペルギルス・ニジュランス由来のアミノペプチダーゼのヌクレオチド配列をもとに、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の菌体より調製したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことにより調製することができる。このためのＰＣＲ用プライマーとしては、ｄＴプライマーと配列番号２４に示すヌクレオチド配列、５’−ＲＡＣＥ用には配列番号２５及び２６に示すヌクレオチド配列、全ＯＲＦを得るには、配列２７および２８に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして得られるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のＥＡＰをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号６に、アミノ酸配列を配列番号７に示す。配列番号３に示すアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰのアミノ酸配列と配列番号７に示すアスペルギルス・オリゼのアミノペプチダーゼのアミノ酸配列は、約８３％の相同性を有しており、約８５アミノ酸残基が異なっている。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ遺伝子とアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ遺伝子との相同性は、解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｅｒ．１０で解析した結果、コード領域では約７６％であり、アミノ酸配列レベルでは８０％以上であった。また、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡのヌクレオチド配列を比較した結果、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡ中にはイントロンが５箇所に含まれていた。アスペルギルス・オリゼＥＡＰをコードするゲノムヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
同様な方法に従って、アスペルギルス・ニガー、コリネ菌、酵母由来の各アミノペプチダーゼＥＡＰをコードする核酸分子を得ることができる。アスペルギルス・ニガー、酵母、コリネ菌由来の各アミノペプチダーゼＥＡＰ遺伝子のゲノム配列をそれぞれ、配列番号８、１１および１４に記載し、コード領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号９，１２および１５に記載した。各ＥＡＰのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０、１３および１６に記載した。
配列番号６に示すｃＤＮＡ配列に含まれるＯＲＦ、すなわち、本発明において使用するアミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列について、アスペルギルス・オリゼのＥＳＴデータベース上にその全配列が記載されている。さらに、前述のデータベース上では、このＯＲＦによってコードされるタンパク質の推定される機能として「アスパルチルアミノペプチダーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）」と記載されている。しかしながら、本発明者らによって実際に得られた酵素はアスパルチルアミノペプチダーゼと著しく異なった機能を有していることが明らかになった。例えば、アスパルチルアミノペプチダーゼはアスパラギン酸と比較してグルタミン酸を遊離する活性が弱い（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｈ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｕｓｈｍａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｂ．Ｂ．Ａ．２４２，１９０−１９３（１９７１））。一方、本発明において使用するアミノペプチダーゼのグルタミン酸を遊離する活性はアスパラギン酸を遊離する活性と同程度である点に本発明の一つの特徴がある。また、アスパルチルアミノペプチダーゼはジペプチドのような短い基質を分解する活性が殆どないとされているが（Ｓ．Ｗｉｌｋ，Ｅ．Ｗｉｌｋ，Ｒ．Ｐ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４０７（２００２）１７６−１８３）、本発明は、本発明において使用するアミノペプチダーゼが醤油醸造過程等において多く見られる難分解性のジペプチドを含む短いペプチドも効率よく分解する点も特徴の一つとする。
このように、本発明はアスペルギルス・オリゼのＥＳＴデータベース上で推定されている仮想的タンパク質の機能および性質とは明らかに異なる機能および性質を利用する方法である。
本発明に用いるアミノペプチダーゼは、上述したアミノペプチダーゼの活性が損なわれない限り、配列番号７に記載のアミノ酸配列において１以上の位置における１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むものであってもよい。ここで、「複数」とは、アミノペプチダーゼタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、通常２〜８５個、好ましくは２〜５０個、最も好ましくは２〜１０個である。アスペルギルス・オリゼ由来のアミノペプチダーゼとアスペルギルス・ニジュランス由来のアミノペプチダーゼの間では８５個のアミノ酸置換が見られるが、実施例に示すように両者は同等の活性を維持していることが明らかになっている。従って、上述の範囲内のアミノ酸置換であればアミノペプチダーゼの活性および特性は本発明の方法に使用するために十分な程度に維持されると期待される。
本発明に用いるアミノペプチダーゼＥＡＰをコードする遺伝子には配列番号６に示すヌクレオチド配列のうち塩基番号１〜１４９４からなるヌクレオチド配列を有するＤＮＡが含まれる。また、当該並列において遺伝暗号の縮重による変更を含んでいても良い。さらに、ＥＡＰと同等の性質を有するタンパク質をコードする核酸分子は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるようにＥＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列を改変することによっても得られる。また、上記のような改変された核酸分子は、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、又は付加、等には麹菌の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有する核酸分子を、適当な細胞で発現させ、発現産物のＥＡＰ活性を調べることにより、ＥＡＰと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。また、変異を有するＥＡＰをコードする核酸分子またはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号６に記載のヌクレオチド配列のうち、塩基番号１〜１４９４からなるヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＥＡＰ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を単離することによっても、ＥＡＰタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。この条件は個々の配列のＧＣ含量や繰り返し配列の有無などに依存するため明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸分子同士、例えば６５％以上の相同性を有する核酸分子同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸分子同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗滌条件である６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれる可能性があるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＥＡＰ活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
なお、本発明で使用するアスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー由来のアミノペプチダーゼＥＡＰの相同性は、解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｅｒ．１０で解析した結果、いずれの２種のアミノペプチダーゼ間でもアミノ酸配列レベルにおいて８０％以上である。
本発明において使用するアミノペプチダーゼをコードする核酸分子は本発明において使用されるアミノペプチダーゼを製造するために使用することができる。
本発明に使用するアミノペプチダーゼ（ＥＡＰ）をコードする核酸分子を用いて、麹菌等の糸状菌の育種、あるいはＥＡＰを製造することができる。例えば、ＥＡＰをコードするＤＮＡを、糸状菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）細胞内に好ましくはマルチコピーで導入することにより、糸状菌の有するＥＡＰ活性を増大させることができる。また、ＥＡＰをコードする核酸分子を適当な宿主で発現させることにより、ＥＡＰを製造することができる。
本発明に使用するアミノペプチダーゼをコードする核酸分子を導入する糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス属、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のニューロスポラ属、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール属に属する糸状菌が挙げられる。アスペルギルス属糸状菌が特に好ましい。
上記のような糸状菌に上述の核酸分子を導入するためのベクターとしては特に制限されず、糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼに用いられるベクターとしては、ｐＵＮＧ（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，４２５−４３１（１９９５））、ｐＭＡＲＧ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０，３２７−３３２（１９９３））、ｐＵＳＣ（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２５４９−２５５５（１９８７））等が挙げられる。ｐＵＮＧはアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０，４３２−４３８（１９９６））のｎｉａＤ−（硝酸資化能欠損）を相補するマーカーを、ｐＭＡＲＧはアスペルギルス・オリゼＭ２−３（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（９），２５４９−２５５５（１９８７））のａｒｇＢ−（アルギニン要求）を相補するマーカーを、ｐＵＳＣはアスペルギルス・オリゼＮＳ４（Ｙａｍａｄａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７））のｓＣ−（ＡＴＰスルフリラーゼ欠損）を相補するマーカーを、それぞれ有している。
このようなベクターのうち、プロモーターを含むベクターを利用する場合は、そのプロモーターの下流にＥＡＰをコードするＤＮＡ分子をフレームを合わせて挿入することによりＥＡＰを発現させることが出来る。例えば、ｐＵＮＧ及びｐＭＡＲＧは、グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーター及びα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢのターミネーター）を有しているので、該プロモーターの下流にＥＡＰをコードするＤＮＡ（例えば配列番号６において塩基番号１〜１４９７を含む領域）をフレームを合わせて挿入することにより、該プロモーター制御下でＥＡＰを発現させることができる。また、プロモーターを含まないベクター、例えばｐＵＣＳ等を利用する場合は、上記ＤＮＡを挿入したｐＵＣ１９等のプラスミドとｐＵＳＣとの共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主糸状菌に導入することによってＥＡＰを発現させることができる。得られる宿主糸状菌またはＥＡＰを本発明の方法に使用することが出来る。
また、以下の表１中に示した文献に記載されているベクター、プロモーター及びマーカーも宿主糸状菌に応じて使用することができる。表１中、プロモーターの名称は天然にその制御下にある遺伝子がコードする酵素名を用いて示してある。
糸状菌の形質転換は、上記文献に記載されている方法の他、任意の公知の方法を採用することができる。例えばアスペルギルス・オリゼは以下のようにして形質転換することができる。
ＤＰＹ培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ５．０）に菌体（分生子）を植菌し、３０℃で２４時間程度激しく振盪培養する。培養液をミラクロス（Ｍｙｒａｃｌｏｔｈ、ＣＡＬＢＩＯ ＣＨＥＭ社製）又は滅菌したガーゼ等で濾過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄し、水分をよく切る。この菌体を、試験管に入れ、酵素液（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ、宝酒造（株）製）、または０．５％ノボザイム（ＮｏｖｏＺｙｍｅ、ノボノルディスク社製）及び０．５％セルラーゼ（例えばＣｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ、ヤクルト社製）、０．６Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭリンゴ酸、ｐＨ５．５）を加え、３０℃で３時間程度穏やかに振盪する。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、良好であれば氷中に保存する。
次に上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、プロトプラストを含む濾液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置く。これを０℃、１５００〜２，５００ｒｐｍで５〜１０分間遠心した後、緩やかに停止させ、ペレットを緩衝液Ａで洗浄し、適量の緩衝液Ａに懸濁する。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液に２０μｌ以下のＤＮＡ溶液（５〜１０μｇ）を加え、２０〜３０分氷中に置く。緩衝液Ｂ（６０％ポリエチレングリコール６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分室温で静置する。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて試験管を反転させ、０℃、１，５００〜２，５００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、予め分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガーに加えて、下層培地（１．２Ｍソルビトールを含有し、マーカーに応じて調製した選択培地）に重層し、３０℃で培養する。生育した菌体を選択培地に植え継いで、形質転換体であることを確認する。さらに、菌体から組換えＤＮＡを調製し、制限酵素解析又はサザン解析等によって、ＥＡＰをコードするＤＮＡが導入されていることを確認してもよい。
使用するプロモーターに適した条件にて上記のようにして得られる形質転換体を培養することによってＥＡＰ遺伝子が発現し、ＥＡＰが産生される。例えば、アスペルギルス・オリゼを宿主に用い、プロモーターとしてグルコアミラーゼプロモーターを使用する場合には、小麦フスマ、リン酸カリウム等を含む培地に形質転換アスベルギルス・オリゼの胞子を懸濁し、約３０℃にて約３日間培養することによりＥＡＰを産生させることができる。必要に応じて培養物を蒸留水等で希釈し、ストマッカー等で処理することによってＥＡＰを含む酵素粗抽出液を得ることができる。得られた粗抽出液はゲル濾過、種々のクロマトグラフィー等を用いることによって更にＥＡＰを精製することもできる。得られたＥＡＰは更に塩析、等電点沈殿、ゲル濾過、イオンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって精製し、ペプチドからの酸性アミノ酸遊離のために使用することができる。
しかしながら、ＥＡＰ活性の向上した形質転換微生物の培養物をそのまま、または必要によりタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）とともにタンパク質原料と直接混合してタンパク質またはその混合物に作用させることにより、遊離アミノ酸含量が高く、呈味および／または風味の改善された調味料、タンパク質加水分解物等の飲食品を得ることもできる。作用させるタンパク質原料としては、例えば大豆、小麦、小麦グルテン、コーンミール、ミルクカゼイン、カツオ、カツオ節、フィッシュミール、食品用に用いられるあらゆるタンパクが挙げられ、さらに脱脂大豆あるいは膨化や可溶化等の加工をされた種々のタンパク質あるいはこれらの種々の原料からの分離タンパク質であってもよい。タンパク質分解酵素を使用する場合、市販の酵素製剤でよく、細胞壁分解酵素等、他の酵素を含むものであっても構わない。アスペルギルス属やバチルス属の微生物が生産するタンパク質分解酵素を使用することができ、例えばウマミザイム、プロテアーゼＭ、フレーバーザイム、アルカラーゼなどの市販の酵素製剤を用いることができる。
グルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的ペプチダーゼを作用させることによって風味・呈味を改善し得るタンパク質、ペプチドを含む食品には、例えば、醤油、味噌などの醸造・発酵食品や、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品、野菜・果実ジュースなどの飲料品、豆乳、豆腐などの大豆食品、パン、麺などの小麦食品、かまぼこ、竹輪などの水練り食品、ソーセージ、ハムなどの畜肉食品などが含まれるが、これらに限定されず広範な食品が含まれる。
形質転換微生物の培養物または粗精製酵素をタンパク質に作用させる実用的条件としては、たとえば０．２〜５０％、好ましくは１〜２０％の濃度のタンパク質原料に精製酵素または必要により更にタンパク質分解酵素を加えて混合し、５〜５５℃、好ましくは３０〜５５℃にて１分間〜１０日間、好ましくは１時間〜１０日間反応させればよい。
反応終了後、未反応のタンパク質原料、菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、従来の分離法を用いて除去することができる。また、必要に応じて減圧濃縮、逆浸透法などにより濃縮を行い、濃縮物は、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理により粉末化または顆粒化することもできる。かくして遊離グルタミン酸含有量が高く、呈味および／または風味の改善された調味料、タンパク質分解物等の飲食品を得ることができる。
本発明において使用するアミノペプチダーゼは上述したダイズのアミノペプチダーゼＧＸの麹菌における対応物と考えられるので、本明細書においては、本発明において使用する微生物由来グルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼタンパク質を「ＥＡＰ」または「アミノペプチダーゼＥＡＰ」と記載し、ＥＡＰをコードする遺伝子を「ＥＡＰ遺伝子」と記載することがある。また、文脈上明らかな場合は、本発明で使用する微生物由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼＥＡＰを単に「アミノペプチダーゼ」と称することがある。例えば、本発明で使用する、アスペルギルス・オリゼ由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼ、およびアスペルギルス・ニジュランス由来のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的アミノペプチダーゼは、それぞれアスベルギルス・オリゼＥＡＰおよびアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰと記載することがある。一方、前述したダイズ由来のアミノペプチダーゼ（特開２０００−３２５０９０）は「ＧＸ」または「ダイズのアミノペプチダーゼＧＸ」または「ダイズＧＸ」と記載することがある。
また、本明細書において、特に「アミノペプチダーゼ」とは、ペプチドのＮ−末端からグルタミン酸やアスパラギン酸等の酸性アミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。
本発明に使用するアミノペプチダーゼＥＡＰをコードする核酸分子は、アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス、例えばアスペルギルス・ニジュランスＡ２６株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから以下のようにして取得することができる。
発芽ダイズ由来のアミノペプチダーゼ（特開２０００−３２５０９０）の遺伝子配列とアスペルギルス・ニジュランスＥＳＴデータベース中の相同性の高いＥＳＴ断片のヌクレオチド配列を参考に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）プライマーを作製し、アスペルギルス・ニジュランスｃＤＮＡもしくはアスペルギルス・ニジュランス染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により本発明の方法に使用し得るアミノペプチダーゼＥＡＰをコードする核酸分子を含むクローンを取得することができる。
アスペルギルス・ニジュランスのポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号１７及び１８に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ、さらに配列番号１９及び２０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとする５’−ＲＡＣＥによって、取得することができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を完全に含む配列を得るためのプライマーとして配列番号２２及び２３に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。上記のようにして得られるアスペルギルス・ニジュランスＡ２６由来のアミノペプチダーゼをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。また、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号３に示す。ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡのヌクレオチド配列を比較した結果、ゲノムＤＮＡ中にはイントロンは見出されなかった。
また、本発明に用いるアミノペプチダーゼをコードする核酸分子は、アスペルギルス属の他の種に属する微生物、例えばアスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することもできる。具体的には、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のｃＤＮＡからＰＣＲ法により取得することができる。上記アスペルギルス・ニジュランス由来のアミノペプチダーゼのヌクレオチド配列をもとに、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の菌体より調製したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことにより調製することができる。このためのＰＣＲ用プライマーとしては、ｄＴプライマーと配列番号２４に示すヌクレオチド配列、５’−ＲＡＣＥ用には配列番号２５及び２６に示すヌクレオチド配列、全ＯＲＦを得るには、配列２７および２８に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして得られるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のＥＡＰをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号６に、アミノ酸配列を配列番号７に示す。配列番号３に示すアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰのアミノ酸配列と配列番号７に示すアスペルギルス・オリゼのアミノペプチダーゼのアミノ酸配列は、約８３％の相同性を有しており、約８５アミノ酸残基が異なっている。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ遺伝子とアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ遺伝子との相同性は、解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｅｒ．１０で解析した結果、コード領域では約７６％であり、アミノ酸配列レベルでは８０％以上であった。また、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡのヌクレオチド配列を比較した結果、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡ中にはイントロンが５箇所に含まれていた。アスペルギルス・オリゼＥＡＰをコードするゲノムヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
同様な方法に従って、アスペルギルス・ニガー、コリネ菌、酵母由来の各アミノペプチダーゼＥＡＰをコードする核酸分子を得ることができる。アスペルギルス・ニガー、酵母、コリネ菌由来の各アミノペプチダーゼＥＡＰ遺伝子のゲノム配列をそれぞれ、配列番号８、１１および１４に記載し、コード領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号９，１２および１５に記載した。各ＥＡＰのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０、１３および１６に記載した。
配列番号６に示すｃＤＮＡ配列に含まれるＯＲＦ、すなわち、本発明において使用するアミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列について、アスペルギルス・オリゼのＥＳＴデータベース上にその全配列が記載されている。さらに、前述のデータベース上では、このＯＲＦによってコードされるタンパク質の推定される機能として「アスパルチルアミノペプチダーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）」と記載されている。しかしながら、本発明者らによって実際に得られた酵素はアスパルチルアミノペプチダーゼと著しく異なった機能を有していることが明らかになった。例えば、アスパルチルアミノペプチダーゼはアスパラギン酸と比較してグルタミン酸を遊離する活性が弱い（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｈ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｕｓｈｍａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｂ．Ｂ．Ａ．２４２，１９０−１９３（１９７１））。一方、本発明において使用するアミノペプチダーゼのグルタミン酸を遊離する活性はアスパラギン酸を遊離する活性と同程度である点に本発明の一つの特徴がある。また、アスパルチルアミノペプチダーゼはジペプチドのような短い基質を分解する活性が殆どないとされているが（Ｓ．Ｗｉｌｋ，Ｅ．Ｗｉｌｋ，Ｒ．Ｐ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４０７（２００２）１７６−１８３）、本発明は、本発明において使用するアミノペプチダーゼが醤油醸造過程等において多く見られる難分解性のジペプチドを含む短いペプチドも効率よく分解する点も特徴の一つとする。
このように、本発明はアスペルギルス・オリゼのＥＳＴデータベース上で推定されている仮想的タンパク質の機能および性質とは明らかに異なる機能および性質を利用する方法である。
本発明に用いるアミノペプチダーゼは、上述したアミノペプチダーゼの活性が損なわれない限り、配列番号７に記載のアミノ酸配列において１以上の位置における１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むものであってもよい。ここで、「複数」とは、アミノペプチダーゼタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、通常２〜８５個、好ましくは２〜５０個、最も好ましくは２〜１０個である。アスペルギルス・オリゼ由来のアミノペプチダーゼとアスペルギルス・ニジュランス由来のアミノペプチダーゼの間では８５個のアミノ酸置換が見られるが、実施例に示すように両者は同等の活性を維持していることが明らかになっている。従って、上述の範囲内のアミノ酸置換であればアミノペプチダーゼの活性および特性は本発明の方法に使用するために十分な程度に維持されると期待される。
本発明に用いるアミノペプチダーゼＥＡＰをコードする遺伝子には配列番号６に示すヌクレオチド配列のうち塩基番号１〜１４９４からなるヌクレオチド配列を有するＤＮＡが含まれる。また、当該並列において遺伝暗号の縮重による変更を含んでいても良い。さらに、ＥＡＰと同等の性質を有するタンパク質をコードする核酸分子は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるようにＥＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列を改変することによっても得られる。また、上記のような改変された核酸分子は、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、又は付加、等には麹菌の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有する核酸分子を、適当な細胞で発現させ、発現産物のＥＡＰ活性を調べることにより、ＥＡＰと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。また、変異を有するＥＡＰをコードする核酸分子またはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号６に記載のヌクレオチド配列のうち、塩基番号１〜１４９４からなるヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＥＡＰ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を単離することによっても、ＥＡＰタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。この条件は個々の配列のＧＣ含量や繰り返し配列の有無などに依存するため明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸分子同士、例えば６５％以上の相同性を有する核酸分子同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸分子同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗滌条件である６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれる可能性があるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＥＡＰ活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
なお、本発明で使用するアスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー由来のアミノペプチダーゼＥＡＰの相同性は、解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｅｒ．１０で解析した結果、いずれの２種のアミノペプチダーゼ間でもアミノ酸配列レベルにおいて８０％以上である。
本発明において使用するアミノペプチダーゼをコードする核酸分子は本発明において使用されるアミノペプチダーゼを製造するために使用することができる。
本発明に使用するアミノペプチダーゼ（ＥＡＰ）をコードする核酸分子を用いて、麹菌等の糸状菌の育種、あるいはＥＡＰを製造することができる。例えば、ＥＡＰをコードするＤＮＡを、糸状菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）細胞内に好ましくはマルチコピーで導入することにより、糸状菌の有するＥＡＰ活性を増大させることができる。また、ＥＡＰをコードする核酸分子を適当な宿主で発現させることにより、ＥＡＰを製造することができる。
本発明に使用するアミノペプチダーゼをコードする核酸分子を導入する糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス属、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のニューロスポラ属、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール属に属する糸状菌が挙げられる。アスペルギルス属糸状菌が特に好ましい。
上記のような糸状菌に上述の核酸分子を導入するためのベクターとしては特に制限されず、糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼに用いられるベクターとしては、ｐＵＮＧ（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，４２５−４３１（１９９５））、ｐＭＡＲＧ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０，３２７−３３２（１９９３））、ｐＵＳＣ（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２５４９−２５５５（１９８７））等が挙げられる。ｐＵＮＧはアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０，４３２−４３８（１９９６））のｎｉａＤ−（硝酸資化能欠損）を相補するマーカーを、ｐＭＡＲＧはアスペルギルス・オリゼＭ２−３（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（９），２５４９−２５５５（１９８７））のａｒｇＢ−（アルギニン要求）を相補するマーカーを、ｐＵＳＣはアスペルギルス・オリゼＮＳ４（Ｙａｍａｄａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７））のｓＣ−（ＡＴＰスルフリラーゼ欠損）を相補するマーカーを、それぞれ有している。
このようなベクターのうち、プロモーターを含むベクターを利用する場合は、そのプロモーターの下流にＥＡＰをコードするＤＮＡ分子をフレームを合わせて挿入することによりＥＡＰを発現させることが出来る。例えば、ｐＵＮＧ及びｐＭＡＲＧは、グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーター及びα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢのターミネーター）を有しているので、該プロモーターの下流にＥＡＰをコードするＤＮＡ（例えば配列番号６において塩基番号１〜１４９７を含む領域）をフレームを合わせて挿入することにより、該プロモーター制御下でＥＡＰを発現させることができる。また、プロモーターを含まないベクター、例えばｐＵＣＳ等を利用する場合は、上記ＤＮＡを挿入したｐＵＣ１９等のプラスミドとｐＵＳＣとの共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主糸状菌に導入することによってＥＡＰを発現させることができる。得られる宿主糸状菌またはＥＡＰを本発明の方法に使用することが出来る。
また、以下の表１中に示した文献に記載されているベクター、プロモーター及びマーカーも宿主糸状菌に応じて使用することができる。表１中、プロモーターの名称は天然にその制御下にある遺伝子がコードする酵素名を用いて示してある。
ＤＰＹ培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ５．０）に菌体（分生子）を植菌し、３０℃で２４時間程度激しく振盪培養する。培養液をミラクロス（Ｍｙｒａｃｌｏｔｈ、ＣＡＬＢＩＯ ＣＨＥＭ社製）又は滅菌したガーゼ等で濾過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄し、水分をよく切る。この菌体を、試験管に入れ、酵素液（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ、宝酒造（株）製）、または０．５％ノボザイム（ＮｏｖｏＺｙｍｅ、ノボノルディスク社製）及び０．５％セルラーゼ（例えばＣｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ、ヤクルト社製）、０．６Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭリンゴ酸、ｐＨ５．５）を加え、３０℃で３時間程度穏やかに振盪する。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、良好であれば氷中に保存する。
次に上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、プロトプラストを含む濾液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置く。これを０℃、１５００〜２，５００ｒｐｍで５〜１０分間遠心した後、緩やかに停止させ、ペレットを緩衝液Ａで洗浄し、適量の緩衝液Ａに懸濁する。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液に２０μｌ以下のＤＮＡ溶液（５〜１０μｇ）を加え、２０〜３０分氷中に置く。緩衝液Ｂ（６０％ポリエチレングリコール６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分室温で静置する。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて試験管を反転させ、０℃、１，５００〜２，５００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、予め分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガーに加えて、下層培地（１．２Ｍソルビトールを含有し、マーカーに応じて調製した選択培地）に重層し、３０℃で培養する。生育した菌体を選択培地に植え継いで、形質転換体であることを確認する。さらに、菌体から組換えＤＮＡを調製し、制限酵素解析又はサザン解析等によって、ＥＡＰをコードするＤＮＡが導入されていることを確認してもよい。
使用するプロモーターに適した条件にて上記のようにして得られる形質転換体を培養することによってＥＡＰ遺伝子が発現し、ＥＡＰが産生される。例えば、アスペルギルス・オリゼを宿主に用い、プロモーターとしてグルコアミラーゼプロモーターを使用する場合には、小麦フスマ、リン酸カリウム等を含む培地に形質転換アスベルギルス・オリゼの胞子を懸濁し、約３０℃にて約３日間培養することによりＥＡＰを産生させることができる。必要に応じて培養物を蒸留水等で希釈し、ストマッカー等で処理することによってＥＡＰを含む酵素粗抽出液を得ることができる。得られた粗抽出液はゲル濾過、種々のクロマトグラフィー等を用いることによって更にＥＡＰを精製することもできる。得られたＥＡＰは更に塩析、等電点沈殿、ゲル濾過、イオンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって精製し、ペプチドからの酸性アミノ酸遊離のために使用することができる。
しかしながら、ＥＡＰ活性の向上した形質転換微生物の培養物をそのまま、または必要によりタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）とともにタンパク質原料と直接混合してタンパク質またはその混合物に作用させることにより、遊離アミノ酸含量が高く、呈味および／または風味の改善された調味料、タンパク質加水分解物等の飲食品を得ることもできる。作用させるタンパク質原料としては、例えば大豆、小麦、小麦グルテン、コーンミール、ミルクカゼイン、カツオ、カツオ節、フィッシュミール、食品用に用いられるあらゆるタンパクが挙げられ、さらに脱脂大豆あるいは膨化や可溶化等の加工をされた種々のタンパク質あるいはこれらの種々の原料からの分離タンパク質であってもよい。タンパク質分解酵素を使用する場合、市販の酵素製剤でよく、細胞壁分解酵素等、他の酵素を含むものであっても構わない。アスペルギルス属やバチルス属の微生物が生産するタンパク質分解酵素を使用することができ、例えばウマミザイム、プロテアーゼＭ、フレーバーザイム、アルカラーゼなどの市販の酵素製剤を用いることができる。
グルタミン酸および／またはアスパラギン酸特異的ペプチダーゼを作用させることによって風味・呈味を改善し得るタンパク質、ペプチドを含む食品には、例えば、醤油、味噌などの醸造・発酵食品や、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品、野菜・果実ジュースなどの飲料品、豆乳、豆腐などの大豆食品、パン、麺などの小麦食品、かまぼこ、竹輪などの水練り食品、ソーセージ、ハムなどの畜肉食品などが含まれるが、これらに限定されず広範な食品が含まれる。
形質転換微生物の培養物または粗精製酵素をタンパク質に作用させる実用的条件としては、たとえば０．２〜５０％、好ましくは１〜２０％の濃度のタンパク質原料に精製酵素または必要により更にタンパク質分解酵素を加えて混合し、５〜５５℃、好ましくは３０〜５５℃にて１分間〜１０日間、好ましくは１時間〜１０日間反応させればよい。
反応終了後、未反応のタンパク質原料、菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、従来の分離法を用いて除去することができる。また、必要に応じて減圧濃縮、逆浸透法などにより濃縮を行い、濃縮物は、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理により粉末化または顆粒化することもできる。かくして遊離グルタミン酸含有量が高く、呈味および／または風味の改善された調味料、タンパク質分解物等の飲食品を得ることができる。
実施例１．アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰをコードするゲノムＤＮＡのクロー ニング
発芽ダイズ由来アミノペプチダーゼの配列をもとに、アスペルギルス・ニジュランスのｃＤＮＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｆｕｎｇａｌ．ｈｔｍｌ）を用いて、ホモロジー検索したところ、相同性の高いＥＳＴｐ０ｆ１０ａ１．ｆ１を見出した。
この情報を基に、アスペルギルス・ニジュランスｃＤＮＡからアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰのクローニングを以下のように行った。
アスペルギルス・ニジュランスＡ２６株（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから購入可能）をＹＧ培地（酵母エキストラクト０．５％，グルコース２．５％，微量元素＊０．１％、ｐＨ６．５）５０ｍｌで３０℃、４８時間振とう培養した（微量元素＊：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８８％，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０４％，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．０１５％，Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．０１％，（ＮＨ４）６ＭｏＯ２４・４Ｈ２Ｏ ０．００５％）。
菌体を回収し、液体窒素にて凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。粉砕物より、ＲＮ ｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行い、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。このｍＲＮＡから、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、アスペルギルス・ニジュランスＥＳＴｐ０ｆ１０ａ１．ｆ１配列よりデザインした下記配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ、および５’ＲＡＣＥ法により、ＥＡＰの完全長ｃＤＮＡのクローニングを行った。
（５’末端用プライマー）
（３’末端用プライマー）
ＰＣＲ反応は、９４℃３分間の熱変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の反応を２５サイクルで行なった。その結果、予想されるサイズのＤＮＡ断片（約１０００ｂｐ）が増幅されたため、プラスミドｐＵＣ１９に挿入した。このプラスミドでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換菌からプラスミドＤＮＡを調製してヌクレオチド配列を決定した。その結果、ＥＳＴデータベースに示された配列と同一の配列であることが判明した。
続いて、アスペルギルス・ニジュランス全ＯＲＦ配列を得るために、５’ＲＡＣＥ法と３’ＲＡＣＥ法を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃９分間の熱変性の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の反応を３０サイクル行い、さらに７２℃５分の反応を行った。その結果、配列番号１９及び２０のプライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法により５’側の全ＯＲＦ配列が明らかになり、配列番号２１を用いた３’ＲＡＣＥ側の全ＯＲＦが明らかとなった。配列番号２２及び２３のプライマーを用いたＰＣＲにより、全ＯＲＦを含む、約１５００ｂｐの増幅断片が得られた。これらのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を配列番号２に、ヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号３に示す。
上記アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ ｃＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。また、挿入した配列の上流にｔｒｐプロモーターを接続した発現プラスミドｐＵＣｔｒｐｎｉｄＧＸも構築した。得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を得た。
（５’ＲＡＣＥ用 プライマー）
（５’ＲＡＣＥ用 プライマー）
（３’ＲＡＣＥ用 プライマー）
（５’末端用プライマー）
（３’末端用プライマー）
実施例２．アスペルギルス・オリゼ由来の、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ に相同なｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・オリゼ由来ｃＤＮＡの取得
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）を、１．５％分離ダイズを含む培地５０ｍｌで３０℃、６４時間培養した。菌体をろ過により集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行い、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。このｍＲＮＡから、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いｃＤＮＡを合成した。
（２）アスペルギルス・ニジュランス由来ＥＡＰに相当するアスペルギルス・オリゼ由来アミノペプチダーゼのクローニング
実施例１で得たアスペルギルス・ニジュランスのＥＡＰ配列を参考に、配列番号２４で示したオリゴヌクレオチドとｄＴプライマーアダプタープライマーを用いた３’ＲＡＣＥおよび配列番号２５及び２６を用いた５’ＲＡＣＥによって、アスペルギルス・ニジュランスのアミノペプチダーゼＥＡＰに相同なアスペルギルス・オリゼ由来のｃＤＮＡのクローニングを行った。
（３’ＲＡＣＥ用 ５’末端プライマー）
（５’ＲＡＣＥ用 プライマー）
（５’ＲＡＣＥ用 プライマー）
３’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約８００ｂｐのアスペルギルス・ニジュランス由来のアミノペプチダーゼＥＡＰに相同な遺伝子断片を得た。５’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これによりそれぞれ約３００ｂの、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰに相同なアスペルギルス・オリゼ遺伝子断片を得た。配列番号２７と２８に示した配列を用いてＰＣＲ反応を行うことにより、全ＯＲＦを含む、約１５００ｂｐのヌクレオチド配列を得た。ＰＣＲ反応は、９４℃ ３０秒、５４℃ ３０秒、７２℃ ４５秒の反応を２５サイクル行った。
（５’末端用 プライマー）
（３’末端用 プライマー）
上記遺伝子断片のヌクレオチド配列を決定したところ、アスペルギルス・ニジュランス由来アミノペプチダーゼＥＡＰに相同な完全長配列を含むことが明らかとなったため、この遺伝子はアスペルギルス・オリゼにおいて、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰに対応するアミノペプチダーゼをコードする遺伝子であると推定した。また、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２７と２８に示すプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、イントロンを５個含む約１８００ｂｐのヌクレオチド配列を得ることができる。このイントロンを含むアスペルギルス・オリゼのゲノム配列を配列番号４に示す。また、アスペルギルス・オリゼ由来アミノペプチダーゼをコードする全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号６に、アスペルギルス・オリゼ由来アミノペプチダーゼのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｏＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例３．アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来 ＥＡＰに相同な、アスペルギルス・ニガー由来のＥＡＰ ｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・ニガー由来アミノペプチダーゼｃＤＮＡの取得
アスペルギルス・ニガー（ＪＣＭ２２６１）を、１．５％分離ダイズを含む培地５０ｍｌで３０℃、６４時間培養した。菌体をろ過により集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行い、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。このｍＲＮＡから、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いｃＤＮＡを合成した。
（２）アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来ＥＡＰに相当するアスペルギルス・ニガー由来ＥＡＰのクローニング
実施例１で得たアスペルギルス・ニジュランスおよび実施例２で得たアスペルギルス・オリゼのＥＡＰの配列間で１００％のホモロジーがある配列部分に、配列番号２９および配列番号３０で示したプライマーを設計した。両プライマーを用いて、アスペルギルス・ニガー由来アミノペプチダーゼＥＡＰの部分的なｃＤＮＡを取得した。これをテンプレートとし、配列番号３１で示したオリゴヌクレオチドとｄＴプライマーアダプタープライマーを用いた３’ＲＡＣＥおよび配列番号３２を用いた５’ＲＡＣＥによって、アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来ＥＡＰに相同なアスペルギルス・ニガー由来ＥＡＰのｃＤＮＡのクローニングを行った。３’ＲＡＣＥには、３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、５’ＲＡＣＥには、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
（部分的ｃＤＮＡ取得用５’側プライマー）
（部分的ｃＤＮＡ取得用３’側プライマー）
（３’ＲＡＣＥ用プライマー）
（５’ＲＡＣＥ用プライマー）
３’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約１２０ｂｐのアスベルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来ＥＡＰに相同な遺伝子断片を得た。５’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約１００ｂｐの、アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来ＥＡＰに相同なアスペルギルス・ニガー遺伝子断片を得た。配列番号３３と３４に示した配列を用いてＰＣＲ反応を行うことにより、全ＯＲＦを含む、約１５００ｂｐのヌクレオチド配列を得た。ＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃４５秒の反応を２５サイクル行った。
（３’末端用プライマー）
（５’末端用プライマー）
上記遺伝子断片をもとに、アスペルギルス・ニガー由来ＥＡＰをコードする全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、配列番号９に示した。また、アスペルギルス・ニガー由来ＥＡＰのアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｎｉｇＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例４．サッカロマイセス由来のダイズ由来ＧＸに相同な遺伝子のクローニン グ
（１）サッカロマイセス由来ゲノムＤＮＡの取得
サッカロマイセスＹＰＨ５００（ＩＦＯ１０５０６）を、ＹＰＤ（１％イーストエキス、２％ペプトン、２％グルコース）とアデニンからなる培地５０ｍｌを用い、３０℃で一晩培養した。培養液から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（ＴａＫａＲａ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
（２）ダイズＧＸに相当するサッカロマイセス由来ＥＡＰのクローニング
サッカロマイセスのゲノムデータベースから、特開平９−２９４５８３記載のダイズＧＸの配列とホモロジーのある配列を検索したところ、４３％のホモロジーの見られる配列が確認され、開始コドンおよび終止コドンの位置が特定された。これを基に、配列番号３５および配列番号３６で示したプライマーを設計し、両プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからサッカロマイセス由来ＥＡＰの遺伝子断片をクローニングした。
（５’側プライマー）
（３’側プライマー）
上記遺伝子断片をもとに、サッカロマイセス由来ＥＡＰをコードする全長ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、配列番号１２に示した。また、サッカロマイセス由来ＥＡＰのアミノ酸配列を配列番号１３に示した。
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｓＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例５．コリネ菌由来のダイズＧＸに相同な遺伝子のクローニング
（１）コリネ菌由来ゲノムＤＮＡの取得
コリネ菌（ＡＴＣＣ１３８６９）を、ＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキストラクト０．５％、塩化ナトリウム１％）５０ｍｌを用い、３０℃で一晩培養した。培養液から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（ＴａＫａＲａ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
（２）ダイズＧＸに相当するコリネ菌由来アミノペプチダーゼのクローニング
コリネ菌のゲノムデータベースから、特開平９−２９４５８３記載のダイズ由来アミノペプチダーゼの配列とホモロジーのある配列を検索したところ、アスパルチルアミノペプチダーゼをコードする配列と４８％のホモロジーが確認された。これを基に、配列番号３７および配列番号３８で示したプライマーを設計し、両プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからコリネ菌由来ＥＡＰの遺伝子断片をクローニングした。
（５’側プライマー）
（３’側プライマー）
上記遺伝子断片をもとに、コリネ菌由来ＥＡＰをコードする全長ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、配列番号１５に示した。また、コリネ菌由来ＥＡＰのアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｃＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例６．アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、 アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、酵母ＥＡＰ、およびコリネＥＡＰのエシェリヒア・コ リＪＭ１０９株における大量発現
（１）アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、酵母ＥＡＰ、およびコリネＥＡＰの精製
ｐＵＣｔｒｐＧＸで形質転換した菌をリフレッシュ培地（トリプトン１％，イースト・エキストラクト０．５％，ＮａＣｌ ０．５％，グルコース０．１％）にて、３０℃で８時間振とう培養した。次いで、得られた培養液５ｍｌを３５０ｍｌカザミノ酸培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．６％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．３％，ＮＨ４Ｃｌ ０．１％，ＮａＣｌ ０．０５％，カザミノ酸１％，チアミン０．０００２％，ＭｇＳＯ４ １ｍＭ，ＣａＣｌ２ １ｍＭ，グルコース０．１％）にて３７℃で２０時間培養した。ただし、コリネのみ培養温度を３４℃とした。得られた菌体を定法に従って破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、４０％−６５％硫安沈殿画分を取得した。ただし、酵母のみ０％−４０％画分を取得した。上記画分を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、あらかじめ前述のリン酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（アマシャムバイオテク社製ｓｅｐｈａｄｅｘ２００）にて分離を行い、粗精製ＥＡＰを得ることができた。得られた酵素溶液を限外ろ過にて濃縮した。粗精製ＥＡＰは陰イオン交換カラム（アマシャムバイオテク社製ｍｏｎｏＱ）にて更に分離操作を行い、精製ＥＡＰを得た。
得られた精製ＥＡＰは未変性ポリアクリルアミドゲル上で約３００〜４８０ｋＤの分子量を示し、変性ポリアクリルアミドゲル上で約４０〜６０ｋＤの分子量を示した。
実施例７．アミノペプチダーゼＥＡＰの特性解析
上述のように調製した酵素精製液中のアミノペプチダーゼ活性を以下のように測定した。即ち、５ｍＭ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５）０．１６ｍｌに酵素精製液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０％酢酸を０．０２ｍｌ添加して反応を停止した。反応液中の遊離Ｇｌｕ量をグルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのＧｌｕを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とした。
その結果、得られた精製アミノペプチダーゼ酵素の酵素学的諸性質を示す。
（ｉ）基質特異性
ＥＡＰの活性測定は、Ｇｌｕ−ｐＮＡを基質として用いても可能である。即ち、１ｍＭ Ｇｌｕ−ｐＮＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに酵素溶液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止した。反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定し、活性を測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とした。Ｇｌｕ−ｐＮＡの代わりにＸ−ｐＮＡを用い、各種Ｘ−ｐＮＡの分解活性を測定した。最大の分解活性値を１００とした時の相対活性値を図１に示す。本酵素はＮ末端の酸性アミノ酸、即ちグルタミン酸とアスパラギン酸の２種類を特異的に効率よく分解することがわかった。
（ｉｉ）温度反応特性
前記Ｇｌｕ−Ｇｌｕを基質とした活性測定法において、各種温度でＥＡＰ活性を測定した。３７℃での活性値を１００とした時の相対活性値を図２に示す。図２から、３０℃〜６０℃の範囲、より好ましくは３７℃〜５０℃の範囲で相対活性が高いことが分かる。
（ｉｉｉ）温度安定性
前記Ｇｌｕ−Ｇｌｕを基質とした活性測定法において、各種温度でＥＡＰを１０、２０、３０、４０、６０分保存した後、前記活性測定方法でＥＡＰ活性を測定した。保存時間０分の際の活性値を１００としたときの相対活性値を図３に示す。
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰおよびアスペルギルス・ニガーＥＡＰを、ｐＨ７．５、２５℃〜４０℃、１時間保存した後に８０％以上の残存活性を示した。また、コリネＥＡＰおよび酵母ＥＡＰを、ｐＨ７．５、２５℃〜５０℃、１時間保存した後に８０％以上の残存活性を示し、ｐＨ７．５、２５〜６０℃３０分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有していた。
（ｉｖ）ｐＨ反応特性
前記Ｇｌｕ−Ｇｌｕを基質とした活性測定法において、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）の代わりに、終濃度５０ｍＭとなるよう、各ｐＨのＧＴＡ緩衝液を反応液に加えた。ｐＨ７．５中におけるＥＡＰ活性を１００とした。各ｐＨにおける活性を図４に示す。図４より、ｐＨ６．０〜９．０の範囲において、至適ｐＨでの活性の５０％以上の活性を有していた。
（ｖ）ｐＨ安定性
精製酵素を５０ｍＭの各種ｐＨのＧＴＡ緩衝液中、０℃で２４時間保存した後、前記活性測定方法（ｐＨ７．５）でＥＡＰ活性を測定した。保存前の活性値を１００とした時の相対活性値を図５に示す。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、アスペルギルス・ニガーＥＡＰおよび酵母ＥＡＰにおいて、ｐＨ６．０〜１０．０の範囲で０℃にて２４時間保存した場合に９０％以上の残存活性を示した。また、コリネＥＡＰにおいて、ｐＨ７．０〜８．０の範囲で０℃にて２４時間保存した場合に９０％以上の残存活性を示した。
（ｖｉ）ペプチド長に対する反応特性
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ基質を用いる代わりに、ＧｌｕをＮ末端に持つ、アミノ酸残基数の異なる他の基質を用いてアミノペプチダーゼの活性を測定した。即ち、５ｍＭ各基質（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５）０．１６ｍｌに酵素精製液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０％酢酸を０．０２ｍｌ添加して反応を停止した。反応液中の遊離Ｇｌｕ量をグルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのＧｌｕを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とし、重量あたりの活性値である比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出して図６に示した。用いた基質は、（ａ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（Ｂａｃｈｅｍ社）、（ｂ）Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ（Ｂａｃｈｅｍ社）（配列番号３９）、（ｃ）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（Ｂａｃｈｅｍ社）（配列番号４０）、（ｄ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ（Ｂａｃｈｅｍ社）の４種類である。図６より、ジペプチドに対する活性に比べ、長鎖ペプチドに対する活性が高い傾向にある。
実施例８．天然調味料に対する呈味増強効果
「本造り一番だし極味かつお」（味の素社）に各種精製ＥＡＰを０．１ｍｇ／ｍｌ添加し、３７℃で反応させ、０、６０、１２０分後に経時的にサンプリングした。そして、サンプリングした反応溶液中の遊離Ｇｌｕ量を、グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した。また、１２０分反応後のサンプルを２０倍希釈し、官能評価を行った。
その結果、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、酵母ＥＡＰは、１２０分間の反応により遊離Ｇｌｕ量を約３００ｍｇ／ｌ増加させた（図７参照）。一方、コリネＥＡＰによる増加は、その３分の１程度であった。また、官能評価によるうま味強度は、遊離Ｇｌｕ量に比例していた（表２参照）。
実施例９．呈味の強いタンパク質加水分解物の作製
５％分離ダイズタンパク溶液をｐＨ８．０に調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌することにより熱変性を行った。得られたタンパク溶液に、ダイズタンパク質量に対してウマミザイム１％（アマノエンザイム社）、プロテアーゼＭ１％（アマノエンザイム社）を添加し、５０℃にて４８時間反応を行った。その後、アスペルギルス・オリゼＥＡＰを０．２％（質量％）添加し、３７℃にて２４時間反応を行った。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加サンプルと、未添加サンプル中に含まれる遊離Ｇｌｕ量をグルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した結果、遊離Ｇｌｕ量がアスペルギルス・オリゼＥＡＰの添加によって約１．５倍に増加した（図８参照）。
上記と同様に処理したダイズタンパク溶液に、アルカラーゼ１％（ノボザイム社）を添加し、５０℃にて４８時間反応を行った。その後、１２１℃にて１０分間アルカラーゼを失活させ、フレーバーザイム１％（ノボザイム社）を添加し、３７℃２４時間の条件で反応を行った。その後、アスペルギルス・オリゼＥＡＰを添加し、さらに３７℃にて２４時間反応を行った。アスペルギルス・オリゼＥＡＰを添加したサンプルと未添加サンプル中に含まれる遊離Ｇｌｕ量を上記と同様に測定した結果、アスペルギルス・オリゼＥＡＰの添加によって遊離Ｇｌｕ量が約２．２倍に増加した（図９参照）。
実施例１０．乳製品の呈味および／または風味の改善
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加のチーズへの効果を確認した。原料乳は同一生乳（約３５Ｌ）を使用した。所定の方法にて脱脂後、脂肪率は３％に調乳した。所定量の乳酸菌スターターを添加後、原料乳を３２℃に加温し、キモシンを原料に対し０．００３％添加した。原料乳が凝固している事を確認後、カッティング、攪拌し、約１／３のホエーを排除した。次に３４℃まで１℃／２ｍｉｎのスピードでゆっくり昇温、攪拌し、更に１／３のホエーを排除した。その後、３８℃まで１℃／２ｍｉｎのスピードでゆっくり昇温し、１時間攪拌した後、ホエーオフし、カードを得た。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加量はカード１００ｇに対し０．５ｍｇとした。このときコントロール群は酵素無添加とした。酵素はカード１５００ｇに直接添加し、均一になるように良くかき混ぜた。使用乳酸菌は、クリスチャン・ハンゼン社の４種混合乳酸球菌（ゴーダチーズ）使用した。なおカード重量に対して３％の食塩を添加した。高温（１０℃）熟成のため、酪酸菌を抑制のため硝酸Ｎａを０．００２％原料乳に加えた。製造日から翌朝で予備乾燥した後、チーズ約３７５ｇのカードをモールドに添加した。試験期間を短縮するため熟成は、真空包装の後に１０℃の熟成室に保管した。１４０日保管後、官能評価した。
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加による熟成率（可溶化窒素率）の上昇は無添加のコントロールと比較して有意な差は認められなかった。可溶化窒素率は１２％トリクロロ酢酸に可溶性の画分の窒素量を、全窒素量に対する比率で求めた。一方、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加による遊離グルタミン酸の増加量は１ｍｇ／１００ｇチーズであった。官能評価の結果、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加により、チーズ風味が強まる、全体のまとまり感が出る、食感が滑らかになる等の効果が認められた。またチーズの苦味がアスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加により消失していたが、これは遊離グルタミン酸の上昇による効果と推測された。
実施例１１．飲料の呈味および／または風味の改善（Ｉ）
トマト（桃太郎、およびプチトマト）を洗浄後、家庭用ミキサーで粉砕しトマト果汁を調製した。本果汁１００ｍｌにアスペルギルス・オリゼＥＡＰを３ｍｇ／ｌの濃度に添加した。コントロールとして予め熱失活させたアスペルギルス・オリゼＥＡＰを添加した。反応は３７℃、１時間で、反応後の果汁を官能評価した。
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ処理により遊離のグルタミン酸は約３％増加した。しかしトマト果汁中には元来０．２％（Ｗ／Ｗ）の遊離グルタミン酸が存在しているため、３％の遊離グルタミン酸含量増加によるうま味強度の影響は認められなかった。一方で、酵素処理群は甘味が強まり、かつ酸味が抑制されていたため、トマト果汁独特の抵抗感が弱まっていた。この呈味および／または風味改質効果はコントロール群では認められなかった。なお、アスペルギルス・オリゼＥＡＰのトマトへの効果はプチトマトや、熟成の進んだトマトで顕著であった。
実施例１２．飲料の呈味および／または風味の改善（ＩＩ）
市販の豆乳飲料（国産豆乳；太子食品工業株式会社）１００ｍｌにアスペルギルス・オリゼＥＡＰを３ｍｇ／ｌの濃度に添加した。コントロールとして予め熱失活したペプチダーゼを用いた。これらを３７℃で１時間酵素反応させた後、官能評価に供した。
豆乳へのアスペルギルス・オリゼＥＡＰ処理によるグルタミン酸量の増加は認められなかった。よってうま味強化は認められなかった。しかし酵素添加群はコントロール群と比較して、豆乳独特の青臭さ（ヘキサナール臭）が弱まっており、尚且つ、まろやかに変化しており、豆乳に対する呈味および／または風味改質効果が確認できた。
本発明により、遊離アミノ酸量が高く、呈味の増強された飲食品を製造する方法が提供される。特に、醤油醸造条件下などで存在するＧｌｕ−Ｇｌｕといった難分解性ペプチドを効率よく分解し、呈味の強い調味液をつくることができる。市販のプロテアーゼ、ペプチダーゼ製剤と併用することによってタンパク質加水分解物中の遊離Ｇｌｕ量を上昇させることができる。これは、市販のプロテアーゼ、ペプチダーゼ製剤にはＥＡＰ様活性を有する酵素が殆ど含まれておらず、Ｇｌｕ−Ｇｌｕといった難分解ペプチドがそのまま存在しているからであると考えられる。このように、本発明によりアミノペプチダーゼＥＡＰを用いることによって、醤油、タンパク質加水分解物などの飲食品の呈味性をさらに高めることが可能となる。
発芽ダイズ由来アミノペプチダーゼの配列をもとに、アスペルギルス・ニジュランスのｃＤＮＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｆｕｎｇａｌ．ｈｔｍｌ）を用いて、ホモロジー検索したところ、相同性の高いＥＳＴｐ０ｆ１０ａ１．ｆ１を見出した。
この情報を基に、アスペルギルス・ニジュランスｃＤＮＡからアスペルギルス・ニジュランスＥＡＰのクローニングを以下のように行った。
アスペルギルス・ニジュランスＡ２６株（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから購入可能）をＹＧ培地（酵母エキストラクト０．５％，グルコース２．５％，微量元素＊０．１％、ｐＨ６．５）５０ｍｌで３０℃、４８時間振とう培養した（微量元素＊：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８８％，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０４％，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．０１５％，Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．０１％，（ＮＨ４）６ＭｏＯ２４・４Ｈ２Ｏ ０．００５％）。
菌体を回収し、液体窒素にて凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。粉砕物より、ＲＮ ｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行い、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。このｍＲＮＡから、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、アスペルギルス・ニジュランスＥＳＴｐ０ｆ１０ａ１．ｆ１配列よりデザインした下記配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ、および５’ＲＡＣＥ法により、ＥＡＰの完全長ｃＤＮＡのクローニングを行った。
（５’末端用プライマー）
続いて、アスペルギルス・ニジュランス全ＯＲＦ配列を得るために、５’ＲＡＣＥ法と３’ＲＡＣＥ法を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃９分間の熱変性の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の反応を３０サイクル行い、さらに７２℃５分の反応を行った。その結果、配列番号１９及び２０のプライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法により５’側の全ＯＲＦ配列が明らかになり、配列番号２１を用いた３’ＲＡＣＥ側の全ＯＲＦが明らかとなった。配列番号２２及び２３のプライマーを用いたＰＣＲにより、全ＯＲＦを含む、約１５００ｂｐの増幅断片が得られた。これらのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を配列番号２に、ヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号３に示す。
上記アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ ｃＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。また、挿入した配列の上流にｔｒｐプロモーターを接続した発現プラスミドｐＵＣｔｒｐｎｉｄＧＸも構築した。得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を得た。
（５’ＲＡＣＥ用 プライマー）
（１）アスペルギルス・オリゼ由来ｃＤＮＡの取得
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）を、１．５％分離ダイズを含む培地５０ｍｌで３０℃、６４時間培養した。菌体をろ過により集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行い、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。このｍＲＮＡから、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いｃＤＮＡを合成した。
（２）アスペルギルス・ニジュランス由来ＥＡＰに相当するアスペルギルス・オリゼ由来アミノペプチダーゼのクローニング
実施例１で得たアスペルギルス・ニジュランスのＥＡＰ配列を参考に、配列番号２４で示したオリゴヌクレオチドとｄＴプライマーアダプタープライマーを用いた３’ＲＡＣＥおよび配列番号２５及び２６を用いた５’ＲＡＣＥによって、アスペルギルス・ニジュランスのアミノペプチダーゼＥＡＰに相同なアスペルギルス・オリゼ由来のｃＤＮＡのクローニングを行った。
（３’ＲＡＣＥ用 ５’末端プライマー）
（５’末端用 プライマー）
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｏＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例３．アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来 ＥＡＰに相同な、アスペルギルス・ニガー由来のＥＡＰ ｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・ニガー由来アミノペプチダーゼｃＤＮＡの取得
アスペルギルス・ニガー（ＪＣＭ２２６１）を、１．５％分離ダイズを含む培地５０ｍｌで３０℃、６４時間培養した。菌体をろ過により集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行い、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行った。このｍＲＮＡから、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いｃＤＮＡを合成した。
（２）アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来ＥＡＰに相当するアスペルギルス・ニガー由来ＥＡＰのクローニング
実施例１で得たアスペルギルス・ニジュランスおよび実施例２で得たアスペルギルス・オリゼのＥＡＰの配列間で１００％のホモロジーがある配列部分に、配列番号２９および配列番号３０で示したプライマーを設計した。両プライマーを用いて、アスペルギルス・ニガー由来アミノペプチダーゼＥＡＰの部分的なｃＤＮＡを取得した。これをテンプレートとし、配列番号３１で示したオリゴヌクレオチドとｄＴプライマーアダプタープライマーを用いた３’ＲＡＣＥおよび配列番号３２を用いた５’ＲＡＣＥによって、アスペルギルス・ニジュランスおよびアスペルギルス・オリゼ由来ＥＡＰに相同なアスペルギルス・ニガー由来ＥＡＰのｃＤＮＡのクローニングを行った。３’ＲＡＣＥには、３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、５’ＲＡＣＥには、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
（部分的ｃＤＮＡ取得用５’側プライマー）
（３’末端用プライマー）
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｎｉｇＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例４．サッカロマイセス由来のダイズ由来ＧＸに相同な遺伝子のクローニン グ
（１）サッカロマイセス由来ゲノムＤＮＡの取得
サッカロマイセスＹＰＨ５００（ＩＦＯ１０５０６）を、ＹＰＤ（１％イーストエキス、２％ペプトン、２％グルコース）とアデニンからなる培地５０ｍｌを用い、３０℃で一晩培養した。培養液から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（ＴａＫａＲａ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
（２）ダイズＧＸに相当するサッカロマイセス由来ＥＡＰのクローニング
サッカロマイセスのゲノムデータベースから、特開平９−２９４５８３記載のダイズＧＸの配列とホモロジーのある配列を検索したところ、４３％のホモロジーの見られる配列が確認され、開始コドンおよび終止コドンの位置が特定された。これを基に、配列番号３５および配列番号３６で示したプライマーを設計し、両プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからサッカロマイセス由来ＥＡＰの遺伝子断片をクローニングした。
（５’側プライマー）
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｓＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例５．コリネ菌由来のダイズＧＸに相同な遺伝子のクローニング
（１）コリネ菌由来ゲノムＤＮＡの取得
コリネ菌（ＡＴＣＣ１３８６９）を、ＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキストラクト０．５％、塩化ナトリウム１％）５０ｍｌを用い、３０℃で一晩培養した。培養液から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（ＴａＫａＲａ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
（２）ダイズＧＸに相当するコリネ菌由来アミノペプチダーゼのクローニング
コリネ菌のゲノムデータベースから、特開平９−２９４５８３記載のダイズ由来アミノペプチダーゼの配列とホモロジーのある配列を検索したところ、アスパルチルアミノペプチダーゼをコードする配列と４８％のホモロジーが確認された。これを基に、配列番号３７および配列番号３８で示したプライマーを設計し、両プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからコリネ菌由来ＥＡＰの遺伝子断片をクローニングした。
（５’側プライマー）
この断片をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。また、ｃＤＮＡの上流にｔｒｐプロモーターを接続し、発現用ベクターｐＵＣｔｒｐｃＧＸを得た。得られたベクターでエシュリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
実施例６．アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、 アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、酵母ＥＡＰ、およびコリネＥＡＰのエシェリヒア・コ リＪＭ１０９株における大量発現
（１）アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、酵母ＥＡＰ、およびコリネＥＡＰの精製
ｐＵＣｔｒｐＧＸで形質転換した菌をリフレッシュ培地（トリプトン１％，イースト・エキストラクト０．５％，ＮａＣｌ ０．５％，グルコース０．１％）にて、３０℃で８時間振とう培養した。次いで、得られた培養液５ｍｌを３５０ｍｌカザミノ酸培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．６％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．３％，ＮＨ４Ｃｌ ０．１％，ＮａＣｌ ０．０５％，カザミノ酸１％，チアミン０．０００２％，ＭｇＳＯ４ １ｍＭ，ＣａＣｌ２ １ｍＭ，グルコース０．１％）にて３７℃で２０時間培養した。ただし、コリネのみ培養温度を３４℃とした。得られた菌体を定法に従って破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、４０％−６５％硫安沈殿画分を取得した。ただし、酵母のみ０％−４０％画分を取得した。上記画分を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、あらかじめ前述のリン酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（アマシャムバイオテク社製ｓｅｐｈａｄｅｘ２００）にて分離を行い、粗精製ＥＡＰを得ることができた。得られた酵素溶液を限外ろ過にて濃縮した。粗精製ＥＡＰは陰イオン交換カラム（アマシャムバイオテク社製ｍｏｎｏＱ）にて更に分離操作を行い、精製ＥＡＰを得た。
得られた精製ＥＡＰは未変性ポリアクリルアミドゲル上で約３００〜４８０ｋＤの分子量を示し、変性ポリアクリルアミドゲル上で約４０〜６０ｋＤの分子量を示した。
実施例７．アミノペプチダーゼＥＡＰの特性解析
上述のように調製した酵素精製液中のアミノペプチダーゼ活性を以下のように測定した。即ち、５ｍＭ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５）０．１６ｍｌに酵素精製液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０％酢酸を０．０２ｍｌ添加して反応を停止した。反応液中の遊離Ｇｌｕ量をグルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのＧｌｕを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とした。
その結果、得られた精製アミノペプチダーゼ酵素の酵素学的諸性質を示す。
（ｉ）基質特異性
ＥＡＰの活性測定は、Ｇｌｕ−ｐＮＡを基質として用いても可能である。即ち、１ｍＭ Ｇｌｕ−ｐＮＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに酵素溶液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止した。反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定し、活性を測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とした。Ｇｌｕ−ｐＮＡの代わりにＸ−ｐＮＡを用い、各種Ｘ−ｐＮＡの分解活性を測定した。最大の分解活性値を１００とした時の相対活性値を図１に示す。本酵素はＮ末端の酸性アミノ酸、即ちグルタミン酸とアスパラギン酸の２種類を特異的に効率よく分解することがわかった。
（ｉｉ）温度反応特性
前記Ｇｌｕ−Ｇｌｕを基質とした活性測定法において、各種温度でＥＡＰ活性を測定した。３７℃での活性値を１００とした時の相対活性値を図２に示す。図２から、３０℃〜６０℃の範囲、より好ましくは３７℃〜５０℃の範囲で相対活性が高いことが分かる。
（ｉｉｉ）温度安定性
前記Ｇｌｕ−Ｇｌｕを基質とした活性測定法において、各種温度でＥＡＰを１０、２０、３０、４０、６０分保存した後、前記活性測定方法でＥＡＰ活性を測定した。保存時間０分の際の活性値を１００としたときの相対活性値を図３に示す。
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰおよびアスペルギルス・ニガーＥＡＰを、ｐＨ７．５、２５℃〜４０℃、１時間保存した後に８０％以上の残存活性を示した。また、コリネＥＡＰおよび酵母ＥＡＰを、ｐＨ７．５、２５℃〜５０℃、１時間保存した後に８０％以上の残存活性を示し、ｐＨ７．５、２５〜６０℃３０分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有していた。
（ｉｖ）ｐＨ反応特性
前記Ｇｌｕ−Ｇｌｕを基質とした活性測定法において、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）の代わりに、終濃度５０ｍＭとなるよう、各ｐＨのＧＴＡ緩衝液を反応液に加えた。ｐＨ７．５中におけるＥＡＰ活性を１００とした。各ｐＨにおける活性を図４に示す。図４より、ｐＨ６．０〜９．０の範囲において、至適ｐＨでの活性の５０％以上の活性を有していた。
（ｖ）ｐＨ安定性
精製酵素を５０ｍＭの各種ｐＨのＧＴＡ緩衝液中、０℃で２４時間保存した後、前記活性測定方法（ｐＨ７．５）でＥＡＰ活性を測定した。保存前の活性値を１００とした時の相対活性値を図５に示す。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニジュランスＥＡＰ、アスペルギルス・ニガーＥＡＰおよび酵母ＥＡＰにおいて、ｐＨ６．０〜１０．０の範囲で０℃にて２４時間保存した場合に９０％以上の残存活性を示した。また、コリネＥＡＰにおいて、ｐＨ７．０〜８．０の範囲で０℃にて２４時間保存した場合に９０％以上の残存活性を示した。
（ｖｉ）ペプチド長に対する反応特性
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ基質を用いる代わりに、ＧｌｕをＮ末端に持つ、アミノ酸残基数の異なる他の基質を用いてアミノペプチダーゼの活性を測定した。即ち、５ｍＭ各基質（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５）０．１６ｍｌに酵素精製液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０％酢酸を０．０２ｍｌ添加して反応を停止した。反応液中の遊離Ｇｌｕ量をグルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのＧｌｕを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とし、重量あたりの活性値である比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出して図６に示した。用いた基質は、（ａ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（Ｂａｃｈｅｍ社）、（ｂ）Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ（Ｂａｃｈｅｍ社）（配列番号３９）、（ｃ）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（Ｂａｃｈｅｍ社）（配列番号４０）、（ｄ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ（Ｂａｃｈｅｍ社）の４種類である。図６より、ジペプチドに対する活性に比べ、長鎖ペプチドに対する活性が高い傾向にある。
実施例８．天然調味料に対する呈味増強効果
「本造り一番だし極味かつお」（味の素社）に各種精製ＥＡＰを０．１ｍｇ／ｍｌ添加し、３７℃で反応させ、０、６０、１２０分後に経時的にサンプリングした。そして、サンプリングした反応溶液中の遊離Ｇｌｕ量を、グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した。また、１２０分反応後のサンプルを２０倍希釈し、官能評価を行った。
その結果、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ、アスペルギルス・ニガーＥＡＰ、酵母ＥＡＰは、１２０分間の反応により遊離Ｇｌｕ量を約３００ｍｇ／ｌ増加させた（図７参照）。一方、コリネＥＡＰによる増加は、その３分の１程度であった。また、官能評価によるうま味強度は、遊離Ｇｌｕ量に比例していた（表２参照）。
５％分離ダイズタンパク溶液をｐＨ８．０に調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌することにより熱変性を行った。得られたタンパク溶液に、ダイズタンパク質量に対してウマミザイム１％（アマノエンザイム社）、プロテアーゼＭ１％（アマノエンザイム社）を添加し、５０℃にて４８時間反応を行った。その後、アスペルギルス・オリゼＥＡＰを０．２％（質量％）添加し、３７℃にて２４時間反応を行った。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加サンプルと、未添加サンプル中に含まれる遊離Ｇｌｕ量をグルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油社）を用いて測定した結果、遊離Ｇｌｕ量がアスペルギルス・オリゼＥＡＰの添加によって約１．５倍に増加した（図８参照）。
上記と同様に処理したダイズタンパク溶液に、アルカラーゼ１％（ノボザイム社）を添加し、５０℃にて４８時間反応を行った。その後、１２１℃にて１０分間アルカラーゼを失活させ、フレーバーザイム１％（ノボザイム社）を添加し、３７℃２４時間の条件で反応を行った。その後、アスペルギルス・オリゼＥＡＰを添加し、さらに３７℃にて２４時間反応を行った。アスペルギルス・オリゼＥＡＰを添加したサンプルと未添加サンプル中に含まれる遊離Ｇｌｕ量を上記と同様に測定した結果、アスペルギルス・オリゼＥＡＰの添加によって遊離Ｇｌｕ量が約２．２倍に増加した（図９参照）。
実施例１０．乳製品の呈味および／または風味の改善
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加のチーズへの効果を確認した。原料乳は同一生乳（約３５Ｌ）を使用した。所定の方法にて脱脂後、脂肪率は３％に調乳した。所定量の乳酸菌スターターを添加後、原料乳を３２℃に加温し、キモシンを原料に対し０．００３％添加した。原料乳が凝固している事を確認後、カッティング、攪拌し、約１／３のホエーを排除した。次に３４℃まで１℃／２ｍｉｎのスピードでゆっくり昇温、攪拌し、更に１／３のホエーを排除した。その後、３８℃まで１℃／２ｍｉｎのスピードでゆっくり昇温し、１時間攪拌した後、ホエーオフし、カードを得た。アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加量はカード１００ｇに対し０．５ｍｇとした。このときコントロール群は酵素無添加とした。酵素はカード１５００ｇに直接添加し、均一になるように良くかき混ぜた。使用乳酸菌は、クリスチャン・ハンゼン社の４種混合乳酸球菌（ゴーダチーズ）使用した。なおカード重量に対して３％の食塩を添加した。高温（１０℃）熟成のため、酪酸菌を抑制のため硝酸Ｎａを０．００２％原料乳に加えた。製造日から翌朝で予備乾燥した後、チーズ約３７５ｇのカードをモールドに添加した。試験期間を短縮するため熟成は、真空包装の後に１０℃の熟成室に保管した。１４０日保管後、官能評価した。
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加による熟成率（可溶化窒素率）の上昇は無添加のコントロールと比較して有意な差は認められなかった。可溶化窒素率は１２％トリクロロ酢酸に可溶性の画分の窒素量を、全窒素量に対する比率で求めた。一方、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加による遊離グルタミン酸の増加量は１ｍｇ／１００ｇチーズであった。官能評価の結果、アスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加により、チーズ風味が強まる、全体のまとまり感が出る、食感が滑らかになる等の効果が認められた。またチーズの苦味がアスペルギルス・オリゼＥＡＰ添加により消失していたが、これは遊離グルタミン酸の上昇による効果と推測された。
実施例１１．飲料の呈味および／または風味の改善（Ｉ）
トマト（桃太郎、およびプチトマト）を洗浄後、家庭用ミキサーで粉砕しトマト果汁を調製した。本果汁１００ｍｌにアスペルギルス・オリゼＥＡＰを３ｍｇ／ｌの濃度に添加した。コントロールとして予め熱失活させたアスペルギルス・オリゼＥＡＰを添加した。反応は３７℃、１時間で、反応後の果汁を官能評価した。
アスペルギルス・オリゼＥＡＰ処理により遊離のグルタミン酸は約３％増加した。しかしトマト果汁中には元来０．２％（Ｗ／Ｗ）の遊離グルタミン酸が存在しているため、３％の遊離グルタミン酸含量増加によるうま味強度の影響は認められなかった。一方で、酵素処理群は甘味が強まり、かつ酸味が抑制されていたため、トマト果汁独特の抵抗感が弱まっていた。この呈味および／または風味改質効果はコントロール群では認められなかった。なお、アスペルギルス・オリゼＥＡＰのトマトへの効果はプチトマトや、熟成の進んだトマトで顕著であった。
実施例１２．飲料の呈味および／または風味の改善（ＩＩ）
市販の豆乳飲料（国産豆乳；太子食品工業株式会社）１００ｍｌにアスペルギルス・オリゼＥＡＰを３ｍｇ／ｌの濃度に添加した。コントロールとして予め熱失活したペプチダーゼを用いた。これらを３７℃で１時間酵素反応させた後、官能評価に供した。
豆乳へのアスペルギルス・オリゼＥＡＰ処理によるグルタミン酸量の増加は認められなかった。よってうま味強化は認められなかった。しかし酵素添加群はコントロール群と比較して、豆乳独特の青臭さ（ヘキサナール臭）が弱まっており、尚且つ、まろやかに変化しており、豆乳に対する呈味および／または風味改質効果が確認できた。
本発明により、遊離アミノ酸量が高く、呈味の増強された飲食品を製造する方法が提供される。特に、醤油醸造条件下などで存在するＧｌｕ−Ｇｌｕといった難分解性ペプチドを効率よく分解し、呈味の強い調味液をつくることができる。市販のプロテアーゼ、ペプチダーゼ製剤と併用することによってタンパク質加水分解物中の遊離Ｇｌｕ量を上昇させることができる。これは、市販のプロテアーゼ、ペプチダーゼ製剤にはＥＡＰ様活性を有する酵素が殆ど含まれておらず、Ｇｌｕ−Ｇｌｕといった難分解ペプチドがそのまま存在しているからであると考えられる。このように、本発明によりアミノペプチダーゼＥＡＰを用いることによって、醤油、タンパク質加水分解物などの飲食品の呈味性をさらに高めることが可能となる。
【配列表】
Claims (8)
- 以下の酵素特性を示す微生物由来のアミノペプチダーゼを、必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法：
（ａ）ペプチド及び／又はタンパク質のＮ末端からグルタミン酸、アスパラギン酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する；
（ｂ）ｐＨ６．０〜９．０において至適ｐＨでの活性の５０％以上の活性を有する；
（ｃ）ｐＨ７．５、２５〜６０℃、３０分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有する；
（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約４０〜６０ｋＤであり、未変性−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約３００〜４８０ｋＤである；および、
（ｅ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕジペプチドに対する分解活性が１０Ｕ／ｍｇ以上を示す。 - アミノペプチダーゼが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、請求項１記載の方法。
- アミノペプチダーゼが、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、請求項１記載の方法。
- アミノペプチダーゼが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、請求項１記載の方法。
- アミノペプチダーゼが、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼである、請求項１記載の方法。
- 配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、または、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされるアミノペプチダーゼを必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、呈味および／または風味の改善された飲食品の製造方法。
- アミノペプチダーゼが形質転換微生物により生産されるものである請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
- 飲食品が調味料又はタンパク質加水分解物又はチーズ又はトマト果汁含有飲料又は豆乳含有飲料である請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
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