JP4071876B2 - 新規なセリンプロテアーゼ及びその製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なセリンプロテアーゼに関する。更に詳細には、塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する、トリプシン様活性を持つ新規なセリンプロテアーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トリプシンはセリンプロテアーゼの一種であり、ウシ、ブタ、ヒト、ウサギなど各種動物の膵臓に由来することが知られ、膵液中に含まれる蛋白質分解作用を有する酵素の名称として使用され、膵臓のacinous cellで不活性型のトリプシノーゲンとして作られるエンドペプチダーゼ群の酵素であることがわかっている。
【０００３】
トリプシンはトリプシノーゲンから自己触媒的に、エンテロキナーゼ、モルドキナーゼ、カテプシンＢによって活性化をうけてトリプシンとなる。その性質や構造については充分に研究され、ペプチド、アミド、エステルの類をＬ−アルギニンまたはＬ−リジンのカルボキシル基側のペプチド結合を優先的に加水分解する作用を有している。
【０００４】
純化された酵素は血液凝固、血圧低下、抗炎症作用などが認められて臨床に利用されている。また、工業分野では皮革の製造や生の絹の処理などにも利用され、蛋白質分解物の製造にも利用されている。
【０００５】
セリンプロテアーゼであるトリプシンはその基質特異性が非常に特異的であり、塩基性アミノ酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に水解する作用を有する。このような基質特異性を有する、いわゆるトリプシン様プロテアーゼの開発が図られてきている。トリプシン様プロテアーゼの酵素起源として各種微生物が検索されている。例えば、Clostridium histolyticum、Streptomyces griseus、Streptomyces fradiae、Bacteroides gingivalis、Colynebacterium sp.、Bacillus cereus、Salmonella typhimurium等由来のトリプシン様プロテアーゼが報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来より報告されているトリプシン様プロテアーゼはその基質特異性が低く、動物由来のトリプシンの代替えとして使用することはできない状況であり、動物由来のトリプシンと同等の基質特異性を有するトリプシン様プロテアーゼの開発が望まれている。また、現在市販されている動物由来のトリプシンには微量ながらキモトリプシンの混入が認められ,実用段階でこの活性をおさえることはかなり困難であった。
【０００７】
上述のように、トリプシンはその基質特異性を利用して広い応用範囲があるが、その供給源が動物由来であることよりその生産が限定されることや、病気に汚染された動物由来のトリプシンの利用の可能性を排除するためにも、より安全で、給源に問題が生じない、基質特異性の高いトリプシン様プロテアーゼの開発・応用が強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
よって、本発明者らは新たにトリプシン様プロテアーゼの給源を安価な微生物に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、本発明者らが土壌中より新たに分離したトリコデルマ（Trichoderma）属に属する新菌株が、新規なトリプシン様プロテアーゼを生産することを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、下記の特性を有する新規なセリンプロテアーゼである。
▲１▼作用：トリプシン様のプロテアーゼ活性を有する。
▲２▼基質特異性：塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する。
▲３▼至適ｐＨ：約pH７〜８
▲４▼至適温度：約40℃
▲５▼pH安定性：約pH５〜10
▲６▼温度安定性：約40〜50℃
【００１０】
本発明は上記の新規なセリンプロテアーゼと生物学的に同等のプロテアーゼをも包含する。即ち、生物学的に同等のプロテアーゼとは本発明の新規なセリンプロテアーゼであるトリプシン様プロテアーゼの一部分あるいは当該プロテアーゼから１個または複数個のアミノ酸が欠失、又は付加され、及び／又は当該プロテアーゼ中の１個または複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられているプロテアーゼであって、本発明のプロテアーゼの生物学的性質を有するものをいう。
【００１１】
本発明の新規なセリンプロテアーゼは、例えばトリコデルマ属由来の菌株を培養することにより得ることができるが、当該プロテアーゼのアミノ酸配列を解析し、それをコードするDNAを調製することにより遺伝子工学的に得ることもできる。
【００１２】
本発明について更に詳細に説明する。本発明者らが新たに土壌より分離した菌株について、その菌学的性質を、下記に記載する。
【００１３】
【００１４】
２． 生育状態
麦芽・イーストエキス寒天培地
生育は極めて良好で、培養初期は白色、綿毛状、分生子形成に従って濃緑色になる。分生子の形成は全面に起こる場合と不規則に点状もしくは斑状になる場合がある；裏面は白色で水溶性の黄色色素を生成する。
ポテトデキストロース寒天培地
生育は麦芽・イーストエキス寒天培地に比べやや悪いが、培養性状は殆ど同様である。
【００１５】
本菌株は有性胞子を欠き、栄養体が隔壁を有する菌糸体であるから不完全菌であること、菌糸はよく発達し、出芽細胞を欠き、裸出しした分生子を形成するので不完全糸状菌類である。
【００１６】
生育は速やかで、分生子の形成により濃緑色になり、分生子柄は分岐し、びん形のフィアライドを形成し、分生子はフィアロ型、フィアライドの頂端で塊状になることから、トリコデルマ（Trichoderma）属類に分類される。
【００１７】
本菌株は、トリコデルマ・エスピー （Trichoderma sp.）No.9064と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17003として寄託されている。
【００１８】
本菌を使用して本発明のトリプシン様プロテアーゼを生産蓄積させる為の培養方法としては、液体培養法、固体培養法の何れでもよい。固体培養培地としては、小麦ふすま単独或いは小麦ふすまに種々の添加物、例えば、きな粉、大豆粉、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、蛋白質加水分解物などの有機及び無機の窒素化合物などを添加して用いることができ、又、適当な無機塩類を加えることもできる。
【００１９】
又、液体培地の場合は、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地又は天然培地があげられる。例えば、炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげられる。
【００２０】
窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
【００２１】
そして無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
【００２２】
固体培養の場合には、静置培養で行い、培地のpHを３〜７に調製したものに本菌を接種し、10〜40℃で１〜10日間培養を行う。培養後その培養抽出物からトリプシン様プロテアーゼをエタノール沈降などの手段により粗酵素沈殿物として得ることができる。
【００２３】
そして、液体培養の場合には、培養は、振盪培養若しくは、通気攪拌培養等の好気的条件下に於いて行い、培地をpH４〜10の範囲、好ましくはpH５〜８の範囲に調製し、温度10〜40℃の範囲、好ましくは、25〜37℃で、24〜96時間培養する。培養後菌体を除去し、粗酵素液を得る。
【００２４】
ついで、これらの粗酵素液から硫安塩析処理、ゲルろ過処理、疎水クロマトグラフィー処理などを適宜組み合わせる事により高純度のトリプシン様プロテアーゼが得られる。
本明細書において、活性測定法は特に記載しない限り以下のカゼイン基質法により測定した。
【００２５】
活性測定法（カゼイン基質 )
酵素溶液１mlと同量の１(w/v)％カゼイン溶液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）を混合し、37℃において20分間反応する。５(w/v)％トリクロロ酢酸溶液３mlで反応を停止し、30分放置後280nmの吸光度を測定した。酵素活性は１分間あたり、の280nmの吸光度0.001の変化量をもたらす酵素量を１単位とした。
【００２６】
更に、本発明の新規なセリンプロテアーゼの酵素化学的性質を記載する。
▲１▼基質特異性
本酵素は塩基性アミノ酸残基のC末端にpNAやMCAを持つ合成基質を強く水解する作用を有し、この傾向はpNA基質、MCA基質の違いはなく塩基性アミノ酸残基のC末端を特異的に切断するトリプシン様活性を有する。
【００２７】
▲２▼pH安定性
本酵素のpH安定性は約pH５〜10である。
【００２８】
▲３▼温度安定性
本酵素の温度安定性は約40〜50℃である。
【００２９】
▲４▼至適pH
本酵素の至適pHは約７〜８である。
【００３０】
▲５▼至適温度
本酵素の至適温度は約40℃である。
【００３１】
▲６▼酵素活性におよぼす各種化合物の影響
本酵素はTos-Lys-CH2Cl、Aprotininで活性を失い、モノヨード酢酸、PCMPS、Pepstatin Aの影響をほとんど受けない。また、Leupeptin、STI、Antipainによっても強く活性が阻害される。
【００３２】
▲７▼分子量
本酵素の分子量は約25,000（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）、約21,000（HPLCゲルろ過法）と推定される。
【００３３】
▲８▼等電点
本酵素の等電点は約7.3と推定される。
【００３４】
▲９▼Ｎ−末端一次構造の解析
Ｎ−末端20残基まで同定した。その結果を配列番号１に示す。
【００３５】
本発明により得られるトリプシン様酵素は、食品分野、医薬分野など種々の分野において有用に利用することができる。従来、動物由来のトリプシンが利用されていた分野ばかりでなく、その基質特異性の高さや至適pHの違い、至適温度の違いなどを考慮して、各種蛋白質の分解に利用することができる。例えば、CCPの製造や、β−ラクトグロブリン分解、ホエータンパクの分解、ペプチド製造などに利用される。より具体的に説明すると、本発明のトリプシン様プロテアーゼは蛋白質およびペプチド中のアルギニン、リジンのごとき塩基性アミノ酸のカルボキシル末端を水解するため、各種蛋白質系食品の製造に有用である。例えば限定水解により食品素材蛋白質の溶解性、起泡性、乳化性を向上させることが可能であり、ヨーグルト、チーズ、発酵ハムなどの発酵食品製造や製菓製造において品質の安定化、風味の向上が図れ、また、ペプチドまで分解することで降コレステロール食品、非アレルギー食品、血圧上昇抑制食品などに応用可能な生理活性ペプチド製造が可能となる。また、易吸収性、酸性領域での可溶性向上などにより、経腸栄養剤、酸性飲料、蛋白質強化食品にも応用できる。
【００３６】
更には、保湿性の向上、発酵促進作用により化粧品素材としての応用や、発酵用培地成分としても利用できる。これらの場合には、通常の方法が適用できる。以下において、実施例により本発明をより具体的に説明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
ポテトデキストロース寒天培地（極東製薬）に30℃，５日間培養したTrichoderma sp.No.9064(FERM P-17003)を、殺菌した８％のふすま懸濁液250mlを入れた培養フラスコに接種し、30℃，40時間，140rpmの条件下振盪培養し、種培養とした。
【００３８】
これをふすま850gと黄粉150gに560mlの水を散水し殺菌した固体培地に全量接種し、30℃に68時間、静置培養してプロテアーゼを産生させた。培養後、ふすまに水4200mlを加え、産生された酵素を抽出し、粗酵素液3000mlを得た。分画分子量6000の限外濾過膜で600mlまで濃縮し、デキストリン40gを溶解させた後、冷エタノール2000mlを添加し粗酵素沈殿物を得た。粗酵素沈殿物を濾別後、減圧下（５mmHg)40℃で22時間乾燥し、60gの粗酵素粉末を得た。本酵素活性は466ｕ／ｇであった。
【００３９】
実施例２
実施例１で得られた粗酵素粉末１ｇを緩衝液（20mM酢酸緩衝液,pH5.0）100mlに溶かした後、遠心分離（7,000×g、５分間）を行いその上清をＣＭ−トヨパール650Mカラムに添加した。素通りした画分を回収し,30％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し,同濃度の硫酸アンモニウムを含む上記酢酸緩衝液で平衡化したブチル−セファロースカラム（１×５cm）に流し、吸着させた後、上記酢酸緩衝液で溶出し、必要に応じて、280nmの吸光度の高い部分の一部を必要に応じて、上記酢酸緩衝液で平衡化したセファデックスG-200ゲルろ過に流して精製した。本精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドであった。
【００４０】
実施例３
実施例２で得られた精製酵素について、酵素化学的性質を検討した。
▲１▼基質特異性
ペプチジル−pNA基質に対する作用
10mMの各種ペプチジル−pNAのDMSO溶液10μlと緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）0.6mlを混合後、酵素溶液0.2mlを加え、25℃で10分間反応後、405nmの吸光度を測定した。遊離するpNA(p-ニトロアニリン）の吸光係数を9920M-1・cm-1(25℃)として基質分解速度を算出した。Bz-Arg-pNAに対する反応性を100として、その結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
ペプチジル−MCA基質に対する作用
10mMの各種ペプチジル−MCAのDMSO溶液５μlと緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）2.8mlを混合後、酵素溶液0.2mlを加え、25℃で10分間反応後、遊離するMCA（メチルクマリルアミド）量を励起波長380nm、蛍光波長460nmで蛍光光度計（日立F-2000型）で測定し、基質分解速度を算出した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
本酵素は塩基性アミノ酸残基のC末端にpNAやMCAを持つ合成基質を強く水解する作用を有し、この傾向はpNA基質、MCA基質の違いはなく塩基性アミノ酸残基のC末端を特異的に切断するトリプシン様活性を有することがわかる。
【００４５】
カエル由来のPhysalaeminのLys６位や過ギ酸酸化ウシインシュリンB鎖（シグマ社製）のArg22位及びLys29位のいずれもC末端側を水解し、その他の切断点がみられないことより、厳密な基質特異性を有することが明らかとなった。
【００４６】
▲２▼pH安定性
10mMのクエン酸−塩酸緩衝液（pH2.0-8.4）及び10mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.4-12.0）と酵素溶液を30分間放置後、pH7.0に戻し、カゼイン及びBz-Arg-pNAを基質として活性を測定した。その結果を図１及び図２に示す。本酵素のpH安定性は約pH５〜10である。
【００４７】
▲３▼温度安定性
26-80℃の緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）に酵素溶液を20分間おいた後に更に37℃で10分間おき、カゼイン及びBz-Arg-pNAを基質として活性を測定（25℃で測定）した。その結果を図３及び図４に示す。本酵素の温度安定性は約40〜50℃であり、70℃で活性を失った。
【００４８】
▲４▼至適pH
0.2Mのクエン酸−塩酸緩衝液（pH2.0-8.4）及び0.2Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.4-12.0）の各緩衝液でカゼインあるいはBz-Arg-pNAを溶かして基質として、活性を測定（30℃で測定)した。その結果を図５及び図６に示す。本酵素の至適pHは約７〜８である。
【００４９】
▲５▼至適温度
カゼインあるいはBz-Arg-pNAを26-80℃の緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）中で20分間プレインキュベートした後、酵素溶液を加えて活性を測定した。その結果を図７及び図８に示す。本酵素の至適温度は約40℃である。
【００５０】
▲６▼酵素活性におよぼす各種化合物の影響
表３に示す各種化合物溶液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）を同量の酵素溶液と混合し、30℃で１時間放置した。残存活性をBz-Arg-pNAを基質とした上記の測定法にしたがって測定した。対照としては化合物を加えていない緩衝液中で同様の条件下で放置した酵素溶液を使用した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
DFP:diisopropyl fluorophosphate
PMSF:phenylmethanesulfonylfluoride
Tos-Lys-CH2Cl:N-Tosyl-L-lysine chloromethylketone
STI:Soybean trypsin inhibitor
MIA:monoiodoacetic acid
PCMPS:p-chloromercuriphenylsulfonic acid
本酵素はTos-Lys-CH2Cl、Aprotininで活性を失い、モノヨード酢酸、PCMPS、Pepstatin Aの影響をほとんど受けないことから、セリンタイプの酵素と考えられる。また、Leupeptin、STI、Antipainによっても強く活性が阻害された。
【００５３】
▲７▼分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（15％ゲルはLaemmliの方法に準じておこなった。標準蛋白質としてはPhosphorylase b(94,000),bovine serum albumin(67,000),ovalabumin(43,000),carbonate dehydrogenase(30,000),soybean trypsin inhibitor(20,000),α−lactalbumin(14,000)を使用し、ゲル染色はCoomassie Brilliant Brue R-250あるいは銀染色法を用いた。その結果、本酵素の分子量は約25,000と推定された。
【００５４】
更に分子量の推定にはHPLCゲルろ過法も併用した。カラムとしてはTSK-gel G2000SW(7.5×600mm+7.5×75mmカードカラム）を使用し、0.3Mの塩化ナトリウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）を溶媒とし、標準蛋白質として上述のα−lactalbuminとPhosphorylase bに代えてribonuclease(14,000)とinsulin(6,000)を使用した。その結果、本酵素の分子量は約21,000と推定された。
【００５５】
▲８▼等電点
等電点電気泳動（15％ゲル）は、スラブゲルを用いておこなった。pH勾配の作成にはAmpholine(pH3-10,ファルマシア）を用い、泳動は35V,６mAでおこなった。その結果、本酵素の等電点は約7.3と推定された。
【００５６】
▲９▼N-末端一次構造の解析
本酵素について、プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製477A）により自動アミノ酸配列分析をおこなった。生じた各PTH-アミノ酸はアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製120A）によりオンラインで分析し、Ｎ−末端20残基まで同定した。その結果を配列番号１に示す。本発明はこれと生物学的に同等のプロテアーゼをも包含する。また、動物起源のトリプシン（配列番号２及び配列番号３）、放線菌由来のトリプシン（配列番号４及び配列番号５）の配列と比較した場合、その類似性が認められた。
【００５７】
実施例４ カゼインホスホペプチドの製造
市販のミルクカゼイン10kgを100 Lの水に溶解し、pHを7.0に調製した。本発明のセリンプロテアーゼを400単位（／gタンパク質）添加し、50℃に６時間保持した。その後、80℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、pHを4.5に調製し、生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を活性炭処理により苦味を低下させた後、常法により濃縮・乾燥し、カゼインホスホペプチドを50％含有するペプチド粉末約2.7kgを得た。
【００５８】
実施例５ 低アレルゲン化ホエー蛋白分解物の製造
ホエー蛋白の10％水溶液２Lに本発明の酵素を360単位（／ｇタンパク質）加え、pHを7.0に調整後、50℃で５時間酵素反応した。反応後、80℃に10分間保ち酵素を失活させ、遠心分離により不溶物を除去後、上清を常法により濃縮し、乾燥させ120ｇの粉末を得た。
【００５９】
得られたホエー分解物の抗原性をInhibition ELISA法（日本小児アレルギー学会誌、１，36、1987）に従って、β−ラクトグロブリンに対して測定したところ＜1／10,000であった。
【００６０】
実施例６ 乳化性、起泡性に優れた蛋白質分解物の製造
市販大豆タンパク質の３％水溶液4ＬをpH7.0に調整後、本発明の酵素500単位（／ｇタンパク質）を添加して40℃に30分間反応させた後、85℃に10分間保ち酵素を失活させ、常法により濃縮、乾燥させた。本タンパク質分解物は、原料市販大豆タンパク質に比し高い起泡性を示した。
【００６１】
実施例７ 調味液の製造
５％大豆蛋白溶液１ＬをpH7.0に調製後、本発明の酵素100単位（／ｇタンパク質）とペプチダーゼR（天野製薬製）１ｇを添加し、45℃に20時間攪拌しつつ反応させた。反応後、80℃に15分間保ち、酵素を失活させ、遠心分離で清澄なタンパク質分解液を得た。この分解液についてカフェイン溶液を指標に呈味試験を実施したところ苦味は全くなく、旨味が感じられた。またファルマシア社製「スーパーロース１２」ゲル濾過用カラムを用いた分子量分布の測定により、ほとんど分子量は1,000以下のペプチド及びアミノ酸であった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する、トリプシン様活性を持つ新規なセリンプロテアーゼが提供される。本酵素は微生物より得ることができ、本酵素は、食品分野、医薬分野など種々の分野において有用に利用することができる。従来、動物由来のトリプシンが利用されていた分野ばかりでなく、その基質特異性の高さや至適pHの違い、至適温度の違いなどを考慮して、各種蛋白質の分解に利用することができる。
【００６３】
【配列表】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２におけるカゼインを基質とした場合のpH安定性の結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるBz-Arg-pNAをとした場合のpH安定性の結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるカゼインを基質とした場合の温度安定性の結果を示す図である。
【図４】実施例２におけるBz-Arg-pNAを基質とした場合の温度安定性の結果を示す図である。
【図５】実施例２におけるカゼインを基質とした場合の至適pHの結果を示す図である。
【図６】実施例２におけるBz-Arg-pNAを基質とした場合の至適pHの結果を示す図である。
【図７】実施例２におけるカゼインを基質とした場合の至適温度の結果を示す図である。
【図８】実施例２におけるBz-Arg-pNAを基質とした場合の至適温度の結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なセリンプロテアーゼに関する。更に詳細には、塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する、トリプシン様活性を持つ新規なセリンプロテアーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トリプシンはセリンプロテアーゼの一種であり、ウシ、ブタ、ヒト、ウサギなど各種動物の膵臓に由来することが知られ、膵液中に含まれる蛋白質分解作用を有する酵素の名称として使用され、膵臓のacinous cellで不活性型のトリプシノーゲンとして作られるエンドペプチダーゼ群の酵素であることがわかっている。
【０００３】
トリプシンはトリプシノーゲンから自己触媒的に、エンテロキナーゼ、モルドキナーゼ、カテプシンＢによって活性化をうけてトリプシンとなる。その性質や構造については充分に研究され、ペプチド、アミド、エステルの類をＬ−アルギニンまたはＬ−リジンのカルボキシル基側のペプチド結合を優先的に加水分解する作用を有している。
【０００４】
純化された酵素は血液凝固、血圧低下、抗炎症作用などが認められて臨床に利用されている。また、工業分野では皮革の製造や生の絹の処理などにも利用され、蛋白質分解物の製造にも利用されている。
【０００５】
セリンプロテアーゼであるトリプシンはその基質特異性が非常に特異的であり、塩基性アミノ酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に水解する作用を有する。このような基質特異性を有する、いわゆるトリプシン様プロテアーゼの開発が図られてきている。トリプシン様プロテアーゼの酵素起源として各種微生物が検索されている。例えば、Clostridium histolyticum、Streptomyces griseus、Streptomyces fradiae、Bacteroides gingivalis、Colynebacterium sp.、Bacillus cereus、Salmonella typhimurium等由来のトリプシン様プロテアーゼが報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来より報告されているトリプシン様プロテアーゼはその基質特異性が低く、動物由来のトリプシンの代替えとして使用することはできない状況であり、動物由来のトリプシンと同等の基質特異性を有するトリプシン様プロテアーゼの開発が望まれている。また、現在市販されている動物由来のトリプシンには微量ながらキモトリプシンの混入が認められ,実用段階でこの活性をおさえることはかなり困難であった。
【０００７】
上述のように、トリプシンはその基質特異性を利用して広い応用範囲があるが、その供給源が動物由来であることよりその生産が限定されることや、病気に汚染された動物由来のトリプシンの利用の可能性を排除するためにも、より安全で、給源に問題が生じない、基質特異性の高いトリプシン様プロテアーゼの開発・応用が強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
よって、本発明者らは新たにトリプシン様プロテアーゼの給源を安価な微生物に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、本発明者らが土壌中より新たに分離したトリコデルマ（Trichoderma）属に属する新菌株が、新規なトリプシン様プロテアーゼを生産することを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、下記の特性を有する新規なセリンプロテアーゼである。
▲１▼作用：トリプシン様のプロテアーゼ活性を有する。
▲２▼基質特異性：塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する。
▲３▼至適ｐＨ：約pH７〜８
▲４▼至適温度：約40℃
▲５▼pH安定性：約pH５〜10
▲６▼温度安定性：約40〜50℃
【００１０】
本発明は上記の新規なセリンプロテアーゼと生物学的に同等のプロテアーゼをも包含する。即ち、生物学的に同等のプロテアーゼとは本発明の新規なセリンプロテアーゼであるトリプシン様プロテアーゼの一部分あるいは当該プロテアーゼから１個または複数個のアミノ酸が欠失、又は付加され、及び／又は当該プロテアーゼ中の１個または複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられているプロテアーゼであって、本発明のプロテアーゼの生物学的性質を有するものをいう。
【００１１】
本発明の新規なセリンプロテアーゼは、例えばトリコデルマ属由来の菌株を培養することにより得ることができるが、当該プロテアーゼのアミノ酸配列を解析し、それをコードするDNAを調製することにより遺伝子工学的に得ることもできる。
【００１２】
本発明について更に詳細に説明する。本発明者らが新たに土壌より分離した菌株について、その菌学的性質を、下記に記載する。
【００１３】
２． 生育状態
麦芽・イーストエキス寒天培地
生育は極めて良好で、培養初期は白色、綿毛状、分生子形成に従って濃緑色になる。分生子の形成は全面に起こる場合と不規則に点状もしくは斑状になる場合がある；裏面は白色で水溶性の黄色色素を生成する。
ポテトデキストロース寒天培地
生育は麦芽・イーストエキス寒天培地に比べやや悪いが、培養性状は殆ど同様である。
【００１５】
本菌株は有性胞子を欠き、栄養体が隔壁を有する菌糸体であるから不完全菌であること、菌糸はよく発達し、出芽細胞を欠き、裸出しした分生子を形成するので不完全糸状菌類である。
【００１６】
生育は速やかで、分生子の形成により濃緑色になり、分生子柄は分岐し、びん形のフィアライドを形成し、分生子はフィアロ型、フィアライドの頂端で塊状になることから、トリコデルマ（Trichoderma）属類に分類される。
【００１７】
本菌株は、トリコデルマ・エスピー （Trichoderma sp.）No.9064と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17003として寄託されている。
【００１８】
本菌を使用して本発明のトリプシン様プロテアーゼを生産蓄積させる為の培養方法としては、液体培養法、固体培養法の何れでもよい。固体培養培地としては、小麦ふすま単独或いは小麦ふすまに種々の添加物、例えば、きな粉、大豆粉、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、蛋白質加水分解物などの有機及び無機の窒素化合物などを添加して用いることができ、又、適当な無機塩類を加えることもできる。
【００１９】
又、液体培地の場合は、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地又は天然培地があげられる。例えば、炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげられる。
【００２０】
窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
【００２１】
そして無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
【００２２】
固体培養の場合には、静置培養で行い、培地のpHを３〜７に調製したものに本菌を接種し、10〜40℃で１〜10日間培養を行う。培養後その培養抽出物からトリプシン様プロテアーゼをエタノール沈降などの手段により粗酵素沈殿物として得ることができる。
【００２３】
そして、液体培養の場合には、培養は、振盪培養若しくは、通気攪拌培養等の好気的条件下に於いて行い、培地をpH４〜10の範囲、好ましくはpH５〜８の範囲に調製し、温度10〜40℃の範囲、好ましくは、25〜37℃で、24〜96時間培養する。培養後菌体を除去し、粗酵素液を得る。
【００２４】
ついで、これらの粗酵素液から硫安塩析処理、ゲルろ過処理、疎水クロマトグラフィー処理などを適宜組み合わせる事により高純度のトリプシン様プロテアーゼが得られる。
本明細書において、活性測定法は特に記載しない限り以下のカゼイン基質法により測定した。
【００２５】
活性測定法（カゼイン基質 )
酵素溶液１mlと同量の１(w/v)％カゼイン溶液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）を混合し、37℃において20分間反応する。５(w/v)％トリクロロ酢酸溶液３mlで反応を停止し、30分放置後280nmの吸光度を測定した。酵素活性は１分間あたり、の280nmの吸光度0.001の変化量をもたらす酵素量を１単位とした。
【００２６】
更に、本発明の新規なセリンプロテアーゼの酵素化学的性質を記載する。
▲１▼基質特異性
本酵素は塩基性アミノ酸残基のC末端にpNAやMCAを持つ合成基質を強く水解する作用を有し、この傾向はpNA基質、MCA基質の違いはなく塩基性アミノ酸残基のC末端を特異的に切断するトリプシン様活性を有する。
【００２７】
▲２▼pH安定性
本酵素のpH安定性は約pH５〜10である。
【００２８】
▲３▼温度安定性
本酵素の温度安定性は約40〜50℃である。
【００２９】
▲４▼至適pH
本酵素の至適pHは約７〜８である。
【００３０】
▲５▼至適温度
本酵素の至適温度は約40℃である。
【００３１】
▲６▼酵素活性におよぼす各種化合物の影響
本酵素はTos-Lys-CH2Cl、Aprotininで活性を失い、モノヨード酢酸、PCMPS、Pepstatin Aの影響をほとんど受けない。また、Leupeptin、STI、Antipainによっても強く活性が阻害される。
【００３２】
▲７▼分子量
本酵素の分子量は約25,000（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）、約21,000（HPLCゲルろ過法）と推定される。
【００３３】
▲８▼等電点
本酵素の等電点は約7.3と推定される。
【００３４】
▲９▼Ｎ−末端一次構造の解析
Ｎ−末端20残基まで同定した。その結果を配列番号１に示す。
【００３５】
本発明により得られるトリプシン様酵素は、食品分野、医薬分野など種々の分野において有用に利用することができる。従来、動物由来のトリプシンが利用されていた分野ばかりでなく、その基質特異性の高さや至適pHの違い、至適温度の違いなどを考慮して、各種蛋白質の分解に利用することができる。例えば、CCPの製造や、β−ラクトグロブリン分解、ホエータンパクの分解、ペプチド製造などに利用される。より具体的に説明すると、本発明のトリプシン様プロテアーゼは蛋白質およびペプチド中のアルギニン、リジンのごとき塩基性アミノ酸のカルボキシル末端を水解するため、各種蛋白質系食品の製造に有用である。例えば限定水解により食品素材蛋白質の溶解性、起泡性、乳化性を向上させることが可能であり、ヨーグルト、チーズ、発酵ハムなどの発酵食品製造や製菓製造において品質の安定化、風味の向上が図れ、また、ペプチドまで分解することで降コレステロール食品、非アレルギー食品、血圧上昇抑制食品などに応用可能な生理活性ペプチド製造が可能となる。また、易吸収性、酸性領域での可溶性向上などにより、経腸栄養剤、酸性飲料、蛋白質強化食品にも応用できる。
【００３６】
更には、保湿性の向上、発酵促進作用により化粧品素材としての応用や、発酵用培地成分としても利用できる。これらの場合には、通常の方法が適用できる。以下において、実施例により本発明をより具体的に説明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
ポテトデキストロース寒天培地（極東製薬）に30℃，５日間培養したTrichoderma sp.No.9064(FERM P-17003)を、殺菌した８％のふすま懸濁液250mlを入れた培養フラスコに接種し、30℃，40時間，140rpmの条件下振盪培養し、種培養とした。
【００３８】
これをふすま850gと黄粉150gに560mlの水を散水し殺菌した固体培地に全量接種し、30℃に68時間、静置培養してプロテアーゼを産生させた。培養後、ふすまに水4200mlを加え、産生された酵素を抽出し、粗酵素液3000mlを得た。分画分子量6000の限外濾過膜で600mlまで濃縮し、デキストリン40gを溶解させた後、冷エタノール2000mlを添加し粗酵素沈殿物を得た。粗酵素沈殿物を濾別後、減圧下（５mmHg)40℃で22時間乾燥し、60gの粗酵素粉末を得た。本酵素活性は466ｕ／ｇであった。
【００３９】
実施例２
実施例１で得られた粗酵素粉末１ｇを緩衝液（20mM酢酸緩衝液,pH5.0）100mlに溶かした後、遠心分離（7,000×g、５分間）を行いその上清をＣＭ−トヨパール650Mカラムに添加した。素通りした画分を回収し,30％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し,同濃度の硫酸アンモニウムを含む上記酢酸緩衝液で平衡化したブチル−セファロースカラム（１×５cm）に流し、吸着させた後、上記酢酸緩衝液で溶出し、必要に応じて、280nmの吸光度の高い部分の一部を必要に応じて、上記酢酸緩衝液で平衡化したセファデックスG-200ゲルろ過に流して精製した。本精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドであった。
【００４０】
実施例３
実施例２で得られた精製酵素について、酵素化学的性質を検討した。
▲１▼基質特異性
ペプチジル−pNA基質に対する作用
10mMの各種ペプチジル−pNAのDMSO溶液10μlと緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）0.6mlを混合後、酵素溶液0.2mlを加え、25℃で10分間反応後、405nmの吸光度を測定した。遊離するpNA(p-ニトロアニリン）の吸光係数を9920M-1・cm-1(25℃)として基質分解速度を算出した。Bz-Arg-pNAに対する反応性を100として、その結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
ペプチジル−MCA基質に対する作用
10mMの各種ペプチジル−MCAのDMSO溶液５μlと緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）2.8mlを混合後、酵素溶液0.2mlを加え、25℃で10分間反応後、遊離するMCA（メチルクマリルアミド）量を励起波長380nm、蛍光波長460nmで蛍光光度計（日立F-2000型）で測定し、基質分解速度を算出した。
【００４３】
【表２】
本酵素は塩基性アミノ酸残基のC末端にpNAやMCAを持つ合成基質を強く水解する作用を有し、この傾向はpNA基質、MCA基質の違いはなく塩基性アミノ酸残基のC末端を特異的に切断するトリプシン様活性を有することがわかる。
【００４５】
カエル由来のPhysalaeminのLys６位や過ギ酸酸化ウシインシュリンB鎖（シグマ社製）のArg22位及びLys29位のいずれもC末端側を水解し、その他の切断点がみられないことより、厳密な基質特異性を有することが明らかとなった。
【００４６】
▲２▼pH安定性
10mMのクエン酸−塩酸緩衝液（pH2.0-8.4）及び10mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.4-12.0）と酵素溶液を30分間放置後、pH7.0に戻し、カゼイン及びBz-Arg-pNAを基質として活性を測定した。その結果を図１及び図２に示す。本酵素のpH安定性は約pH５〜10である。
【００４７】
▲３▼温度安定性
26-80℃の緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）に酵素溶液を20分間おいた後に更に37℃で10分間おき、カゼイン及びBz-Arg-pNAを基質として活性を測定（25℃で測定）した。その結果を図３及び図４に示す。本酵素の温度安定性は約40〜50℃であり、70℃で活性を失った。
【００４８】
▲４▼至適pH
0.2Mのクエン酸−塩酸緩衝液（pH2.0-8.4）及び0.2Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.4-12.0）の各緩衝液でカゼインあるいはBz-Arg-pNAを溶かして基質として、活性を測定（30℃で測定)した。その結果を図５及び図６に示す。本酵素の至適pHは約７〜８である。
【００４９】
▲５▼至適温度
カゼインあるいはBz-Arg-pNAを26-80℃の緩衝液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）中で20分間プレインキュベートした後、酵素溶液を加えて活性を測定した。その結果を図７及び図８に示す。本酵素の至適温度は約40℃である。
【００５０】
▲６▼酵素活性におよぼす各種化合物の影響
表３に示す各種化合物溶液（67mMリン酸緩衝液、pH7.0）を同量の酵素溶液と混合し、30℃で１時間放置した。残存活性をBz-Arg-pNAを基質とした上記の測定法にしたがって測定した。対照としては化合物を加えていない緩衝液中で同様の条件下で放置した酵素溶液を使用した。
【００５１】
【表３】
DFP:diisopropyl fluorophosphate
PMSF:phenylmethanesulfonylfluoride
Tos-Lys-CH2Cl:N-Tosyl-L-lysine chloromethylketone
STI:Soybean trypsin inhibitor
MIA:monoiodoacetic acid
PCMPS:p-chloromercuriphenylsulfonic acid
本酵素はTos-Lys-CH2Cl、Aprotininで活性を失い、モノヨード酢酸、PCMPS、Pepstatin Aの影響をほとんど受けないことから、セリンタイプの酵素と考えられる。また、Leupeptin、STI、Antipainによっても強く活性が阻害された。
【００５３】
▲７▼分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（15％ゲルはLaemmliの方法に準じておこなった。標準蛋白質としてはPhosphorylase b(94,000),bovine serum albumin(67,000),ovalabumin(43,000),carbonate dehydrogenase(30,000),soybean trypsin inhibitor(20,000),α−lactalbumin(14,000)を使用し、ゲル染色はCoomassie Brilliant Brue R-250あるいは銀染色法を用いた。その結果、本酵素の分子量は約25,000と推定された。
【００５４】
更に分子量の推定にはHPLCゲルろ過法も併用した。カラムとしてはTSK-gel G2000SW(7.5×600mm+7.5×75mmカードカラム）を使用し、0.3Mの塩化ナトリウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）を溶媒とし、標準蛋白質として上述のα−lactalbuminとPhosphorylase bに代えてribonuclease(14,000)とinsulin(6,000)を使用した。その結果、本酵素の分子量は約21,000と推定された。
【００５５】
▲８▼等電点
等電点電気泳動（15％ゲル）は、スラブゲルを用いておこなった。pH勾配の作成にはAmpholine(pH3-10,ファルマシア）を用い、泳動は35V,６mAでおこなった。その結果、本酵素の等電点は約7.3と推定された。
【００５６】
▲９▼N-末端一次構造の解析
本酵素について、プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製477A）により自動アミノ酸配列分析をおこなった。生じた各PTH-アミノ酸はアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製120A）によりオンラインで分析し、Ｎ−末端20残基まで同定した。その結果を配列番号１に示す。本発明はこれと生物学的に同等のプロテアーゼをも包含する。また、動物起源のトリプシン（配列番号２及び配列番号３）、放線菌由来のトリプシン（配列番号４及び配列番号５）の配列と比較した場合、その類似性が認められた。
【００５７】
実施例４ カゼインホスホペプチドの製造
市販のミルクカゼイン10kgを100 Lの水に溶解し、pHを7.0に調製した。本発明のセリンプロテアーゼを400単位（／gタンパク質）添加し、50℃に６時間保持した。その後、80℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、pHを4.5に調製し、生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を活性炭処理により苦味を低下させた後、常法により濃縮・乾燥し、カゼインホスホペプチドを50％含有するペプチド粉末約2.7kgを得た。
【００５８】
実施例５ 低アレルゲン化ホエー蛋白分解物の製造
ホエー蛋白の10％水溶液２Lに本発明の酵素を360単位（／ｇタンパク質）加え、pHを7.0に調整後、50℃で５時間酵素反応した。反応後、80℃に10分間保ち酵素を失活させ、遠心分離により不溶物を除去後、上清を常法により濃縮し、乾燥させ120ｇの粉末を得た。
【００５９】
得られたホエー分解物の抗原性をInhibition ELISA法（日本小児アレルギー学会誌、１，36、1987）に従って、β−ラクトグロブリンに対して測定したところ＜1／10,000であった。
【００６０】
実施例６ 乳化性、起泡性に優れた蛋白質分解物の製造
市販大豆タンパク質の３％水溶液4ＬをpH7.0に調整後、本発明の酵素500単位（／ｇタンパク質）を添加して40℃に30分間反応させた後、85℃に10分間保ち酵素を失活させ、常法により濃縮、乾燥させた。本タンパク質分解物は、原料市販大豆タンパク質に比し高い起泡性を示した。
【００６１】
実施例７ 調味液の製造
５％大豆蛋白溶液１ＬをpH7.0に調製後、本発明の酵素100単位（／ｇタンパク質）とペプチダーゼR（天野製薬製）１ｇを添加し、45℃に20時間攪拌しつつ反応させた。反応後、80℃に15分間保ち、酵素を失活させ、遠心分離で清澄なタンパク質分解液を得た。この分解液についてカフェイン溶液を指標に呈味試験を実施したところ苦味は全くなく、旨味が感じられた。またファルマシア社製「スーパーロース１２」ゲル濾過用カラムを用いた分子量分布の測定により、ほとんど分子量は1,000以下のペプチド及びアミノ酸であった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する、トリプシン様活性を持つ新規なセリンプロテアーゼが提供される。本酵素は微生物より得ることができ、本酵素は、食品分野、医薬分野など種々の分野において有用に利用することができる。従来、動物由来のトリプシンが利用されていた分野ばかりでなく、その基質特異性の高さや至適pHの違い、至適温度の違いなどを考慮して、各種蛋白質の分解に利用することができる。
【００６３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２におけるカゼインを基質とした場合のpH安定性の結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるBz-Arg-pNAをとした場合のpH安定性の結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるカゼインを基質とした場合の温度安定性の結果を示す図である。
【図４】実施例２におけるBz-Arg-pNAを基質とした場合の温度安定性の結果を示す図である。
【図５】実施例２におけるカゼインを基質とした場合の至適pHの結果を示す図である。
【図６】実施例２におけるBz-Arg-pNAを基質とした場合の至適pHの結果を示す図である。
【図７】実施例２におけるカゼインを基質とした場合の至適温度の結果を示す図である。
【図８】実施例２におけるBz-Arg-pNAを基質とした場合の至適温度の結果を示す図である。
Claims (3)
- 下記の特性を有するトリコデルマ・エスピー（Trichoderma sp．）由来のセリンプロテアーゼ。
（１）作用：トリプシン様のプロテアーゼ活性を有する。
（２）基質特異性：塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に水解する。
（３）至適ｐＨ：約pH７〜８
（４）至適温度：約40℃
（５）ｐＨ安定性：約pH５〜10
（６）温度安定性：約40〜50℃
（７）分子量：25,000（SDS-PAGE） - トリコデルマ・エスピー（Trichoderma sp.）属に属する菌株を栄養培地に培養し、培養物中に請求項1に記載のセリンプロテアーゼを蓄積せしめ、当該セリンプロテアーゼを採取することを特徴とするセリンプロテアーゼの製造法。
- 蛋白質含有原料に、請求項1に記載のセリンプロテアーゼを作用させることを特徴とする当該蛋白質の分解方法。
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