JPH02234642A - 低分子ペプチド組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業」一の利用分野 本発明は短腸症候群なとのような吸収不良症候群の治療
に有用な栄養輸液あるいは栄養食品素祠として用いられ
る低分子ペプチト組成物およびその製造方法に関するも
のである。

従来の技術 タンパク質が体内で吸収される場合、種々の消化酵素に
より低分子のオリゴペプチトに加水分解された後吸収さ
れる。この時、分子量の小さいオリゴペプチトの方が吸
収されやずいが、オリコベプチドの中でもジペプヂド、
トリペプチトのものがもっともよく吸収され、このよう
な低分子ペプチドは遊離のアミノ酸よりむしろ吸収効率
が高い事が知られている。

従って、低分子ベプチト組成物の中でもシペプチド、ト
リペプチドの混合物は栄養食品素材としばかりでなく、
経腸輸液として最も有用な素材となりえるものである。

一般にタンパク質から低分子ペプチド組成物を得る方法
としては、タンパク質原料を酵素反応あるいは酵素反応
と他の処理、例えば加熱処理などを組み合わせて加水分
解を行い、ゲノレろ過などの方法により目的とするペプ
チド鎮長をもった生成物を集める方法がとられている。

例えば、ベプシン、アスペルギルス・サイトーイ起源酸
性プロテアーゼおよびリゾーパス、シネンシス起源酸性
プロテアーゼの中から選ばれる２種以上の酵素を組み合
わせて加水分解を行い、分子量７００以上のペプチド含
量が２０％以下の低分子ペプチド組成物を得る方法（特
開昭５９−１１１９２号他）、チオールプ口テアーゼと
カルボキシプロテアーゼを組み合わせて加水分解を行っ
た後、更にセリンプロテアーゼまたはプロリン特異性プ
ロテアーゼを用いて加水分解を行い、分子量５００〜１
５００のペプチド組成物を得る方法（特開昭６０９８９
９３号他）あるいは、加熱処理と、いくつかのプロテア
ーゼを用いた酵素反応によって加水分解を行い、ペプチ
ド鎖長が１０〜３０のペプチト組成物を得る方法（特開
昭６１−２５４１５３号）などが知られている。

発明が解決しようとする問題点 これ才でタンパク質原料を低分子ペプチト組成物に加水
分解する際の酵素として、ペプンン、パパイン、トリプ
シンなどを始め種々のべプチダゼが用いられている。こ
れらのべプチダーゼは通常、単独で用いた場合ある程度
以上は加水分解が進行しないものが多い。このため、希
望するような低分子ペプチドを得るために、いくつかの
酵素を混ぜた複合酵素による加水分解や、複数の酵素を
順次用いて段階的に加水分解を行う方法などがとられて
いる。

ところが、このような複合酵素反応あるいは多段階酵素
反応の場合、条件によってはアミノ酸にまで加水分解が
進行する危険性が高く、酵素反応の調節には充分注意を
払う必要があった。

従来よりこのような調節方法として、使用する酵素の種
類、酵素の組み合わせ方あるいは酵素反応の順序、反応
条件等を変えることによって酵素反応を調節する方法が
とられている。しかしながら、これらの調節方法には限
界があるため、最終的には低分子ペプチド含量が高まる
一方、遊離アミノ酸の生成が少ない段階で酵素反応を停
止させる方法がとられていた。

このように、従来の方法は目的とする低分子ペプチドを
得るための加水分解の調節が極めて難しく、また、常に
一定した組成の生成物を得ることも困難なものであった
。

問題点を解決するための手段 本発明者らは栄養食品素材または栄養輸液として有用な
低分子ペプチド組成物の効率的な製造方法を見出すべく
検討した結果、タンパク質原料をジペプチジルペプチダ
ーゼを用いて加水分解することによって、容易に効率よ
く低分子ペプチド組成物を得ることができることを見出
し、本発明を成すに至った。

すなわち、本発明の目的は、動物性または植物性タンパ
ク質原料を、必要に応じトリプシン、キモトリプシン、
ズブチリシンなどのプロテアーゼで処理した後、ジペプ
チジルペプチダーゼを用いて加水分解することによって
得られる分子量１０００以上のペプチドの含量が１０％
以下である低分子ペプチド組成物およびその製造方法を
提供することである。

本発明の製造方法に用いられるタンパク質原料としては
、カゼイン、卵白、牛乳、食肉タンパク質などのような
動物性タンパク質、大豆、大豆ホエー、落花生タンパク
質などのような植物性タンパク質のいずれも用いること
ができる。

本発明の製造方法において使用するタンパク質原料はジ
ペプチジルペプチダーゼによる加水分解に先立ち、トリ
プシン、キモトリプシン、ズブチリシンなどのようなプ
ロテアーゼで一次処理゛を行って適当な大きさのオリゴ
ペプチドに変換した方が短時間に効率よく加水分解でき
るので好適である。

この一次処理に用いられる酵素は一般に知られているプ
ロテアーゼであればどのようなものでもよく、また、酵
素反応もきわめて一般的な条件下で行うことができる。

本発明の製造方法に使用されるジペプチシルペプチダー
セとしてはカデプンンＣなとの市販精製品および各種臓
器からの抽出混合物のいずれも用いることができるが、
１種の酵素を単独で使用するより、２種以上の酵素を組
み合わせて使用する方が効果的である。

本発明の製造方法における、ジペプチジルペプチダーゼ
による加水分解反応は、通常の酵素反応の条件下で行う
ことができ、例えば、ｐＨ５〜９、温度２５〜５０℃、
基質濃度２〜５％程度で好適に進行する。

本発明の製造方法を好適に実施するには、タンパク質原
料、例えばカゼインをプロテアーセ、例えばトリプシン
、キモトリプシンおよびズブチリシンの中の１〜２種の
酵素で順次処理した後、カテプンンＣおよび臓器抽出物
、例えばウン肝臓抽出物から分画したジペプシジルペプ
チダーゼリンチフラクションを用い、基質濃度４％、反
応温度約３７℃、ｐｔ｛７．０で約６時間酵素反応を行
い、反応終了後限外ろ過を行って酵素を除去して、低分
子ペプチト組成物を得る。

このようにして得られる低分子ペプチド組成物は、液体
クロマトクラフィーによる分子量解析の結果、分子量１
０００以上のペプチトが０．７〜７％と極めて少ないも
のである。

しかも、生成ペプチド組成物のアミノ酸分析計の解析結
果、アミノ酸組成においてタンパク質原料とほとんど変
化しておらず、遊離アミノ酸が少ないものである。

また、ＴＮＢＳ（　２，４．６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅ
ｎｚｅｎｅｓｕｌ丁ｏｎｉｃ．＋ｃｉｄ）　法（蛋白質
・核酸・酵素、１８巻、１３号、１１５３ページ〜、１
９７３年）による遊離アミン基の定量値の逆数から求め
た平均分子量およびこれを構成アミノ酸の平均分子量て
除して求め１こ平均ペブチト残基数はそれぞれ６００〜
９００６〜８ペプチド鎖である。（参考例２参照） このように、本発明の製造方法で得られる低分子ペプチ
ト組成物は、従来の製造方法で得られる低分子ペプチド
組成物より平均分子量、平均ペプチド鎖長、分子量１０
００以上のペプチド含量等において、より低分子化され
ている一方、遊離アミノ酸含量が少ない優れたものであ
る。

また、ＴＮＢＳ法による生成物の遊離アミノ基の定量値
と、生成物を塩酸で完全に加水分解した後の遊離アミン
基の定量値との比の値が２．３〜３．７程度と極めて低
く、このことは、本発明の製造方法で得られる低分子ペ
プチド組成物中のジペプチドおよびトリペプチドの含量
が極めて高いことを示すものである。

本発明の製造方法の酵素反応に用いられるジペプチジル
ペプチダーゼは、基質特異性により■型、■型、■型、
■型に分類されている（蛋白質・核酸・酵素、２７巻、
１４号、２０３７ページ〜、１９８２年）。

これらのジペプチジルペプチダーゼはいずれもアミノ末
端が遊離状熊のタンパク質あるいはオリゴペプチドに作
用して、Ｎ末端からジペプチド単位で分解する性質を持
っている。

従って、完全に酵素反応を進行させても、Ｊ　ｕ：Ｉｆ
アミノ酸まで分解する危険性が少なく、結果的にジペプ
チド、トリペプヂドの含量が高く、遊離アミノ酸の含量
が低い低分子ペプヂド組成物を製造することができる。

本発明の製造方法は従来の低分子ペプチト組成物の製造
方法に比べ、酵素反応の条件および進行状況に細心の注
意を払うこともなく、操作も簡単で、極めて容易な製造
方法であり、分子量１０００以上のペプチドおよび遊離
アミノ酸の含量が少なく、ジペプチドおよびトリペプチ
ドの含量が高い低分子ペプチト組成物を効率的に製造で
きる方法である。

また、本発明の製造方法で製造される低分子ペプチド組
成物は吸収効率の高いシペプチドおよびトリペプチドの
含量が高く、アミノ酸組成においてタンパク質原料とほ
とんど変化がみられないものであり、栄養輸液あるいは
栄養食品素材としてきわめて有用なものである。

発明の効果 本発明の低分子ペプチド組成物は、分子量１０００以上
のペプチド含量が０．７〜７％と極めて少なく、ＴＮＢ
Ｓ法による遊離アミノ基の定量値の逆数から求めた平均
分子量が約６００〜９００、およびこれを構成アミノ酸
の平均分子量で除して求めた平均ペプヂド残基数が６〜
８ペプチド鎖という極めて低分子のペプチドで構成され
るものである。

しかも、本発明の低分子ペプチド組成物は、ＴＮＢＳ法
による生成物の遊離アミノ基の定量値と生成物を塩酸で
完全に加水分解した後の遊離アミン基の定量値の比が２
．３〜３．７程度の、すなわち、ジペプチドおよびトリ
ペプチドが主構成成分である低分子ペプチド組成物であ
る。

さらに、本発明のペプチド組成物は、遊離アミノ酸が少
なく、しかもアミノ酸組成においてタンパク質原料とほ
とんど変わらず、酵素タンパク質等の分解物の混入がな
い純粋なタンパク質原料分解低分子ペプチド組成物であ
る。

本発明の製造方法は、このように極めてよく低分子化さ
れ、ジペプチドおよびトリペプチドを主構成成分とし、
しかも遊離アミノ酸含量の少ない低分子ペプチド組成物
をきわめて容易に、効率よく、常に一定の組成で得るこ
とができるものである。

実施例 本発明の内容を以下の参考例および実施例で更に詳細に
説明する。なお、本発明のペプチド組成物およびその製
造方法は各実施例に限定されるものではない。

参考例　１ 牛の肝ＰｉＡ　２　ｋｇに適量の精製氷を加えてホモジ
ナイズした後６Ｎ一硫酸でＰＨ３．５に調整した。３７
℃で２４時間撹拌した後遠心分離（８０００　Ｘ　ｇ、
２０分）にかけ、上清１．９ｌを得た。これに硫酸アン
モニウム８９７ｇを加え、４℃で一夜放置して塩析した
後遠心分離（９０００　Ｘ　ｇ、５０分）を行い、沈澱
物３４　ｇを得た。沈澱物を適量の精製氷に懸濁して０
．ＯＩＭリン酸緩衝液に透析し、透析液を遠心分離（１
００００×ｇ、６０分）にかけ、上清を得た。得られた
上清をＤＥＡＢセファデックスのＡ−５０カラムに吸着
させ、０１〜０３Ｍの塩化ナ｝　ＩＪウムを添加した０
．ＯＩＭリン酸緩衝液で溶出し、ジペプチジルペプチダ
ーゼ活性の高い両分を集め、ジペプチジルペプチダーゼ
リッチフラクションとした。得られたフラクションの酵
素活性は以下の通りであった。

ジペプチジル ペプチダーゼＩ活性　３７９．２　（ｎｍｏｌ／ｍｇ／
ｍｉｎ）ジペプチジル ペプチダーセ■活性　　１４．７　（ｎｍｏｌ／ｍｇ／
ｍｉｎ）ジペプチジル ペプチダーゼ■活性　　０．０　（ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍ
ｉｎ）ジペプチジル ペプチダーゼ■活性　　９．２　（ｎ’ｍｏｌ／ｍｇ／
ｍｉｎ）アミノペプチダーゼ活性　０．　１８　（ＩＩ
ｇ／ｍｇ／ｍｉｎ）エンドペプチダーゼ活性 ｐＨ７．０ ｐ＋＋３．５ ０．０（尾／ｍｇ／ｍｉｎ） ０．０（尾／ｍｇ／ｍｉｎ） 実施例　１ ４％カゼイン（ハンマーステン、メルク社製）溶液をＩ
Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整し、ズ
ブチリシン（ナガセ製）を加え、３７℃で６時間撹拌し
て酵素反応させた。１００℃で５分間加熱して酵素反応
を停止させた後、参考例１で得た牛肝臓抽出ジペプチジ
ルペプチダーゼリッチフラクションを加え、３７℃で６
時間撹拌して酵素反応をさせた。反応液を限外ろ過くア
ミコン、ＹＭ−２）にて酵素を除去し、凍結乾燥して低
分子ペプチド組成物Ｐ１を得た。

実施例　２ ４％カゼイン溶液（実施例１参照），をＩ］Ｈ８．Ｏに
調整してトリプシン（シグマ社製）を加え、３７℃で６
時間撹拌して酵素反応させた後、１００℃で５分間加熱
して酵素反応を停止させた。反応液を実施例１と同様に
してズブチリンンおよび牛肝臓抽出ンペブチシルペプチ
ターセリッチフラクションで加水分解を行い、低分子ペ
プチト組成物Ｐ２を得実施例　３ 実施例２と同様にして４％カゼイン溶液にトリブンンを
加えて酵素反応を行った後１００℃で５分間加熱して酵
素反応を停止させた。反応液にキモ１・リプンン（ンク
マ社製）を加え、３７℃で６時間撹拌して酵素反応させ
、１００℃で５分間加熱して酵素反応を停止させた後、
実施例１と同様にして牛肝臓抽出ジペプヂジルペプチダ
ーセリンチフラクンヨンで加水分解を行い、低分子ペプ
チド組成物Ｐ３を得た。

参考例　２ ＴＮＢＳ法による平均分子量および平均ペプチト残基数
の算出 Ｔ　Ｎ　Ｂ　Ｓ法により各低分子ペプチド組成物のミＩ
Ｊクラムタンパク質当たりの解離アミン基数を求め、Ａ
（μｍｏｌ／ｍｇ）とした。次いで、塩酸加水分解後の
アミノ酸分析により、リジン量（［７）を求め、得られ
たリジン量からＴＮＢＳによるε位のアミノ基の発色を
補正して、各ペプチド組成物の真の解離アミノ基数Ａ　
−　Ｌ　（　μｍｏｌ／ｍｇ）を求めた。

上記（Ａ−Ｌ）値がら、下式にょり各低分子ペプチト組
成物の平均分子量を求め、次いで構成アミノ酸の平均分
子量を１１０として平均ペプチト残基数を求めた。

結果は以下の通りであった。

ｌ５ Ｐ．　（実施例１）　　　８６０　　　　　　　　８Ｐ
２　（実施例２）　　　７３０　　　　　　　　７Ｐ３
　（実施例３：ｌ　　　６６０　　　　　　　　６ド組
成物の平均ペプチド鎖長とも言える。

各低分子ペプチド組成物の値は下記の通りであった。

参考例　３ 塩酸加水分解による平均ペプチド残基数の算出各低分子
ペプヂド組成物を６Ｎ一塩酸で真空下２２時間加水分解
した後、ＴＮＢＳ法で解離アミン基量を測定し、リジン
量からεアミン基を補正して全アミノ酸残基量Ａｔ　（
μｍｏｌ／ｍｇ）を求めた。参考例２で求めた真の解離
アミノ基量（Ａ−Ｌ）を各低分子ペプチド組成物の解離
アミノ基量Ｂ（μｍｏｌ／ｍｇ）とした。ここで、低分
子ペプチド組成物が完全にジペプチドのみの混合物であ
ればＢ　＝　％Ａｔとなる。

従って、Ｂの値が％Ａｔに近い程ジペプチドの比率が高
いことを示す。また、（Ａｔ＋Ｂ）は各ペプチ参考例 分析条件 カ　　　　ラ　　　　ム　： 溶　　　出　　　液 流　　　　　　速一 分析システム： バイオファインＧＦＣ　ＰＯ−４Ｋ （日本分光） ５０　ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐ＋＋　７．０）０．５
　ｍＱ／ｍｉｎ 液体クロマトグラフィーシス テム（島津製作所製、１、Ｃ−６八 ＳＰ［］−６Ａ，　Ｃ−Ｒ６Ａクロマトバック）検　　
　　　　出　：２２０ｎｍ 資料注入量＝１０Ｉ 上記条件により液体クロマトグラフィーを行い原料のカ
ゼインおよび各ペプチド組成物の分子量分布を測定した
。結果は下記の通りであった。

低分子ペプチド　　　　　分子量分布（％）カゼイン　
　　　　　　１００ Ｐ，　（実施例１）　　　　　　５　　　　　　９５Ｐ
２　（実施例２）　　　　　　７　　　　　　９３Ｐ３
（実施例３）　　　　　　０．７　　　　　９９．３参
考例　５ 低分子ペプチド組成物のアミノ酸分析 実施例１、２、３で得られたペプチド組成物ＰＰ２、Ｐ
３および原料のカゼインを６Ｎ塩酸で減圧下１１０℃、
２２時間の加水分解をした後、自動アミノ酸分析計（日
立８３５型）にてアミノ酸分析を行った。その結果、原
料であるカゼインと各低分子ペプチド組成物との間に、
大きな差はδ忍められす、これらの組成物を製造する過
程で＃素タンパク質の混入はないことが確認された。

各ペプチドの構成アミノ酸の組成比は図１に示す通りで
あった。

【図面の簡単な説明】

図１はカゼインおよび低分子ペプチド組成物のＰ１、Ｐ
２、Ｐ３の各構成アミノ酸の組成を示すグラフであり、
縦軸は組成比（％）、横軸は構成アミノ酸である。なお
、アミノ酸の略号中ＡＳＸはアスパラギンとアスパラギ
ン酸を、Ｇ１×はグルタミンとグルタミン酸をそれぞれ
合わせたものを意味する。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）動物性または植物性タンパク質原料を、必要に応
   じ、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシンなどの
   プロテアーゼで処理した後、ジペプチジルペプチダーゼ
   を用いて加水分解することによって得られる、分子量１
   ０００以上のペプチド含量が１０％以下である低分子ペ
   プチド組成物。
2. （２）タンパク質原料がカゼインである請求項第１項記
   載の低分子ペプチド組成物。
3. （３）カゼインをトリプシン次いでキモトリプシンで処
   理した後、ジペプチジルペプチダーゼを用いて加水分解
   することによって得られる請求項第１項記載の低分子ペ
   プチド組成物。
4. （４）動物性または植物性タンパク質原料を、必要に応
   じ、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシンなどの
   プロテアーゼで処理した後、ジペプチジルペプチダーゼ
   を用いて加水分解することを特徴とする、分子量１００
   ０以上のペプチドの含量が１０％以下である低分子ペプ
   チド組成物の製造方法。