DE4208923A1 - Antirheumatischer und antiphlogistischer wirkstoff, verfahren zu seiner herstellung, diesen wirkstoff enthaltende arzneimittel sowie deren verwendung - Google Patents
Antirheumatischer und antiphlogistischer wirkstoff, verfahren zu seiner herstellung, diesen wirkstoff enthaltende arzneimittel sowie deren verwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft antirheumatische und antiphlogistische
Wirkstoffe gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, Verfahren
zu ihrer Herstellung gemäß den Ansprüchen 5 und 7, anti
phlogistisch und antirheumatisch wirkende Zubereitungen gemäß
Anspruch 8 sowie die Verwendung dieser Wirkstoffe nach
Anspruch 9.
Unter dem Begriff "Rheumatismus" werden an Bewegungs- und
Stützorganen auftretende heterogene Krankheitsbilder teils
entzündlicher, teils degenerativer Art mit unterschiedlicher
Ätiologie und Pathogenese zusammengefaßt.
Rheumatische Erkrankungen sind eine heterogene, von den
Symptomen her zu deutende, jedoch problematische und
elastisch gehandhabte Krankheitsgruppe. Im Vordergrund der
Symptomatik stehen der Schmerz und die Funktionsbehinderung
am Bewegungsapparat, das sogenannte rheumatische Syndrom.
Die Therapie bei der Behandlung solcher Erkrankungen ist
dabei auf
- - Aufhebung bzw. Unterdrückung der Aktivität der rheumati schen Entzündung,
- - Beseitigung oder Minderung der Schmerzen und
- - Erhaltung und Besserung der Funktion des Bewegungsapparates gerichtet.
Trotz einiger Teilerfolge, insbesondere in der Therapie der
symptomatischen Erscheinungen, wie Schmerz oder Entzündung,
sind keine sowohl kausal wie auch symptomatisch wirkenden
Antirheumatika ohne erhebliche Nebenerscheinungen bekannt.
Die sogenannten nicht-steroidalen Antirheumatika, wie
Salicylate, Pyrazolone, Pyrazolidine, Indol-, Anthranilsäure-
oder Phenylalkansäure-Derivate, haben zahlreiche Gemeinsam
keiten in ihrem symptomatischen Wirkungsprofil, jedoch auch
bezüglich ihrer toxischen Nebenwirkungen. Länger dauernde
Verabreichung von Salicylaten führen zu Magen- und Darm
ulcerationen. Ebenfalls bekannt ist die allgemeine Unverträg
lichkeit bei langzeitiger Verabreichung von Voltaren®,
Ibuprofen® oder Indometacin®.
Auch die sogenannten steroidalen Antiphlogistika sind mit
einer Reihe von schwersten Nebenwirkungen, wie Myopathie,
Osteoporose, psychischen Störungen sowie erhöhter Infektions
anfälligkeit, belastet.
Ein weiterer Nachteil der "symptomatischen" Rheumatherapie
besteht darüber hinaus darin, daß die therapeutischen Effekte
eine ständige Arzneimittelgabe erfordern. Bei Unterbrechung
oder Beendigung der Medikation treten üblicherweise die
Krankheitssymptome wieder auf, die indirekt eine nicht
kausale Lösung der Krankheitsursachen beweisen.
Für die Verbesserung oder Wiederherstellung der Funktion des
Bewegungsapparates sind die wiederum symptomatisch wirkenden
Neuraltherapeutika bekannt. Wegen der in letzterer Zeit
gefundenen toxischen Metabolite erfordern die hier am meisten
angewandten Lokalanaesthetika, wie Xylin oder Procain, jedoch
eine erhebliche Zurückhaltung.
Der größte Teil der Arzneimittel, die heute zur Behandlung
der rheumatischen Krankheitsbilder eingesetzt werden, sind
die sogenannten symptomatischen Antirheumatika, die ent
zündungshemmend (antiphlogistisch) - in der Regel auch mit
Verminderung der Schmerzerscheinungen - wirken, ohne aber in
die wahrscheinlich autoimmune Pathogenese der rheumatoiden
Arthritis kausal eingreifen zu können.
Die heute als Basistherapeutika bekannten, vermutlich kausal
wirkenden Antirheumatika - Immunsuppressiva und Cytostatika -
weisen ein großes Risiko an Nebenwirkungen, wie Anämie,
Leukopenie, Thrombozytopenie, hohe Infektionsanfälligkeit
oder dergleichen, auf.
Wegen der wachsenden Bedenken gegen die Verwendung und die
zum Teil nicht vorhersehbaren Nebenwirkungen dieser Mittel
haben daher bei den von Rheumatismus befallenen Menschen und
auch bei den Herstellern dieser Mittel dazu geführt, nach
schonenden Mitteln zur Behandlung dieser Krankheiten zu
suchen.
Aus dem Artikel von D.A. Lewis, Antiinflammatory Drugs from
Plant and Marine Sources, Birkhäuser-Basel (1989), ist
bekannt, daß einige Substanzen pflanzlicher Herkunft
antiphlogistische Effekte aufweisen können. Der Wirkungs
mechanismus konnte jedoch nur in einigen Fällen aufgeklärt
werden und es wird vermutet, daß es zu einer Hemmung der
Prostaglandin-Synthese kommt.
Aus der DE-A-25 51 962 ist die Verwendung eines Extraktes aus
verschiedenen Spezies von Helleborus zur Behandlung
verschiedener Formen hartnäckiger Algien bekannt, bei dem ein
ethanolischer Totalextrakt eingesetzt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen anti
rheumatischen und antiphlogistischen Wirkstoff auf pflanz
licher und/oder bakterieller Basis bereitzustellen, bei dem
die vorstehend erwähnten Nebenwirkungen nicht auftreten,
sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Wirkstoffe.
Darüber hinaus liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine
immunmodulatorisch, antiphlogistisch und neuraltherapeutisch
wirkende pharmazeutische Zubereitung unter Verwendung dieses
Wirkstoffes sowie die Verwendung dieser Wirkstoffe als Mittel
zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale der
Ansprüche 1, 5, 7, 8 und 9 gelöst. Bevorzugte Weiterführungen
der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.
Erfindungsgemäß enthält der Wirkstoff auf pflanzlicher
und/oder bakterieller Basis im wesentlichen ein Gemisch
niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbindungen, die eine
schnelle und langdauernde therapeutische Wirksamkeit in 100-
bis 1000-facher geringerer Dosierung als die bisher bekannten
und verwendeten Arzneimittel und gleichzeitig gegenüber den
bekannten Antirheumatika, Antiphlogistika sowie Neuralthera
peutika keine schädlichen Nebenwirkungen aufweisen, womit im
Gegensatz zu den bisher bekannten Wirkstoffen eine kausale
und somit auch langzeitige Wirkung ausgeübt wird, die haupt
sächlich durch eine Wiederherstellung der normalen Immunmodu
lationsmechanismen erreicht wird.
Als für die Erfindung geeignete Pflanzen und Bakterien haben
sich diejenigen erwiesen, die L-Rhamnose-Verbindungen, wie
Di- und Oligosaccharide, Polysaccharide, Flavonglykoside,
Antocyane, Saponine und digitaloide Glykoside, enthalten. Als
L-Rhamnose-haltige Di- und Oligosaccharide enthaltende Pflan
zen sollen hier Pflanzen der Familie Rosaceae genannt werden,
die Neohesperidose, Sophorabiose, Scillabiose, Rutinose,
Robinobiose und Rhamninose enthalten. Geeignete
rhamnosehaltige Polysaccharide sind zum Beispiel in Pflanzen
der Gattung Echinacea und in Acacia sowie in Bakterien wie
Salmonella paratyphi und Citrobacter enthalten. L-Rhamnose
haltige Phenolglykoside, Flavonglykoside, Antocyanglykoside
sowie Steroidglykoside finden sich bei den Rosaceae, Com
positae, Labiatae, Rutaceae, Rhamnaceae, Violaceae, Liliaceae
sowie den Ranunculaceae. Gypsophila struthium, Chlorogalum
pomeridianum, Sarsaparilla radix sowie Dioscorea tokoro sind
z. B. Vertreter L-Rhamnose-haltiger Saponine.
Als für die Erfindung besonders geeignete Pflanzen oder
pflanzliche Zellkulturen haben sich Pflanzen, Pflanzenteile
oder pflanzliche Zellen von Ranunculaceae gezeigt, insbeson
dere von Helleborus spec. Im wesentlichen besteht das nieder
molekulare, aminosäurehaltige Gemisch aus Peptiden und/oder
Glykopeptiden, wobei der nicht-peptische Anteil aus Zucker
besteht und/oder laktonbildende Funktionsgruppen wie Uronsäu
ren enthalten kann. Gegen verdünnte Mineralsäuren wie 4%-ige
Schwefelsäure ist das erfindungsgemäße Gemisch relativ
stabil.
Als für die Erfindung besonders geeignete Wirkstoffe haben
sich Gemische niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbin
dungen gezeigt, die ein Molekulargewicht von ca. 200 bis
30 000 D, insbesondere 300 bis 15 000 D, haben. Vorzugsweise
beträgt das gelpermeationschromatographisch bestimmte Moleku
largewicht unter 10 000 D. Peptide als solche oder an ein
saccharidisches Gerüst gebundene Peptide oder Gemische der
beiden haben sich als für die kausale und symptomatische
Behandlung der Autoimmunkrankheiten und damit der Krankheits
bilder des rheumatischen Formenkreises als besonders geeignet
gezeigt. Diese vorstehend genannte Stoffgruppe weist als
wichtigste Aminosäurekomponenten relativ hohe Gehalte an
Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure und Asparagin
und/oder geringere Mengen an Leucin, Cystein, Tryptophan,
Glycin und γ-Aminobuttersäure sowie Derivate der
Glutaminsäure, wie Pyroglutaminsäure. In der Regel liegen die
Molverhältnisse von 2 bis 10 Einheiten Glx (Glu und/oder Gln)
pro Einheit an Asx (Asp und/oder Asn). Das erfindungsgemäße
Gemisch aus niedermolekularen, aminosäurehaltigen
Verbindungen enthält darüber Metalle, wobei neben einem
überwiegenden Gehalt an Kalium sowie geringeren Mengen an
Natrium, Magnesium und Calcium noch nachweisbare Gehalte an
Schwermetallionen, wie Zn, Mn, Cu und/oder Fe, vorliegen.
Diese Metallionen sind hauptsächlich an die freien Carboxy
gruppen der Peptidaminosäuren wie Glutamin und Asparaginsäure
gebunden, wobei für die Schwermetallionen auch eine
Chelatbindung an Peptidgruppen angenommen wird. Die Gehalte
dieser Metalle schwanken von 5 bis 5000 ppm, insbesondere von
100 bis 3000 ppm, wobei die Unterschiede zwischen den
einzelnen Metallen erheblich sein können und Kupfer in
relativ geringen Mengen vorliegt.
Die erfindungsgemäßen niedermolekularen aminosäurehaltigen
Verbindungen weisen darüberhinaus eine spezifische Affinität
gegenüber saccharidischen Verbindungen, insbesondere gegenü
ber Deoxysacchariden, bevorzugt gegenüber L-Rhamnose-haltigen
Verbindungen oder Rezeptoren, auf.
Erfindungsgemäß wird der Wirkstoff aus Pflanzen, pflanzlichen
Zellkulturen oder Bakterienkulturen, bevorzugt aus L-Rham
nose-haltigen Arten, isoliert, wobei die Isolierung in an
sich bekannter Weise erfolgt.
Aus verfahrenstechnischen Gründen - geringer apparativer Auf
wand - wird das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch vorzugs
weise aus getrocknetem Pflanzenmaterial isoliert. Dabei sind
die Gehalte der Wirkstoffe von der Blütezeit der Pflanzen
abhängig, wobei die maximalen Gehalte an Wirkstoff im wesent
lichen im Herbst in der Wurzel und im Frühjahr in den Blät
tern zu finden sind. Das Verhältnis des Wirkstoffgehaltes
zwischen Herbst und Frühjahr liegt dabei im Herbst deutlich
höher als im Frühjahr. Als besonders geeignete Pflanzen
materialien oder -teile haben sich die unterirdischen Teile
der entsprechenden Pflanzen gezeigt, nämlich Wurzeln, Wur
zelstöcke oder Rhizome. Neben getrocknetem Pflanzenmaterial
kann selbstverständlich auch frisches Pflanzenmaterial ver
wendet werden, wobei die Ausbeute an dem erfindungsgemäßen
Wirkstoffgemisch bei letzteren verringert ist, da im frischen
Pflanzenmaterial ziemlich viele Enzyme enthalten sind, die zu
einer unspezifischen Spaltung der niedermolekularen, amino
säurehaltigen Verbindungen führen und somit zu geringen Aus
beuten.
In einem ersten Schritt wird das getrocknete Pflanzenmaterial
mit organischen Lösungsmitteln vorbehandelt, wobei die Ver
wendung apolarer organischer Lösungsmittel zu einer Entfet
tung und der Einsatz eines niederen Alkohols zur Vorextrak
tion erfolgt. Als geeignete apolare organische Lösungsmittel
haben sich Hexan und Petrolether eines hohen Reinheitsgrades
gezeigt. Im Bezug auf die Trockensubstanz werden diese in
einem Verhältnis von 1:2 bis 1:15, vorzugsweise von 1:5 bis
1 : 10 im Verhältnis Droge zu Lösungsmittel eingesetzt. An
schließend wird das entfettete Pflanzenmaterial mit einem
Vorextraktionsmittel in Mengen von 1 : 3 bis 1 : 20, insbesondere
von 1 : 4 bin 1 : 8 versetzt. Das erfindungsgemäße Vorextrak
tionsmittel ist in der Regel Diethylether, Ethylacetat,
Chloroform oder Methanol oder ein Gemisch der vorstehenden
Lösungsmittel, wobei der mengenmäßige Einsatz relativ
unabhängig ist, Hauptsache ihre Menge ist ausreichend für den
beabsichtigten Zweck. In der Regel als ausreichend haben sich
die 5- bis 10fache Menge Vorextraktionsmittel, bezogen auf
die Menge des entfetteten Pflanzenmaterials, erwiesen, wobei
eine Mischung aus Methanol und Diethylether in einem Volumen
verhältnis von 3 : 1 bevorzugt wird.
Die aus dem Entfettungs- und Vorextraktionsschritt erhaltene
Droge wird anschließend mit einem wäßrigen Extraktionsmittel
extrahiert. In der Regel handelt es sich dabei um eine
schwach basische Pufferlösung auf Basis von Natriumacetat
oder Elektrophoresepuffer wie Tris/Glycin oder Tris/HCl eines
pH-Wertes von 8 bis 9 oder neutrales oder schwach mit
Ammoniak alkalinisiertes Wasser einer Normalität von 0,001
bis 0,2 n. Gegebenenfalls kann das alkalinisierte Wasser noch
0,1 bis 96% (V/V) eines Alkohols, vorzugsweise Ethanol oder
n-Propanol eines hohen Reinheitsgrades enthalten. Das Ver
hältnis vorbehandeltes Pflanzenmaterial (Droge) des ersten
Schrittes zu schwach basischer Pufferlösung oder alka
linisiertem Wasser beträgt von 1 : 2 bis 1 : 40, vorzugsweise von
1 : 5 bis 1 : 20. Eine Extraktion mit neutralen oder mit 4 Gew.-%
H2SO4, 0,1 bis 1 N HCl, H3PO4 oder HClO4 schwach angesäuertem
Wasser, das gegebenenfalls noch 0,1 bis 30% (V/V) der
vorstehend genannten Alkohole enthalten kann, ist erfin
dungsgemäß ebenfalls vorgesehen, wobei das Verhältnis Droge
zu Extraktionsmittel im wesentlichen der mit schwach basi
schem oder alkanisiertem Wasser durchgeführten Extraktion
entspricht.
Eventuell im Rohextrakt vorliegende toxische Inhaltsstoffe,
wie Bufadienolidglykoside, Hellebrin, Desglucohellebrin
und/oder unwirksame Komponenten wie hochmolekulare Polysac
charide, z. B. Stärke, des Extraktes werden durch Dialyse,
Elektrodialyse, kurzzeitige kontrollierte Säurebehandlung bei
leicht erhöhter Temperatur oder durch Liquid-Solid-Adsorption
entfernt. Zur Säurebehandlung wird dabei der Rohextrakt in
der Regel mit 0,5 N H2SO4 über 0,5 bis 20 Minuten,
vorzugsweise 2 bis 5 Minuten, bei 60 bis 100°C, bevorzugt um
80°C, behandelt, wobei die vorstehend genannten, die Wirksam
keit der erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehal
tigen Verbindungen beeinflussende Verbindungen entfernt wer
den. Anschließend wird der so behandelte Rohextrakt mittels
Neutralisationsmitteln, wie KOH, CaCO3, NaOH, NH3, auf einen
pH-Wert um pH 6 neutralisiert und eingeengt. Die Einengung
der neutralisierten Lösung erfolgt dabei durch Eindampfen,
Lyophilisieren oder ähnliche schonende Verfahrensweisen.
Der so erhaltene konzentrierte bzw. getrocknete Rohextrakt
wird anschließend einer Vorbehandlung mit anorganischen oder
organischen Verbindungen unterworfen, wobei ein Niederschlag
entsteht, der die erfindungsgemäßen niedermolekularen, amino
säurehaltigen Verbindungen enthält. Als anorganisches Behand
lungsmittel hat sich dabei Ammoniumsulfat in wäßriger Lösung
und als organisches Behandlungsmittel ein organisches Lö
sungsmittel, vorzugsweise Aceton oder Ethanol, gezeigt, wobei
bei Verwendung des organischen Lösungsmittels ein Verhältnis
konzentrierter Rohextrakt zu Lösungsmittel von 1 : 1 bis 1 : 10,
vorzugsweise 1 : 2 bis 1 : 8, geeignet ist.
Der durch Ammoniumsulfatprezipitation oder Acetonprezipi
tation erhaltene Niederschlag wird anschließend, in der Regel
durch Zentrifugation, abgetrennt, erneut gelöst und mittels
gängiger physikalischer Trennverfahren fraktioniert. Für das
erfindungsgemäße Verfahren haben sich selektive Membrandia
lyse oder Gelfiltration als erfolgversprechend erwiesen,
wobei der durch Zentrifugation abgetrennte Niederschlag vor
der Auftrennung in Wasser gelöst wird. Bei der Auftrennung
des in Wasser gelösten Niederschlags durch Gelfiltration
haben sich Sephadex® G 10- oder G 25-Fraktionierungen als
sehr geeignet erwiesen, wobei der Vorlauf, der die hochmo
lekulare Fraktion enthält, verworfen und die niedermoleku
laren Fraktionen gesammelt werden. Als Puffersysteme finden
wäßrige Puffersysteme eines neutralen bis schwach sauren pH-
Wertes Verwendung, wie Natriumacetatpuffer oder Tris/HCl-Puf
fer. Die bevorzugte Verwendung eines neutralen bis schwach
sauren Puffersystems liegt dabei in der relativen Stabilität
der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindung gegen
Wasserstoffionen.
Die abgetrennten niedermolekularen Fraktionen werden an
schließend durch Hyperfiltration unter Verwendung einer
Membran unter Druck, durch HPLC, durch Ionenaustausch
chromatographie mit NaCl-Gradienten und/oder Affinitäts
chromatographie mit L-Rhamnose-haltigen Festphasen weiter
fraktioniert. Geeignete Filtrations- und/oder Affinitäts
medien sind Sephadex® G 10, Sephadex® G 25 oder epoxid
aktiviertes oder ethylenoxidaktiviertes Sephadex® bzw.
Sepharose®.
Die erhaltenen gereinigten Fraktionen wurden anschließend
lyophilisiert, wobei weiße bis hellbraune Pulver erhalten
werden, die gut löslich in Wasser und schwer löslich in orga
nischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Hexan oder Chloroform,
sind.
Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, die Wirkstoffe oder das
Wirkstoffgemisch auf peptidsynthetischem Weg herzustellen,
wobei die Umsetzung bzw. Herstellung in an sich bekannter
Weise mit Aminosäuren und/oder aminosäurehaltigen Ausgangs
stoffen erfolgt.
Die auf die erfindungsgemäße Verfahrensweise erhaltenen
erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Ver
bindungen zeigen in sehr geringen Dosen eine bemerkenswerte
antiphlogistische und antirheumatische Wirkung. Zusätzlich
zeigen sie eine starke Inhibition des alternativen Komple
mentweges und können sich an den MHC- oder Fc-Rezeptoren der
Lymphozyten binden und dadurch eine spezifische, immunmo
dulierende Wirkung ausüben. Auch eine Normalisierung der
erhöhten spontanen (SMCC) oder antikörperabhängigen zellu
lären Cytotoxizität (ADCC) der rheumatischen oder an erhöhter
Autoagressivität leidenden Patienten wird durch eine Wieder
herstellung der normalen Suppressoraktivität erreicht. Über
dies zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen durch ihre
peptidischen Struktureinheiten spezifische Interaktionen mit
den Immunzellrezeptoren, bevorzugt den MHC- und/oder Fc-Re
zeptoren, wobei die Wechselwirkung von gewissen Deoxysaccha
riden, wie L-Rhamnose, beeinträchtigt wird.
Die erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehaltigen
Verbindungen können entweder getrennt als Reinsubstanz oder
als Substanzgemisch oder in Form von pharmazeutischen Zube
reitungen verabreicht werden, wobei Letztgenannte außer den
erfindungsgemäßen Verbindungen noch einen und/oder mehrere
pharmazeutisch unbedenkliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe
enthalten können. Als diese Stoffe seien hier 0,9%-ige phy
siologische Kochsalzlösung, 1 bis 5%-ige Glucoselösung, Man
nit, Lactose, Kartoffelstärke, Carboxymethylcellulose Na
trium, Talcum, Magnesiumstearat, Glycerin, Lanolin, Stearin,
Natriumlaurylsulfat und Nipagin® genannt. Gegebenenfalls
können den so hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen
auch noch weitere therapeutische Wirkstoffe oder Adjuvanzien
zugesetzt werden.
Diese Formulierungen schließen alle diejenigen Formulierungen
ein, die für eine parenterale, einschließlich intramuskulä
rer, intravenöser, subkutaner, peri- oder intraartikularer
Injektionen, eine perorale, wie Tabletten, Kapseln oder
Tropfen, oder für eine äußere Anwendung, wie Salben, Cremes,
Gele oder Suppositorien, geeignet sind. Auch homöopathische
Arzneimittelzubereitungen mit den erfindungsgemäßen Verbin
dungen sind möglich.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher
erläutert.
10 Teile getrocknete und pulverisierte Wurzel und Wurzelstock
von Helleborus purpurascens (Familie Ranunculaceae) werden
mit 100 Teilen Petrolether p.A. entfettet und anschließend
mit 80 Teilen Ethylacetat vorextrahiert. Nach Entfernen des
Extraktionsmittels wird der erhaltene Rückstand mit 100 Tei
len 30% (V/V) Ethanol enthaltender 0,05 n Ammoniaklösung
während 24 Stunden mazeriert. Dieser Rohextrakt wird dann bis
etwa 1/8 seines Volumens eingeengt und mit der fünffachen
Menge Aceton p.A. versetzt, die Mischung über Nacht bei 0 bis
6°C gehalten und anschließend zentrifugiert. Der nach Zentri
fugation erhaltene Niederschlag wird dann unter Verwendung
einer Cellulosemembran gegen destilliertes Wasser während 72
Stunden dialysiert. Das Exdialysat wird erneut eingeengt und
mit Aceton p.A. behandelt. Die nach einmaliger oder wieder
holten Fällungen erhaltenen niedermolekularen, aminosäurehal
tigen Verbindungen werden in schwach basischer, 0,01 n Ammo
niak enthaltender Lösung aufgenommen und einer Ionenaus
tauschchromatographie an einer NaCl-aktivierten DEAE-Cellu
lose mit einem HCOOH-Gradienten von 0,05 bis 0,1 M unter
worfen.
Die gelchromatographisch mit Sephadex® G 10 bestimmten Mole
kulargewichte der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Ver
bindungen liegen in einem Bereich von 300 bis 5000 Dalton,
wobei das Vorliegen oligomerer Homologverbindungen berück
sichtigt wurde.
Die Identitätsbestimmung der niedermolekularen, aminosäure
haltigen Verbindungen wurde mit Hilfe der Dünnschichtchroma
tographie unter Verwendung von Kieselgel GF-254 Fertigplatten
mit n-Propanol/Ethylacetat/Wasser im Verhältnis 60:10:30 als
Laufmittel und Detektion mit Ninhydrin bzw. mit dem Chlor
tolidin-Reagenz nach Pataki durchgeführt.
Fehlende oder schwächere Farbreaktion mit Ninhydrin, aber
rot-violett-farbige Flecken mit dem Chlor-o-Tolidin-Reagenz
weisen auf das Vorhandensein von erfindungsgemäßen Verbindun
gen hin.
Die Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber
Säurehydrolyse wurde mit 4 Gew.-%-iger Schwefelsäure be
stimmt, wobei nach 20-minütigem Kochen in 4 Gew.-%-iger
Schwefelsäure noch über 80% der erfindungsgemäßen Verbin
dungen unverändert vorliegen.
Die Aminosäurencharakterisierung wurde durch Hydrolyse mit
6 N HCl während 20 Stunden bei 105°C durchgeführt, wobei
erhebliche Mengen an Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glycin
und γ-Aminobuttersäure identifiziert werden konnten. Das
Verhältnis dieser Aminosäuren zueinander lag bei 10:2:1:1.
Die gemäß Beispiel 1 erhaltenen niedermolekularen, amino
säurehaltigen. Verbindungen wurden auf ihre immunmodula
torische Wirkung gemäß dem Antibody Dependent Cellular
Cytotoxity-Test (ADCC-Test) der Killer-Zellen von gesunden
bzw. rheumatischen Patienten getestet, wobei ein Verhältnis
Killer-Zellen zu Effektor/Zielzellen von 10:1 eingehalten
wurde.
Die Ergebnisse dieses Tests sind der nachfolgenden Abbildung
zu entnehmen:
Wie der vorstehenden Abbildung 1 zu entnehmen ist, führt die
Zugabe von 0,1 bis 1,5 µg der erfindungsgemäßen Verbindungen
pro kg zu einer deutlichen Hemmung der erhöhten Autoaggre
sivität der K-Zellen bei rheumatischen Patienten.
Die antiphlogistische Wirkung der gemäß Beispiel 1 herge
stellten erfindungsgemäßen Verbindungen wurde mit dem
dextraninduzierten Rattenpfotenödem-Test ermittelt. Die
Ergebnisse dieses Tests sind der nachfolgenden Tabelle 1 zu
entnehmen:
Die Ergebnisse der Tabelle 1 verdeutlichen, daß bei Einsatz
erfindungsgemäßer Verbindungen (HP) eine mit Voltaren®
ähnliche antiphlogistische Wirkung erzielt wird, wobei diese
Wirkung jedoch bei einer um den Faktor 2000 kleineren
Wirkstoffdosis erreicht wird.
Die gemäß Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Verbin
dungen wurden auf ihre antikomplementäre Wirkung an Human-
und Meerschweinchen-Komplement auf dem klassischen und auf
dem alternativen Weg untersucht (M. Smith et al., Int.
Immunity, 38, 1279 (1982)).
Die Ergebnisse auf dem klassischen Weg zeigen, daß eine
Hemmung nur bei 10 bis 40 µg/ml an erfindungsgemäßen Verbin
dungen eintrat. Bei dem alternativen Weg der Komplement
kaskade dagegen wurde eine sehr starke und dosisabhängige
Hemmung der erfindungsgemäßen Verbindungen gefunden.
Die Ergebnisse auf dem alternativen Komplementweg sind der
nachfolgenden Tabelle 2 zu entnehmen:
Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, zeigen die erfindungs
gemäßen Verbindungen eine sehr starke antikomplementäre
Wirkung auf dem Alternativweg und führen zu einer ent
sprechend effizienten Hemmung der inflammatorischen Prozesse.
25 Teile getrocknetes und pulverisiertes Kraut von Adonis
vernalis (Familie Ranunculaceae) werden mit 150 Teilen
Petrolether p.A. entfettet und anschließend mit 200 Teilen
0,05 n Ammoniak enthaltendes Wasser während 36 Stunden
mazeriert. 100 Teile dieses filtrierten Rohauszuges werden
eingeengt und anschließend mit der fünffachen Menge an
Ethanol p.a. versetzt, das Gemisch während 2 Tagen bei 3 bis
6°C gehalten und anschließend der entstandene Niederschlag
abzentrifugiert. Der nach Zentrifugation erhaltene
Niederschlag wird in einer ausreichenden Menge Wasser gelöst,
filtriert und die vorstehende Ethanolfällung zweimal
wiederholt. Die aus der wiederholten Fällung abgetrennten
Niederschläge werden in einer geringen Menge Natrium
acetatpuffer gelöst und durch Ultrafiltration über Folien
membranen (Firma Amicon, Lexington) die niedermolekularen
Verbindungen von den hochmolekularen (MG 20 000 Dalton)
abgetrennt.
Durch Gelfiltration mit Sephadex® G 10 konnte das Mole
kulargewicht der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Ver
bindungen mit 1500 bis 8000 Dalton bestimmt werden.
Die Charakterisierung sowie die immunmodulatorische, anti
phlogistische sowie antikomplementäre Wirkung der gemäß
Beispiel 6 isolierten erfindungsgemäßen niedermolekularen,
aminosäurehaltigen Verbindungen war vergleichbar mit der Wir
kung der erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Beispiel 1.
25 Teile getrocknete und pulverisierte Wurzel und Wurzelstock
von Helleborus orientalis (Familie Ranunculaceae) werden mit
150 Teilen Petrolether p.A. entfettet und anschließend mit
100 Teilen Aceton/Diethylether in einem Vol-Verhältnis von
1:1 vorextrahiert. Nach Entfernung des Extraktionsmittels
wird der Rückstand mit 150 Teilen 15% (V/V) Ethanol ent
haltendes Wasser während 24 Stunden mazeriert und der Extrak
tionsschritt einmal wiederholt. Der erhaltene Rohextrakt wird
auf eine mit 0,01 M Natriumacetat-Puffer equilibrierte Affi
nitätschromatographie-Säule aufgebracht. Als feste Phase kam
mit Rutin behandelte epoxyaktivierte Sepharose® 6B zur
Anwendung. Nicht absorbierte Verbindungen werden mit Start
puffer eluiert, die niedermolekularen, aminosäurehaltigen
Verbindungen mit 0,25 M Essigsäurelösung desorbiert und die
desorbierten Verbindungen mit gesättigter Ammoniumsulfat
lösung (60%) gefällt. Die nach einmaliger oder mehrmaliger
Fällung mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung abgetrennten
Verbindungen werden vereinigt und nach Lösung in der erfor
derlichen Menge des gleichen Puffers die hochmolekularen Be
standteile von den niedermolekularen Verbindungen durch
Folienmembranen (Ausschlußgrenze 20 000 Dalton) abgetrennt.
Die Molekulargewichte der niedermolekularen, aminosäurehal
tigen Verbindungen wurden mit 300 bis 8000 Dalton mit Hilfe
der Gelpermeationschromatographie auf Sephadex® G 10 be
stimmt.
Die Eigenschaften der erhaltenen niedermolekularen,
aminosäurehaltigen Verbindungen waren vergleichbar mit den
Eigenschaften der gemäß Beispiel 1 und 6 erhaltenen Ver
bindungen.
Claims (9)
1. Antirheumatischer und antiphlogistischer Wirkstoff auf
pflanzlicher und/oder bakterieller Basis,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Wirkstoff im wesentlichen ein Gemisch niedermolekularer,
aminosäurehaltiger Verbindungen ist.
2. Wirkstoff nach Anspruch l,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Gemisch ein Molekulargewicht von 200 bis 30 000, einen
relativ hohen Gehalt an Glutamin, Glutaminsäure, Asparagin
und Asparaginsäure sowie geringere Gehalte an Leucin,
Cystein, Tryptophan, Glycin und Derivaten der Glutaminsäure
aufweist.
3. Wirkstoff nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Gemisch eine spezifische Affinität gegenüber Saccharid
verbindungen aufweist.
4. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Gemisch carboxylgruppengebundene Metalle aufweist.
5. Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffes nach einem der
Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Wirkstoff aus Pflanzen, pflanzlichen Zellkulturen oder
Bakterienkulturen erhalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
- a) getrocknetes Pflanzenmaterial mit organischen Lösungs mitteln vorbehandelt,
- b) das vorbehandelte Pflanzenmaterial mit einem wäßrigen Extraktionsmittel extrahiert,
- c) hochmolekulare und toxische Bestandteile unter Erhalt niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbindungen abge trennt und
- d) die erhaltenen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen gereinigt werden.
7. Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffes nach einem der
Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Wirkstoff durch Peptidsynthese aus Aminosäuren und/oder
aminosäurehaltigen Ausgangsstoffen in an sich bekannter Weise
hergestellt wird.
8. Antiphlogistisch und antirheumatisch wirkende Zuberei
tung, enthaltend einen Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1
bis 4 und pharmazeutisch unbedenkliche Hilfs- und/oder Trä
gerstoffe.
9. Verwendung eines Wirkstoffes nach einem der Ansprüche 1
bis 4 als Mittel zur Behandlung von Phlogosis, Rheumatismus
und Autoimmunkrankheiten.
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---|---|---|---|
DE19924208923 DE4208923C2 (de) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | Antirheumatischer und antiphlogistischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dessen Verwendung |
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DE4208923A1 true DE4208923A1 (de) | 1993-09-23 |
DE4208923C2 DE4208923C2 (de) | 1994-10-20 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004058813A3 (de) * | 2002-12-21 | 2004-10-28 | Franz Kerek | Peptide mit hohem cysteingehalt |
Citations (3)
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FR2592884A1 (fr) * | 1986-01-10 | 1987-07-17 | Spie Batignolles | Extrait de jacinthe d'eau renfermant des peptides, son procede de preparation et ses utilisations |
JPH02234642A (ja) * | 1989-03-09 | 1990-09-17 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | 低分子ペプチド組成物およびその製造方法 |
JPH0429998A (ja) * | 1990-05-28 | 1992-01-31 | Tsumura & Co | 新規な生理活性物質 |
-
1992
- 1992-03-19 DE DE19924208923 patent/DE4208923C2/de not_active Expired - Fee Related
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WO2004058813A3 (de) * | 2002-12-21 | 2004-10-28 | Franz Kerek | Peptide mit hohem cysteingehalt |
US7750114B2 (en) | 2002-12-21 | 2010-07-06 | Franz Kerek | Peptides having a high cysteine content |
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Publication number | Publication date |
---|---|
DE4208923C2 (de) | 1994-10-20 |
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