DE4208923C2 - Antirheumatischer und antiphlogistischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dessen Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft antirheumatische und antiphlogistische Wirkstoffe gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, ein Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß dem Anspruch 5 sowie die Verwendung dieser Wirkstoffe nach Anspruch 7.

Unter dem Begriff "Rheumatismus" werden an Bewegungs- und Stützorganen auftretende heterogene Krankheitsbilder teils entzündlicher, teils degenerativer Art mit unterschiedlicher Ätiologie und Pathogenese zusammengefaßt.

Rheumatische Erkrankungen sind eine heterogene, von den Symptomen her zu deutende, jedoch problematische und elastisch gehandhabte Krankheitsgruppe. Im Vordergrund der Symptomatik stehen der Schmerz und die Funktionsbehinderung am Bewegungsapparat, das sogenannte rheumatische Syndrom.

Die Therapie bei der Behandlung solcher Erkrankungen ist dabei auf

• - Aufhebung bzw. Unterdrückung der Aktivität der rheumati­ schen Entzündung,
• - Beseitigung oder Minderung der Schmerzen und
• - Erhaltung und Besserung der Funktion des Bewegungsapparates gerichtet.

Trotz einiger Teilerfolge, insbesondere in der Therapie der symptomatischen Erscheinungen, wie Schmerz oder Entzündung, sind keine sowohl kausal wie auch symptomatisch wirkenden Antirheumatika ohne erhebliche Nebenerscheinungen bekannt.

Die sogenannten nicht-steroidalen Antirheumatika, wie Salicylate, Pyrazolone, Pyrazolidine, Indol-, Anthranilsäure- oder Phenylalkansäure-Derivate, haben zahlreiche Gemeinsam­ keiten in ihrem symptomatischen Wirkungsprofil, jedoch auch bezüglich ihrer toxischen Nebenwirkungen. Länger dauernde Verabreichung von Salicylaten führen zu Magen- und Darm­ ulcerationen. Ebenfalls bekannt ist die allgemeine Unverträg­ lichkeit bei langzeitiger Verabreichung von Voltaren®, Ibuprofen® oder Indometacin®.

Auch die sogenannten steroidalen Antiphlogistika sind mit einer Reihe von schwersten Nebenwirkungen, wie Myopathie, Osteoporose, psychischen Störungen sowie erhöhter Infektions­ anfälligkeit, belastet.

Ein weiterer Nachteil der "symptomatischen" Rheumatherapie besteht darüber hinaus darin, daß die therapeutischen Effekte eine ständige Arzneimittelgabe erfordern. Bei Unterbrechung oder Beendigung der Medikation treten üblicherweise die Krankheitssymptome wieder auf, die indirekt eine nicht­ kausale Lösung der Krankheitsursachen beweisen.

Für die Verbesserung oder Wiederherstellung der Funktion des Bewegungsapparates sind die wiederum symptomatisch wirkenden Neuraltherapeutika bekannt. Wegen der in letzterer Zeit gefundenen toxischen Metabolite erfordern die hier am meisten angewandten Lokalanaesthetika, wie Xylin oder Procain, jedoch eine erhebliche Zurückhaltung.

Der größte Teil der Arzneimittel, die heute zur Behandlung der rheumatischen Krankheitsbilder eingesetzt werden, sind die sogenannten symptomatischen Antirheumatika, die ent­ zündungshemmend (antiphlogistisch) - in der Regel auch mit Verminderung der Schmerzerscheinungen - wirken, ohne aber in die wahrscheinlich autoimmune Pathogenese der rheumatoiden Arthritis kausal eingreifen zu können.

Die heute als Basistherapeutika bekannten, vermutlich kausal wirkenden Antirheumatika - Immunsuppressiva und Cytostatika - weisen ein großes Risiko an Nebenwirkungen, wie Anämie, Leukopenie, Thrombozytopenie, hohe Infektionsanfälligkeit oder dergleichen, auf.

Wegen der wachsenden Bedenken gegen die Verwendung und die zum Teil nicht vorhersehbaren Nebenwirkungen dieser Mittel haben daher bei den von Rheumatismus befallenen Menschen und auch bei den Herstellern dieser Mittel dazu geführt, nach schonenden Mitteln zur Behandlung dieser Krankheiten zu suchen.

Aus dem Artikel von D.A. Lewis, Antiinflammatory Drugs from Plant and Marine Sources, Birkhäuser-Basel (1989), ist bekannt, daß einige Substanzen pflanzlicher Herkunft antiphlogistische Effekte aufweisen können. Der Wirkungs­ mechanismus konnte jedoch nur in einigen Fällen aufgeklärt werden und es wird vermutet, daß es zu einer Hemmung der Prostaglandin-Synthese kommt.

Aus der DE-A-25 51 962 ist die Verwendung eines Extraktes aus verschiedenen Spezies von Helleborus zur Behandlung verschiedener Formen hartnäckiger Algien bekannt, bei dem ein ethanolischer Totalextrakt eingesetzt wird.

Die FR-A-2 592 884 beschreibt einen wäßrigen Hyazinthenextrakt, aus dem Peptide gewonnen werden können und der Verwendung bei der Vermehrung pflanzlicher Zellen und/oder der Keimung von Samen findet.

Die JP-A-2234-642 beschreibt eine niedermolekulare Peptidzusammensetzung, die durch Behandlung tierischer oder pflanzlicher Materialien mit Proteasen wie Trypsin, Subtilisin oder dergleichen erhalten wird. Die Peptidzusammensetzung besteht im wesentlichen aus Dipeptiden und Tripeptiden, d. h. aus aus zwei oder drei Aminosäuren zusammengesetzten Peptiden, deren Molekulargewicht in der Regel unter 300 liegt.

Die JP-A-4029-998 beschreibt ein aus den Wurzeln von Trichosanthes Kirilowii extrahiertes Antitumor-Peptid, welches ein Molekulargewicht von ca. 28 000 aufweist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen anti­ rheumatischen und antiphlogistischen Wirkstoff auf pflanz­ licher und/oder bakterieller Basis bereitzustellen, bei dem die vorstehend erwähnten Nebenwirkungen nicht auftreten, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Wirkstoffe. Darüber hinaus liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Verwendung dieser Wirkstoffe als Mittel zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 1, 5 und 7 gelöst. Bevorzugte Weiterführungen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

Erfindungsgemäß enthält der Wirkstoff auf pflanzlicher und/oder bakterieller Basis im wesentlichen ein Gemisch niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbindungen, die eine schnelle und langdauernde therapeutische Wirksamkeit in 100- bis 1000-facher geringerer Dosierung als die bisher bekannten und verwendeten Arzneimittel und gleichzeitig gegenüber den bekannten Antirheumatika, Antiphlogistika sowie Neuralthera­ peutika keine schädlichen Nebenwirkungen aufweisen, womit im Gegensatz zu den bisher bekannten Wirkstoffen eine kausale und somit auch langzeitige Wirkung ausgeübt wird, die haupt­ sächlich durch eine Wiederherstellung der normalen Immunmodu­ lationsmechanismen erreicht wird.

Als für die Erfindung geeignete Pflanzen und Bakterien haben sich diejenigen erwiesen, die L-Rhamnose-Verbindungen, wie Di- und Oligosaccharide, Polysaccharide, Flavonglykoside, Antocyane, Saponine und digitaloide Glykoside, enthalten. Als L-Rhamnose-haltige Di- und Oligosaccharide enthaltende Pflan­ zen sollen hier Pflanzen der Familie Rosaceae genannt werden, die Neohesperidose, Sophorabiose, Scillabiose, Rutinose, Robinobiose und Rhamninose enthalten. Geeignete rhamnosehaltige Polysaccharide sind zum Beispiel in Pflanzen der Gattung Echinacea und in Acacia sowie in Bakterien wie Salmonella paratyphi und Citrobacter enthalten. L-Rhamnose­ haltige Phenolglykoside, Flavonglykoside, Antocyanglykoside sowie Steroidglykoside finden sich bei den Rosaceae, Com­ positae, Labiatae, Rutaceae, Rhamnaceae, Violaceae, Liliaceae sowie den Ranunculaceae. Gypsophila struthium, Chlorogalum pomeridianum, Sarsaparilla radix sowie Dioscorea tokoro sind z. B. Vertreter L-Rhamnose-haltiger Saponine.

Als für die Erfindung besonders geeignete Pflanzen oder pflanzliche Zellkulturen haben sich Pflanzen, Pflanzenteile oder pflanzliche Zellen von Ranunculaceae gezeigt, insbeson­ dere von Helleborus spec. Im wesentlichen besteht das nieder­ molekulare, aminosäurehaltige Gemisch aus Peptiden und/oder Glykopeptiden, wobei der nicht-peptische Anteil aus Zucker besteht und/oder laktonbildende Funktionsgruppen wie Uronsäu­ ren enthalten kann. Gegen verdünnte Mineralsäuren wie 4%-ige Schwefelsäure ist das erfindungsgemäße Gemisch relativ stabil.

Als für die Erfindung geeignete Wirkstoffe haben sich Gemische niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbin­ dungen gezeigt, die ein Molekulargewicht von ca. 300 bis 15 000 D, haben. Vorzugsweise beträgt das gelpermeationschromatographisch bestimmte Moleku­ largewicht unter 10 000 D. Peptide als solche oder an ein saccharidisches Gerüst gebundene Peptide oder Gemische der beiden haben sich als für die kausale und symptomatische Behandlung der Autoimmunkrankheiten und damit der Krankheits­ bilder des rheumatischen Formenkreises als besonders geeignet gezeigt. Diese vorstehend genannte Stoffgruppe weist als wichtigste Aminosäurekomponenten relativ hohe Gehalte an Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure und Asparagin und/oder geringere Mengen an Leucin, Cystein, Tryptophan, Glycin und γ-Aminobuttersäure sowie Derivate der Glutaminsäure, wie Pyroglutaminsäure. In der Regel liegen die Molverhältnisse von 2 bis 10 Einheiten Glx (Glu und/oder Gln) pro Einheit an Asx (Asp und/oder Asn). Das erfindungsgemäße Gemisch aus niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen enthält darüber Metalle, wobei neben einem überwiegenden Gehalt an Kalium sowie geringeren Mengen an Natrium, Magnesium und Calcium noch nachweisbare Gehalte an Schwermetallionen, wie Zn, Mn, Cu und/oder Fe, vorliegen. Diese Metallionen sind hauptsächlich an die freien Carboxy­ gruppen der Peptidaminosäuren wie Glutamin und Asparaginsäure gebunden, wobei für die Schwermetallionen auch eine Chelatbindung an Peptidgruppen angenommen wird. Die Gehalte dieser Metalle schwanken von 5 bis 5000 ppm, insbesondere von 100 bis 3000 ppm, wobei die Unterschiede zwischen den einzelnen Metallen erheblich sein können und Kupfer in relativ geringen Mengen vorliegt.

Die erfindungsgemäßen niedermolekularen aminosäurehaltigen Verbindungen weisen darüberhinaus eine spezifische Affinität gegenüber saccharidischen Verbindungen, insbesondere gegenü­ ber Deoxysacchariden, bevorzugt gegenüber L-Rhamnose-haltigen Verbindungen oder Rezeptoren, auf.

Erfindungsgemäß wird der Wirkstoff aus Pflanzen, pflanzlichen Zellkulturen oder Bakterienkulturen, bevorzugt aus L-Rham­ nose-haltigen Arten, isoliert, wobei die Isolierung in an sich bekannter Weise erfolgt.

Aus verfahrenstechnischen Gründen - geringer apparativer Auf­ wand - wird das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch vorzugs­ weise aus getrocknetem Pflanzenmaterial isoliert. Dabei sind die Gehalte der Wirkstoffe von der Blütezeit der Pflanzen abhängig, wobei die maximalen Gehalte an Wirkstoff im wesent­ lichen im Herbst in der Wurzel und im Frühjahr in den Blät­ tern zu finden sind. Das Verhältnis des Wirkstoffgehaltes zwischen Herbst und Frühjahr liegt dabei im Herbst deutlich höher als im Frühjahr. Als besonders geeignete Pflanzen­ materialien oder -teile haben sich die unterirdischen Teile der entsprechenden Pflanzen gezeigt, nämlich Wurzeln, Wur­ zelstöcke oder Rhizome. Neben getrocknetem Pflanzenmaterial kann selbstverständlich auch frisches Pflanzenmaterial ver­ wendet werden, wobei die Ausbeute an dem erfindungsgemäßen Wirkstoffgemisch bei letzteren verringert ist, da im frischen Pflanzenmaterial ziemlich viele Enzyme enthalten sind, die zu einer unspezifischen Spaltung der niedermolekularen, amino­ säurehaltigen Verbindungen führen und somit zu geringen Aus­ beuten.

In einem ersten Schritt wird das getrocknete Pflanzenmaterial mit organischen Lösungsmitteln vorbehandelt, wobei die Ver­ wendung apolarer organischer Lösungsmittel zu einer Entfet­ tung und der Einsatz eines niederen Alkohols zur Vorextrak­ tion erfolgt. Als geeignete apolare organische Lösungsmittel haben sich Hexan und Petrolether eines hohen Reinheitsgrades gezeigt. Im Bezug auf die Trockensubstanz werden diese in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:15, vorzugsweise von 1:5 bis 1 : 10 im Verhältnis Droge zu Lösungsmittel eingesetzt. An­ schließend wird das entfettete Pflanzenmaterial mit einem Vorextraktionsmittel in Mengen von 1 : 3 bis 1 : 20, insbesondere von 1 : 4 bin 1 : 8 versetzt. Das erfindungsgemäße Vorextrak­ tionsmittel ist in der Regel Diethylether, Ethylacetat, Chloroform oder Methanol oder ein Gemisch der vorstehenden Lösungsmittel, wobei der mengenmäßige Einsatz relativ unabhängig ist, Hauptsache ihre Menge ist ausreichend für den beabsichtigten Zweck. In der Regel als ausreichend haben sich die 5- bis 10fache Menge Vorextraktionsmittel, bezogen auf die Menge des entfetteten Pflanzenmaterials, erwiesen, wobei eine Mischung aus Methanol und Diethylether in einem Volumen­ verhältnis von 3 : 1 bevorzugt wird.

Die aus dem Entfettungs- und Vorextraktionsschritt erhaltene Droge wird anschließend mit einem wäßrigen Extraktionsmittel extrahiert. In der Regel handelt es sich dabei um eine schwach basische Pufferlösung auf Basis von Natriumacetat oder Elektrophoresepuffer wie Tris/Glycin oder Tris/HCl eines pH-Wertes von 8 bis 9 oder neutrales oder schwach mit Ammoniak alkalinisiertes Wasser einer Normalität von 0,001 bis 0,2 n. Gegebenenfalls kann das alkalinisierte Wasser noch 0,1 bis 96% (V/V) eines Alkohols, vorzugsweise Ethanol oder n-Propanol eines hohen Reinheitsgrades enthalten. Das Ver­ hältnis vorbehandeltes Pflanzenmaterial (Droge) des ersten Schrittes zu schwach basischer Pufferlösung oder alka­ linisiertem Wasser beträgt von 1 : 2 bis 1 : 40, vorzugsweise von 1 : 5 bis 1 : 20. Eine Extraktion mit neutralen oder mit 4 Gew.-% H₂SO₄, 0,1 bis 1 N HCl, H₃PO₄ oder HClO₄ schwach angesäuertem Wasser, das gegebenenfalls noch 0,1 bis 30% (V/V) der vorstehend genannten Alkohole enthalten kann, ist erfin­ dungsgemäß ebenfalls vorgesehen, wobei das Verhältnis Droge zu Extraktionsmittel im wesentlichen der mit schwach basi­ schem oder alkanisiertem Wasser durchgeführten Extraktion entspricht.

Eventuell im Rohextrakt vorliegende toxische Inhaltsstoffe, wie Bufadienolidglykoside, Hellebrin, Desglucohellebrin und/oder unwirksame Komponenten wie hochmolekulare Polysac­ charide, z. B. Stärke, des Extraktes werden durch Dialyse, Elektrodialyse, kurzzeitige kontrollierte Säurebehandlung bei leicht erhöhter Temperatur oder durch Liquid-Solid-Adsorption entfernt. Zur Säurebehandlung wird dabei der Rohextrakt in der Regel mit 0,5 N H₂SO₄ über 0,5 bis 20 Minuten, vorzugsweise 2 bis 5 Minuten, bei 60 bis 100°C, bevorzugt um 80°C, behandelt, wobei die vorstehend genannten, die Wirksam­ keit der erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehal­ tigen Verbindungen beeinflussende Verbindungen entfernt wer­ den. Anschließend wird der so behandelte Rohextrakt mittels Neutralisationsmitteln, wie KOH, CaCO₃, NaOH, NH₃, auf einen pH-Wert um pH 6 neutralisiert und eingeengt. Die Einengung der neutralisierten Lösung erfolgt dabei durch Eindampfen, Lyophilisieren oder ähnliche schonende Verfahrensweisen.

Der so erhaltene konzentrierte bzw. getrocknete Rohextrakt wird anschließend einer Vorbehandlung mit anorganischen oder organischen Verbindungen unterworfen, wobei ein Niederschlag entsteht, der die erfindungsgemäßen niedermolekularen, amino­ säurehaltigen Verbindungen enthält. Als anorganisches Behand­ lungsmittel hat sich dabei Ammoniumsulfat in wäßriger Lösung und als organisches Behandlungsmittel ein organisches Lö­ sungsmittel, vorzugsweise Aceton oder Ethanol, gezeigt, wobei bei Verwendung des organischen Lösungsmittels ein Verhältnis konzentrierter Rohextrakt zu Lösungsmittel von 1 : 1 bis 1 : 10, vorzugsweise 1 : 2 bis 1 : 8, geeignet ist.

Der durch Ammoniumsulfatprezipitation oder Acetonprezipi­ tation erhaltene Niederschlag wird anschließend, in der Regel durch Zentrifugation, abgetrennt, erneut gelöst und mittels gängiger physikalischer Trennverfahren fraktioniert. Für das erfindungsgemäße Verfahren haben sich selektive Membrandia­ lyse oder Gelfiltration als erfolgversprechend erwiesen, wobei der durch Zentrifugation abgetrennte Niederschlag vor der Auftrennung in Wasser gelöst wird. Bei der Auftrennung des in Wasser gelösten Niederschlags durch Gelfiltration haben sich Sephadex® G 10- oder G 25-Fraktionierungen als sehr geeignet erwiesen, wobei der Vorlauf, der die hochmo­ lekulare Fraktion enthält, verworfen und die niedermoleku­ laren Fraktionen gesammelt werden. Als Puffersysteme finden wäßrige Puffersysteme eines neutralen bis schwach sauren pH- Wertes Verwendung, wie Natriumacetatpuffer oder Tris/HCl-Puf­ fer. Die bevorzugte Verwendung eines neutralen bis schwach sauren Puffersystems liegt dabei in der relativen Stabilität der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindung gegen Wasserstoffionen.

Die abgetrennten niedermolekularen Fraktionen werden an­ schließend durch Hyperfiltration unter Verwendung einer Membran unter Druck, durch HPLC, durch Ionenaustausch­ chromatographie mit NaCl-Gradienten und/oder Affinitäts­ chromatographie mit L-Rhamnose-haltigen Festphasen weiter fraktioniert. Geeignete Filtrations- und/oder Affinitäts­ medien sind Sephadex® G 10, Sephadex® G 25 oder epoxid­ aktiviertes oder ethylenoxidaktiviertes Sephadex® bzw. Sepharose®.

Die erhaltenen gereinigten Fraktionen wurden anschließend lyophilisiert, wobei weiße bis hellbraune Pulver erhalten werden, die gut löslich in Wasser und schwer löslich in orga­ nischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Hexan oder Chloroform, sind.

Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, die Wirkstoffe oder das Wirkstoffgemisch auf peptidsynthetischem Weg herzustellen, wobei die Umsetzung bzw. Herstellung in an sich bekannter Weise mit Aminosäuren und/oder aminosäurehaltigen Ausgangs­ stoffen erfolgt.

Die auf die erfindungsgemäße Verfahrensweise erhaltenen erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Ver­ bindungen zeigen in sehr geringen Dosen eine bemerkenswerte antiphlogistische und antirheumatische Wirkung. Zusätzlich zeigen sie eine starke Inhibition des alternativen Komple­ mentweges und können sich an den MHC- oder Fc-Rezeptoren der Lymphozyten binden und dadurch eine spezifische, immunmo­ dulierende Wirkung ausüben. Auch eine Normalisierung der erhöhten spontanen (SMCC) oder antikörperabhängigen zellu­ lären Cytotoxizität (ADCC) der rheumatischen oder an erhöhter Autoagressivität leidenden Patienten wird durch eine Wieder­ herstellung der normalen Suppressoraktivität erreicht. Über­ dies zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen durch ihre peptidischen Struktureinheiten spezifische Interaktionen mit den Immunzellrezeptoren, bevorzugt den MHC- und/oder Fc-Re­ zeptoren, wobei die Wechselwirkung von gewissen Deoxysaccha­ riden, wie L-Rhamnose, beeinträchtigt wird.

Die erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen können entweder getrennt als Reinsubstanz oder als Substanzgemisch oder in Form von pharmazeutischen Zube­ reitungen verabreicht werden, wobei Letztgenannte außer den erfindungsgemäßen Verbindungen noch einen und/oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten können. Als diese Stoffe seien hier 0,9%-ige phy­ siologische Kochsalzlösung, 1 bis 5%-ige Glucoselösung, Man­ nit, Lactose, Kartoffelstärke, Carboxymethylcellulose Na­ trium, Talcum, Magnesiumstearat, Glycerin, Lanolin, Stearin, Natriumlaurylsulfat und Nipagin® genannt. Gegebenenfalls können den so hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen auch noch weitere therapeutische Wirkstoffe oder Adjuvanzien zugesetzt werden.

Diese Formulierungen schließen alle diejenigen Formulierungen ein, die für eine parenterale, einschließlich intramuskulä­ rer, intravenöser, subkutaner, peri- oder intraartikularer Injektionen, eine perorale, wie Tabletten, Kapseln oder Tropfen, oder für eine äußere Anwendung, wie Salben, Cremes, Gele oder Suppositorien, geeignet sind. Auch homöopathische Arzneimittelzubereitungen mit den erfindungsgemäßen Verbin­ dungen sind möglich.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Isolierung der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbin­ dungen

10 Teile getrocknete und pulverisierte Wurzel und Wurzelstock von Helleborus purpurascens (Familie Ranunculaceae) werden mit 100 Teilen Petrolether p.A. entfettet und anschließend mit 80 Teilen Ethylacetat vorextrahiert. Nach Entfernen des Extraktionsmittels wird der erhaltene Rückstand mit 100 Tei­ len 30% (V/V) Ethanol enthaltender 0,05 n Ammoniaklösung während 24 Stunden mazeriert. Dieser Rohextrakt wird dann bis etwa 1/8 seines Volumens eingeengt und mit der fünffachen Menge Aceton p.A. versetzt, die Mischung über Nacht bei 0 bis 6°C gehalten und anschließend zentrifugiert. Der nach Zentri­ fugation erhaltene Niederschlag wird dann unter Verwendung einer Cellulosemembran gegen destilliertes Wasser während 72 Stunden dialysiert. Das Exdialysat wird erneut eingeengt und mit Aceton p.A. behandelt. Die nach einmaliger oder wieder­ holten Fällungen erhaltenen niedermolekularen, aminosäurehal­ tigen Verbindungen werden in schwach basischer, 0,01 n Ammo­ niak enthaltender Lösung aufgenommen und einer Ionenaus­ tauschchromatographie an einer NaCl-aktivierten DEAE-Cellu­ lose mit einem HCOOH-Gradienten von 0,05 bis 0,1 M unter­ worfen.

Die gelchromatographisch mit Sephadex® G 10 bestimmten Mole­ kulargewichte der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Ver­ bindungen liegen in einem Bereich von 300 bis 5000 Dalton, wobei das Vorliegen oligomerer Homologverbindungen berück­ sichtigt wurde.

Beispiel 2 Charakterisierung der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen

Die Identitätsbestimmung der niedermolekularen, aminosäure­ haltigen Verbindungen wurde mit Hilfe der Dünnschichtchroma­ tographie unter Verwendung von Kieselgel GF-254 Fertigplatten mit n-Propanol/Ethylacetat/Wasser im Verhältnis 60:10:30 als Laufmittel und Detektion mit Ninhydrin bzw. mit dem Chlor­ tolidin-Reagenz nach Pataki durchgeführt.

Fehlende oder schwächere Farbreaktion mit Ninhydrin, aber rot-violett-farbige Flecken mit dem Chlor-o-Tolidin-Reagenz weisen auf das Vorhandensein von erfindungsgemäßen Verbindun­ gen hin.

Die Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber Säurehydrolyse wurde mit 4 Gew.-%-iger Schwefelsäure be­ stimmt, wobei nach 20-minütigem Kochen in 4 Gew.-%-iger Schwefelsäure noch über 80% der erfindungsgemäßen Verbin­ dungen unverändert vorliegen.

Die Aminosäurencharakterisierung wurde durch Hydrolyse mit 6 N HCl während 20 Stunden bei 105°C durchgeführt, wobei erhebliche Mengen an Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glycin und γ-Aminobuttersäure identifiziert werden konnten. Das Verhältnis dieser Aminosäuren zueinander lag bei 10:2:1:1.

Beispiel 3 Immunmodulatorische Wirkung

Die gemäß Beispiel 1 erhaltenen niedermolekularen, amino­ säurehaltigen Verbindungen wurden auf ihre immunmodula­ torische Wirkung gemäß dem Antibody Dependent Cellular Cytotoxity-Test (ADCC-Test) der Killer-Zellen von gesunden bzw. rheumatischen Patienten getestet, wobei ein Verhältnis Killer-Zellen zu Effektor/Zielzellen von 10:1 eingehalten wurde.

Die Ergebnisse dieses Tests sind der nachfolgenden Abbildung zu entnehmen:

Abbildung 1 Mittelwerte der zellulären Cytotoxizität von 10 gesunden und 16 rheumatischen Patienten mit und ohne Zugabe der niedermo­ lekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen (HP)

Wie der vorstehenden Abbildung 1 zu entnehmen ist, führt die Zugabe von 0,1 bis 1,5 µg der erfindungsgemäßen Verbindungen pro kg zu einer deutlichen Hemmung der erhöhten Autoaggre­ sivität der K-Zellen bei rheumatischen Patienten.

Beispiel 4 Antiphlogistische Wirkung

Die antiphlogistische Wirkung der gemäß Beispiel 1 herge­ stellten erfindungsgemäßen Verbindungen wurde mit dem dextraninduzierten Rattenpfotenödem-Test ermittelt. Die Ergebnisse dieses Tests sind der nachfolgenden Tabelle 1 zu entnehmen:

Tabelle 1

Statische Differenz (in %) zwischen den mit erfindungs­ gemäßen Verbindungen behandelten Ödemen und den unbehandelten Vergleichsödemen

Die Ergebnisse der Tabelle 1 verdeutlichen, daß bei Einsatz erfindungsgemäßer Verbindungen (HP) eine mit Voltaren® ähnliche antiphlogistische Wirkung erzielt wird, wobei diese Wirkung jedoch bei einer um den Faktor 2000 kleineren Wirkstoffdosis erreicht wird.

Beispiel 5

Die gemäß Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Verbin­ dungen wurden auf ihre antikomplementäre Wirkung an Human- und Meerschweinchen-Komplement auf dem klassischen und auf dem alternativen Weg untersucht (M. Smith et al., Int. Immunity, 38, 1279 (1982)).

Die Ergebnisse auf dem klassischen Weg zeigen, daß eine Hemmung nur bei 10 bis 40 µg/ml an erfindungsgemäßen Verbin­ dungen eintrat. Bei dem alternativen Weg der Komplement­ kaskade dagegen wurde eine sehr starke und dosisabhängige Hemmung der erfindungsgemäßen Verbindungen gefunden.

Die Ergebnisse auf dem alternativen Komplementweg sind der nachfolgenden Tabelle 2 zu entnehmen:

Tabelle 2

Test der antikomplementären Wirkung

Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, zeigen die erfindungs­ gemäßen Verbindungen eine sehr starke antikomplementäre Wirkung auf dem Alternativweg und führen zu einer ent­ sprechend effizienten Hemmung der inflammatorischen Prozesse.

Beispiel 6

25 Teile getrocknetes und pulverisiertes Kraut von Adonis vernalis (Familie Ranunculaceae) werden mit 150 Teilen Petrolether p.A. entfettet und anschließend mit 200 Teilen 0,05 n Ammoniak enthaltendes Wasser während 36 Stunden mazeriert. 100 Teile dieses filtrierten Rohauszuges werden eingeengt und anschließend mit der fünffachen Menge an Ethanol p.a. versetzt, das Gemisch während 2 Tagen bei 3 bis 6°C gehalten und anschließend der entstandene Niederschlag abzentrifugiert. Der nach Zentrifugation erhaltene Niederschlag wird in einer ausreichenden Menge Wasser gelöst, filtriert und die vorstehende Ethanolfällung zweimal wiederholt. Die aus der wiederholten Fällung abgetrennten Niederschläge werden in einer geringen Menge Natrium­ acetatpuffer gelöst und durch Ultrafiltration über Folien­ membranen die niedermolekularen Verbindungen von den hochmolekularen (MG 20 000 Dalton) abgetrennt.

Durch Gelfiltration mit Sephadex® G 10 konnte das Mole­ kulargewicht der niedermolekularen, aminosäurehaltigen Ver­ bindungen mit 1500 bis 8000 Dalton bestimmt werden.

Die Charakterisierung sowie die immunmodulatorische, anti­ phlogistische sowie antikomplementäre Wirkung der gemäß Beispiel 6 isolierten erfindungsgemäßen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen war vergleichbar mit der Wir­ kung der erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Beispiel 1.

Beispiel 7

25 Teile getrocknete und pulverisierte Wurzel und Wurzelstock von Helleborus orientalis (Familie Ranunculaceae) werden mit 150 Teilen Petrolether p.A. entfettet und anschließend mit 100 Teilen Aceton/Diethylether in einem Vol-Verhältnis von 1:1 vorextrahiert. Nach Entfernung des Extraktionsmittels wird der Rückstand mit 150 Teilen 15% (V/V) Ethanol ent­ haltendes Wasser während 24 Stunden mazeriert und der Extrak­ tionsschritt einmal wiederholt. Der erhaltene Rohextrakt wird auf eine mit 0,01 M Natriumacetat-Puffer equilibrierte Affi­ nitätschromatographie-Säule aufgebracht. Als feste Phase kam mit Rutin behandelte epoxyaktivierte Sepharose® 6B zur Anwendung. Nicht absorbierte Verbindungen werden mit Start­ puffer eluiert, die niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen mit 0,25 M Essigsäurelösung desorbiert und die desorbierten Verbindungen mit gesättigter Ammoniumsulfat­ lösung (60%) gefällt. Die nach einmaliger oder mehrmaliger Fällung mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung abgetrennten Verbindungen werden vereinigt und nach Lösung in der erfor­ derlichen Menge des gleichen Puffers die hochmolekularen Be­ standteile von den niedermolekularen Verbindungen durch Folienmembranen (Ausschlußgrenze 20 000 Dalton) abgetrennt.

Die Molekulargewichte der niedermolekularen, aminosäurehal­ tigen Verbindungen wurden mit 300 bis 8000 Dalton mit Hilfe der Gelpermeationschromatographie auf Sephadex® G 10 be­ stimmt.

Die Eigenschaften der erhaltenen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen waren vergleichbar mit den Eigenschaften der gemäß Beispiel 1 und 6 erhaltenen Ver­ bindungen.

Claims (7)

1. Antirheumatischer und antiphlogistischer Wirkstoff auf pflanzlicher und/oder bakterieller Basis, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein aus L-Rhamnose-haltigen Pflanzen und/oder Bakterien isolierter Wirkstoff und im wesentlichen ein Gemisch niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 300 bis 15 000 ist.

2. Wirkstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch einen relativ hohen Gehalt an Glutamin, Glutaminsäure, Asparagin und Asparaginsäure sowie geringere Gehalte an Leucin, Cystein, Tryptophan, Glycin und Derivaten der Glutaminsäure aufweist.

3. Wirkstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch eine spezifische Affinität gegenüber Saccharidverbindungen aufweist.

4. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch carboxylgruppengebundene Metalle aufweist.

5. Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus Pflanzen, pflanzlichen Zellkulturen oder Bakterienkulturen erhalten wird, wobei

• a) ein getrocknetes Pflanzenmaterial mit organischen Lösungsmitteln vorbehandelt,
• b) das vorbehandelte Pflanzenmaterial mit einem wäßrigen Extraktionsmittel extrahiert,
• c) hochmolekulare und toxische Bestandteile unter Erhalt niedermolekularer, aminosäurehaltiger Verbindungen abgetrennt und
• d) die erhaltenen niedermolekularen, aminosäurehaltigen Verbindungen gereinigt werden.

6. Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff durch Peptidsynthese aus Aminosäuren und/oder aminosäurehaltigen Ausgangsstoffen in an sich bekannter Weise hergestellt wird.

7. Verwendung eines Wirkstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Mittel zur Behandlung von Phlogosis, Rheumatismus und Autoimmunkrankheiten.