DE69634658T2

DE69634658T2 - Verfahren zur Isolierung eines Wirkstoffes aus Azadirachta Indica zur Verwendung bei der Therapie von Hyperacidität und Magengeschwüren

Info

Publication number: DE69634658T2
Application number: DE69634658T
Authority: DE
Inventors: Dr. Uday Bandyopadhyay; Dr. Ratna Chatterjee; Dr. Ranajit Kumar Bandyopadhyay
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2016-02-03
Also published as: EP0787495B1; DE69634658D1; EP0787495A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Wirkstoffs aus Azidirachta indica zur Regulierung von Magenhyperacidität und Magengeschwüren. Hyperacidität oder Hyperchlorhydria, ist ein bedeutendes weltweites Problem, an dem derzeit etwa 5% der Weltbevölkerung leiden; sie ist auf eine überschüssige Sekretion von Salzsäure (HCl) von der Magenschleimhaut zurückzuführen. Die Ursache dieser Hypersekretion ist unbekannt, sie ist jedoch auf eine Hyperaktivität der Protonen-pumpenden H⁺-K⁺-ATPase der parietalen Zellen zurückzuführen (Sachs, Penny & Lewin. Physiol. Rev. 58, 106, 1978). Hyperacidität kann die Ursache von Stress und Anspannung im täglichen Leben sein. Sie kann die Folge sein von nicht-steroider und steroider entzündungshemmender Arzneimitteltherapie bei der Behandlung einiger pathologischer Erkrankungen. Fortwährende Sekretion von HCl verhindert außerdem die Wundheilung der Magenschleimhaut und verschlimmert Magengeschwüre, eine Erkrankung, die durch eine Disbalance zwischen einigen aggressiven Faktoren und zellschützenden Faktoren der Magenschleimhaut verursacht wird. Die Säuresekretion wird durch ein Zusammenspiel physiologischer Sekretionsprodukte reguliert. Histamin interagiert mit dem H₂-Rezeptor der parietalen Zellen und triggert Säuresekretion durch eine Erhöhung von cAMP und Ca⁺⁺, was zu einer Aktivierung der H⁺-K⁺-ATPase führt (Sachs, Carlsson, Londberg & Wallmark, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 28, 269, 1988). Acetylcholin interagiert mit dem Muscarin-Rezeptor und stimuliert HCl-Sekretion durch Erhöhung des intrazellulären Diacylgycerols, IP₃ und Ca⁺⁺ (Muallem & Sachs, Amer. J. Physiol. 248, C216, 1985). Gastrin bewirkt dies durch transiente Erhöhung des intrazellulären Ca⁺⁺ durch Interaktion mit dem gastrischen Rezeptor (Soll, Amerian, Thomas, Ready & Elashoft, J. Clin. Inv., 73, 1434, 1984). Wie cAMP, Ca⁺⁺ oder IP₃, die "Second Messenger" das Signal an die H⁺-K⁺-ATPase übermitteln, ist noch unbekannt.
Es gibt drei Typen von Medikationen zur Bekämpfung von Hyperacidität und Geschwürbildung (Breenton. In Goodman's & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, eds. Gilman, Rall, Nies & Taylor, 2, 897, 1991): [I] H₂-Rezeptor-Blocker, die das Einnehmen des Rezeptors durch die Sekretionsprodukte blockieren, was zu einer Entkopplung der Stimulus-Sekretions-Verbindung führt, z. B. Cimetidin, Ranitidin, Famotidin und Nizatidin; muscarine cholinerge Rezeptorblocker, wie Atropin, Pirenzepin und Telenzepin; [II] Inaktivitoren der H⁺-K⁺-ATPase, z. B. Omeprazol; [III] verschiedene säurewidrige Stoffe (Alkaligele, z. B. Al(OH)₃, Mg(OH)₂ usw.).
Es wurden eine Anzahl von Nebenwirkungen für diese Medikationen beschrieben (Breenton. In Goodman's & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. eds. Gilman, Rall, Nies & Taylor, 2, 897, 1991). Cimetidin verursacht veränderte Laxation, Kopfschmerzen, Schwindel und Übelkeit, Muskelrheuma, Hautausschlag und Jucken, das Auftreten von Symptomen in Verbindung mit dem zentralen Nervensystem (ZNS), beeinträchtigte Nierenfunktion, Verlust der Libido, Impotenz und Gynäkomastie (Howden & Nunt. Peptic ulcer disease. In A Pharmacological Approach to Gastrointestinal Disorders. ed. Lewis J. 3, 1994). Cimetidin inhibiert außerdem Cytochrom P₄₅₀-kalatysierte Arzneimitteloxidation und Hydroxylierung von Estradiol, was zu einem Anstieg der Plasmakonzentration im Menschen führt. Cimetidin verursacht gelegentlich hämatologische Wirkungen (verschiedene Cytopenien) und verändert die Funktion des Immunsystems. Ranitidin hat ebenso verschiedene Nebenwirkungen (Howden & Hunt, Peptic ulcer disease, in A Pharmacological Approach to Gastrointestinal Disordes, ed. Lewis J. 3, 1994) und verursacht bei manchen Patienten Kopfschmerzen, leichten Durchfall und eine reversible Form von Arzneimittel-induzierter Hepatitis. Es verursacht ebenso reversible mentale Zerstreutheit bei einigen kranken älteren Patienten. Über Famotidin und Nizatidin ist bisher wenig be kannt, da sie erst kürzlich auf den Mark gekommen sind. Omeprazol verursacht gastrointestinale Störungen, einschließlich Übelkeit, Diarrhö und Darmkoliken, und hat Auswirkungen auf das ZNS (z. B. Kopfschmerzen, Schwindel, Schläfrigkeit). Hautreizungen, Leukopenie und transiente Erhöhung der Plasmaaktivität von hepatischen Aminotransferasen wurden gelegentlich beobachtet. Omeprazol reduziert die Sekretion, Synthese und Genexpression von Pepsinogen im Rattenmagen (Kakel, Ichinore, Tsukada, Tatematsu, Tezuka, Yahagi, Matsushima, Miki, Kurokawa, Takahashi & Jukamachi. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 997, 1993). Bei Langzeittherapie von Omeprazol wurden Magenschleimhauthypertrophie und Karzinome beschrieben (Ivy, Amer. J. Med. 84, Suppl. 2A, 41, 1988). Säurewidrige Mittel, wie Al(OH)₃, verursachen Verstopfung, während Mg(OH)₂ lockeren Stuhl oder Diarrhö verursacht. Bei Personen mit beeinträchtigter Nierenfunktion induziert die Langzeitverabreichnung von Al³⁺ sogar Osteodystrophie, proximale Myopathie und Enzephalopathie; die letztere kann in Form von Demenz oder Anfällen auftreten. Unter Berücksichtigung der Nebenwirkungen und Nachteile dieser Arzneimittel, ist die Identifizierung eines besseren Arzneimittels, welches weniger Toxizität jedoch potente inhibierende Wirkung gegen Säure und Geschwüre aufweist, dringend erforderlich, um diese menschlichen Leiden zu kontrollieren. Natürliche Produkte mit therapeutischer Wirkung werden als weniger toxisch für die humane Medikation akzeptiert, und Bemühungen zur Identifizierung derartiger Produkte sind stets willkommen.
Pflanzen sind seit dem Beginn der Zivilisation Teil der humanen Gesellschaft, und vielfache Verwendungen von Neem (Margosa-Baum) zur Behandlung einer Anzahl humaner Erkrankungen erinnern an ein breites Wirkungsspektrum einiger moderner Arzneimittel. Azidirachta indica A. Juss (syn. Melia azadirachta) und Melia azedarach Linn sind zwei nahe Verwandte Arten der Meliaceae. Die erstere ist allgemein be kannt als Indisches Neem oder Indisches Lilac und die letztere als Persisches Lilac. A. indica ist ein immergrüner Baum, der in verschiedenen Teilen von Indien kultiviert wird, und nahezu jeder Teil dieser Pflanze wurde in der Naturmedizin in Indien seit dem Altertum verwendet (Chopra, Chopra, Handa & Kapur. Indigenous drugs of India. Dhur & Sons Pvt. Ltd., Calcutta, 360, 1958). Der wässrige Rindenextrakt wird als tonisch, astringierend und nützlich bei Fieber, Erbrechen und Hauterkrankungen betrachtet. Die Blätter sind nützlich bei allen Typen von Anorexie und bei Hauterkrankungen, und die Früchte werden als abführend und (stuhl-)erweichend beschrieben und sind geeignet zur Behandlung von Magen-Darm-Würmern, Harnwegserkrankungen und Hämorrhoiden (Chatterjee & Pakrashi. The treatise on Indian Medicinal Plants. eds. Chatterjee & Pakrashi, 3, 76, 1994). Es stellte sich heraus, dass die wasserlösliche Fraktion des alkoholischen Extrakts der grünen Blätter bedeutende hypoglykämische Eigenschaften besitzt (Murty, Rao, Rao & Murty. Ind. J. Pharmacol. 10, 247, 1978; Pillai & Shantakumari. Ind. J. Med. Res. 74, 931, 1981). Der wässrige Extrakt der Neemblätter besitzt Wirkung gegen Magengeschwüre (Garg, Nigam & Ogle. Planta Med. 59, 215, 1993).
Dem Saft der Blätter von M. azadarach werden anthelmente und emmenagoge Eigenschaften nachgesagt. Die Wurzel ist geeignet bei der Behandlung von Tumoren (Japanisches Patent, Terumo Corporation, 2,522,001, 1983, C. A. 10000 168227), Herzbeschwerden, Leukoderma und Blutunreinheiten. Die Blätter und Borke werden innerlich und äußerlich bei Lepra und Scrofurose, bei der Behandlung von Exzemen und zur Erleichterung asthmatischer Anfälle verwendet.
Azadirachtin, ein sauerstoffhaltiges komplexes Tetranotriterpenoid, isoliert aus dem Ethanolextrakt der Neemfrucht, wird verbreitet als Pestizid mit phagenabstoßenden, antifeadenten und das systemische Wachstum störenden Eigenschaften bei Insekten verwendet (Butter worth, Morgan & Percy. J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 2445, 1972; Gill & Lewis, Nature, 236, 159, 1972; Zanno, Miura, Nakanishi & Editor. J. Amer. Chem. Soc. 97, 1975, 1975; Aldhons, Science, 258, 893, 1992; Govindachari, Current Sci. 63, 117, 1992; Grossman & Ley, Tetrahedron, 50, 11553, 1994). Kürzlich wurde gezeigt, dass Azadirachtin gegen die Larven von P. xylostella L wirksam ist (Verkerk & Wright, Pest. Sci. 37, 83, 1993) und die Entwicklung von Malariaparasiten inhibiert (Jones, Delholm, Ley, Lovell, Wood & Sinden. FEM Microb. Letts. 120, 267, 1994). Neemöl weist außerdem fertilitätshemmende Eigenschaften auf (Juneja & Williams, Pharmacol. Letts. Life Sc. 53, 279, 1993; Upadhyay, Dhawan, Sharma & Talwar. Contraception, 49, 161, 1994; Kaushic & Upadhyay, Contraception, 51, 203, 1995). Ebenso wurden spermizidhemmende, diuretische und entzündungshemmende Wirkungen von Neem beschrieben (Sharma & Saxena. Ind. J. Med. Res. 13, 1038, 1959; Shah, Sheth., Vide & Shah. Ind. J. Med. Res. 12, 150, 1958; Pillai & Santakumari. Planta Med. 43, 59, 1981). Von Nimbidin, dem bitteren Wirkstoff von Neem, wurde gezeigt, dass es Wirkung gegen Magengeschwüre aufweist (Pillai, Suganthan, Seshadri & Santakumari. Ind. J. Med. Res. 68, 169, 1978). Tatsächlich wurde Neem Gegenstand weltweiter Forschungsanstrengungen bezüglich seiner vorteilhaften Verwendung in der heutigen Zivilisation. Es wurden mehr als 100 verschiedene Verbindungen aus Neem isoliert und charakterisiert (Chatterjee & Pakrashi. The treatise on Indian Medicinical Plants, 3, 76, 1994).
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Isolierung eines Wirkstoffs aus der Pflanze Azadirachta indica zur Verfügung zu stellen, welcher geeignet ist zur Regulierung der Übersäuerung des Magens und Magengeschwürbildung. Dem gemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines Wirkstoffs gemäß Anspruch 1 zur Verfügung, bei dem es sich um ein phenolisches Glyco sid aus Azadirachta indica (Neem) handelt, und der geeignet ist für die Behandlung von Magenübersäuerung und Magengeschwüren; bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Ansprüchen 1 bis 6.
Die verwendete HPLC-Säule ist eine Umkehrphasen-C₁₈-Säule, wie Bondapak, Novapak oder Deltapak. Der Rückstand in Stufe [d] wird HPLC mit einer Fließgeschwindigkeit im Bereich von 0,5 ml/Min. bis 3 ml/Min. unterzogen, wobei das Eluat in dem Zeitraum zwischen 6 Minuten und 60 Minuten gesammelt wird. Das phenolische Glycosid, welches aus der Säule austritt, wird anhand seiner maximalen Absorption bei 280 nm, welche sich bei Zugabe von Alkali auf 293 nm verschiebt und einen positiven Molisch-Test auf Kohlenhydrat ergibt, detektiert.
Verschiedene Teile von Azadirachta indica (Neem), wie Blätter, Blüten, Rinde, werden in einem Erlenmeyerkolben in Wasser eingeweicht. Die Rinde der Pflanzen ist bevorzugt. Der Kolben wird gelegentlich geschüttelt. Der pH-Wert der Lösung kann durch die Zugabe von HCl oder Bicarbonat, je nachdem, was erforderlich ist, zwischen 5,7 und 7,0 gehalten werden. Der Wasserextrakt wird gefiltert und anschließend durch Gefriertrocknen lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wird zunächst mit Lösungsmitteln ansteigender Polarität extrahiert. Bei dem Lösungsmittelsystem, das für diesen Zweck verwendet wird, kann es sich um eines der Folgenden handeln:
(i) Petroleumether, Ethylacetat, Methanol und Butanol; (ii) Petroleumether, Butanol, Ethanol und Aceton; (iii) Petroleumether, Chloroform, Butanol und Methanol; (iv) Petroleumether, Dichlorethan, 2-Propanol und Methanol.
Der Rückstand, der nach Extraktion mit dem Lösungsmittel der höchsten Polarität erhalten wird, wird unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule, welche Moleküle auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität trennen kann, HPLC unterzogen. Die Fraktionen aus der Säule, welche das phenolische Glycosid mit der maximalen Absorption bei 280 nm enthalten, werden genommen und lyophilisiert.
Isolierung des Wirkstoffs:
Extraktion und Herstellung der Testproben:
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens und schränken den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise ein.
Beispiel 1
100 g Rinde von Azadirachta indica in kleinen feinen Stücken, die an der Luft und im Schatten getrocknet worden waren, wurden in 1.000 ml Glas-destilliertem Wasser 30 Stunden in einem Drei-Liter-Erlenmeyerkolben bei Raumtemperatur (20–30°C) eingeweicht. Der Kolben wurde gelegentlich geschüttelt. Der Wasserextrakt mit braunrötlicher Farbe wurde durch einen Whatman-Filter Nr. 1 gefiltert und anschließend lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver (3 g) wurde zunächst mit 100 ml Petroleumether (Siedepunkt 60–80°C) extrahiert. Der Petroleumether-Extrakt wurde verworfen. Der Rückstand wurde anschließend mit 100 ml Ethylacetat extrahiert. Der in Ethylacetat unlösliche Teil wurde dann mit 150 ml Methanol extrahiert und schließlich der in Methanol unlösliche Teil mit 100 ml n-Butanol extrahiert. Der in Methanol lösliche Teil zeigte leichte Aktivität. Der in n-Butanol unlösliche Teil zeigte säureinhibierende Aktivität und Wirkung gegen Geschwürbildung sowohl in in-vivo- als auch in-vitro-Experimenten. Der in n-Butanol unlösliche Teil wurde weiter durch HPLC durch Verwendung einer präparativen C₁₈-Deltapak-Säule aufgelöst und mit 50 : 50 = Methanol : Wasser bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. eluiert. Beim Scannen bei 280 nm wurde der in n-Butanol unlösliche Teil (welcher in Wasser oder in 50 : 50 Wasser : Methanol löslich ist) in sechs Peaks mit einer Retentionszeit von 24 Minuten, 34 Minuten, 35 Minuten, 35,5 Minuten, 38,5 Minuten und 40 Minuten aufgelöst; diese wurden als Peak 1, Peak 2, Peak 3, Peak 4, Peak 5 bzw. Peak 6 bezeichnet. Peak 1 zeigte säureinhibierende Aktivität. Die Homogenität von Peak 1 wurde in einem Brechungsindex-Detektor und ebenso in 2D-TLC (Lösungsmittel, Ethylacetat : Methylethylketon : Ameisensäure : Wasser = 4 : 3 : 1 : 2 oder Methanol : Wasser = 95 : 5) getestet. Die Homogenität von Peak 1 wurde weiter unter Verwendung einer C₁₈-Ionenpaar-Säule, ausgestattet mit einem elektrochemischen Detektor, bestätigt. Peak 1 wurde lyophilisert, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, bei dem es sich um ein phenolisches Glycosid handelt; dieses wurde bei 4°C gelagert. Die Ausbeute an Wirkstoff betrug 7%.
Beispiel 2
90 g der luftgetrockneten Rinde in kleinen Stücken wurden in 1.500 ml Glas-destilliertem Wasser (pH = 6,2–6,5) 35 Stunden in einem Drei-Liter-Erlenmeyerkolben bei Raumtemperatur (25–35°C) eingeweicht. Der Kolben wurde kontinuierlich in einem Schüttelbad geschüttelt. Der Wasserextrakt brauner Farbe wurde durch ein Whatman-Nr.-1-Filterpapier gefiltert und anschließend lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver (3,5 g) wurde zunächst mit 150 ml Petroleumether (Siedepunkt 60–80°C) extrahiert. Der Petroleumetherextrakt wurde verworfen. Der Rückstand wurde anschließend mit 100 ml Ethylacetat extrahiert. Der in Ethylacetat unlösliche Teil wurde dann mit 150 ml Ethanol extrahiert und schließlich der in Ethanol unlösliche Teil mit 100 ml Propanol extrahiert. Der in Ethanol lösliche Teil zeigte leichte biologische Aktivität. Der in Propanol unlösliche Teil zeigte säureinhibierende, sekretionshemmende und Geschwürbildung hemmende Aktivität sowohl in in-vivo- als auch in-vitro-Experimenten. Der in Propanol unlösliche Teil wurde weiter unter Verwendung einer präparativen C₁₈-Deltapak-Säule in einer HPLC aufgelöst und mit 50 : 50 = Ethanol : Wasser mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. eluiert. Beim Scannen bei 280 nm wurde der in Propanol unlösliche Teil in 6 Peaks mit einer Retentionszeit von 24 Minuten, 34 Minuten, 35 Minuten, 35,5 Minuten, 38,5 Minuten und 40 Minuten aufgelöst; diese wurden als Peak 1, Peak 2, Peak 3, Peak 4, Peak 5 bzw. Peak 6 bezeichnet. Peak 1 zeigte die säureinhibierende Wirkung. Die Homogenität von Peak 1 wurde in einem Brechungsindex-Detektor und auch in 2D-TLC (Lösungsmittel, Ethylacetat Methylethylketon : Ameisensäure : Wasser = 4 : 3 : 1 : 2 oder Methanol : Wasser = 95 : 5) getestet. Die Homogenität von Peak 1 wurde außerdem unter Verwendung einer C₁₈-Ionenpaarsäule, ausgestattet mit einem elektrochemischen Detektor, bestätigt. Nach Entfernen von Ethanol und Wasser in einem Rotationsverdampfer, wurde aus Peak 1 ein Pulver erhalten, bei dem es sich um ein phenolisches Glycosid handelt; dieses wurde (als lyophilisertes Pulver) gelagert. Die Ausbeute des Wirkstoffs betrug 5%.
Beispiel 3
100 g luftgetrocknete Blätter wurden zerkleinert und in 1.000 ml Glas-destilliertem Wasser (pH 6,2–6,5) 48 Stunden in einem Drei-Liter-Erlenmeyerkolben bei Raumtemperatur (25°C) eingeweicht. Der Kolben wurde kontinuierlich geschüttelt, und der wässrige Extrakt wurde durch Glaswolle gefiltert und anschließend lyophilisert. Dieser Extrakt ist biologisch aktiv bei der Inhibierung von Säuresekretion und Magengeschwürbildung. Das lyophilisierte Pulver (1 g) wurde zunächst mit 50 ml Petroleumether (Siedepunkt 60–80°C) extrahiert; der Petroleumetherextrakt wurde verworfen. Der Rückstand wurde anschließend mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Der in Ethylacetat unlösliche Teil wurde dann mit 100 ml Methanol extrahiert; schließlich wurde der in Methanol unlösliche Teil mit 50 ml n-Butanol extrahiert. Der in n-Butanol unlösliche Teil zeigte säure-inhibierende, sekretionshemmende und Geschwürbildung hemmende Aktivität sowohl in in-vito- als auch in-vitro-Experimenten. Der in n-Butanol unlösliche Teil wurde weiter in HPLC unter Verwendung einer präparativen C₁₈-Säule aufgelöst und mit 60 : 40 = Methanol : Wasser mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. eluiert. Beim Scannen bei 280 nm wurde das in n-Butanol unlösliche Material in 4 Peaks mit einer Retentionszeit von 36 Minuten, 46 Minuten, 47 Minuten und 48 Minuten aufgelöst; diese wurden als Peak 1, Peak 2, Peak 3 bzw. Peak 4 bezeichnet. Peak 1 zeigte säureinhibierende Wirkung. Die Homogenität von Peak 1 wurde wie in den Beispielen 1 und 2 getestet. Peak 1 wurde lyophilisiert, wodurch ein braunes Pulver erhalten wurde, bei dem es sich um ein phenolisches Glycosid handelt. Die Ausbeute des Wirkstoffs betrug 2%.
Der gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierte Wirkstoff wurde als phenolisches Glycosid identifiziert; es besitzt die folgenden Eigenschaften:
Physikalische Eigenschaften:

1. Das lyophilisierte Pulver besitzt eine ziegelrote Farbe, ist leicht in Wasser bei einer Konzentration bis zu 60 mg/ml und in DMSO mit 50 mg/ml löslich.
2. Bei der UV-Spektrometrie ergibt die wässrige Lösung einen symmetrischen Peak bei 224 nm und 276 nm. Bei Zugabe eines Tropfens konzentrierter KOH wird lediglich der Peak bei 276 nm auf 298 nm verschoben; die ursprüngliche ziegelrote Farbe verändert sich in ein dunkelrot. Die ursprüngliche Farbe erscheint wieder nach Zugabe von Essigsäure. Diese Eigenschaft tritt in der Regel bei phenolischen Verbindungen auf.
3. Bei IR-Spektroskopie (in KBr) ergibt dieses Material einen Peak bei 3380 cm^–1, 2362 cm^–1, 2360 cm^–1, 1514 cm^–1, 1512 cm^–1, 1452 cm^–1, 1452 cm^–1, 1382 cm^–1 und 1067 cm^–1. Einige dieser Absorptionen sind auf die Hydroxylgruppen zurückzuführen.
4. Der Schmelzpunkt liegt über 260°C.
5. Die optische Drehung dieses Materials ist [alpha]²⁵ + 14° (C 1,0, H₂O).
6. Die ¹H-NMR-Analyse dieses Materials ergibt Peaks bei 8,01, 7,87, 5,93, 4,69, 4,59, 4,50, 4,30, 3,94, 3,88, 3,69, 2,30, 2,19, 2,14, 2,01, 1,91, 1,80, 1,55, 1,16, 1,12, 0,8, 0,32, 0,26 und 0,15 PPM in D₂O in einem 200-MHz/52-MM-NMR-Spektrometer.
7. Die ¹H-NMR-Analyse des isolierten Aglycananteils dieses Materials in DMSO unter Verwendung eines 200-MHz/52-MM-NMR-Spektrometers ergibt Peaks bei 8,28, 3,42, 3,39, 3,15, 2,81 und 2,49 PPM.

Chemische Eigenschaften:

1. Die Elementaranalyse (insbesondere C, H, N) in einem CHN-Analysegerät ergibt 44,76% Kohlenstoff und 4,72% Wasserstoff, jedoch keinen Stickstoff.
2. Mit Folin-Ciocalteau-Reagenz wird eine Blaufärbung erzeugt, die positiv für Phenolgruppen ist. In einer Polyacrylamidgelelektrophorese wurde kein Peptid nachgewiesen.
3. Der Molisch-Test für Kohlenhydrate ist positiv. Bei Hydrolyse besteht der Glycananteil aus Arabinose, Glukose, Mannose, Rhamnose und Galaktose in Verhältnis von 1 : 1 : 1 : 1 : 2, nachgewiesen durch automatisierte Gas-Flüssigkeits-Chromatographie. Nach kontrolliertem Verdau über Nacht bei 28 ± 1°C mit 5% H₂SO₄ wird ein Aglycananteil ausgefällt, welcher in Wasser unlöslich, in Methanol jedoch leicht löslich ist. Der Aglycananteil ist phenolischer Natur, wie sich (1) durch UV-Absorption bei 279 nm, welche durch verdünntes Alkali auf 293 nm verschoben wird, und (2) seine Reduktion von Eisen-Ferricyanid unter Bildung einer preußisch blauen Farbe von Eisen-Ferrocyanid – ein positiver Test für phenolische Verbindungen – zeigt.
4. Magnetometer-Daten zeigen, dass keinerlei Übergangsmetall-Ion enthalten ist. Andere Metall-Ionen, z. B. Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺ usw., sind ebenso nicht enthalten, wie einer negativen Flammprobe zu entnehmen ist.

Weitere Studien zur Bestimmung der genauen Struktur dieser neuen Verbindung werden derzeit durchgeführt.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Verbindung wurde Bioessay-Studien unterworfen:
Tiere:
Albino-Ratten (Wistar-Stamm jedes Geschlechts, 180–200 g) bekamen 24 Stunden vor Beginn des Experiments kein Futter mehr, jedoch freien Zugang zu Wasser und wurden in Käfigen mit Aluminiumgitterboden gehalten, um Caprophagie zu vermeiden.
In-vivo-Studien:
A. Durch Pylorus-Ligation induzierte Magensäuresekretion:
Die pylorische Ligation wurde unter leichter Etheranästhesie (Shay, Komarov, Fels, Meranze, Gruenstein & Siplet. Gastroenterology, 5, 43, 1945) 30 Minuten nach intraperitonealer Injektion verschiedener Dosen des Wirkstoffs (0,5–2,5 mg/100 g) vorgenommen. Die Tiere wurden 2 Stunden nach der Ligation durch Dekapitieren getötet. Der Mageninhalt wurde durch Ausspülen des Magenhohlraums mit 2 ml 0,9%iger Salzlösung durch das pylorische Ende gesammelt (Bandyopadhyay, Bhattacharyya, Chatterjee & Banerjee, Biochem. J. 284, 305, 1992). Er wurde bei 5.000 × g 10 Minuten in einer RC-5B-Sorvall-Kühlzentrifuge zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gesammelt, das Volumen aufgenommen und der HCl-Gehalt durch Autotitration in einem pH-Meter, Radiometer, Kopenhagen, gemessen.
B. Mercaptomethylimidazol(MMI)-induzierte Magensäuresekretion
MMI-induzierte Magensäuresekretion wurde wie zuvor beschrieben gemessen (Bandyopadhyay, Bhattacharya, Chatterjee & Banerjee. Biochem. J. 284, 305, 1992). Seit 24 Stunden nüchternen Ratten wurde der Wirkstoff in verschiedenen Dosen injiziert (0,5–2,5 mg/100 g); nach 30 Minuten wurde dann MMI (3 mg/200 g) oder der Träger (Wasser) injiziert (IP). Nach 2,5 Stunden wurden die Tiere getötet, das Abdomen geöffnet und die Magenflüssigkeit wie beschrieben gesammelt. Der Wirkstoff blockiert dosisabhängig MMI-induzierte Magensäuresekretion.
In-vitro-Studien:
A. Messung der Akkumulation von [¹⁴C]-Aminopyrin [¹⁴CAP] in isolierten Magendrüsen als Index der Säuresekretion:
Magendrüsen wurden durch kontrollierten enzymatischen Verdau hergestellt (Berglindh & Obrink. Acta Physiol. 96, 150, 1976). Dabei wurde die Magenschleimhaut von Kaninchen abgeschabt und schließlich mit einer Schere zerkleinert. Der Verdau wurde 25 Minuten bei 37°C unter Verwendung von 20 mg Collagenase/50 ml Inkubationsmedium (NaCl, 140 mM; MgSO₄ 7H₂O, 1,2 mM; CaCl₂ 2H₂O, 1 mM; Hepes, 10 mM; KOH, 5,4 mM; Cimetidin, 100 μM; D(+)-Glukose, 0,5 mg/ml; BSA, 2 mg/ml) durchgeführt. Die Drüsen wurden dreimal mit Inkubationsmedium gewaschen und in dem gleichen Medium resuspendiert. [¹⁴C]-AP wurde zu der Drüsensuspension in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Sekretionsprodukte gegeben und nach 0, 15, 30 und 60 Minuten Aliquots entfernt. Die Proben wurden kurz zentrifugiert, der Überstand entfernt, das Pellet getrocknet und in 3 N KOH gelöst. Die Radioaktivität wurde durch einen Flüssigszintillationszähler bestimmt. Die AP-Akkumulation ist in CPM/mg Drüsen ausgedrückt (Berglindh. Acta Physiol. Scand. 96, 150, 1976).
B. Essay der H⁺-K⁺-ATPase-Aktivität:
Herstellung von H⁺-K⁺-ATPase-angereicherten gastrischen Vesikeln:
Mikrosome der Magenschleimhaut von Schweinen wurden wie beschrieben hergestellt (Soumarmon, Abasfado, Bonfils & Lewine. J. Biol. Chem. 255, 11682, 1980; Wolosin & Forte. J. Biol. Chem. 256, 3149, 1981). Dazu wurde die abgekratzte Mukosa mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in einem Puffer, enthaltend 250 mM Saccharose, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA und 2 mM Tris-Cl (pH 7,4), homogenisiert. Der post-mitochondriale Überstand wurde bei 100.000 × g 60 Minuten zentrifugiert, wodurch das mikrosomale Pellet erhalten wurde. Dieses wurde in Homogenisierungspuffer suspendiert und über einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten, bestehend aus gleichen Volumen (10 ml) 37%igen und 22%iger (w/v) Saccharoselösung (die Saccharoselösungen wurden mit Puffer, enthaltend 1 mM EGTA und 2 mM Tris-Cl, hergestellt) geschichtet. Nach 12-stündiger Zertrifugation bei 81.000 × g in einer Beckman-Ultrazentrifuge wurde die Membranbande an der Grenzfläche der 22%igen und 37%igen Saccharoseschichten gesammelt und als H⁺-K⁺-ATPase-angereicherte Vesikelfraktion verwendet. Diese Fraktion wurde in Puffer mit 1 mg/ml gelagert und bei –20°C mehrere Monate aufbewahrt. Alle Stufen wurden bei 4°C durchgeführt.
Die H⁺-K⁺-ATPase-Aktivität wurde wie beschrieben bestimmt. (Beil, Hackbarth & Sewing. Brit. J. Pharmacol. 88, 19, 1986). Dabei wurde die Enzymaktivität in 1 ml Inkubationsmedium, enthaltend 2 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), 0,1 mM EGTA, 5–10 μg Membranprotein mit oder ohne 7 mM KCl und 7 mM NH₄Cl, gemessen. Das Ganze wurde 2 Minuten bei 37°C vorinkubiert und die Reaktion durch 20 μl 0,1 M ATP (Endkonzentration 2 mM) gestartet; dann wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion durch 0,1 ml 50%iges kaltes TCA wurde das freigesetzte anorganische Phosphat wie beschrieben bestimmt (Staussky & Shorr. J. Biol. Chem. 202, 675, 1953). Die H⁺- K⁺-ATPase-Aktivität wurde aus der Differenz der Menge an Phosphat, die in das Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von 7 mM KCl und 7 mM NH₄Cl freigesetzt wurde, berechnet. Die Wirkung des Wirkstoffs wurde bei variierenden Konzentrationen vor der Zugabe von ATP untersucht.
Diese Verbindung, welche gemäß des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens isoliert wurde, inhibiert dosisabhängig sowohl durch Pylorus-Ligation als auch durch Mercaptomethyl-Imidazol(MMI)-induzierte Magensäure- und Volumensekretion in vivo. Bei einer Dosis von 14 μg/100 g Ratte wird die Säuresekretion vollständig blockiert. Ebenso werden 70% und 62% der Volumensekretion in Pylorus-ligierten bzw. MMI-injizierten Tieren reduziert.
Bei in-vitro-Magendrüsen-Präparation wird sowohl die Grund- als auch die durch Sekretionsprodukte induzierte Säuresekretion bei einer Konzentration von 3 mg/ml Drüsensuspension vollständig inhibiert. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Verbindung inhibiert H⁺-K⁺-ATPase-Aktivität in konzentrationsabhängiger Weise. Bei einer Konzentration von 2 μg/ml wird die H⁺-K⁺-ATPase vollständig inhibiert. Im Vergleich zu Omeprazol weist die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Verbindung wenigstens die dreifach erhöhte Wirksamkeit auf.
Der durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren erhaltene Wirkstoff verhält sich ähnlich wie die Verbindung, die durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isoliert wurde, sowohl bei der Inhibierung von Magensäuresekretion in vivo und in vitro als auch bei der Inhibierung der Magengeschwürbildung. Bei einer Dosis von 20 μg/100 g Ratte wurde die Säuresekretion vollständig blockiert und 60% und 65% des Volumens der Magensekretion in Pylorus-ligierten bzw. MMI-injizierten Tieren reduziert. Bei in-vitro-Magendrüsen-Präparation wird sowohl die Grund- als auch die durch Sekretionsprodukte induzierte Säuresekretion bei einer Konzentration von 4 mg/ml Drüsensuspension inhibiert. Ebenso wird bei einer Konzentration von 3 μg/ml die H⁺-K⁺-ATPase-Aktivität vollständig inhibiert.
Vorteile der vorliegenden Erfindung:

1. Das isolierte phenolische Glycosid ist geeignet zur Regulierung von Hyperacidität des Magens und Magengeschwüren. Diese neue Verbindung ist wirksam bei sehr geringer Konzentration. Es wurde kein Todesfall beobachtet, wenn Ratten einer hohen Dosis (2,0 mg/100 g Ratte) ausgesetzt waren. Somit sind 14 μg/100 g Ratte, eine Dosis, die vollständig die Säuresekretion inhibiert, weder letal noch toxisch.
2. Der IC₅₀-Wert der neuen Verbindung ist geringer als der von Omeprazol. Die Verbindung ist wirksamer als Omeprazol bei der vollständigen Inhibierung der H⁺-K⁺-ATPase.
3. Die Ausbeute der Verbindung (aus lyophilisiertem Pulver) ist sehr hoch (7–8%).
4. Da die neue isolierte Verbindung nicht signifikant die Pepsinogen-Sekretion im Magensaft beeinflusst, kann sie selektiv als Arzneimittel zur Inhibierung von Hyperacidität verwendet werden. Da Säure die Heilung von Magengeschwüren verzögert, begünstigt sie die Heilung von Magengeschwüren. Sie blockiert außerdem durch Stress induzierte Geschwüre (Das & Banerjee. Mol. Cell. Biochem. 125, 115, 1993) zu 90% bei einer Konzentration von 2 mg/100 g Ratte.
5. Die isolierte neue Verbindung wird durch Extraktion mit Wasser erhalten, und ihr phenolischer Glycosidcharakter unterscheidet sich vollständig von den bisher aus dem Neembaum isolierten, zuvor beschriebenen Verbindungen (Mahato, Sahu & Poddar. Science & Culture 53, Suppl. No. 5, 1987; Chatterjee & Pakrashi. The treatise on the Indian Medicinal Plants. eds. Chatterjee & Pakrashi, 3, 76, 1994).

Claims

Verfahren zur Isolierung eines Wirkstoffs aus Azadirachta indica (Neem) zur Verwendung bei der Behandlung von Übersäuerung des Magens und Magengeschwüren mit den Stufen: [a] Herstellen eines wässrigen Extrakts aus Teilen von Azadirachta indica (Neem) durch Weichen kleiner Teile der Neem-Pflanzen mit destilliertem Wasser mit einem pH-Wert von 5,5–7,0 über einen Zeitraum vom 3–48 Stunden bei Raumtemperatur und Abtrennen nicht gelöster Verunreinigen durch bekannte Verfahren, [b] Lyophilisieren des in Stufe [a] erhaltenen Extrakts durch konventionelle Verfahren zur Bildung eines Pulvers, [c] Extrahieren des lyophilisierten Pulvers mit Lösungsmitteln ansteigender Polarität, ausgewählt aus Petrolether, Ethylacetat, Methanol, Butanol; Petrolether, Butanol, Ethanol, Aceton; Petrolether, Chloroform, Butanol, Methanol; Petrolether, Dichlorethan, [d] Behandeln des in Stufe [c] erhaltenen Rückstands in einer HPLC auf einer Umkehrphasensäule, welche Moleküle verschiedener Hydrophobien trennen kann, [e] Abtrennen der aus der Säule austretenden Fraktion, welche eine maximale UV-Absorption bei 280 nm aufweist, [f] Lyophilisieren des in Stufe [d] erhaltenen Eluats durch bekannte Verfahren zur Bildung eines Pulvers des Wirkstoffs.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei den Teilen der verwendeten Pflanzen um Blätter, Blüten und Borke handelt, wobei die Borke bevorzugt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Lyophilisation des Extrakts zur Bildung eines Pulvers durch Gefriertrocknen bewirkt wird.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lösungsmittel mit ansteigender Polarität, die zum Extrahieren des lyophiliserten Pulvers verwendet werden, aus folgenden ausgewählt werden: i) Petrolether, Ethylacetat, Methanol, Butanol, ii) Petrolether, Butanol, Ethanol, Aceton, iii) Petrolether, Chloroform, Butanol, Methanol, iv) Petrolether, Dichlorethan, 2-Propanol, Methanol.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1–4, wobei es sich bei der verwendeten HPLC-Säule um eine C₁₈-Umkehrphasensäule handelt.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1–5, wobei der in Stufe [d] erhaltene Rückstand HPLC mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min.–3,0 ml/Min. unterworfen und das Phenolglycosid enthaltende Eluat, welches in dem Zeitraum von 6 Min.–60 Min. aus der Säule austritt, gesammelt wird.