DE3042491A1 - Niedermolekulare polysaccaride aus pflanzen der compositen-familie, verfahren zu ihrer gewinnung und sie enthaltende pharmazeutische zubereitungen - Google Patents

Description

• Niedermolekulare Polysaccharide aus Pflanzen der Compositen-
• Familie, Verfahren zu ihrer Gewinnung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen In den letzten Jahren haben sogenannte "Faktorenkrankheiten" zugenommen bei denen es sich um bakterielle, virus-oder pilzbedingte Infektionskrankheiten von Warmblütern durch sogenannte "opportunistische Keime" handelt. Diese Erreger befinden sich entweder in latenter Form im Organismus oder sie leben in Symbiose mit dem menschlichen Körper, ohne ihn zu schädigen. Kommt es jedoch zu einer Senkung der allyemeinen Resistenz, im besonderen durch Einwirkung enercjiereicher Strahlen, so gehen diese Infektionskrankheiten an und können zu schwer beeinflußbaren Krankheitsbildern führen.
• Aus der DE-OS 2 714 665 war es bereits bekannt, die allgemeine Belastungsüberwindungsfähigkeit des menschlichen und tierischen körpers durch Verßbreichung eines Präparates zu erhöhen, das durch y-Bestçahlung attenuierter Avipox-Viren erhalten wird.
• Zur Abwehr bakterieller Infektionen beim menschlichen Organisinus wurden auch bereits Pflanzenextrakte eingesetzt, z.B. aus dem Roten Sonnenhut (Echinacea purpurea; Echinacea angustifolia). Die bekannten Echinaceaextrakt-haltigen Präparate sind verhältnismäßig mild wirkende Präparate zur Erhöhung der Körperabwehrkraft. Die meisten dieser Präparate sind Mischpräparate und enthalten zum Teil die Extrakte in homöopathischen Verdünnungen zusätzlich zu anderen Stoffen.
• Es besteht daher weitethin ein dringender Bedarf nach biologischen Präparaten zur Stimulierung des Immunsystems des Säugetierorganismus und damit zur Prophylaxe und Bekämpfung von durch Resistenzsenkung induzierten Infektionskrankheiten.
• Es wurde nunmehr überraschend gefunden, daß durch Resistenzsenkung, im besonderen durch Strahlenschädigung induzierte Infektionen wirksam durch ein präparat verhindert oder bekämpft werden können, das als Wirkstoff aus Pflanzen der Compositen-Familie erhaltene, unten näher beschriebene Polysaccharide enthält. Die erfindungsgemäßen Polysaccharide weisen stark immunstimulierende Eigenschaften bei gleichzeitig entzündungshemmender Wirkung auf.
• Diese Feststellung war überraschend, da die meisten immunstimulierenden biologischen Wirkstoffe gleichzeitig Entzündungsreizstoffe sind.
• Es wurde beispielsweise festgestel]t, daß durch die erfindungsgemäßen Polysaccharide eine Stimuiation der T-Lymphozythen des Menschen bewirkt wird, die diejenige des Lectin (Phythämagglutinin .M) bei Zusatz von 25 ßg zu 200 000 Zellen -deutlich, d.h. um 20 bis 30 % übertrifft, was an der Einlagerung von H3-Thymidin in den Lymphozythen gemessen wurde.
• Es wurde weiterhin festgestellt, daß der erfindungsgemäße Wirkstoff Makrophagen, B- und T-Zellen in gleichem Umfang stimuliert.
• Die erfindungsgemäßen Polysaccharide sind besonders wirksam als Strahlenschutzmittel sowohl bei vorheriger als auch bei unmittelbar nach Strahleneinwirkung erfolgter Verabreichung und heben die tödli.che Wirkung energiereicher Strahlen in signifikantem Umfang auf. Im Tierversuch mit NMRI-Mäusen ergab sich, daß bei Bestrahlung von 2 Gruppen von je 100 Versuchstieren mit Y-o<?trahlen in subletaler Dosis etwa 40 Mäuse starben. Bei i.p.Applikation der erfindungsgemäßen Polysaccharide vor der Bestrahlung wurde die Letalität derart aufgefangen, daß nunmehr 94. bzw. 96 Mäuse überlebten.
• Die erfindungsgemäßen Polysaccharide zeigen außerdem eine signifikante Wirkung als Immunadjuvantien, was durch eine deutliche Vermehrung der antikörperbildenden Zellen an der C3H-Maus im hämolytischen plaque-Test von Jerne gezeigt werden kcnnte. Diese Adjuvans-Eigenschaft ist deshalb überraschend, da die bisher bekannten Immunadjuvantien, wie z.B. Åluminiumhydroxid, Freund'sches Adjuvans und Pertussisbakterien ausnahmslos auch Entzündungsreizstoffe waren. s können deshalb durch simultane Verabreichung der erfindungsgemäßen Polysaccharide schlecht verträgliche Impfstoffe, wie z.B. Cholera-Impfstoff niedriger dosiert und besser verträglich gemacht werden.
• Die anti};örperaShEngige Zytotoxizität der Lymphozysten wird durch die erfindungsgemäßen Polysaccharide im Pearlman-Test um das 2- bis 4-fache verbessert. Dies ist ein Beweis für die Aktivierung der lysosomalen Enzyme bei der Immunreaktion; es werden dadurch Immunkomplexe beseitigt. Diese Eigenschaft ist von besonderer Bedeutung für die Verwendung der erfindungsgemäßen Polysaccharide in der adjuvanten Chemotherapie maligner Tumore.
• Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann wegen der fehlenden Entzündungsreizwirkung subkutan und i.v. verabreicht werden. Bei Injektion beträgt die Dosis etwa 5 mg. Bei oraler Verabreichung und Resorption über die Schleimhäute ist die Dosis entsprechend höher und beträgt etwa 20 bis 50 mg/70 kg Körpergewicht.
• Während die meisten in Pflanzen vorkommenden Polysaccharide ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 aufweisen, sind die erfindungsgemäßen Polysaccharide verhältnismäßig niedermolekular und zeigen eine Moleku].argewichtsverteilung zwischen etwa 5000 und 50 000.
• Die erfindungsgemäßen Polysaccharide sind Heteroglycane, die folgende Zucker enthalten: Rhamnose, Mannose, Arabinose, Galactose, Xylose, Glucose und Uronsäuren. Die Hauptbestandteile sind Tri- und Tetraglykane enthaltend die Zucker: Rhamnose, Arabinose, Xylose, Galactose und Glucose neben geringen Anteilen anderer Heteroglykane.
• Zur Abgrenzung gegenüber den gleichfalls biologisch aktiven Phythämagglutininen (tectinen), die etwa 4 - 6 % Stickstoff enthalten, sind die erfindungsgemäßen Polysaccharide praktisch frei von Stickstoff bzw. enthalten Stickstoff nur in Spuren von weniger als 0.1%.
• Die Hauptmenge der erfindungsgemäßen Polysaccharide wird bei der Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Sepharose Cl 6B-Säule und Gradientenelution mit 0 bis 1 Mol NaCl-Lösung bei einer konzentration zwischen 0.2 und 0.6 Mol NaCl erhalten.
• Die erfindungsgemäßen Polysaccharide können bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich, aus den oberirdischen Teilen beispielsweise folgender Pflanzen aus der Familie der Compositen: Echinacea purpurea u. angustfolie (Herba; Radix); Arnica montana (Flos); Calendula officinalis (Flos); Eupatorium cannabinum (Herba); Matricaria chamomilla (Flos) und Achyrocline saturoides (Herba), nach folgendem Verfahren erhalten werden: Trockenes, gepulvertes Pflanzenmaterial wird nacheinander mit der 5-6-fachen Menge eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z.B. Dichlormethan, Ethylacetat und Methanol jeweils 4 Tage lang extrahiert.Die Extrakte werden verworfen. Der getrocete Drogenrückstand wird mit der mehrfachen, vorzugsweise der 5-fachen Menge einer kalten 0.5 Vol. %igen wäßrigen Alkalilösung, z.B. einer NaOH-Lösung versetzt und diese über Nacht bei 40 C stehenge]assen. Nach Filtration, vorzugsweise durch eine Zellstofflage, wird das Filtrat mit der etwa 3-fachen Volumenmenge kalten Alkanols, vorzUgsweise 95 %igen Ethanols versetzt, das Ganze wieder über Nacht bei 40 C stehengelassen und danach dekantiert bzw zentrifugiert. Der Uberstand wird verworfen. Der NiederSchlag wird in der zur Lösung notwendigen Menge kalten Wassers aufgenommen ( etwa 11 - 1,51 / 250g Ausgangsdroge). Man gibt die etwa gleiche Volumenmenge einer kalten 15 %igen wäßrigen Trichloressigsäurelösung hinzu, läßt das Ganze etwa 1 Stunde unter Eiskühlung stehen und zentrifugiert 20 Min. bis 1 Stundc bei 15 000 U/Min. Der abzentrifugierte Anteil wird verworfen. Der Uberstand wird mit der 4-fachen Menge an kaltem Ethanol versetzt, die Mischung über Nacht bei 40 C stehengelassen und anschließend dekantiert bzw. zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird je nach Ausbeute. mit 500-750 ml einer-wäBrigen 2%igen Natriumacetatlösung (bezogen auf 250g Ausgangsdroge) aufgenommen, filtriert und entweder (a) mit der 2-fachen Volumenmenge kalten Ethanols versetzt. Man läßt über Nacht. bei 4" C stehen und dekantiert bzw. zentrifugiert anschließend. Der Überstand wird verworfen; oder (b) es wird anstelle der zweifachen Volumenmenge Ethanol die Ausfällung mit einer niedrigeren Ethanolmenge (ca. 0.5 Vol.) begonnen, in welchem Fall der Uberstand anschließend nochmals mit der einfachen Volumenmenge Ethanol und nach Abtrennung des Niederschlages der erneute überstand mit der doppelten und schließlich mit der vierfachen Ethanolmenge versetzt wird. Man erhalt nach diesem modifizierten Verfahren vier Niederschläge. Die Hauptmenge an Niederschlag (ca. 50-75 %) erhält man in der Regel bei der ersten Fällung. Durch das nochmalige fraktionierte Fällen wird bei Vorliegen stark verunreinigter und gefärbter Niederschläge eine bessere Abtrennung der Begleitstoffe und dadurch bereits eine Vorfraktionierung der Polysaccharide nach dem Mol.-Gewicht möglich. Die erste Ausfällung enthält die Fraktion mit dem höchsten Mol.-Gewicht.
• Der Niederschlag der einmaligen Fällung aus (a) oder die einzelnen Niederschläge der verschiedenen Fällungen aus (b) werden getrennt in der zum lösen notwendigen Menge Wasser aufgenommen (bel einer Drogenausqangsmenge von 250g zwischen 250 und 350 ml). Anschließend wird gefriergetrocknet. Man erhält je nach verwendeter Ausgangsdroge hellbraune, gelblich braune bis weißlich graue Substanzen,-die zur Abtrennung von färbenden Verunreinigungen einer Filtration beispielsweise über eine Biogel-P-2-Säule unterworfen werden können. Die Substanz aus der einmaligen Fällung aus (a) oder die Substanzen der verschiedenen Fällungen aus (b) werden anschließend getrennt durch Ultrafiltration mit entsprechenden Folienmemranen (Firma Berghof-Tübingen oder Amicon Corporation Lexington) in die Molekulargewichtsbereiche 1000, 1000-50130 und 5000-50 000 aufgetrennt. Die Fraktionen mit dem Molekulargewichtsbereich 5000 bis 50 000 werden vereinigt und stellen die erfindungsgemäßen, biologisch aktiven Polysaccharide dar.
• Beispiel Isolierung eines biologisch aktiven Polysaccharids aus den oberirdischen Teilen (Herba-Droge) von Echinacea purpurea.
• 1 kg in der Drogenmthle bis zu einem groben Pulver zerkleinertes, getrocknetes Drogenmaterial wird 4 Tage lang nacheinander mit 6 1 Dichlormethan, Ethylacetat und Methanol bei Raumtemperatur unter nochmaligem Rühren und kurzem Schütteinextrahiert. Die einzelnen Extrakte werden verworfen.
• Das von der letzten Extraktion mit Methanol noch feuchte Drogenmaterial wird von Lösungsmittelresten durch einfaches Trocknen bei Raumtemperatur befreit. Nach Zugabe von 5 1 einer 0.5 M wäßrigen kalten Natronlauqe wird die Suspension 24 Stunden bei 40 C stehengelassen. Anschliessend wird durch Zellstoffpapier filtriert und der Drogenrückstand nochmals mit der gleichen Menge 0.5 M Matronlauge gewaschen.
• Zu den gesammelten Filtraten (ca. 10 1) wird langsam unter Rühren die dreifache Menge 95 %iges Ethanol gegeben und das Ganze wieder 24 Stunden bei 40 C stehengelassen. Nach dieser Zeit wird der Niederschlag abzentrifugiert (15 000 U/Min.,=20 Min.). Der überstand wird verworfen.
• Der abzentrifugierte Niederschlag wird in 6 1 kaltem destiLiertem Wasser aufgenommen. Zu dieser Lösung gibt man unter Eiskühlung und Rühren die'gleiche Menge einer 5 %igen Trichloressigsäure-Lösung. Man läßt das Ganze 1 Stunde bei 40 C im Eisbad stehen und zentrifugiert anschließend von dem gebildeten Niederschlag ab (12000 U/Min.
• t = 60 Min.). Der Niederschlag wird verworfen.
• Der Überstand wird unter Rühren mit der vierfachen Menge 95 %igen kalten Ethanols versetzt. Man läßt die Lösung 3 Tage bei 40 C stehen und zentrifugiert nach dieser Zeit erneut vom gebildeten Niederschlag ab (15 000 U/Min., t = 20 Min.). Der Uber5tand wird verworfen.
• Der Niederschlag wird in ca. 2 1 einer 2. %igen Natriumacetat-Lösung aufgenommen. Man filtriert von unlöslichen B»standteilen ab und gibt zu der Lösung unter Rühren die gleiche Menge kalten Ethanols p.a. Die lösung wird 48 Stunden bei 40 C stehengelassen und der Niederschlag (a) abzentrifugiert. Der überstand wird erneut mit dem nun halben Volumen an Ethanol p.a. versetzt. Nach 48 Stunden wird auch dieser Niederschlag (b) durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Uberstand wird verworfen.
• Die Niederschläge (a) und (b) werden in der eben zur Lösung notwendigen Menge destillierten Wassers aufgenommen und dann gefriergetrocknet. Man erhält aus (a) ein braunes und aus (b) ein gelblich weißes Pulver.
• Jede der beiden Fraktionen (a) und (b) wird in Mengen von jeweils 500 mg durch Ultrafiltration in die Molekulargewichtsbereiche 1) MG. < 1000 2) MG. 1000 - 5000 3) MG. 5000 - 50 000 aufyetrennt.
• Die Fraktion 3) (MG. = 5000 - 50 000) aus den Fraktionen (a) und (b) wird vereinigt und anschließend zur Reinigung über eine Biogel-P-2-Säule (Säule: ca. 20 cm Länge und 5 cm) filtriert. Für ca. 1 g Polysaccharid sind etwa 1 1 Wasser erforderlich. Als Eluans dient destilliertes Wasser.
• Nach Gefriertrocknung wird die gereinigte Substanz in Wasser aufgenommen und zur weiteren Anreicherung einer Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose Cl 6B-Såule unterworfen. Gradientenelution mit 0 bis 1 Mol NaCl-Lösung liefert bei einer Konzentration von 0.2-0.6 Mol NaCl die Hauptmenge an erfindungsgemäßem Polysaccharid. Die Ausbeute, bezogen auf die zur Ionenaustauschchromatographie verwendete Substanzmenge beträgt etwa 50 *.
• Die erhaltenen erfindungsgemäßen Polysaccharide weisen ein Molekulargewicht von 5000 bis 50 000 auf, sind praktisch frei von Stickstoff und enthalten im wesentlichen a) ein Tetraheteroglykan mit den Zuckern: Rhamnose, Arabinose, Xylose und Galactose im Molverhältnis 1 : 5 : 12 : 4 und b) ein Triheteroglykan mit den Zuckern: Rhamnose, Arabinose und Galactose im Molverhältnis 1 : 1 : 1.
• Ende der Beschreibung

Claims (4)

1. Patentansprüche 1Polysaccharide aus Pflanzen der Compositen-Familie, U d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie a) einen Molekulargewichtsbereich von 5000 bis 50 000 aufweisen, b) praktisch keinen Stickstoff enthalten, c) im wesentlichen Arabinogalaktane, Arabinoglukane und Arabinoxylane neben geringen Anteilen anderer Heteroglykane enthalten und d) bei der Ionenaustauscher-Chromatographie (DEAE-Sepharose Cl 6B-Säule) und Gradientenelution mit 0 - 1 Mol NaCl-Lösung bei einer Konzentration von 0.2 - 0.6 Mol NaCl-Lösung eluterbar sind.
2. 2. Polysaccharide aus Echinacea purpurea und angustifolia, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie a) einen Molekulargewichtsbereich von 5000 bis 50 000 besitzen, b) Stickstoff in Mengen von weniger als 0.01 Mol % aufweisen und im wesentlichen c) ein Tetraheteroglykan mit den Zuckern: Rhamnose, Arabinose, Xylose und Galactose im Molverhältnis 1 : 5 : 12 : 4 und ein Triheteroqlykan mit den Zuckern: Rhamnose, Arabinose und Galaktose im Molverhältnis 1 : 1 : 1 enthalten.
3. 3. Verfahren zur Gewinnung der Polysaccharide gemäß den Ansprüchen 1 und 2, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß man a) gepulvertes Pflanzenmaterial aus den oberirdischen Teilen von Pflanzen der Compositen-Familie nacheinander mit der 5- bis 6-fachen Menge Lösungsmittel wie Dichlormethan, äthylacetat und Methanol jeweils 4 Tage lang extrahiert und die Extrakte verwirft; b) den Drogenrückstand trocknet und mit der mehrfachen, vorzugsweise 5-fachen Menge einer kalten 0,5 Vol %igen wäßrigen NaOH-Lösung versetzt, diese über Nacht bei 4" C stehen läßt, nach Filtration das Filtrat mit der etwa dreifachen Volumenmenge Alkohol, vorzugsweise kalten 95 %igen Ethanols versetzt, das Ganze über Nacht bei 40 C sehen läßt, anschließend dekantiert oder zentrifugiert und den Uberstand verwirft; c) den Niederschlag in der zur Lösung notwendigen Menge kalten Wassers aufnimmt, etwa die gleiche Volumenmenge einer kalten 15 %igen wäßrigen Trichloressigsäure hinzugibt, das Ganze etwa 1 Std. unter Eiskühlung stehen läßt, 20 Min. bis 1 Std. bei 15 000 U/Min.

   zentrifugiert und den abzentrifugierten Anteil verwirft.

   d) den Uberstand mit der 4-fachen Menge an kaltem Ethanol versetzt, die Mischung über Nacht bei 40 C stehen läßt, anschließend dekantiert bzw. zentrifugiert und den Uberstand verwirft; e) den Niederschlag je nach Ausbeute mit 500-750 ml einer wäßrigen 2 %igen Natriumacetatlösung (bezogen auf 250g Ausgangsdroge) aufnimmt, filtriert und entweder mit der zweifachen Volumenmenge kalten Ethanols versetzt, über Nacht bei 40 C stehen läßt, de-.

   kantiert bzw. zentrifugiert, den UPerstand verwirft oder anstelle der zweifachen Volumenmenge Ethanol die Ausfällung mit einer niedrigeren Ethanolmenge beginnt, den Bestand anschließed nochmals mit der- einfachen Volumenmenge Ethanol und nach Abtrennung des Niederschlages die überstände mit der doppelten und schließlich mit der vierfachen Ethanolmenge versetzt; f> die erhaltenen vier Niederschläge mit dem Niederschlag der einmaligen Fällung in der zum Lösen notwendigen Menge Wasser aufnimmt, anschließend gefriertrocknet; g) die Substanz aus der einmaligen Fällung und die Substanzen der verschiedenen Fällungen getrennt durch Ultrafiltration mit geeigneten Folienmembranen in die Molekulargewichtsbereiche unterhalb 1000, 1000 - 5000 und 5000 bis 50 000 auftrennt und die Fraktionen des Molekulargewichtsbroreichs 5000 bis 50 000 vereinigt.
4. 4. Pharmazeutische Zubereitung, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß sie als Wirkstoff die Polysaccharide gemäß den Ansprüchen 1 und 2 gegebenenfalls neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen enthält.