JP2001037474A - 酵素液とその製造方法、酵素剤、蛋白質分解酵素剤、蛋白質分解酵素生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 工業的に好ましく利用される、高耐熱性と優
れた蛋白質低分子化能力とを併せ備える蛋白質分解酵素
を提供する。 【解決手段】 バチルス・ズブチリスＭ２−４株を培養
して取得される酵素液、これから酵素蛋白質を分離して
なる酵素剤、これらの酵素液や酵素剤を有効成分として
含む蛋白質分解酵素剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に得られた酵
素液とその製造方法、酵素液から得られる酵素剤、これ
らの酵素液あるいは酵素剤を有効成分として含む蛋白質
分解酵素剤、及び蛋白質分解酵素生産菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】各種の蛋白質をペプチドあるいはアミノ
酸に分解する技術は、例えば医療用の経腸栄養剤や食品
素材としての栄養補給剤の調製，大豆蛋白等に含まれる
難分解性蛋白質の分解効率を高めることによる食品利用
効率の向上，原料蛋白質からのアミノ酸調味料の製造，
ふくらみの増強されたパンの製造等、極めて多様な産業
分野において広範囲に利用されている。

【０００３】蛋白質を分解するに当たり、塩酸等を用い
る化学的分解方法は、効率が良いとは言え、分解条件が
過酷であるために好ましくない副産物を生成する懸念も
あり、特に食品，調味料や栄養素材等の人体に関連する
産業分野においては、蛋白質をマイルドな条件で分解で
きる酵素分解方法が好ましく利用されている（例えば特
公平７−５３１０６号公報，特開平１１−７５７６５号
公報等）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで従来、このよ
うな目的で工業的に利用する蛋白質分解酵素は、主とし
て各種の細菌やカビを利用して生産しているが、一般的
に、細菌から取得された蛋白質分解酵素とカビから取得
された蛋白質分解酵素とは互いに一長一短があると言わ
れており、工業的に利用する蛋白質分解酵素として充分
に満足できる活性や安定性を備えた蛋白質分解酵素は必
ずしも得られていない。

【０００５】即ち、細菌由来の蛋白質分解酵素は通常、
耐熱性に優れるが、蛋白質をアミノ酸にまで分解するペ
プチダーゼ活性もしくは蛋白質低分子化能力が低い点が
指摘されている。従って、その分解生成物には高分子量
のペプチドが多く含まれることとなり、食品素材や調味
料等として苦味が強かったり、栄養素材としては腸から
の吸収速度が遅い等と言う不具合がある。又、細菌由来
の蛋白質分解酵素が耐熱性に優れるとは言え、例えば６
０°Ｃ程度の高温度域でペプチダーゼ活性を維持する高
耐熱性のものは殆ど報告されていない。

【０００６】一方、カビ由来の蛋白質分解酵素は通常、
ペプチダーゼ活性，ペプチド結合に対する分解特異性の
広さ，蛋白質の低分子化能力等の面で優れているが、耐
熱性（例えば、５０°Ｃもしくはそれ以上の中〜高温度
域での蛋白質分解能力）が劣るために、比較的低温度域
で蛋白質分解工程を行うことを余儀無くされて、雑菌の
繁殖を許し易かった。

【０００７】このように、従来、中〜高温度以上の温度
域で失活しない熱安定性と、優れた蛋白質低分子化能力
とを併せ持つ蛋白質分解酵素が提供されていなかった。

【０００８】更に、蛋白質原料として有力な大豆等には
難分解性蛋白質が含まれており、これを有効に分解する
ためには蛋白質のペプチド結合に対する分解特異性の広
さがキー・ポイントになると考えられるが、上記のよう
な熱安定性と優れた蛋白質低分子化能力とを備えたもと
で、かかる難分解性蛋白質に対して有効な分解能力を示
すものが提供されていなかった。

【０００９】そこで本発明は、中〜高温度以上の温度域
での熱安定性と優れた蛋白質低分子化能力とを併せ持
ち、更に好ましくは難分解性蛋白質を有効に分解するこ
とができる酵素的な蛋白質分解手段を提供することを、
解決すべき課題とする。

【００１０】本願発明者は、モンゴル地方の伝統食品で
ある「饅頭（マントウ）」の生地より分離したバチルス
属の細菌を培養して得られる酵素液が、このような酵素
活性を示すことを見出し、本願発明を完成した。

【００１１】

【課題を解決するための手段】（第１発明の構成）上記
課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の
発明）の構成は、バチルス属の細菌を培養して得られる
蛋白質分解活性を示す酵素液であって、ｐＨ７における
６０〜６５°Ｃでの１時間の熱処理に対して実質的に１
００％の残存活性を示す高耐熱性ペプチダーゼ活性を備
える、酵素液である。

【００１２】（第２発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、
前記第１発明に係る酵素液が、更にプロテアーゼ活性と
コラゲナーゼ活性とを併せ備えることである。

【００１３】（第３発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、
前記第１発明又は第２発明に係る酵素液が、下記１）〜
４）の少なくとも一の特性を示すことである。

【００１４】１）蛋白質のペプチド鎖における少なくと
も１０種類以上のアミノ酸の結合部位を切断するペプチ
ド分解部位特異性を示す。

【００１５】２）酸カゼイン１ｇ当たりプロテアーゼ活
性で２００単位の前記酵素液を添加して１７時間の分解
を行うことにより、分子量１０００以下のペプチド又は
アミノ酸を前記酸カゼインに対して５０重量％以上生成
すると言う蛋白質低分子化能力を示す。

【００１６】３）上記２）の蛋白質低分子化能力が、４
５°Ｃ及び６０°Ｃの温度条件での分解において同等に
発現される。

【００１７】４）大豆の難分解性蛋白質に対して、所定
の作用条件において５０％以上の可溶化率を示す。

【００１８】（第４発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、
前記第１発明〜第３発明に係る酵素液が、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７１５５号として国際寄託されているバチルス・ズ
ブチリス（ Bacillus subtilis）Ｍ２−４株を培養して
得られるものであることである。

【００１９】（第５発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、
バチルス属の細菌を培養し、培養物から第１発明〜第４
発明のいずれかに係る酵素液を取得する、酵素液の製造
方法である。

【００２０】（第６発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、
第５発明に係る酵素液の製造方法により得られた酵素液
から酵素蛋白質を分離して得られる、酵素剤である。

【００２１】（第７発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第７発明（請求項７に記載の発明）の構成は、
第１発明〜第４発明のいずれかに係る酵素液あるいは第
６発明に係る酵素剤を有効成分として含み、難分解性蛋
白質の分解，アミノ酸調味料の製造，パンの製造，食肉
の軟化，ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白質の製
造，チーズの製造のいずれかの用途に用いる、蛋白質分
解酵素剤である。

【００２２】（第８発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第８発明（請求項８に記載の発明）の構成は、
バチルス・ズブチリスＭ２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７
１５５）である、蛋白質分解酵素生産菌である。

【００２３】

【発明の作用・効果】（第１発明の作用・効果）第１発
明の酵素液を用いることにより、雑菌の繁殖を許さない
温度条件、例えば５０°Ｃ以上、もしくは６０〜６５°
Ｃに至る中〜高温度域で蛋白質分解工程を行うことが可
能となり、しかもペプチダーゼ活性によって充分な蛋白
質低分子化能力を期待することができる。

【００２４】（第２発明の作用・効果）第２発明の酵素
液は、上記高耐熱性のペプチダーゼ活性に加えてプロテ
アーゼ活性を併せ備えるため、更に優れた蛋白質低分子
化能力と、プロテアーゼ活性の一般的な特徴である反応
初速度の早さとを期待することができ、蛋白質分解反応
の高速度化を図ることができる。

【００２５】更に第２発明の酵素液はコラゲナーゼ活性
を併せ備えるので、例えば食肉を軟化させる際、ペプチ
ダーゼ活性やプロテアーゼ活性による肉質の軟化と結合
組織のコラーゲンの分解とが同時に進行し、食味の良い
肉とすることができる。

【００２６】（第３発明の作用・効果）従来の蛋白質分
解酵素において、そのペプチド結合分解活性は、通常は
５，６種類以下、多くとも１０種類未満のアミノ酸の結
合部位に対して示される程度である。しかしながら、第
３発明の酵素液は、前記１）の特性として述べたよう
に、少なくとも１０種類以上（例えば、１２種類）のア
ミノ酸の結合部位を切断するペプチド分解部位特異性を
示すので、非常に優れた蛋白質低分子化能力が担保され
る。又、恐らくはこの広範囲なペプチド分解部位特異性
のために、従来の蛋白質分解酵素によっては分解するこ
とが困難とされて来た大豆等の難分解性蛋白質に対し
て、４）の特性として述べるような有効な分解活性が発
現される。

【００２７】第３発明の酵素液は、前記２）の特性とし
て述べたように、蛋白質原料から分子量１０００以下の
ペプチド又はアミノ酸を非常に効率良く生成することが
できるので、苦味のない高品質なアミノ酸素材やアミノ
酸調味料を調製することができ、又、消化管からの吸収
性の良好な栄養素材を調製することができる。

【００２８】又、前記３）の特性として述べたように、
上記の蛋白質低分子化能力が６０°Ｃでの分解において
４５°Ｃでの分解の場合と同等に発現されるので、蛋白
質低分子化工程を雑菌の繁殖を許さない温度条件で行う
ことができる。

【００２９】更に第３発明の酵素液は、前記４）の特性
として述べたように、大豆の難分解性蛋白質に対して、
所定の作用条件において５０％以上の可溶化率を示すの
で、蛋白質原料として有力である大豆を、その難分解性
蛋白質も含めて、有効にアミノ酸に分解することができ
る。

【００３０】なお、後述のように、第１発明〜第３発明
の酵素液については、カラムクロマトグラフィによって
分子量の異なる複数種類の蛋白質分画を得ると共に、こ
れらの各分画に係る蛋白質を個別に分離して酵素活性試
験に供することにより、酵素液中にアミノペプチダー
ゼ，中性プロテアーゼ，酸性プロテアーゼ及びコラゲナ
ーゼが含まれることを確認している。従って、第１発明
又は第２発明の酵素液に係る高耐熱性ペプチダーゼ活
性，プロテアーゼ活性及びコラゲナーゼ活性や、第３発
明の酵素液に係る前記１）〜４）の特性が、これらの酵
素の作用に基づくものであることは確実である。但し、
前記１）〜４）の個々の特性に対する各酵素の関与の種
類及び度合いについては、常識的に推定可能な事項を除
き、未だ実験的に確認していない。

【００３１】（第４発明及び第５発明の作用・効果）第
１発明〜第３発明の酵素液は、「ＦＥＲＭ ＢＰ−７１
５５号」として既に国際寄託しているバチルス・ズブチ
リスＭ２−４株を培養することにより、その培養液とし
て、あるいは該培養液の除菌液もしくはその濃縮液とし
て、確実に取得することができる。

【００３２】（第６発明の作用・効果）第５発明の製造
方法により取得した酵素液より、硫酸アンミニウム（硫
安）塩析等の公知の適宜な方法で蛋白質を分離して、粗
酵素粉末や、その緩衝液溶液等の剤型の酵素剤を得るこ
とができる。これらの酵素剤は前記酵素液と同様の酵素
活性及び特性を示す。

【００３３】（第７発明の作用・効果）第１発明〜第４
発明に係る酵素液や、第６発明に係る酵素剤を用いて、
従来にない高耐熱ペプチダーゼ活性，優れた蛋白質低分
子化能力，コラゲナーゼ活性等を示す蛋白質分解酵素剤
を提供することができる。この蛋白質分解酵素剤は、難
分解性蛋白質の分解，アミノ酸調味料の製造，パンの製
造，食肉の軟化，ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白
質の製造又はチーズの製造と言う用途に特に有効に利用
することができる。なお、パンの製造に用いた際には、
体積増加（ふくらみの増強）と言う効果を得ることがで
きる。

【００３４】（第８発明の作用・効果）第８発明によっ
て、上記各種の酵素液，酵素剤及び蛋白質分解酵素剤の
有効な製造手段が提供される。

【００３５】

【発明の実施の形態】次に、第１発明〜第８発明の実施
の形態を説明する。以下において単に「本発明」と言う
時は、第１発明〜第８発明を一括して指している。

【００３６】〔蛋白質分解酵素生産菌〕本発明に係る蛋
白質分解活性を有する酵素液の生産に用いる微生物は、
バチルス属に属し、より好ましくはズブチリス種の細菌
であって、その最も代表的なものがバチルス・ズブチリ
スＭ２−４株である。

【００３７】バチルス・ズブチリスＭ２−４株は、モン
ゴル地方の伝統的な小麦粉自然発酵食品である饅頭（マ
ントウ）の生地より分離された複数種類の蛋白質分解酵
素生産菌の内、特に実用的に優れたものであって、同定
試験の結果、末尾の表１の成育状態（栄研社製普通寒天
培地による３０°Ｃ、４８時間培養時のコロニー）を示
すこと、末尾の表２の菌学的形態が観察されること、及
び、末尾の表３の生理的性質を示すことから、バチルス
・ズブチリス（ Bacillus subtilis）と同定し、「バチ
ルス・ズブチリスＭ２−４株」と命名したものである。
本菌株は生命研菌寄 Ｐ−１７３８８号として平成１１
年５月１２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（特
許微生物寄託センター）に寄託され、平成１２年５月１
１日にＦＥＲＭ ＢＰ−７１５５号としてブダペスト条
約に基づく国際寄託に移管されている。

【００３８】〔酵素液〕第１発明〜第４発明の酵素液
は、バチルス属の所定の細菌、例えば上記バチルス・ズ
ブチリスＭ２−４株を培養することにより取得すること
ができる。そのための培養条件には特段の限定はなく、
通常の栄養培地を用いて通常の条件で培養しても良く、
必要に応じて特殊な培地や特殊な培養条件を採用しても
良い。

【００３９】酵素液としては、液体培地を用いて培養し
た場合における培地を、そのまま除菌することなく使用
することもできるし、濾過や遠心分離等の手段により菌
体を除菌したり固形物の排除した後の酵素液を使用する
こともでき、更にはこれを、限外濾過膜等を利用したマ
イルドな手段で濃縮した酵素液として使用することもで
きる。

【００４０】〔酵素液の酵素活性〕第１発明〜第４発明
の酵素液は、ペプチダーゼ活性、より具体的にはアミノ
ペプチダーゼ活性を示し、かつ、ｐＨ７における６０〜
６５°Ｃでの１時間の熱処理に対して実質的に１００％
の残存活性を示すと言う高耐熱性を備えている。

【００４１】第２発明〜第４発明の酵素液は、上記アミ
ノペプチダーゼ活性に加え、プロテアーゼ活性とコラゲ
ナーゼ活性とを併せ備え、かつ、前記プロテアーゼ活性
には好適ｐＨを中性域に持つ中性プロテアーゼ活性と、
好適ｐＨをアルカリ性域に持つアルカリ性プロテアーゼ
活性とが認められる。これらの活性については、現在の
処、必ずしも高耐熱性は確認されていない。

【００４２】〔酵素液の特性〕第３発明又は第４発明の
酵素液は、１）非常に広範囲なペプチド分解部位特異性
と、２）優れた蛋白質低分子化能力と、３）難分解性蛋
白質に対する有効な分解活性とを示す。なお、コラーゲ
ンに対する分解活性も認められる。

【００４３】上記１）の広範囲なペプチド分解部位特異
性に関しては、１０種類以上、より好ましくは１２種類
のアミノ酸の結合部位をカルボキシル末端において切断
するペプチド分解部位特異性が認められる。このような
アミノ酸として、具体的にはロイシン，イソロイシン，
フェニルアラニン，リシン，バリン，アラニン，スレオ
ニン，グリシン，セリン，グルタミン，アスパラギン，
アルギニンが挙げられる。

【００４４】上記２）の蛋白質低分子化能力に関して
は、従来の蛋白質分解酵素に比較して、同一量の蛋白質
原料に対して同一条件で同一の酵素活性単位量を作用さ
せた時、分子量１０００以下のペプチド又はアミノ酸の
生成量が著しく多いことと、そのような蛋白質低分子化
能力が比較的中温度域に近い４５°Ｃの温度条件でも、
かなりの高温度域である６０°Ｃの温度条件でも同等に
発現されることとが、非常に特徴的である。

【００４５】上記３）の難分解性蛋白質分解活性に関し
ては、既に大豆の難分解性蛋白質に対して高い可溶化率
を示すことが確認されているが、例えば食肉の結合組織
等の他種の難分解性蛋白質に対しても高い分解活性を示
すことが期待できる。この特性には、上記の広範囲なペ
プチド分解部位特異性、とりわけ、従来の蛋白質分解酵
素において余り見られないグリシン，バリン，アスパラ
ギン等のアミノ酸の結合部位に対する分解部位特異性が
関与している可能性がある。

【００４６】〔酵素剤〕酵素剤は、上記酵素液から適宜
な手段により酵素蛋白質を分離することで調製され、酵
素液に比較して高品位化できる点で有利である。酵素蛋
白質の分離手段は限定されないが、硫安等を用いた塩析
や、エタノールによる沈澱等の適宜な手段を任意に採用
することができる。酵素剤は、酵素粉末，その緩衝液等
の溶液等の任意の剤型とすることができる。

【００４７】〔蛋白質分解酵素剤〕蛋白質分解酵素剤と
は、上記の酵素液あるいは酵素剤を有効成分として含
み、各種の具体的な用途、例えば難分解性蛋白質の分
解，アミノ酸調味料の製造，パンの製造，食肉の軟化，
ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白質の製造，チーズ
の製造等に用いるものを言う。

【００４８】

【実施例】〔実施例１：酵素液の調製と内容分析〕１％
のグルコース，１％のペプトン，０．３％のゼラチン，
０．１％の酵母エキス，０．７％のリン酸２カリウム，
０．１％のリン酸１カリウム，０．０５％のクエン酸及
び０．０１％の硫酸マグネシウムから組成される培地
を、５００ｍＬ（ミリリッター）容の坂口フラスコに１
００ｍＬ入れて、１２０°Ｃで２０分間殺菌した後、こ
の培地にバチルス・ズブチリスＭ２−４株を接種し、３
０°Ｃで４０時間の振盪培養を行った。振盪培養の後、
フラスコの培養液を遠心分離して除菌を行い、粗酵素液
を得た。

【００４９】この粗酵素液について、「ＤＥＡＥセファ
ロースＣＬ６Ｂ」のカラムクロマトグラフィを行ったと
ころ、図２に示すように、蛋白質を示す分子量の抽出フ
ラクションにＡ〜Ｈの複数のピークが認められた。

【００５０】そこで、これらの各ピークに相当するフラ
クションを個別に回収して各種の酵素活性試験に供した
ところ、ピークＢの回収液にはコラゲナーゼが、ピーク
Ｃ及びピークＤの回収液にはアルカリ性プロテアーゼ
が、ピークＥ及びピークＦの回収液にはアミノペプチダ
ーゼが、ピークＧ及びピークＨの回収液には中性プロテ
アーゼが、それぞれ含まれることを確認した。上記の酵
素活性は、それぞれ次の方法によって測定した。

【００５１】プロテアーゼ活性：１ｍＬの０．７５％の
ミルクカゼイン溶液（ｐＨ７．０）に１ｍＬのフラクシ
ョン回収液を加え、３７°Ｃで６０分間の反応を行った
後に２ｍＬの０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液を添加して酵
素反応を停止させる。この溶液を３７°Ｃで２５分間静
置した後に濾紙で濾過する。別に調製した５ｍＬの０．
４Ｍ炭酸ナトリウム溶液に、上記した濾液を１ｍＬ添加
した後に更に１ｍＬのフォーリン試液（和光純薬製）を
加えて、３７°Ｃで２０分間静置する。この液について
６６０ｎｍでの吸光度を測定する。盲験として、上記操
作法において、２ｍＬの０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液の
添加後に１ｍＬのフラクション回収液を加える順序で反
応を行う。なお、上記反応条件下での濾液中に０．１ｍ
ｇのチロシン相当量のアミノ酸を生成させる活性を１単
位とする。

【００５２】コラゲナーゼ活性：０．４ｍＬの２．５％
のコラーゲン溶液（ｐＨ７．５）に０．１ｍＬのフラク
ション回収液を加え、３０°Ｃで３０分間の反応を行っ
た後に０．５ｍＬの０．１Ｍ酢酸溶液を添加する。この
溶液を遠心分離して上清を取得する。この上清液０．１
ｍＬに０．９ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ５）、０．１
ｍＬの塩化スズ溶液及び２ｍＬのニンヒドリン溶液を添
加して沸騰水中で２０分間加熱する。その後、水を添加
して１０ｍＬとし、５７０ｎｍでの吸光度を測定する。
盲験として、沸騰水中で５分間加熱処理をしたフラクシ
ョン回収液を使用して、同一の測定操作を行う。なお、
上記反応条件下での１分間に１マイクロモルのチロシン
相当量のアミノ酸を生成させる活性を１単位とする。

【００５３】アミノペプチダーゼ活性：０．８ｍＬのロ
イシン−ｐ−ニトロアニリド溶液（０．０７２％）に
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、０．２ｍ
Ｌのフラクション回収液を添加後、３７°Ｃで６０分間
の反応を行う。その後に２ｍＬの０．７％塩酸／エタノ
ール溶液を添加し、次いで２ｍＬの０．０６％ｐ−ジメ
チルアミノ・ケイ皮アルデヒド溶液を加え、１０分後に
５４０ｎｍでの吸光度を測定する。盲験として、沸騰水
中で５分間加熱処理をしたフラクション回収液を使用し
て、同一の測定操作を行う。なお、上記反応条件下での
１分間に１マイクロモルのロイシンを生成させる活性を
１単位とする。

【００５４】又、上記各ピークに相当する回収液の内、
ピークＥ及びピークＦの回収液については、分画分子量
３０００のＵＦ膜（アミコン社製のミニタンプレート）
を用いて濃縮を行い、アミノペプチダーゼの熱安定性を
評価した。その結果、図３に示すように、ｐＨ７におけ
る４０〜６５°Ｃの各温度域での１時間の熱処理に対し
て、いずれもほぼ１００％の残存活性を示すと言う高耐
熱性を確認した。

【００５５】〔実施例２：濃縮酵素液の調製〕実施例１
と同じ組成の培地を各１００ｍＬ入れた２０本の坂口フ
ラスコに、それぞれバチルス・ズブチリスＭ２−４株を
接種して、実施例１と同じ条件で振盪培養し、次いで遠
心分離により除菌して粗酵素液を得た後、これらの粗酵
素液を一緒にした（合計量約１９００ｍＬ）。この粗酵
素液において、中性プロテアーゼ活性は１１．０ｕ／ｍ
Ｌ、アルカリ性プロテアーゼ活性は１２．１ｕ／ｍＬ、
コラゲナーゼ活性は４．４ｕ／ｍＬ、アミノペプチダー
ゼ活性は０．４８ｕ／ｍＬであった。

【００５６】次に、上記の粗酵素液約１９００ｍＬをア
ミコン社製のミニタンプレート（分画分子量３０００）
の膜を用いて濃縮し、濃縮酵素液約９０ｍＬを得た。こ
の濃縮酵素液において、中性プロテアーゼ活性は１６６
ｕ／ｍＬ、アルカリ性プロテアーゼ活性は１８０ｕ／ｍ
Ｌ、コラゲナーゼ活性は６６．４ｕ／ｍＬ、アミノペプ
チダーゼ活性は５．９ｕ／ｍＬであった。

【００５７】〔実施例３：酵素剤の調製〕実施例１と同
じ組成の培地２０Ｌを用いて、３０Ｌ容のジャーファー
メンターにて、３０°Ｃ、回転数２５０ｒｐｍ、通気量
２０Ｌ／分の条件でバチルス・ズブチリスＭ２−４株を
４０時間培養した。

【００５８】培養後、遠心分離により１８Ｌの除菌液を
得て、これを旭化成（株）製のＵＦ膜（分画分子量１３
０００）で９００ｍＬに濃縮した。この濃縮液を硫安
０．８飽和で塩析を行い、生成した沈澱を凍結乾燥し
て、７５ｇの粗酵素粉末からなる酵素剤を得た。

【００５９】この酵素剤の酵素活性は、中性プロテアー
ゼ活性が１９９２ｕ／ｍＬ、アルカリ性プロテアーゼ活
性が２２００ｕ／ｍＬ、コラゲナーゼ活性が７９０ｕ／
ｍＬ、アミノペプチダーゼ活性が７１ｕ／ｍＬであっ
た。

【００６０】〔実施例４：蛋白質低分子化能力〕ｐＨ７
の１％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製した酵
素剤、及び、比較対照としてのバチルス・ズブチリス起
源の中性プロテアーゼである「プロテアーゼＮ」と、バ
チルス・ズブチリス起源のアルカリ性プロテアーゼであ
る「プロレザー」（いずれも天野製薬（株）製）を、酸
カゼイン１ｇ当たりｐＨ７のプロテアーゼ活性で２００
単位添加となるように添加し、４５°Ｃで１７時間分解
反応を行って、反応物の分子量分布を測定した。

【００６１】この測定はゲル濾過法で行い、 Amarciam
社製のＦＰＬＣシステムにより、分析カラムは Amarcia
m 社製の「スーパーロース１２」を用いた。又、分子量
の標準物質として、血清アルブミン（分子量６７００
０），キモトリプシノーゲン（分子量２５０００），チ
トクロームＣ（分子量１２３００），トリプシンインヒ
ビター（分子量６５００）及びバシトラシン（分子量１
４５０）を使用した。

【００６２】実施例に係る酵素剤についての測定結果を
図４（ａ）に、プロレザーについての測定結果を図４
（ｂ）に、プロテアーゼＮについての測定結果を図４
（ｃ）にそれぞれ示す。

【００６３】図４（ｂ）及び図４（ｃ）より明らかなよ
うに、プロレザー及びプロテアーゼＮによる分解ペプチ
ドには、分子量が１０００超〜１００００の高分子量ペ
プチドが多く、分子量１０００以下の低分子量ペプチド
が少なかった。そして、高分子量ペプチド（Ｘ）の低分
子量ペプチド（Ｙ）に対する量比Ｘ／Ｙは、いずれも約
４以上であった。

【００６４】一方、図４（ａ）より分かるように、実施
例に係る酵素剤による分解ペプチドでは、分子量１００
０以下の低分子量ペプチドが大半を占め、高分子量ペプ
チド（Ｘ）の低分子量ペプチド（Ｙ）に対する量比Ｘ／
Ｙは０．７以下であって、図４（ｂ）及び図４（ｃ）の
結果とは顕著な差異を示した。

【００６５】分子量１０００以下の低分子量ペプチド
は、消化管からの吸収速度が早く、医療用の経腸栄養剤
や食品素材たる栄養補給剤として有効であると言われて
おり、実施例に係る酵素剤を用いて得られたペプチド
は、このような目的に適う。

【００６６】〔実施例５：高温度域での蛋白質低分子化
能力〕ｐＨ７の１％酸カゼイン溶液に対して、実施例３
で調製した酵素剤と、比較対照としてのアスパーギルス
・オリゼー（ Aspergillus oryzae ）起源の中性プロテ
アーゼである「プロテアーゼＡ」（天野製薬（株）製）
とを、酸カゼイン１ｇ当たりｐＨ７のプロテアーゼ活性
で２００単位添加となるように添加し、４５°Ｃ及び６
０°Ｃでそれぞれ１７時間分解反応を行って、反応物の
分子量分布を測定した。測定法は実施例４と同様であ
る。

【００６７】実施例に係る酵素剤について、４５°Ｃに
おける分解の場合の測定結果を図５（ａ）に、同６０°
Ｃにおける分解の場合の測定結果を図５（ｂ）に、プロ
テアーゼＡについて、４５°Ｃにおける分解の場合の測
定結果を図５（ｃ）に、同６０°Ｃにおける分解の場合
の測定結果を図５（ｄ）に、それぞれ示す。

【００６８】プロテアーゼＡによる分解ペプチドには、
図５（ｃ）より明らかなように、４５°Ｃにおける分解
の場合にも実施例４と同様に高分子量ペプチドが多い傾
向が認められるが、図５（ｄ）に見られるように、６０
°Ｃにおける分解の場合にはこの傾向が一層顕著にな
り、高温度域におけるプロテアーゼＡのかなりの活性低
下が推測される。

【００６９】一方、図５（ａ）及び図５（ｂ）より分か
るように、実施例に係る酵素剤による分解ペプチドで
は、６０°Ｃにおける分解の場合にも、４５°Ｃにおけ
る分解の場合とほぼ同等に、分子量１０００以下の低分
子量ペプチドが大半を占めており、優れた低分子化能力
と同時に高耐熱性が裏付けられた。

【００７０】従って、実施例に係る酵素剤を用いて工業
的スケールでペプチドを製造する際、雑菌の繁殖による
微生物汚染を生じ得る５０°Ｃ以下での分解操作を回避
して、５５°Ｃ以上（例えば、６０°Ｃ）での工程管理
が可能となるため、大きな工業的利点が得られる。

【００７１】〔実施例６：難分解性蛋白質の分解〕市販
の分離大豆蛋白質である不二製油（株）製の「ニューフ
ジプロＲ」１００ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、前記
「プロレザー」及び「プロテアーゼＡ」各１ｇを添加し
て、５０°Ｃで１７時間の分解反応を行った。その後、
分解液を遠心分離して上記プロテアーゼ剤で分解できな
かった沈澱物を分離、乾燥して、水に不溶の２５ｇの難
分解性物質を取得した。

【００７２】この難分解性物質についてケルダール法で
蛋白質の定量を行った処、原料蛋白質に対して２０重量
％の蛋白質が含まれていた。上記乾燥した難分解性物質
５ｇを１００ｍＬの水に懸濁し、前記実施例１で得た粗
酵素液６ｍＬを添加して、５０°Ｃで１７時間の分解反
応を行った。

【００７３】又、比較対照として、上記と同様に調製し
た難分解性物質の懸濁液の各１００ｍＬに対して、それ
ぞれプロレザー０．１ｇを添加したものと、プロテアー
ゼＡ０．１ｇを添加したものとを準備し、上記と同条件
で分解反応を行った。

【００７４】これらの各例につき、分解反応終了後に遠
心分離を行って、上清液の蛋白量をケルダール法で定量
し、難分解性蛋白質の可溶化率を算出した。その結果、
プロレザーによる分解例では５％、プロテアーゼＡによ
る分解例では４％の可溶化率であったのに対し、実施例
に係る粗酵素液による分解例では、７０％の可溶化率で
あった。

【００７５】従って、実施例に係る粗酵素液を用いるこ
とにより、難分解性蛋白質を含む蛋白質原料を用いるペ
プチドもしくはアミノ酸の製造において、難分解性蛋白
質を有効に資化し、ペプチドの収率を向上させ、廃棄物
量を低減させることができると言う工業的メリットが得
られる。

【００７６】〔実施例７：ペプチド分解部位特異性〕ｐ
Ｈ７の１％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製し
た酵素剤と、比較対照としてのプロレザー及びプロテア
ーゼＮとを、適宜な同一単位量添加して分解反応を行
い、その後、各例の分解反応液に酵母カルボキシペプチ
ダーゼＹを添加して遊離アミノ酸を分析することによ
り、分解されたペプチドのカルボキシル末端を推定し
た。

【００７７】その結果、図１の該当欄において上向きの
矢印で示すように、プロテアーゼＮはロイシン，フェニ
ルアラニン及びスレオニンの３種のアミノ酸のカルボキ
シル側を切断し、プロレザーはロイシン，フェニルアラ
ニン，リシン，アラニン，セリン及びグルタミンの６種
のアミノ酸のカルボキシル側を切断するのに対して、実
施例に係る「Ｍ２−４」と表記する酵素剤は、ロイシ
ン，イソロイシン，フェニルアラニン，リシン，バリ
ン，アラニン，スレオニン，グリシン，セリン，グルタ
ミン，アスパラギン，アルギニンの１２種のアミノ酸の
カルボキシル側を切断すると言う、非常に広範囲にわた
るペプチド分解部位特異性を示す事が分かった。

【００７８】本発明の酵素液や酵素剤が発現する優れた
蛋白質低分子化能力や、難分解性蛋白質に対する分解力
には、上記の広範囲にわたるペプチド分解部位特異性が
関係しているものと考えられる。

【００７９】〔実施例８：アミノ酸調味料の製造〕ｐＨ
７の１０％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製し
た酵素剤と、比較対照としてのプロレザー及びプロテア
ーゼＡを、それぞれ酸カゼイン１ｇ当たりｐＨ７のプロ
テアーゼ活性で２００単位添加となるように添加し、５
５°Ｃでそれぞれ１７時間分解反応を行った後、遠心分
離した上清についてアミノ酸分析及び呈味の官能評価を
行った。

【００８０】プロレザーによる分解例では、上清液にお
ける遊離アミノ酸の生成量が１５％で、苦味があり、旨
味に欠けていた。プロテアーゼＡによる分解例では、上
清液における遊離アミノ酸の生成量が３６％であった
が、やや苦味があり、やはり旨味に欠けていた。一方、
実施例に係る酵素剤による分解例では、上清液における
遊離アミノ酸の生成量が４６％に達し、呈味性に優れて
いた。

【００８１】〔実施例９：中華饅頭の製造〕１００ｇの
強力粉と１００ｇの薄力粉に、１０ｇの砂糖及び１ｇの
食塩を添加混合し、これに３０°Ｃの温湯を１０５ｍＬ
添加して、良く混合した。この混合物に、実施例１で調
製した酵素液及び市販のパン酵母（オリエンタル酵母工
業（株）製）を４ｇ添加して、３０°Ｃで４時間の１次
発酵後に、２０ｇずつに分割・成形を行い、３０°Ｃで
４時間の２次発酵を行った。その後、沸騰湯浴上で６分
間蒸して、中華饅頭とした。

【００８２】対照として、上記混合物に上記市販のパン
酵母（オリエンタル酵母工業（株）製）のみを４ｇ添加
して、同様の方法にて中華饅頭を調製した。

【００８３】調製した実施例及び対照に係る中華饅頭の
体積を測定した処、実施例に係る酵素液添加の中華饅頭
は、対照に係る酵素液無添加の中華饅頭に比較して、約
１５％の体積増加が認められた。

【００８４】〔実施例１０：パンの製造〕１００ｇの小
麦粉、５０ｇの砂糖、２０ｇの食塩、４０ｇのショート
ニング及び３０ｇの市販パン酵母（オリエンタル酵母工
業（株）製）を混合し、それに水６９０ｍＬと実施例１
で調製した酵素液５０ｍＬを添加して、２７〜２９°Ｃ
で混合を行った。そして３０分間の１次発酵後に４５０
ｇに分割し、３０分間の２次発酵を行った。これを食パ
ンケースに入れ、２３０°Ｃで２５分間の焼成を行っ
た。

【００８５】対照として、上記酵素液無添加のものを、
上記と同様の方法で１次発酵，２次発酵及び焼成した。

【００８６】調製した実施例及び対照に係るパンの体積
を測定した処、実施例に係る酵素液添加のパンは、対照
に係る酵素液無添加のパンに比較して、約１０％の体積
増加が認められた。

【００８７】〔実施例１１：酵母エキスへの利用〕市販
の乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業製）１００ｇに
水を加えて１Ｌとした。これを２モルの塩酸溶液にてｐ
Ｈ７に調整した後、９０°Ｃで３０分間加熱を行った。
この溶液に溶菌酵素「ＹＬ−１５」（天野製薬製）を１
ｇ添加して、攪拌しつつ５０°Ｃで１６時間の反応を行
った。その後、９０°Ｃで２０分間加熱を行うことによ
り、酵母菌体を溶菌してエキスを抽出した。抽出液の遠
心分離を行い、上清液を凍結乾燥して７０ｇの酵母エキ
ス粉末を得た。本粉末中の蛋白質の含有量は３５％であ
った。

【００８８】得られた酵母エキス粉末７ｇを１００ｍＬ
の水に溶解すると共に２モルの塩酸溶液にてｐＨ７に調
整した溶液を用いて、本発明の酵素剤による遊離アミノ
酸の生成率を、前記プロテアーゼＮ「アマノ」を対照と
して比較した。上記酵母エキス溶液に所定単位の酵素剤
を添加した後、５０°Ｃで１７時間反応させ、９０°Ｃ
で２０分間加熱を行った。得られた酵素処理溶液につい
てアミノ酸分析を行い、遊離アミノ酸生成率を算出し
た。なお、酵素剤の添加量は酵母エキス粉末１ｇ当たり
のプロテアーゼ活性として表示した。

【００８９】本発明の酵素剤と対照酵素剤であるプロテ
アーゼＮ「アマノ」との比較結果を末尾の表４に示し
た。表４より明らかなように、本発明の酵素剤による処
理群は遊離アミノ酸の生成率が高く、かつ呈味性に優
れ、苦味がなく酵母エキスとして優れた特色を有してい
た。

【００９０】

【表１】

【００９１】

【表２】

【００９２】

【表３】

【００９３】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素のペプチド分解部位特異性を示す一覧図で
ある。

【図２】実施例に係るクロマトグラフ図である。

【図３】酵素の熱安定性を示すグラフ図である。

【図４】分解反応物の分子量分布を示すグラフ図であ
る。

【図５】分解反応物の分子量分布を示すグラフ図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｊ 3/34 Ａ２３Ｊ 3/34 Ａ２３Ｌ 1/227 Ａ２３Ｌ 1/227 Ｂ 1/28 1/28 Ａ 1/29 1/29 1/318 1/318 1/48 1/48 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 安藤 啓一 愛知県西春日井郡西春町大字九之坪字西城 屋敷51天野製薬株式会社中央研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス属の細菌を培養して得られる蛋
   白質分解活性を示す酵素液であって、ｐＨ７における６
   ０〜６５°Ｃでの１時間の熱処理に対して実質的に１０
   ０％の残存活性を示す高耐熱性ペプチダーゼ活性を備え
   ることを特徴とする酵素液。
2. 【請求項２】 前記酵素液が更にプロテアーゼ活性とコ
   ラゲナーゼ活性とを併せ備えることを特徴とする請求項
   １に記載の酵素液。
3. 【請求項３】 前記酵素液が、下記１）〜４）の少なく
   とも一の特性を示すことを特徴とする請求項１又は請求
   項２のいずれかに記載の酵素液。 １）蛋白質のペプチド鎖における少なくとも１０種類以
   上のアミノ酸の結合部位を切断するペプチド分解部位特
   異性を示す。 ２）酸カゼイン１ｇ当たりプロテアーゼ活性で２００単
   位の前記酵素液を添加して１７時間の分解を行うことに
   より、分子量１０００以下のペプチド又はアミノ酸を前
   記酸カゼインに対して５０重量％以上生成すると言う蛋
   白質低分子化能力を示す。 ３）上記２）の蛋白質低分子化能力が、４５°Ｃ及び６
   ０°Ｃの温度条件での分解において同等に発現される。 ４）大豆の難分解性蛋白質に対して、所定の作用条件に
   おいて５０％以上の可溶化率を示す。
4. 【請求項４】 前記酵素液がバチルス・ズブチリス（ B
   acillus subtilis）Ｍ２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１
   ５５）を培養して得られるものであることを特徴とする
   請求項１〜請求項３のいずれかに記載の酵素液。
5. 【請求項５】 バチルス属の細菌を培養し、培養物から
   請求項１〜請求項４のいずれかに記載の酵素液を取得す
   ることを特徴とする酵素液の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の酵素液の製造方法によ
   り得られた酵素液から酵素蛋白質を分離して得られるこ
   とを特徴とする酵素剤。
7. 【請求項７】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
   酵素液あるいは請求項６に記載の酵素剤を有効成分とし
   て含み、難分解性蛋白質の分解，アミノ酸調味料の製
   造，パンの製造，食肉の軟化，ペプチドの製造，低アレ
   ルゲン化蛋白質の製造，チーズの製造のいずれかの用途
   に用いることを特徴とする蛋白質分解酵素剤。
8. 【請求項８】 バチルス・ズブチリス Ｍ２−４株（Ｆ
   ＥＲＭ ＢＰ−７１５５）であることを特徴とする蛋白
   質分解酵素生産菌。