DE69813212T2 - Verfahren zur erzeugung von proteinhydrolysaten - Google Patents

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Description

  • Diese Anmeldung ist eine "Continuation-in-part" der anhängigen U.S.Anmeldung Nr. 08/857,886, eingereicht am 16. Mai 1997, und beansprucht die Priorität der dänischen Anmeldung Nr. 1465/97, eingereicht am 16. Dezember 1997, und der U.S."Provisional"-Anmeldung Nr. 60/062,893 und 60/069,719, jeweils eingereicht am 20. Oktober 1997 und 16. Dezember 1997, diese Anmeldungen werden hierin vollständig durch Hinweis aufgenommen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen eines Proteinhydrolysats, welches das Hinzufügen von einem oder mehreren Polypeptid/en mit Glycin-freisetzender Aktivität und einer oder mehreren zusätzlichen Proteasen zu einem proteinhaltigen Material umfasst, bei denen die Menge an hergestelltem Glycin größer ist als die Menge an Glycin, welches durch die eine oder mehreren zusätzlichen Proteasen allein unter den gleichen Bedingungen hergestellt wird.
  • Beschreibung des verwandten Standes der Technik
  • Verschiedene Nahrungsmittelprodukte, z. B. Suppen, Soßen und Gewürze, enthalten Geschmacksmittel, welche durch Hydrolyse von proteinhaltigen Materialien erhalten werden. Diese Hydrolyse wird üblicherweise erreicht durch ein Verwenden starker Salzsäure, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid.
  • Eine solche chemische Hydrolyse führt jedoch zu einer ernsten Degradierung der Aminosäuren, welche während der Hydrolyse erhalten werden, und ebenfalls zu gefährlichen Nebenprodukten, welche im Verlauf dieser chemischen Reaktion gebildet werden. Eine anwachsende Sorge über die Verwendung von Geschmacksmitteln, welche durch eine chemische Hydrolyse erhalten werden, hat zu der Entwicklung von enzymatischen Hydrolyseprozessen geführt.
  • Enzymatische Hydrolyseprozesse von proteinhaltigen Materialien helfen, einen hohen Hydrolysegrad (degree of hydrolysis, DH)) zu erhalten, und dies wird gewöhnlich durch ein Verwenden eines Komplexes von unspezifisch wirkenden proteolytischen Enzymen (d. h. unspezifisch wirkenden Endo- und Exopeptidasen) erreicht. Zum Beispiel beschreibt WO 94/25580 ein Verfahren von hydrolysierenden Proteinen durch die Verwendung einer unspezifisch wirkenden Enzymzubereitung, welche von Aspergillus oryzae erhalten wird. Spezifisch wirkende proteolytische Enzyme sind für diesen Zweck nicht verwendet worden, da solche Enzyme lediglich zu einem unzulänglichen Hydrolysegrad führen.
  • Polypeptide, welche eine Aminopeptidaseaktivität besitzen, katalysieren das Entfernen von einem oder mehreren Aminosäureresten von dem N-Terminus von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen. Solche Polypeptide sind unter der Enzymklassifizierungsnummer E. C. 3.4.11. der Internationalen Union der Biochemie und Molekularbiologie (International Union of Biochemistry und Molecular Biology) klassifiziert.
  • WO 96/28542 offenbart eine Aminopeptidase, welche ein Molekulargewicht von 35 kDa besitzt. JP-7-5034631 (Noda) offenbart eine Leucinaminopeptidase, welche von dem gelben Kojischimmel ("yellow koji mold"), welcher Aspergillus oryzae einschließt, erhalten wird. JP-7-4021798 (Zaidan Hojin Noda Sangyo) offenbart die Herstellung von "miso" durch ein Hinzufügen einer Leucinaminopeptidase II, welche durch ein Kultivieren einer Anzahl von Stämmen, einschließlich des Aspergillus oryzae Stammes 460 (ATCC 20386) und des Stammes IAM 2616 einschließt, zubereitet wurde. Der Aspergillus oryzae Stamm 460 ist dafür bekannt, eine Anzahl von Leucinaminopeptidasen herzustellen, von denen drei ein Molekulargewicht von 26,5, 56 und 61 kDa, durch Gelfiltration, besitzen (jeweils Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 757–765; Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 767–774; und Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 775–782). Penicillum citrium stellt eine intrazelluläre Leucinaminopeptidase mit einem Molekulargewicht von 65 kDa, durch SDS-PAGE, her (Kwon et al., 1996, Journal of Industrial Microbiology 17: 30–35).
  • WO 97/04108 (Roehm) offenbart eine DNA, welche eine Aspergillus sojae Leucinaminopeptidase kodiert. Chang und Smith (1989, Journal of Biological Chemistry 264: 6979–6983) offenbaren das molekulare Klonieren und Sequenzieren eines Gens, welches eine vakuoläre Aminopeptidase von Saccharomyces cerevisiae kodiert. Chang et al. (1992, Journal of Biological Chemistry 267: 8007-8011) offenbaren das molekulare Klonieren und Sequenzieren eines Gens, welches eine Methioninaminopeptidase von Saccharomyces cerevisiae kodiert.
  • Die Herstellung von Proteinhydrolysaten mit wünschenswerten organoleptischen Eigenschaften und einem hohen Hydrolysegrad erfordert im Allgemeinen die Verwendung einer Mischung von Peptidaseaktivitäten. Es würde wünschenswert sein, ein Einzelkomponentenpeptidaseenzym bereitzustellen, welches eine Aktivität besitzt, die zur Verbesserung der organoleptischen Eigenschaften und des Hydrolysegrads von Proteinhydrolysaten, welche in Nahrungsmittelprodukten entweder alleine oder in Kombination mit anderen Enzymen verwendet werden, verwendbar ist.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zum Herstellen von Proteinhydrolysaten mit wünschenswerten organoleptischen Qualitäten und/oder einemhohen Hydrolysegrad herzustellen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Proteinhydrolysats, welches das Hinzufügen von einer oder mehreren Aminopeptidase/n mit Glycin-freisetzender Aktivität, und einer oder mehreren zusätzlichen Proteasen zu einem proteinhaltigen Material umfasst, bei dem die Menge an hergestelltem Glycin größer ist als die Menge an Glycin, das durch die eine oder mehreren zusätzlichen Protease(n) allein unter denselben Bedingungen hergestellt wird.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt die Nukleinsäureseguenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Aspergillus oryzae ATCC 20386 Aminopeptidase (jeweils SEQ ID NO: 1 und 2) dar.
  • 2 stellt eine Restriktionskarte von pMWR3 dar.
  • 3 stellt eine Restriktionskarte von pEJGl9 dar.
  • 4 stellt eine Restriktionskarte von pDM181 dar.
  • 5 stellt eine Restriktionskarte von pEJG28 dar.
  • 6 stellt die Aktivität einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase gegen den pH, gemessen bei Raumtemperatur unter Verwenden einer 100 mg/ml Lösung Ala-pNA in DMSO, dar.
  • 7 stellt die Aktivität einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase gegen die Temperatur in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 dar.
  • 8 stellt die Aktivität einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase gegen die Temperatur in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5 dar.
  • 9 stellt den Effekt auf den DH dar, wenn ein Sphingomonas capsulata rohes Enzymextrakt und eine Sphingomonas capsulata Aminopeptidase jeweils zu einer geringen und einer hohen FlavourzymeTM-Hintergrunddosierung hinzugegeben wird.
  • 10 stellt den Effekt auf den DH dar, wenn ein Sphingomonas capsulata reines Enzymextrakt und eine Sphingomonas capsulata Aminopepti dase jeweils zu einer geringen und hohen FlavourzymeTM-Hintergrunddosierung hinzugegeben wird.
  • 11 stellt den DH dar, welcher durch verschiedene Kombination von FlavourzymeTM, Alcalase® und einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase erhalten wird.
  • 12 zeigt den DH, welcher durch verschiedene Kombinationen von FlavourzymeTM, Alcalase® und einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase erhalten wird.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats, welches das Hinzufügen von einem oder mehreren Polypeptid/en mit Glycin-freisetzender Aktivität und einer oder mehreren zusätzlichen Proteasen zu einem proteinhaltigen Material umfasst, bei dem die Menge an hergestellten Glycin größer ist als die Menge an Glycin, das durch die eine oder mehreren zusätzlichen Proteasen allein unter denselben Bedingungen hergestellt wird. Wegen der Aktivität des Glycin-freisetzenden Polypeptids sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Lage, Proteinhydrolysate herzustellen, welche einen höheren Hydrolysegrad oder den gleichen Hydrolysegrad bei Verwenden geringerer Enzymmengen besitzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge an hergestelltem Glycin zwischen 10–400%, bevorzugt 50–350%, bevorzugter 100–350%, noch mehr bevorzugt 150–350% und am meisten bevorzugt 200–350% der Glycinmenge, welche durch die eine oder mehreren zusätzliche(n) Protease(n) unter den gleichen Bedingungen hergestellt wird.
  • Die enzymatische(n) Behandlungen) können bei einer beliebigen geeigneten Temperatur, bei welcher die Enzyme nicht inaktiviert werden, stattfinden, bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 20°C bis ungefähr 70°C. In Übereinstimmung mit der etablierten Praxis können die Enzyme durch ein Erhöhen der Temperatur der Inkubationsmischung auf eine Temperatur, bei der Enzyme inaktiviert werden, z. B. oberhalb von ungefähr 70°C, oder durch ein Herabsetzen des pH der Inkubationsmischung auf einen Punkt, bei dem die Enzyme inaktiviert werden, z. B. unterhalb von 4,0, inaktiviert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Proteinhydrolysat her, welches einen Hydrolysegrad zwischen 35–90%, bevorzugt 45–80%, bevorzugter 50–75%, noch bevorzugter 55–75% und am meisten bevorzugt 60–70% besitzt.
  • Der Hydrolysegrad (DH) ist der Prozentsatz der Gesamtanzahl an Aminobindungen in einem Protein, das durch ein proteolytisches Enzym hydrolysiert worden ist. Der DH wird durch die folgende Formel definiert:
    Figure 00060001
  • Der DH kann berechnet werden gemäß Adler-Nissen; Enzymic Hydrolysis of Food Proteins; Elsvier Applied Science Publishers Ltd. (1986), S. 122.
  • Proteinhaltiges Material
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen das Behandeln eines proteinhaltigen Materials mit mindestens zwei Enzymen. Das proteinhaltige Material kann aus intakten Proteinen, vorhydrolysierten Proteinen (d. h. Peptiden) oder einer Mischung hiervon bestehen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das proteinhaltige Material ein Nahrungsmittel. Das proteinhaltige Material kann pflanzlicher oder tierischer Herkunft sein.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das proteinhaltige Material von tierischer Herkunft, bevorzugt Milchprotein, Molkeprotein, Kasein, Fleischprotein, Fischprotein, Blutprotein, Fiweißgelatine oder Lactoalbumin.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das proteinhaltige Material von pflanzlicher Herkunft, bevorzugt Sojaprotein, Getreidekornproteine, z. B. Weizengluten, Maisgluten ("corn gluten"), Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Zein, Lupine, Baumwollsamenprotein, Rapssamenprotein, Erdnuss, Alfalfaprotein, Erbsenprotein, Fabacaenbohnenprotein, Sesamsamenprotein oder Sonnenblume.
  • Polypeptide mit Glycin-freisetzender Aktivität
  • Eines der zu dem proteinhaltigen Material hinzugefügten Enzyme ist ein Polypeptid, welches Glycin-freisetzende Aktivität besitzt. Der Ausdruck "Glycinfreisetzende Aktivität" wird hierin definiert als eine Peptidaseaktivität, welche das Entfernen von Glycin von dem N-terminalen Ende von Peptiden, Oligopeptiden oder Proteinen katalysiert. Die Polypeptide können ebenfalls eine Peptidaseaktivität besitzen, welche in der Lage ist, eine oder mehrere Aminosäuren X von dem N-Terminus eines Peptids, Polypeptids oder Proteins zu spalten, wobei X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val, aber mindestens Leu, Glu, Gly, Ala und/oder Pro.
  • Das/die Polypeptid(e) kann/können dem proteinhaltigen Substrat in einer effektiven Menge hinzugefügt werden, welche herkömmlich in Proteinhydrolyseprozessen angewendet wird, bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 100.000 Aminopeptidaseeinheiten pro 100 g Protein und bevorzugter in dem Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10.000 Aminopeptidaseeinheiten pro 100 g Protein. Wie hierin definiert, ist eine Aminopeptidaseeinheit (aminopeptidase unit, APU) die Enzymmenge, welche benötigt wird, um 1 Mikromol p-Nitroanilid pro Minute von Leu-p-nitroanilid (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) unter den spezifizierten Bedingungen freizusetzen. Alternativ kann die Aminopeptidase in dem Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 500 LAPU/g Protein und bevorzugter in dem Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 50 LAPU/g Protein angewendet werden. LAPU wird definiert als die Leucinaminopeptidaseaktivität, welche bestimmt wird, wie in AF 298/1-GB beschrieben (erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S, Dänemark).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform spaltet das Polypeptid bevorzugt Glycin.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 50 Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat;
    • (b) einem Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, welche unter mittleren stringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, (ii) deren komplementärem Strang oder (iii) einer Untersequenz hiervon hybridisiert;
    • (c) eine allelische Variante von (a) oder (b); und
    • (d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), in welchem das Fragment Aminopeptidase-Aktivität hat; und
    • (e) einem Polypeptid mit Aminopeptidase-Aktivität, mit physiochemischen Eigenschaften von (i) einem pH-Optimum in dem Bereich von ca. pH 7,27 bis ca. pH 10,95, bestimmt bei Raumtemperatur in Gegenwart von Ala-paranitroanilid; (ii) einer Temperaturstabilität von 90% oder mehr, relativ zur Anfangsaktivität, bei pH 7,5, bestimmt nach Inkubation für 20 Minuten bei 60°C in der Abwesenheit eines Substrats; und (iii) einer Aktivität in Richtung auf Xaa-para-nitroanilid, in welchem Xaa ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Leu, Glu, Gly, Ala und Pro.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 50 Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 hat;
    • (b) einem Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, welche unter mittleren stringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 10, (ii) ihrem komplementären Strang oder (iii) einer Untersequenz hiervon hybridisiert;
    • (c) einer allelischen Variante von (a) oder (b); und
    • (d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), in welchem das Fragment Aminopeptidase-Aktivität hat; und
    • (e) einem Polypeptid, welches (a) Aminopeptidase-Aktivität in dem pH-Bereich zwischen pH 5,0–8,5, gemessen bei 37°C, hat, (b) einen isoelektrischen Punkt (pI) in dem Bereich von 7,4–8,5; (c) Aminopeptidase-Aktivität in dem Temperaturbereich von 20–55°C, gemessen bei pH 7,5 unter Verwendung von Gly-pNA in Tris-HCl-Puffer hat; (d) Ala-pNA, Gly-pNA, Leu-pNA, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA und Val-pNA hydrolysiert; (e) weder Phe-pNA noch Pro-pNA hydrolysiert; (f) durch PhenylEDTA,methansulfonylfluorid nicht inhibiert wird, durch Diisopropylfluorphosphat, p-Chlorquecksilberbenzoesäure und Jodessigsäure leicht inhibiert wird, durch o-Phenanthrolin vollständig inhibiert wird und/oder (g) von einem Stamm, zugehörig zu Sphingomonas erhalten wird und eine Molekularmasse von 67 ± 5 kDa hat.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine Aminosäureseguenz, die einen Identitätsgrad zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 11 von mindestens ca. 50%, bevorzugt mindestens ca. 60%, bevorzugt mindestens ca. 70%, besonders bevorzugt mindestens ca. 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens ca. 90%, am meisten bevorzugt mindestens ca. 95% und ganz besonders am meisten bevorzugt mindestens ca. 97% hat, welches Aminopepti dase-Aktivität hat (nachfolgend "homologe Polypeptide"). In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die homologen Peptide eine Aminosäuresequenz, die sich durch fünf Aminosäuren, bevorzugt durch vier Aminosäuren, bevorzugter durch drei Aminosäuren, noch bevorzugter durch zwei Aminosäuren und am meisten bevorzugt durch eine Aminosäure von der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder 11 unterscheidet. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Identitätsgrad zwischen zwei Aminosäuresequenz durch das Cluster-Verfahren bestimmt (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151–153) mit einer Identitätstabelle, einer Lückenstrafe ("gap penalty") von 10 und einer Lückenlängestrafe ("gap length penalty") von 10.
  • Bevorzugt umfassen die Polypeptide die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder 11 eine allelische Variante; und ein Fragment hiervon, wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität besitzt. In einer bevorzugteren Ausführungsform umfassen die Polypeptide die Aminosäureseguenz von SEQ ID NO: 2 oder 11. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptide die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 11 oder ein Fragment hiervon, wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität besitzt. Ein Fragment der SEQ ID NO: 2 ist ein Polypeptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäure(n) von dem Amino- und/oder Carboxy-Terminus dieser Aminosäuresequenz deletiert sind. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder 11.
  • Bevorzugt enthält ein Fragment mindestens 330 Aminosäurereste, bevorzugter mindestens 380 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 430 Aminosäurereste.
  • Eine allelische Variante bezeichnet eine beliebige der zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, welches den gleichen chromosomalen Ort besetzen. Eine allelische Variation wird natürlicherweise durch eine Mutation erreicht und kann in einem phänotypischen Polymorphismus innerhalb von Populationen re sultieren. Genmutationen können still sein (keine Veränderung in dem kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide kodieren, welche veränderte Aminosäuresequenzen besitzen. Der Ausdruck allelische Variante wird ebenfalls verwendet, um ein Protein zu bezeichnen, welches durch eine allelische Variante eines Gens kodiert wird.
  • Die Aminosäuresequenzen der homologen Polypeptide können sich von der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder 11 unterscheiden durch eine Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste und/oder der Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste durch verschiedene Aminosäurereste. Bevorzugt sind die Aminosäureveränderungen von geringerer Natur, welches konservative Aminosäuresubstitutionen, welche die Faltung und/oder Aktivität des Proteins nicht signifikant angreifen; kleine Deletionen, typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren, kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Verlängerungen, wie ein aminoterminaler Methioninrest; ein kleines Linker-Peptid von bis zu ungefähr 20–25 Resten; oder eine kleine Verlängerung, welche eine Aufreinigung erleichtert, durch ein Verändern der Nettoladung oder einer anderen Funktion, wie einem Poly-Histidinstrang, einem antigenen Epitop oder einer Bindedomäne, sind.
  • Beispiele von konservativen Substitutionen liegen vor innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin und Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin und Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäuresubstitutionen, welche nicht allgemein die spezifische Aktivität verändern, sind im Stand der Technik bekannt und beschrieben, zum Beispiel von H. Neurath und R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Die am häufigsten auftretenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly genauso wie diese in umgekehrter Weise.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid durch Nukleinsäuresequenzen kodiert, welche unter geringen Stringenzbedingungen, bevorzugter mittleren Stringenzbedingungen und am meisten bevorzugt hohen Stringenzbedingungen hybridisieren, mit einer Oligonukleotidprobe, welche unter den gleichen Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder 10 oder ihrem komplementären Strang hybridisiert (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatus, 1989, Molecular C1oning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York); oder allelischen Varianten und Fragmenten der Polypeptide, wobei die Fragmente Aminopeptidaseaktivität besitzen.
  • Eine Hybridisierung zeigt an, dass die Nukleinsäuresequenz mit der Oligonukleotidprobe hybridisier, entsprechend dem Polypeptid-kodierenden Teil der Nukleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder 10, unter geringen oder hohen Stringenzbedingungen (d. h. Vorhybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssamen-DNA und entweder 25, 35 oder 50% Formamid für jeweils geringe, mittlere und ohne Stringenzen), Standard Southern Blotting-Vorgehensweisen folgend.
  • Die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder 11 oder eine Teilsequenz hiervon kann verwendet werden, um eine Oligonukleotidprobe zu gestalten oder eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, wie die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder 10 oder eine Untersequenz hiervon, kann verwendet werden, um DNA zu identifizieren und zu klonieren, welche Polypeptide kodiert, welche eine Aminopeptidaseaktivität von Stämmen von verschiedenen Gattungen oder Arten besitzt, nach Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Insbesondere können solche Proben für eine Hybridisierung mit der genomischen oder cDNA der Gattung oder Art von Interesse verwendet werden, Standard Southern Blotting-Vorgehensweisen folgend, um die entsprechenden Gene hierin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Proben können beträchtlich kürzer als die vollständige Sequenz sein, sollten jedoch mindestens 15, bevorzugt mindestens 20 und bevorzugter mindestens 40 Nukleotide lang sein. Längere Proben können ebenfalls verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Proben können verwendet werden. Die Proben werden zum Detektieren des entsprechenden Gens typischerweise markiert (zum Beispiel mit 32P, 3H, 35S, Biotin oder Avidin).
  • So kann eine genomische, cDNA oder kombinatorische chemische Bibliothek zubereitet werden von solchen anderen Organismen, welche für eine DNA durchsucht werden kann, welche mit den oben beschriebenen Proben hybridisiert und welche ein Polypeptid kodiert, welches Aminopeptidaseaktivität besitzt. Die genomische oder andere DNA von solchen anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder anderen Auftrennungstechniken aufgetrennt werden. Die DNA aus den Bibliotheken oder die aufgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder andere geeignete Trägermaterialien transferiert und immobilisiert werden. Um einen Klon oder DNA zu identifizieren, welche homolog mit SEQ ID NO: 1 oder 10 ist, wird das Trägermaterial in einem Southern Blot verwendet, in welchem das Trägermaterial schließlich dreimal gewaschen wird für 30 Minuten, jedesmal 2 × SSC, 0,2% SDS verwendend, bevorzugt bei mindestens 50°C, bevorzugter bei mindestens 55°C, bevorzugter bei mindestens 60°C, bevorzugter bei mindestens 65°C, noch bevorzugter bei mindestens 70°C und am meisten bevorzugt bei mindestens 75°C. Moleküle, mit welchen die Oligonukleotidprobe unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwenden eines Röntgenstrahlenfilms detektiert.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzen die Polypeptide die folgenden physiochemischen Eigenschaften: (a) ein pH-Optimum in dem Bereich von ungefähr pH 7,27 bis ungefähr pH 10,95, bestimmt bei Raumtemperatur in der Gegenwart von Ala-para-nitroanilid; (ii) eine Temperaturstabilität von 90% oder mehr, relativ zu der Anfangsaktivität bei pH 7,5, bestimmt nach einer Inkubation für 20 Minuten bei 60°C in der Abwesenheit eines Substrats; und (iii) eine Aktivität in Richtung auf Xaa-para-nitroanilid, wobei Xaa ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Leu, G1u, Gly, Ala und Pro. Die Polypeptide besitzen ebenfalls die Fähigkeit, andere Substrate zu hydrolysieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das pH-Optimum in dem Bereich von ungefähr pH 7,27 bis ungefähr pH 10,95, bevorzugter in dem Bereich von ungefähr pH 8,03 bis ungefähr pH 10,95, und am meisten bevorzugt in dem Bereich von ungefähr pH 8,62 bis ungefähr pH 10,51, bestimmt nach einer Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur in der Gegenwart von Ala-Pro-para-nitroanilid.
  • In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine Molekularmasse von 67 ± 5 kDa, bevorzugter eine Molekularmasse von 67 ± 2 kDa, und wird von einem Stamm erhalten, der Sphingomonas angehört, bevorzugter Sphingomonas capsulata und am meisten bevorzugt Sphingomonas capsulata IFO 12533. Die Molekularmasse wird durch SDS-Polyacrylamindelektrophorese (SDS-PAGE) gemessen unter Verwenden eines 10–15%-igen Gradientengels in der Apparatur von FAST System von Pharmacia (Uppsala, Schweden). Die Molekularmasse des Enzyms wurde von der Regressionslinie der Molekulargewichtsmarker wie folgt bestimmt:
    Phosphorylase b (94 kDa)
    Albumin (67 kDA)
    Ovalbumin (43 kDa)
    Carboanhydrase (30 kDa)
    Trypsininhibitor (20,1 kDa)
    a-Lactalbumin (14,4 kDa)
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptid (a) eine Aminopeptidaseaktivität in dem pH-Bereich zwischen pH 5,0–8,5, gemessen bei 37°C, bevorzugter in dem pH-Bereich 6,5–8,0 und noch mehr bevorzugt besitzt es die höchste Aminopeptidaseaktivität in dem pH-Bereich 7,0–7,5, gemessen bei 37°C; (b) einen isoelektrischen Punkt (pI) in dem Bereich von 7,4–8,5; (c) eine Aminopeptidaseaktivität in dem Temperaturbereich von 20–55°C, gemessen bei pH 7,5 unter Verwenden von Gly-pNA in Tris-HCl-Puffer; (d) hydrolysiert AlapNA, Gly-pNA, Leu-pNA, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA und ValpNA; (e) hydrolysiert nicht Phe-pNA noch Pro-pNA; und/oder (f) wird nicht inhibiert durch Phenylmethansulfonylfluorid, leicht inhibiert durch EDTA, Diisopropylfluorphosphat, p-Chlormercuribenzoesäure und Jodessigsäure, vollständig inhibiert durch o-Phenanthrolin.
  • Der isoelektrische Punkt der Aminopeptidase ist variabel, da der pI des frisch zubereiteten Enzyms mit 8,4 eingeschätzt wird, unter Verwenden eines Aktivitätsfarbverfahrens ("activity staining method"), jedoch variiert der pI von 7,4–8,5 während des Verlaufs der Aufreinigung und/oder Aufbewahrung. Die Unbeständigkeit des pI kann durch den Selbstabbau der Aminopeptidase von ihrem Aminoterminalen Ende her begründet sein.
  • In einer bevorzugteren Ausführungsform wird das Polypeptid von einem Aspergillus oryzae Stamm erhalten und am meisten bevorzugt von Aspergillus oryzae ATCC 20386 oder einem Mutantenstamm hiervon, z. B. das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das Polypeptid von einem Sphingomonas capsulata Stamm, z. B. Sphingomonas capsulata ist IFO 12533, welches ein Bakterienstamm ist, der an dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan, aufgewahrt wird, z. B. das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11 (das vorhergesagte Signalpeptid besteht aus den ersten 32 Aminosäuren).
  • In einer anderen Ausführungsform besitzen die Polypeptide immunochemische Identität oder teilweise immunochenmische Identität mit dem Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder 11 besitzt. Die immunochemischen Eigenschaften werden durch immunologische Kreuzreaktionsidentitätstests mit der gut bekannten Ouchterlony-Doppelimmunodiffusionsvorgehensweise be stimmt. Spezifischerweise werden ein Antiserum-enthaltende Antikörper, welche immunoreaktiv sind oder an Epitope des Polypeptids binden, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder 11 besitzt, durch ein Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagetieren) zubereitet, gemäß der Vorgehensweise, beschrieben von Harboe und Ingild, In N. H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23 oder Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (spezieller Seiten 27–31). Ein Polypeptid, welches immunochemische Identität besitzt, ist ein Polypeptid, welches mit dem Antiserum in identischer Weise reagiert, wie eine Gesamtfusion der Präzipitate, eine identische Präzipitatmorphologie und/oder eine identische elektrophoretische Mobilität unter Verwenden einer spezifischen immunochemischen Technik. Eine weitere Erklärung immunologischer Identität wird beschrieben von Axelsen, Bock, and Krøll, In N. H. Axelsen, J. Krøll, und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 10. Ein Polypeptid, welches teilweise immunochemische Identität besitzt, ist ein Polypeptid, welches mit dem Antiserum in einer teilweise identischen Weise reagier, wie einer teilweisen Fusion der Präzipitate, einer teilweisen identischen Präzipitatmorphologie und/oder einer teilweise identischen elektrophoretischen Mobilität, unter Verwenden einer spezifischen immunochemischen Technik. Eine weitere Erklärung für eine teilweise immunochemische Identität wird beschrieben von Bock und Axelsen, In N. H. Axelsen, J. Krøll, und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 11.
  • Polypeptide, welche durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, welche mit einer Oligonukleotidprobe hybridisieren, welche mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder 10 hybridisiert, ihren komplementären Stränge oder allelischen Varianten und Untersequenzen von SEQ ID NO: 1 oder 10; allelischen Varianten und Fragmente der Polypeptide; oder die homologen Polypeptide und Polypeptide, welche identische oder teilweise identische immunologische Eigen schaften besitzen, können von Mikroorganismen einer beliebigen Gattung erhalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können diese Polypeptide von einer Bakterienquelle erhalten werden. Zum Beispiel können diese Polypeptide von einem grampositiven Bakterium erhalten werden, wie einem Bacillus Stamm, z. B., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus cirulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis; oder einem Streptomyces Stamm, z. B., Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus; oder von einem gramnegativen Bakterium, z. B., E. coli oder Pseudomonas sp..
  • Die Polypeptide können von einer Pilzquelle erhalten werden, und bevorzugter von einem Hefestamm, wie einem Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oder Yarrowia Stamm; oder einem filamentösen Pilzstamm, wie einem Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma Stamm.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polypeptide erhalten von einem Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharornyces oviformis Stamm.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Polypeptide erhalten von einem Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusurium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioi des, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Netcrospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride Stamm.
  • Die Polypeptide werden bevorzugt erhalten von Arten von Aspergillus, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae.
  • Es soll verstanden werden, dass für die vorerwähnten Arten die Erfindung sowohl den perfekten als auch den Imperfekten Zustand umfasst und andere taxonomische Äquivalente, z. B. Anamorphe, unabhängig von dem Artennamen, über den sie bekannt sind. Der Fachmann wird die Identität von passenden Äquivalenten leicht erkennen. Die Polypeptide können ebenfalls von Mikroorganismen erhalten werden, welche Synonyme von Aspergillus sind, wie definiert von Raper, K. D. und Fennel, D.I, 1965, The Genus Aspergillus, The Wilkins Company, Baltimore.
  • Aspergilli sind mitosporische Pilze, charakterisiert durch ein Aspergillum, welches umfasst wird von einem Konidiosporenstiel mit unbekannten teleomorphen Stadien, in einem Vesikel endend, welcher abwechselnd eine oder zwei Schichten synchron gebildeter spezialisierter Zellen trägt, auf welche verschieden als Sterigmata oder Phialides hingewiesen wird, und asexuell gebildete spezialisierte Zellen und asexuell gebildete Sporen, auf die als Conidien verwiesen wird. Bekannte Teleomorphe von Aspergillus schließen Eurotium, Neosartorya und Emericella ein. Stämme von Aspergillus und Teleomorphe hiervon sind der Öffentlichkeit leicht zugänglich in einer Anzahl von Kultursammlungen, wie der American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
  • Weiterhin können solche Polypeptide von anderen Quellen identifiziert und erhalten werden, einschließlich Mikroorganismen, welche aus der Natur isoliert werden (z. B. Erdboden, Kompost, Wasser, etc.) unter Verwenden der oben erwähnten Proben. Techniken zur Isolierung von Mikroorganismen aus natürlicher Umgebung sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann dann durch ähnliches Durchsuchen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek anderer Mikroorganismen abgeleitet werden. Wenn eine Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptide kodiert, einmal mit der/den Probe(n) detektiert worden ist, kann die Sequenz isoliert oder kloniert werden durch Verwenden von Techniken, welche dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, supra).
  • Für Zwecke der Erfindung wird der Ausdruck "erhalten von" hierin verwendet in Zusammenhang mit einer Quelle, dies soll bedeuten, dass das Polypeptid von der Quelle oder non einer Zelle, in welche ein Gen aus der Quelle inseriert worden ist, hergestellt wird.
  • Das/die Polypeptid(e) kann/können ein fusionierte(s) Polypeptid(e) oder spaltbares) Fusionspolypeptid(e) sein, bei denen ein anderes Polypeptid an dem N-Terminus oder dem C-Terminus des Polypeptids oder des Fragments hiervon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch eine Fusion einer Nukleinsäureseguenz (oder eines Teils hiervon), welche ein anderes Polypeptid kodiert, mit einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils hiervon) der vorliegenden Erfindung hergestellt. Techniken zum Herstellen von Fusionsproteinen sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein Ligieren der Kodierungssequenzen, welche die Polypeptide kodieren, ein, so dass sie im Rahmen sind und dass die Expression des fusionierten Polypeptids unter Kontrolle desselben/derselben Promotors/Promotoren und Terminators steht.
  • Zusätzliche Protease(n)
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das proteinhaltige Material ebenfalls mit einer oder mehreren zusätzlichen Protease(n) behandelt. Die zusätzliche(n) Protease(n) kann/können gleichzeitig mit dem/den Polypeptid(en) oder nacheinander hinzugefügt werden. Die zusätzliche(n) Protease(n) kann/können in einer effektiven Menge, welche herkömmlich in Proteinhydrolyseprozessen angewendet wird, zu dem proteinhaltigen Material hinzugefügt werden.
  • Die eine oder mehreren zusätzlichen Protease(n) können Endopeptidasen sein. Die Endopeptidase(n) kann können in einer effektiven Menge, welche herkömmlich in Proteinhydrolyseprozessen angewendet wird, zu dem proteinhaltigen Substrat hinzugefügt werden, bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 0,05 bis ungefähr 15 AU/100 g Protein und bevorzugter von ungefähr 0,1 bis 8 AU/100 g Protein. Eine AU (Anson Unit) wird definiert als die Enzymmenge, welche unter Standardbedingungen (d. h. 25°C, pH 7,5 und 10 Min. Reaktionszeit) Hämoglobin mit einer Anfangsrate ("initial rate") verdaut, so dass dort pro Minute eine Menge von TCA-löslichem Produkt freigesetzt wird, welches dieselbe Farbe mit einem Phenolreagens ergibt wie ein Milliäguivalent Tyrosin. Das analytische Verfahren AF 4/1 ist auf Anfrage erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark, welches hierdurch durch Verweis eingeschlossen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Endopeptidase eine Glutamylendopeptidase (EC 3.4.21.19); eine Lysylendopeptidase (EC 3.4.21.50); eine Leucylendopeptidase (EC 3.4.21.57); eine Glycylendopeptidase (EC 3.4.22.25); eine Prolylendopeptidase (EC 3.4.21.26); Trypsin (EC 3.4.21.4) oder eine Trypsinähnliche (Lysin/Arginin-spezifische) Endopeptidase; oder eine Peptidyl-Asp-Metalloendopeptidase (EC 3.4.24.33).
  • Die Glutamylendopeptidase (EC 3.4.21.19) kann bevorzugt von einem Bacillus Stamm erhalten werden, insbesondere Bacillus licheniformis und Bacillus subtilis, einem Staphylococcus Stamm, insbesondere Staphylococcus aureus, einem Streptomyces Stamm, insbesondere Streptomyces thermovulgaris und Streptomyces griseus, oder einem Actinomyces Stamm.
  • Die Lysylendopeptidase (EC 3.4.21.50) kann bevorzugt von einem Achromobacter Stamm erhalten werden, insbesondere Achromobacter lyticus, einem Lysobacter Stamm, insbesondere Lysobacter enzymogenes, oder einem Pseudomonas Stamm, insbesondere Pseudomonas aeruginosa.
  • Die Leucylendopeptidase (EC 3.4.21.57) kann von pflanzlicher Herkunft sein.
  • Die Glycylendopeptidase (EC 3.4.22.25) kann bevorzugt von der Papayapflanze (Carica papaya) erhalten werden.
  • Die Prolylendopeptidase (EC 3.4.21.26) kann bevorzugt von einem Flavobacterium Stamm erhalten werden oder sie kann von pflanzlicher Herkunft sein.
  • Die Trypsin-ähnliche Endopeptidase kann bevorzugt von einem Fusarium Stamm, insbesondere Fusarium oxysporum, z. B. wie in WO 89/06270 oderr WO 94/25583 beschrieben, erhalten werden.
  • Die Peptidyl-Asp-Metalloendopeptidase (EC 3.4.24.33) kann bevorzugt von einem Pseudomonas Stamm, insbesondere Pseudomonas fragi, erhalten werden.
  • Die Endopeptidase kann von einem Stamm von Bacillus, bevorzugt Bacillus amylollquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis, einem Stamm von Staphylococcus, bevorzugt Staphylococcus aureus, einem Stamm von Streptomyces, bevorzugt Streptomyces thermovularis oder Streptomyces griseus, einem Stamm von Actinomyces Arten, einem Stamm von Aspergillus, bevorzugt Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus sojae, oder einem Stamm von Fusarium, bevorzugt Fusarium venenatum.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das spezifisch wirkende proteolytische Enzym eine Exopeptidase, die von einem Ende des Peptides wirken kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Exopeptidase eine Aminopeptidase wie eine Leucylaminopeptidase (EC 3.4.11.1); eine Dipeptidaminopeptidase oder eine Tripeptidaminopeptidase (EC 3.4.11.4).
  • In einer anderen Ausführungsform ist die Exopeptidase eine Carboxypeptidase wie eine Prolincarboxypeptidase (EC 3.4.16.2); eine Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1); eine Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2); eine Carboxypeptidase C (EC 3.4.16.5); eine Carboxypeptidase D (EC 3.4.16.6); eine Lysin-(Arginin)carboxypeptidase (EC 3.4.17.3); eine Glycincarboxypeptidase (EC 3.4.17.4); eine Alanincarboxypeptidase (EC 3.4.17.6); eine Glutamatcarboxypeptidase (EC 3.4.17.11); eine Peptidyldipeptidase A (EC 3.4.15.1); oder eine Peptidyldipeptidase (EC 3.4.15.5).
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Protease eine Mehrzahl von Proteasen, welche unter dem Namen FLAVOURZYMETM verkauft wird, hergestellt von Novo Nordisk A/S, Dänemark. Die Proteaseformulierung enthält mindestens fünf Aspergillus oryzae-abgeleitete Proteasen und Peptidasen von verschiedenem Molekulargewicht.
  • Zusätzliche Enzyme
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das proteinhaltige Material mit einem oder mehreren zusätzlichem/n Enzym(en) behandelt. Das eine oder die mehreren zusätzliche(n) Enzym(e) kann/können eine Amylase, Carbohydrase, Cellulase, Esterase, alpha-Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Lipase, ein pektinolytisches Enzym, Peptidoglutaminase, Phytase, Transglutaminase oder Xylanase sein.
  • Das/die zusätzliche(n) Enzyme) kann/können erhalten werden von einem Mikroorganismus, welcher zu der Gattung Aspergillus, bevorzugt Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae, Trichoderma, Humiola, bevorzugt Humicola insolens oder Fusarium, bevorzugt Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides oder Fusarium venenatum gehört.
  • Proteinhydrolysate
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Proteinhydrolysate, welche durch Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Proteinhydrolysate, welche in freier Glutaminsäure und/oder Peptid-gebundenen Glutaminsäureresten angereichert ist. Solche Proteinhydrolysate können durch ein Unterwerfen des proteinhaltigen Materials einem Desamidationsprozess, entweder vor oder gleichzeitig mit der/den enzymatischen Behandlung(en), hergestellt werden.
  • Diese Proteinhydrolysate besitzen einen ausgezeichneten Geschmack wegen der Glutaminsäure (Glu), ob frei oder Peptid-gebunden, welche eine wichtige Rolle in dem Geschmack und der Schmackhaftigkeit von Proteinhydrolysaten spielt. Diese Proteinhydrolysate besitzen ebenfalls eine verbesserte Funktionalität, insbesonde re eine verbesserte Löslichkeit, verbesserte Emulgierungseigenschaften, einen erhöhten Hydrolysegrad und verbesserte Schaumbildungseigenschaften.
  • Der Desamidationsprozess, d. h. die Konversion von Amiden (Glutamin oder Asparagin) in geladene Säuren (Glutaminsäure oder Asparaginsäure), über die Freisetzung von Ammoniak kann als nicht-enzymatische oder nicht-enzymatischer oder enzymatischer Desamidationsprozess stattfinden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Desaminierung als ein enzymatischer Desaminierungsprozess durchgeführt, z. B. durch Unterwerfen des Substrates einer Transglutaminase und/oder Peptidoglutaminase.
  • Die Transglutaminase kann von einer beliebigen herkömmlichen Quelle sein, einschließlich Säugetiere, siehe z. B. JP 1050382 und JP 5023182 , einschließlich des aktivierten Faktors XIII, siehe z. B. WO 93/15234; solche von einem Fisch abgeleitete, siehe z. B. EP 555,649 ; und solche, welche von Mikroorganismen erhalten werden, siehe z. B. EP 379,606 , WO 96/06931 und WO 96/22366. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transglutaminase von einer Oomycete erhalten, einschließlich einem Stamm von Phytophthora, bevorzugt Phytophthora cactorum, oder einem Stamm von Pythium, bevorzugt Pythium irregulare, Pythium sp., Pythium intermedium, Pythium ultimum oder Pythium perulum (oder Pythium periplocum). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Transglutaminase von bakterieller Herkunft und wird erhalten von einem Stamm von Bacillus, bevorzugt Bacillus subtilis, einem Stamm von Streptoverticillium, bevorzugt Streptoverticillium mobaraensis, Streptoverticillium griseocarneum oder Streptoverticillium cinnamoneum und einem Stamm von Streptomyces, bevorzugt Streptomyces lydicus.
  • Die Peptidoglutaminase kann eine Peptidoglutaminase I (Peptidylglutaminase; EC 3.5.1.43), oder eine Peptidoglutaminase II (Protein-Glutaminglutaminase; EC 3.5.1.44) oder eine beliebige Mischung hiervon sein. Die Peptidoglutaminase kann erhalten werden von einem Stamm von Aspergillus, bevorzugt Aspergillus japonicus, einem Stamm von Bacillus, bevorzugt Bacillus circulans, einem Stamm von Cryptococcus, bevorzugt Cryptococcus albidus oder einem Stamm von Debaryomyces, bevorzugt Debaryomyces kloecheri.
  • Die Transglutaminase wird zu dem proteinhaltigen Material in einer effektiven Menge hinzugefügt, wie sie herkömmlich in Desamidationsprozessen angewendet wird, bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 0,01 bis ungefähr 5% (w/w) und bevorzugter in dem Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1% (w/w) der Enzympräparation, welches sich auf die Menge des Substrats bezieht.
  • Die Peptidoglutaminase wird dem proteinhaltigen Substrat in einer effektiven Menge beigefügt, wie sie herkömmlich in Desamidationsprozessen angewendet wird, bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100.000 PGase-Einheiten pro 100 g Substrat und bevorzugter in dem Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10.000 PGase-Einheiten pro 100 g Substrat.
  • Die Peptidoglutaminaseaktivität kann gemäß der Vorgehensweise von Cedrangoro et al. (1965, Enzymologia 29: 143) bestimmt werden. Gemäß dieser Vorgehensweise wird 0,5 ml einer Enzymprobe, eingestellt auf pH 6,5 mit 1 N NaOH, in ein kleines Gefäß geladen. Dann wird 1 ml Borat-pH 10,8-Pufferlösung zu dem Gefäß hinzugefügt. Der entladene Ammoniak wird mit 5 N Schwefelsäure absorbiert und durch Verwendung des Nesslers Reagens wird der Mischung eine Farbbildung erlaubt, welche bei 420 nm gemessen wird. Eine PGase-Einheit ist die Enzymmenge, welche in der Lage ist, 1 Mikromol Ammoniak pro Minute unter diesen Bedingungen herzustellen.
  • Alternativ kann die Peptidoglutaminaseaktivität gemäß der in US 3,857,967 oder Beispiel 20 unten beschriebenen Vorgehensweise bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Nahrungsmittelprodukte, z. B. gebackene Produkte und Tierfutterzusätze, welche ein Proteinhydrolysat umfassen, welches durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird. Solche Nahrungsmittelprodukte weisen verstärkte organoleptische Qualitäten auf, wie eine Verbesserung im Geschmack, der Schmackhaftigkeit, des Mundgefühls, des Aromas und der Krustenfarbe ("crust color").
  • In dem vorliegenden Zusammenhang schließt der Ausdruck "gebackene Produkte" beliebige Nahrungsmittel ein, welche aus Teig zubereitet werden, entweder mit einem weichen oder einem krustigen Charakter. Beispiele von gebackenen Produkten, ob heller oder dunkler Typ, welche durch diese Erfindung vorteilhaft hergestellt werden können, sind Brot, insbesondere weißes, Vollmehl- oder Roggenbrot, typischerweise in der Form von Brotlaiben oder Brötchen; französische Baguette-Typ-Brote; Pitabrote; Tacos; Torten; Pfannkuchen; Biscuits; Krustenbrote; und dergleichen.
  • Solche gebackenen Produkte werden herkömmlicherweise aus einem Teig zubereitet, welcher Mehl und Wasser umfasst, und welcher typischerweise angesäuert wird. Der Teig kann auf verschiedene Weisen angesäuert werden, wie durch ein Hinzufügen von Natriumbicarbonat oder dergleichen oder durch ein Hinzufügen eines Gärmittels (Gärungsteig), jedoch wird der Teig bevorzugt durch ein Hinzufügen einer geeigneten Hefekultur, wie einer Kultur von Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) angesäuert. Beliebige der kommerziell erhältlichen Saccharomyces cerevisiae Stämme können angewendet werden.
  • Weiterhin kann der Teig, welcher in der Zubereitung von gebackenen Produkten verwendet wird, frisch oder gefroren sein. Die Zubereitung von gefrorenem Teig wird beschrieben von K. Kulp und K. Lorenz in "Frozen and Refrigerated Doughs and Batters". Eine geschmacksverbessernde Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird typischerweise in den Teig in einer Menge in dem Bereich von 0,01–5%, bevorzugter 0,1–3% eingeschlossen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Hydrolysats, welches durch die Verfahren der Erfindung hergestellt wird, als ein Zusatzstoff zu Nahrungsmittelprodukten, wie gebackenen Nahrungsmittel, um die organolepti schen Qualitäten, wie den Geschmack, die Schmackhaftigkeit und das Aroma, zu steigern.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht als Begrenzung des Schutzbereichs der Erfindung aufgefasst werden sollten.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Aufreinigung der FLAVOURZYMETM-Aminopeptidase II
  • Die Aminopeptidase wurde aus einer FLAVOURZYMETM-Brühe (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) aufgereinigt. Die FLAVOURZYMETM-Brühe wurde durch Kultivierung des Aspergillus oryzae Stammes 1568 (ATCC 20396) in einem Medium, welches aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Spurenmetallen zusammengesetzt ist, hergestellt. Zuerst wurde die Brühe (20 ml, enthaltend 720 mg Protein) mit 180 ml 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer verdünnt und gefiltert unter Verwenden von Nalgene Filterware, ausgestattet mit 0,45 μm Filter mit einem Filter (Nalgene, Rochester, NY). Die gefilterte Lösung wurde auf eine 24 × 130 mm-Säule geladen, welche 31 ml Q-Sepharose, Big Beads (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) enthielt, voräquilibriert mit 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer. Das Protein wurde unter Verwenden von pH-Gradienten von 7,0 (20 mM Natriumphosphatpuffer) bis 5,0 (20 mM Natriumacetatpuffer) von 5,0 bis 3,5 (20 mM Natriumacetatpuffer) und dann von 3,5 bis 3,0 (20 mM Natriumacetatpuffer) eluiert. Fraktionen, welche zwischen pH 3,5 und 3,0 eluierten, wurden gesammelt, gepoolt und auf 20 ml konzentriert durch eine Ultrafiltration mit einer PM 10-Membran (Amicon, New Bedford, MA).
  • Die konzentrierte Lösung wurde mit 100 ml 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer verdünnt und dann auf eine 20 × 100 mm Säule geladen, welche Pharmacia MonoQ Beads (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) enthielt, voräquilibriert mit 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer. Das Protein wurde mit einem 0 bis 0,4 M NaCl-Gradienten in 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer eluiert. Die Fraktionen zwischen 0,330 und 0,343 M NaCl wurden gesammelt, gepoolt und konzentriert unter Verwenden einer Ultrafiltration gegen 20 mM NatriumacetatpH 4,0-Puffer.
  • Für die aufgereinigte Zubereitung wurde gefunden, dass sie drei Hauptbanden enthielt, welches durch eine SDS-PAGE-Analyse beurteilt wurde. Die Probe bestand aus Komponenten mit Molekulargewichten von ungefähr 65,50 und 33 kDa.
  • Beispiel 2: Aminosäuresequenzierung einer Aminopeptidase II
  • Ein Aliquot der in Beispiel 1 beschriebenen aufgereinigten Aminopeptidase II-Zubereitung wurde elektrophoriert und nachfolgend Blot-transferiert auf eine PVDF-Membran (Novex, San Diego, CA) unter Verwenden von 10 mM CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure) pH 11 in 10% Methanol für 2 Stunden. Die PVDF-Membran wurde mit 0,1% Coommassie-Blau R-250 in 40% Methanol/1% Essigsäure für 20 Sekunden angefärbt und mit 50% Ethanol entfärbt, um die Proteinbanden zu beobachten. Drei Komponenten bei 65, 50 und 33 kDa wurden ausgeschnitten und einer aminoterminalen Sequenzierung in einem Applied Biosystems Model 476A Protein Sequenzer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unterworfen, unter Verwenden einer Blot-Kartusche ("blot cartridge") und einer Flüssigphasen-TFA-Förderleistung ("liquid phase TFA delivery") gemäß den Instruktionen des Herstellers. Alle drei Komponenten erzielten dieselbe aminoterminale Sequenz RALVSPDEFPEDIQLEDLLEGSQQLEDFAY (SEQ ID NO: 2).
  • Eine 300 μl Probe des Proteins wurde in einem Savant Speed Vac AS160 (Savant Instruments, Farmingdale, NY) getrocknet und dann mit 300 μl 70%-iger Ameisensäure (wässrig) wiederhergestellt. Es wurden einige Kristalle Cyanbromid hinzugefügt und bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht inkubiert. Die Probe wurde wieder getrocknet in dem Speed Vac und wiederhergestellt in dem Tricinprobenpuffer (Novex, San Diego, CA). Die Cyanbromid-gespaltenen Fragmente wurden unter Verwenden eines 10–20%-igen Tricin-SDS-Polyacrylamidgel in Banden von 6, 10, 15, 22, 27, 40 und 50 kDa aufgetrennt und Blot-transferiert auf eine PVDF-Membran. Die 6, 10, 15 und 22 kDA-Banden wurden ausgeschnitten und einer aminoterminalen Sequenzierung unterworfen.
  • Die aminoterminalen Sequenzen der 15 und 22 kDa-Banden waren identisch zu der obigen aminoterminalen Sequenz, während die Sequenzen der 6 und 10 kDa Banden beide bestimmt wurden, die Sequenz TYSPSVEVTADVAVVKNLGTSEADYPDVEGKVAL (SEQ ID NO: 2) zu enthalten.
  • Beispiel 3: Aspergillus oryzae Stamm 1568-RNA-Isolierung
  • Der Aspergillus oryzae Stamm 1568 wurde in einem Fermentationstank kultiviert, in einem Medium, welches aus 7,5 g Kartoffelstärke, 10 g Sojabohnenmehl, 2 g KHP2O4, 5 g Na2HPO4-2H2O und 0,1 g ZnSO4-7H2O pro Liter zusammengesetzt war. Eine Zwei-Liter-Probe wurde nach 5 Tagen Wachstum bei 30°C entnommen und die Mycelia wurde gesammelt, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C aufbewahrt. Die Gesamt-RNA wurde aus den gefrorenen gepuderten Mycelia von Aspergillus oryzae 1568 durch Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von einer Ultrazentrifugierung durch ein 5,7 M Cäsiumchlorid-Kissen (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294–5299) zubereitet. Poly(A)+ RNA wurde isoliert durch eine Oligo(dT)-Celluloseaffinitätschromatographie gemäß Aviv und Leder (1972, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69: 1408-1412).
  • Beispiel 4: Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
  • Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 μg Aspergillus oryzae 1568 poly(A) + RNA aus Beispiel 3 sythetisiert, unter Verwenden der von Gubler und Hoffmann (1983, Gene 25: 263–269) und Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) beschriebenen Vorgehensweise, mit Ausnahme, dass ein Oligo(dT)-NotI-Ankerprimer, anstelle eines Oligo(dT)12-18-Primers in der Erststrangreaktion verwendet wurde. Nach der Synthese wurde die cDNA mit "Mung bean"-Nuklease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) behandelt, glatte Enden mit der T4 DNA-Polymerase hergestellt (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und zu nicht-palindromen BstXI-Adaptoren ligiert (Invitrogen, San Diego, CA), unter Verwenden eines un gefähr 50-fachen molaren Überschusses der Adaptoren. Die adaptierte cDNA wurde mit NotI verdaut, Größen-fraktioniert für 1,2–3,0 kB cDNAs durch Agarosegelelektrophorese und in pYES2,0 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert, geschnitten mit BstXI/NotI. Die Ligationsmischung wurde in elektrokompetente E. coli DH10B-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) transformiert, gemäß den Instruktionen des Herstellers. Die Bibliothek, welche aus 1 × 106 unabhängigen Klonen bestand, wurde als einzelne Pools (25.000-30.000 Kolonienbildungseinheiten/Pool) in 20% Glycerol bei –80°C und als doppelsträngige cDNA und Ligationsmischung bei –20°C gelagert.
  • Beispiel 5: Extraktion genomischer DNA
  • Aspergillus oryzae 1568 wurde in 25 ml 0,5% Hefeextrakt-2% Glucose (YEG)-Medium für 24 Stunden bei 37°C und 250 rpm wachsen gelassen. Die Mycelia wurden dann durch eine Filtration durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) gesammelt und einmal mit 25 ml 10 mM Tris-1 mM EDTA (TE)-Puffer gewaschen. Der überschüssige Puffer wurde aus der Mycelia-Zubereitung abtropfen gelassen, welche nachfolgend in flüssigem Stickstoff gefroren wurde. Die gefrorene Mycelia-Zubereitung wurde in einer elektrischen Kaffemühle zu einem feinen Pulver vermahlen und das Pulver wurde in ein wegwerfbares Plastikzentrifugationsröhrchen hinzugefügt, welches 20 ml des TE-Puffers und 5 ml 20% w/v Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt. Die Mischung wurde einige Male vorsichtig umgedreht, um ein Mischen sicherzustellen, und zweimal mit einem gleichen Volumen an Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1 v/v/v) extrahiert. Es wurde Natriumacetat (3 M Lösung) hinzugefügt zu der extrahierten Probe bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, gefolgt von 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol, um die DNA zu präzipitieren. Das Röhrchen wurde bei 15.000 x g für 30 Minuten zentrifugiert, um die DNA zu pelletieren. Das DNA-Pellet wurde 30 Minuten luftgetrocknet vor der Resuspendierung in 0,5 ml TE-Puffer. DNase-freie Ribonuklease A wurde hinzugefügt, um das DNA-Pellet auf eine Konzentration von 100 μg/ml zu resuspendieren und die Mischung wurde dann bei 37°C für 30 Mi nuten inkubiert. Proteinase K (200 μg/ml) wurde hinzugefügt und das Röhrchen wurde eine zusätzliche Stunde bei 37°C inkubiert. Schließlich wurde die Probe zweimal mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol extrahiert und die DNA mit Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen, vakuumgetrocknet, resuspendiert in TE-Puffer und bei 4°C aufbewahrt.
  • Beispiel 6: PCR-Amplifizierung der Aspergillus oryzae 1568-Aminopeptidase II
  • Basierend auf den in Beispiel 2 beschriebenen Aminosäuresequenzen von den Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II-Teilpeptiden, wurden die unten gezeigten degenerierten Oligonukleotidprimer synthetisiert mit einem Applied Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer gemäß den Instruktionen des Herstellers, um Aminopeptidase II-Genfragmente aus der genomischen DNA von Aspergillus oryzae 1568 mit einer PCR zu amplifizieren.
    Vorwärtsrimer: 5'-CCIGAYGARTTYCCIGARGA-3' (SEQ ID NO: 3)
    Ruckwärtsprimer: 5'-RTTYTTIACIACIGCIACRTCIGCIGTIACYTCIAC-3' (SEQ ID NO: 4).
  • (R = A oder G, Y = C oder T, N = G oder A oder C oder T, H = A oder C oder T, I = Inosin).
  • Die Amplifizierungsreaktionen (50 μl) wurden unter Verwenden von ungefähr 1 μg Aspergillus oryzae 1568 genomischer DNA als Matrize zubereitet, welche wie in Beispiel 5 beschrieben zubereitet wurde. Jede Reaktion enthielt die folgenden Komponenten: 1 μg genomische DNA, 40 pMol des Vorwärtsprimers, 40 pMol des Rückwärtsprimers, 20 μM von jedem dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × Taq Polymerase-Puffer (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ) und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ). Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer Model 480 Thermocycler inkubiert und wie folgt programmiert: Zyklus 1 bei 94°C für 5 Minuten, 50°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten; und Zyklen 2–26 bei 94°C für 2 Minuten, 50°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten. Die Reaktionsprodukte wurden in einem 1,5%-igen Agarosegel (Eastman Kodak, Rochester, NY), wobei eine 309 bp-Produktbande aus dem Gel ausgeschnitten wurde und aufgereinigt wurde unter Verwenden von Qiaex II (Qiagen, Chatsworth, CA) gemäß der Instruktionen des Herstellers. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde nachfolgend in einen pCRII-Vektor (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert und die DNA-Sequenz wurde unter Verwenden der Lac-Vorwärts- und Rückwärtsprimer (New England BioLabs, Beverly, MA) bestimmt.
  • Das Aminopeptidase II-Gensegment (309 Bp) bestehend aus 103 Codons, wurde von Aspergillus oryzae 1568 mit den oben beschriebenen Aminopeptidase IIspezifischen PCR-Primern amplifiziert. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass das amplifizierte Gensegment einen Teil des entsprechenden Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II-Gens kodierte. Das Aminopeptidase II-Gensegment wurde verwendet, um die Aspergillus oryzae 1568 cDNA-Bibliothek, beschrieben in Beispiel 5, zu testen.
  • Beispiel 7: Identifizierung von Aspergillus oryzae 1568-Aminopeptidase II-Klonen
  • Die Aspergillus oryzae 1568 cDNA-Bibliothek wurde auf Luria plus 50 μg/ml Carbenicillin Agar-Platten ausplattiert. Kolonieanhebungen ("colony lifts") (Maniatis et al., 1982, Molecular C1oning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) wurden mit ungefähr 10.000 Kolonien durchgeführt und die DNA was wurde guervernetzt auf Membranen (Hybond N+, Amersham, Arlington Heights, IL) unter Verwendung eines W-Stratalinkers Stratagene, La Jolla, CA). Die Membranen wurden für drei Stunden bei 45°C in einer Hybridisierungslösung eingeweicht, welche 5 × SSPE, 0,3% SDS, 50% Formamid und 10 μg/ml denaturierte und gescherte Heringssamen-DNA enthielt. Das Aminopeptidase II-Genfragment, welches wie in Beispiel 6 beschrieben von dem Aspergillus oryzae 1568 isoliert wurde, wurde radiomarkiert unter Verwen den des „Random Primed DNA Labeling Kit" (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland), denaturiert durch ein Hinzugeben von NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M und zu der Hybridisierungslösung bei einer Aktivität von ungefähr 1 × 106 cpm pro ml Hybridisierungslösung hinzugegebt. Die Mischung wurde über Nacht bei 45°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Der Inkubation folgend wurden die Membranen dreimal in 2 × SSC mit 0,2% SDS bei 55°C gewaschen. Die Membranen wurden dann auf Blotting-Papier für 15 Minuten getrocknet, eingepackt in SaranWrapTM und mit einem Röntgenstrahlenfilm für 48 Stunden bei –70°C mit Intensivierungsabschirmvorrichtung (Kodak, Rochester, NY) belichtet.
  • Elf Kolonien stellten starke Hybridisierungssignale mit der Probe her. Die elf Kolonien wurden in fünf ml LP plus 50 μg/ml Carbenicillinmedium inokuliert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Von jedem dieser Klone wurde eine Miniprep-DNA zubereitet unter Verwenden des Wizard 373 DNA-Aufreinigungskit (Wizard 373 DNA Purification Kit, Promega, Madison, WI. Der Klon 9 und der Klon 10 enthielten eine Aminopeptidase II-kodierende Sequenz, wie durch DNA-Sequenzierung bestätigt wurde. Der Klon 9 (pEJGl8) besaß Volllänge. Das Plasmid pEJGl8 wurde in E. coli DHSα-Zellen subkloniert, um E. coli DHSα EJG18 herzustellen.
  • Beispiel 8: DNA-Sequenzanalysen des Aspergillus orzyae 1568 Aminopeptidase II-Gens
  • Eine DNA-Sequenzierung des Aminopeptidase II-Gens, welches in pEJGl8 in E. coli DHSα EJG18 enthalten war, beschrieben in Beispiel 7, wurde mit einem Applied Biosystems Model 373A Automatisierten DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) an beiden Strängen durchgeführt, unter Verwenden der Primerwanderungstechnik mit der Farbstoffterminatorchemie (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47–60). Es wurden Oligonukleotid- Sequenzprimen zu den komplementären Sequenzen in dem Aminopeptidase II-Gen gestaltet und wurden in einem Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA-Synthetisierer (Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer) synthetisiert, gemäß den Instruktionen des Herstellers.
  • Die Nukleotidsequenz des Gens, welches die Aspergilus oryzae 1568-Aminopeptidase II kodiert und die abgeleitete Aminosäuresequenz hiervon wird in 1 (jeweils SEQ ID NO: 1 und 2) dargestellt. Sequenzanalysen des klonierten Inserts enthüllten einen großen offenen Leserahmen von 1.488 Nukleotiden (das Stop-Kodon ausgeschlossen), welche ein Protein mit einer 496 Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) kodiert. Der G + C-Gehalt dieses offenen Leserahmens beträgt 58%. Basierend auf den Regeln von van Heijne (van Heijne, 1984 , Journal of Molecular Biology 173: 243–251) umfassen die ersten 15 Aminosäuren wahrscheinlich ein sekretorisches Signalpeptid, welches das im Entstehen begriffene Polypeptide in das endoplasmatische Reticulum leitet (doppelt unterstrichen in 1).
  • Die Aminosäuresequenzen der Teilpeptide, welche von der aufgereinigten Aminopeptidase II, wie in Beispiel 2 beschrieben, abgeleitet sind, sind in 1 unterstrichen und waren konsistent mit solchen, die in der abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) der Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II-cDNA gefunden wurde.
  • Unter Verwenden des Clustal Abgleichungsprogramms (Higgins, 1989, supra), um die abgeleitete Aminosäuresequenz der Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II mit der Saccharomyces cerevisiae Aminopeptidase II Y (SEQ ID NO: 5) abzugleichen, wurde eine 33,7 %-ige Aktivität beobachtet.
  • Beispiel 9: Konstruktion eines Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II-Expressionsvektors für einen Aspergillus Wirt
  • sEs wurden zwei unten gezeigte synthetische Oligonukleotidprimer gestaltet, um die Aspergillus oryzae A1568 Aminopeptidase II Gen-kodierende Sequenz von dem Plasmid pEJG18 (E. coli DHSα-EJG18) zu amplifizieren für ein Subklonieren und eine Expression in einem Aspergillus Wirt.
  • Figure 00350001
  • Fettgedruckte Buchstaben stellen die kodierende Sequenz dar.
  • Um das Subklonieren des Genfragments in einen Expressionsvektor, benannt als pMWR3 (2), zu vereinfachen, wurde eine NsiI-Restriktionsenzymstelle an dem 3'-Ende des Aminopeptidase II-Gens eingeführt. Das 5'-Ende wurde glatt gelassen mit einem Zusatz von ATG für die Insertion in die SwaI-Stelle. Der Vektor pMWR3 enthielt den TAKA-Promotor und -Terminator als regulatorische Seguenzen. Da das Plasmid keinen selektierbaren Marker für Pilztransformationen enthält, wurde es mit pToC90 (WO 91/17243), welches amdS als selektierbaren Marker enthält, cotransformiert.
  • Fünfzig Pikomol von jedem der obigen Primer wurden in einer PCR-Reaktion (50 μl) verwendet, welche 70 ng pEJG18 (ein Aspergillus oryzae 1568 cDNA-Klon in pYES2) 1X Pwo-Puffer (Boehringer Mannheim, Indiapolis, IN), 8 μl eines 10 mM Gemisches von dATP, dTTP, dGTP, und dCTP, und 2,5 Einheiten PwoI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) enthielt. Die Amplifizierungsbedingungen betrugen ein Zyklus bei 94°C für 2 Minuten, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute; 9 Zyklen bei 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute; 15 Zyklen bei 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute, mit einer Verlängerung von 20 Sekunden pro Zyklus; und eines Endzyklus von 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 7 Minuten. Der Hitzeblock ging dann auf einen 4°C-Einweichzyklus ("soak cycle"). Das amplifizierte 1.500 Bp DNA-Fragment wurde durch Gelelek trophorese und Qiaex II aufgereinigt. Der Aminopeptidaseklon wurde mit NsiI verdaut (unter Verwenden der von dem Hersteller spezifizierten Bedingungen). Das Fragment wurde Phenol-Chloroform-extrahiert und Ethanol-präzipitiert. Das geschnittene Fragment wurde in pMWR3 kloniert, welches vorher mit SwaI und NsiI geschnitten wurde, welches in dem Expressionsplasmid pEJG19 (3) resultierte, in welchem die Transkription des Ammopeptidase II-Gens unter der Kontrolle des TAKA-Promoters stand. Das Plasmid pEJG19 wurde in E. coli DHSα-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) transformiert. Ein E. coli-Transformant, welcher das PEJG19-Plasmid enthielt, wurde isoliert und die Plasmid-DNA wurde gemäß der Vorgehensweise, beschrieben von Sambrook et al., 1989, supra zubereitet.
  • Beispiel 10: Expression des Aspergillus oryzae 1568-Aminopeptidase II-Gens in Aspergillus oryzae
  • Das Plasmid pEJG19 wurde in einen alkalische Protease-defizienten Aspergillus oryzae Wirt JaL142-6 eingeführt, unter Verwenden der folgenden Protoplast-Transformationsverfahren. Die Transformation wurde mit Protoplasten bei einer Konzentration von ca. 2 × 107 Protoplasten pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplasten wurden mit ca. 5 μg pEJG19 auf Eis platziert und 5 μg pTOC90; 250 μl 60% PEG 4000, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM CaC12 wurden hinzugegeben und die Protoplasten wurden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Drei ml STC (1,2 mM Sorbitol, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 und 10 mM CaC12) wurden hinzugegeben. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und auf COVE-Transformationsplatten gegossen (pro Liter: 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO4-7H2O, 1,52 g KH2P O4, I ml Spurenmetalle, wie unten beschrieben, 342,3 g Sucrose, 25 g Noble Agar, 10 ml 1 M Acetamid, 10 ml 3 M CsCl). Die Spurenmetalllösung (1000X) umfasste 22 g ZnSO4–7H2O, 11 g H3BO3, 5 g MnCl2–4H2O, 5 g FeSO4-7H2O, 1,6 g CoCl2–5H4O, 1,6 g (NH4)6Mo7O24 und 50 g Na4EDTA pro Liter. Die Platten wurden für 7 Tage bei 37°C inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit demselben Medium transferiert und für 2 Tage bei 37°C inkubiert.
  • Schließlich wurden 140 Transformanten entdeckt durch ihre Fähigkeit, auf COVE-Medium unter Verwenden von Acetamin als einzige Stickstoffquelle zu wachsen.
  • Die Transformanten wurden für 4 Tage für 34°C, 200 rpm in 24 Vertiefungsplatten, enthaltend 1 ml pro Vertiefung 25% MY50-Medium, verdünnt mit 75% N1Y50-Salzen, wachsen gelassen. MY50 war pro Liter zusammengesetzt aus 50 g Maltodextrin, 2,0 g MgSO4-7H2O, 10 g KH2PO4, 2 g Zitronensäure, 10 g Hefeextrakt, 2,0 g Harnstoff 2 g K2SO4 und 0,5 ml Spurenelementelösung, eingestellt auf pH 6,0. Die Spurenmetalllösung war pro Liter zusammengesetzt aus 14,3 g ZnSO4-7H2O, 2,5g CuSO4-5H2O, 0,5 g NiCl2-6H2O, 13,8 g FeSO4-7H2O, 8,5 g MnSO4-H2O, 3 g Zitronensäure. Die MY50-Salze waren pro Liter zusammengesetzt aus 2,0 g MgSO4-7H2O, 10 g KH2PO4, 2 g Zitronensäure und 2 K2SO4, pH 6,0.
  • Jede der 140 Vertiefungen wurde auf die Aminopeptidase II-Aktivität hin überprüft unter Verwenden von Leu-pNA (Hydrochloridsalz) als Substrat. In einer 96-Vertiefungsmikrotiterplatte wurden 4 μl des Überstandes zu 100 μl 1 mg/ml LeupNA in 50 mM Natriumphosphat pH 7,5-Puffer hinzugegeben. Die Absorbans bei 405 nm wurde aufgezeichnet.
  • Vier Transformanten, 20, 88, 90 und 137, mit dem höchsten Grad an Aminopeptidase II-Aktivität wurden dann in 125 ml-Schüttelflaschen für 4 Tage bei 24°C, enthaltend 25 ml MY50-Medium, wachsen gelassen.
  • Am Tag 2, 3 und 4 wurden Proben auf ihre Aminopeptidase II-Aktivität hin überprüft durch ein Mischen von 100 μl 10-fach verdünnten Überstand mit 100 μl 2 mg/ml Leu-pNA in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer. Die Transformanten 20, 90 und 137 waren die höchsten Produzenten. Zur Rufreinigung der Aminopeptidase II, wurden die Transformanten 20 und/oder 90 in Schüttelflaschen, wie oben, oder in einem Fermentationsmedium, welches aus geeigneten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zusammengesetzt war, wachsen gelassen.
  • Beispiel 11: Rufreinigung rekombinanter Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II, hergestellt in Aspergillus
  • Die vereinigten Überstände aus den Schüttelflaschenbrühen, beschrieben in Beispiel 10, wurden vereinigt (ungefähr 100 mg Protein in ungefähr 100 ml) und wurden zu 3,7 mS verdünnt und auf pH 7,0 eingestellt. Die verdünnte Probe wurde dann auf Q-Sepharose, Big Beads, geladen, voräquilibriert mit 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer. Die Aminopeptidase II wurde mit einem 0–0,4 M NaCl-Gradienten in 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer eluiert, gefolgt von einem Waschen mit 0,4 M NaCl. Die Fraktionen wurden auf die Aminopeptidase II-Aktivität hin überprüft durch Mischen von 100 μl jeder Fraktion mit 100 μl 2 mg Leu-pNA pro ml von 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer. Die Prüfungsergebnisse zeigten an, dass die Aminopeptidase II am Ende des Gradienten und während des 0,4 M NaCl-Waschens eluiert wurde. Eine Analyse durch SDS-PAGE offenbarte, dass das Enzym homogen war.
  • Beispiel 12: Konstruktion eines Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II-Expressionsvektors für einen Fusarium Wirt
  • Zwei synthetische Oligonukleotidprimer, unten gezeigt, wurden benannt als , um die Aspergillus oryzae A 1568 Aminopeptidase-Gen-kodierende Sequenz von dem Plasmid pEJG18 (E. coli DHSα-EJG18) zu PCR-amplifizieren, für ein Subklonieren und eine Expression in einem Fusarium Wirt.
  • Figure 00380001
  • Fettgedruckte Buchstaben stellen die kodierende Sequenz dar. Kleingeschriebene Buchstaben ("small case") stellen eine Kozak-Consensus-Sequenz dar, um die Expression zu verstärken (Kozak, 1981, Nucleic Acid Research 12, 857–872).
  • Um das Subklonieren des Genfragments in einen Expressionsvektor, benannt als pDM181 (4), zu erleichtern, wurden SwvaI und PacI-Restriktionsenzymstellen jeweils am 5'- und 3'-Ende des Aminopeptidase II-Gens eingeführt. Der Vektor pDM181 enthielt den Fusarium oxysporum Trypsin-ähnlichen Protease(SP387)-Promotor und -Terminator (WO 96/00787) als regulatorische Sequenzen. Das Plasmid enthielt ebenfalls das bar-Gen als einen selektierbaren Marker für Pilztransformationen (de Block et al., 1987, EMBO Journal 6: 2513-2518).
  • Fünfzig Pikomol von jedem der obigen Primer wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, welche 70 ng pEJG18, 1X Pwo-Puffer, 5 μl 10 mM Gemisches aus dATP, dTTP, dGTP und dCTP und 2,5 Einheiten PwoI enthielt. Die Amplifikationsbedingungen betrugen ein Zyklus bei 94°C für 2 Minuten, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute; 9 Zyklen, jeder bei 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute; 15 Zyklen, jeder bei 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute mit einer Verlängerung von 20 Sekunden pro Zyklus; und einem Endzyklus bei 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 7 Minuten. Der Hitzeblock wurde dann bei einem 4°C Einweichzyklus gehalten. Das amplifizierte 1.500 Bp DNA-Fragment wurde durch Gelelektrophorese und Qiaex II aufgereinigt und dann in den pCRII TOPO TA-Klonierungsvektor (Stratagene, San Diego, CA) subkloniert. Der pCRII-Aminopeptidase-Klon wurde mit den Restriktionsendonukleasen SwaI und PacI geschnitten (unter Verwenden der von dem Hersteller spezifizierten Bedingungen). Das Fragment wurde durch Gelelektrophorese und Qiaex II aufgereinigt. Das Schnittfragment wurde in pDM181 kloniert, welcher vorher mit SwaI und Pacl geschnitten wurde, welches in dem Expressionsplasmid pEJG28 (5) resultierte, in welchem die Transkription des Aminopeptidase II-Gens unter der Kontrolle des Fusarium oxysporum Trypsin-ähnlichen Proteasepromotors stand. Das Plasmid pEJG28 wurde in E. coli ABLE K-Zellen (Stratagene, San Diego, CA) transformiert. Der E. coli-Transformant, der das pEJG28-Plasmid enthielt, wurde isoliert und die Plasmid-DNA wurde gemäß den Vorgehensweisen, beschrieben von Sambrook et al., 1989, supra, präpariert.
  • Beispiel 13: Transformation von Fusarium CCl-3 und Analyse der Transformanten
  • Der Fusarium Stamm CC1–3, eine hochverzweigte morphologische Mutante von dem Fusarium Stamm A3/5 (ATCC 20334) (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555–562; bliebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284–1288; bliebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555–562) wurde in einem Flüssigmedium wachsen gelassen, welches Vogel's Salze enthielt (Vogel, 1964, Am. Nature 98: 435–446), 25 mM NaNO3 und 1,5% Glucose enthielt, für 4 Tage bei 28°C und 150 rpm. Die Conidia wurden aufgereinigt durch Filtration durch 4 Schichten Baumwollstoff und schließlich durch eine Schicht Mirastoff ("Miracloth"). Die Conidial-Suspensionen wurden durch Zentrifugation konzentriert. Fünfzig ml YPG-Medium, welches 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton und 2% Glucose umfasste, wurde mit ungefähr 108 Conidia inokuliert und für 14 Stunden bei 24°C und 150 rpm inkubiert. Die resultierenden Hyphae wurden auf einem sterilen 0,4 mm Filter aufgefangen und nachfolgend gewaschen mit sterilem destillierten Wasser und 1,0 M MgSOa. Die Hyphae wurden in 10 ml NOVOZYM 234TM-Lösung (2–10 mg/ml in 1,0 M MgSO4) resuspendiert und für 15–30 Minuten bei 34°C unter Bewegung bei 80 rpm verdaut. NOVOZYM 234TM wurde von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark erhalten. Unverdautes Hyphal-Material wurde aus der resultierenden Protoplastensuspension entfernt durch sukzessive Filtration durch 4 Schichten Baumwollstoff und durch Mirastoff. Zwanzig ml 1 M Sorbitol wurden mit der Protoplasten-Lösung vereinigt. Nach einem Mischen wurden die Protoplasten durch Zentrifugation pelletiert und nachfolgend gewaschen durch eine Resuspension und eine Zentrifugation in 20 ml 1 M Sorbitol und 20 ml STC (0,8 M Sorbitol, 0,05 M Tris pH 3,0, 0,05 M CaCl2. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 4 Teilen STC und 1 Teil SPTC (0,8 M Sorbitol, 40% PEG 4000, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaC12) resuspendiert bei einer Konzentration von 5 × 107/ml.
  • Einhundert ml der Protoplastensuspension wurden zu 10 μg pEJG28 in Polypropylenröhrchen (17 × 100 mm) hinzugegeben, gemischt und auf Eis inkubiert für 30 Minuten. Ein ml SPTC wurde vorsichtig in die Protoplastensuspension gemischt und die Inkubation wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten fortgesetzt. 12,5 ml geschmolzene ("molten") Lösung (abgekühlt auf 40°C), welche aus 1X Vogel's Salzen, 25 mM NaNO3, 0,8 M Sucrose und 1% niedrigschmelzender Agarose (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) bestand, wurde mit den Protoplasten gemischt und dann auf eine leere 100 mm-Petriplatte ausplattiert. Die Inkubation wurde fortgesetzt bei Raumtemperatur für 10 bis 14 Tage. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 24 Stunden, wurden 12,5 ml des identischen Mediums plus 10 mg BASTATM (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) pro ml auf die Petriplatte überschichtet. BASTATM wurde vor der Verwendung zweimal mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert und einmal mit Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert.
  • Nach zwei Wochen waren zwei Transformanten, als #1 und #2 benannt, ersichtlich. Ein myceliales Fragment von dem Rand eines jeden Transformanten wurde in einzelne Vertiefungen einer 24-Vertiefungsplatte transferiert, welche Vogel's/BASTATM-Medium enthielt. Das Medium enthielt 25 g Sucrose, 25 g Nobel-Agar, 20 ml 50X Vogel's Salze (Vogel, 1964, supra), 25 mM NaNO3 und 10 g BASTATM pro Liter. Die Platte wurde in einen Plastikbeutel eingewickelt, um die Feuchtigkeit beizubehalten und ungefähr eine Woche bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Beispiel 14: Expression des Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II-Gens in Fusarium
  • Ein myceliales Fragment von jedem der 2 Fusarium CCl-3-Transformanten, beschrieben in Beispiel 13, wurde in 20 ml M400Da-Medium inokuliert, welches zusammengesetzt war aus 50 g Maltodextrin, 2,0 g MgSO4-7H2O, 2,0 g KH2P O4, 4,0 g Zitronensäure, 8,0 g Hefeextrakt, 2,0 g Harnstoff und 0,5 ml Spurenmetalllösung pro Liter, und für 7 Tage bei 30°C und 150 rpm inkubiert. Das Medium wurde auf pH 6,0 mit 5 N NaOH eingestellt. Die Spurenmetalllösung enthielt 14,3 g ZnSO4-7H2O, 2,5 g CuSO4-5H2O, 0,5 g NiCl2-6H2O, 13,8 g FeSO4-7H2O, 8,5 g MnSO4-H2O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter. Der nicht transformierte Wirt wurde ebenfalls als Kontrolle laufen gelassen. Ein ml des Kulturüberstandes wurde an 7 Tagen geerntet und gelagert und überprüft. Die Aminopeptidase II-Aktivität wurde bestimmt durch ein Mischen von 10 μl Überstand mit 20 μl einer Substratstammlösung, welche 2 mg Leu-para-Nitroanilid pro ml 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer enthielt, und einem Überwachen der Veränderung in der Extinktion bei 405 nm über 4 Minuten hinweg. Beide Transformanten zeigten eine Aktivität in Richtung auf Leu-pNA, welche größer als die der nicht transformierten Kontrolle war.
  • Der primäre Fusarium Tranformant #2, beschrieben in Beispiel 13, wurde in 125 ml Schüttelflaschen für 5 Tage bei 30°C und 25 ml M400Da-Medium kultiviert. Die gesamte Kulturbrühe wurde gefiltert unter Verwenden einer Doppelschicht Mirastoff. Das Filtrat wurde zurückerhalten und dann bei –20°C gefroren.
  • Beispiel 15: Rufreinigung der rekombinanter Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II, hergestellt durch Fusarium
  • Ein 20 ml Volumen einer 5-Tage Fusarium-Brühe, beschrieben in Beispiel 14, wurde gefiltert durch einen 0,45 Mikrometer-Spritzenfilter. Die Probe wurde dann 8-fach in 20 mM Natriumpliosphat-pH 7,5-Puffer verdünnt. Die Leitfähigkeit und der pH der Probe betrug jeweils 3,1 mS und 7,10. Die Probe wurde auf eine XK-26 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden)-Säule geladen, welche 60 ml Q- Sepharose, Big Beads, enthielt, welche mit 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer voräquilibriert worden war. Die Säule wurde gewaschen, bis eine Grundlinie ("baseline") erreicht wurde und dann wurde die Probe mit einem linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 über 8,3 Säulenvolumina und bei einer Flussrate von 5 ml/Min eluiert. Die Fraktionen wurden überprüft unter Verwenden von Leu-pNA als Substrat durch ein Mischen von 10 μl von jeder Fraktion mit 90 μl 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer und 100 μl einer Substratstammlösung, welche 2 mg Leu-pNA pro ml 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer enthielt, und einem Überwachen der Veränderung der Extinktion bei 405 nm über 4 Minuten. Alle Fraktionen, die aktiv auf Leu-pNA waren, wurden dann gepoolt, verdünnt und konzentriert unter Verwenden einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit, eine PM 10-Membran verwendend.
  • Die konzentrierte Probe wurde dann auf eine Mono Q 16/10 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden)-Säule geladen, welche mit 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer voräquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 0,15 M NaCl gewaschen. Ein Gradient wurde von 0,15–0,5 M NaCl über 10 Säulenvolumina bei einer Flussrate von 2 ml/Min durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden dann äquilibriert in 1,7 M (NH4)2SO4 in 50 mM Natuumphosphatpuffer, pH 7,0.
  • Die Probe wurde dann auf eine Phenyl-Superose 5/5-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) geladen, welche mit 1,7 M (NH4)2SO4 in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1,7 M (NH4)2SO4 in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer gewaschen, bis eine Grundlinie erreicht worden war. Das Enzym wurde mit einem Gradienten von 1,7 M bis 0 M (NH4)2SO4 über 30 Säulenvolumina bei einer Flussrate von 0,5 ml/Min eluiert. Der Durchfluss hatte eine Aktivität von Leu-pNA, so wie es die Fraktionen hatten, die eluiert wurden. Das Enzym erschien als eine Reihe von verschieden glykolisierten Formen, basiert auf einer SDS-PAGE-Analyse. Wenn die verschiedenen Formen des Enzyms mit Endoglykosidase F/N Glykosidase F (Boehringer Mannheim, Indianapolis, N) gemäß des von dem Hersteller vorge schlagenen Protokolls behandelt wurden, erschien eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 58 kDa in allen analysierten Proben. Die verschieden glykolisierten Formen wurden dann gepoolt, entsalzt unter Verwenden von 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5, und einer biochemischen Charakterisierung unterworfen.
  • Beispiel 16: Charakterisierung von rekombinanter Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II
  • Die gereinigte Aminopeptidase II, beschrieben in Beispiel 11, wurde in der folgenden Charakterisierung verwendet.
  • Es wurden kinetische Parameter für die Aminopeptidase II bestimmt für einige p-Nitroanilid (pNA), einschließlich Leu-pNA, Gly-pNA, Ala-pNA und Pro-pNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, oder Bachem, Torrance, CA). Es wurden Stammlösungen von 100 mg von jedem p-Nitroanilid pro ml Dimethylsulfoxid mit 50 mM Kaliumphosphat-pH 7,0-Puffer auf Konzentrationen verdünnt, welche von 0,0064 bis 9,56 mM reichten. Es sollte bemerkt werden, dass die Löslichkeit der Substrate nicht immer ausreichend ist, um Konzentrationen zu haben, welche vergleichbar mit dem Km sind, welches in Fehlern resultieren kann, welche höher als normalerweise erwartet sein könnten. Die Reaktion von der Aminopeptidase II mit dem p-Nitroanilid wurde initiiert, wenn ein 100 μl Aliquot der Enzymlösung in 50 mM Kaliumphosphat pH 7,0 zu 100 μl einer Substratlösung in einer Mikrotiterplattenvertiefung hinzugegeben wurde und wurde bei 405 nm und 25°C unter Verwenden eines THERMOmax-Mikroplattenlesers (THERMOmax Microplate Reader) (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) überwacht. Eine Analyse der Initialraten der Hydrolyse des p-Nitroanilid stellten die in Tabelle 1 dargestellten Resultate her:
  • Tabelle 1. Kinetische Parameter der Aminopeptidase II bei pH 7,0 und 25°C
    Figure 00450001
  • Figure 00450002
  • Die Resultate stellten dar, dass die Aminopeptidase II eine Substratspezifität besitzt, wobei die Spezifität in Richtung auf Ala sehr viel schlechter ist als in Richtung auf Gly.
  • Eine Inhibierung der Aminopeptidase II mit 1,10-Phenanthrolin wurde unter Verwenden von Leu-pNA als Substrat bei pH 7,5 in 50 mM Tris-pH 7,5-Puffer bewertet, wobei die Hydrolyse bei 405 nm überwacht wurde. Eine 200 nm Lösung 1,10-Phenanthrolin in Methanol wurde zubereitet. Die Inhibierungsreaktion wurde durch ein Mischen von 100 μl 2 mg Leu-pNA aus ml 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Lösung und 10 μl der 1,10-Phenanthrolinlösung mit 100 μl Aminopeptidase II, 5-fach verdünnt in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer, durchgeführt. Eine Kontrolle wurde mitlaufen gelassen, wobei 10 μl 20 mM Tris-pH 7,6-Puffer anstelle der 1,10-Phenanthrolinlösung verwendet wurde.
  • Die Resultate zeigten an, dass 1,10-Phenanthrolin die Aminopeptidase II inhibiert, was nahe legt, dass die Aminopeptidase II eine Metalloprotease ist. Der Hydrolysegrad von Leu-pNA nimmt von 285 mOD/Minute bis 21 mOD/Minute in der Gegenwart von 1,10-Phenanthrolin ab.
  • Die gereinigte Aminopeptidase II, beschrieben in Beispiel 15, wurde in den folgenden Charakterisierungen verwendet.
  • Das pH-Optimum wurde bestimmt unter Verwenden von Ala-pNA als Substrat in dem Universalpuffer, welcher zusammengesetzt war aus 0,125 M Zitronensäure, 0,125 M monobasischem Natriumphosphat ("mono basic sodium phosphate") und 0,125 M Borsäure, der pH wurde auf 4,5–11 mit 10 N NaOH, in 0,5 pH Zuwach sen, eingestellt. Das Ala-pNA-Substrat wurde zubereitet durch ein Auflösen von 100 mg Ala-pNA in 1 ml DMSO und einem Zugeben von 20 μl der AlapNA/DMSO-Lösung zu 980 μl des Universalpuffers bei den verschiedenen pH-Werten. Der Test wurde initiiert durch ein Zugeben eines 15 μl Aliquots der Aminopeptidase II in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer zu 200 μl 2 mg/ml AlapNA bei den verschiedenen pH-Werten bei Raumtemperatur. Die Veränderung in der Extinktion bei 405 nm wurde für 5 Min überwacht. Die Autohydrolyse des Substrats als eine Kontrolle wurde bestimmt durch ein Zugeben von 15 μl 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer zu 200 μl 2 mg/ml Ala-pNA bei den verschiedenen pH-Werten.
  • Die in Tabelle 2 unten dargestellten Resultate demonstrierten, dass die Aminopeptidase II-Aktivität mit Ala-pNA als Substrat über den gemessenen pH-Bereich 4,91 bis 10,91, mit einer optimalen Aktivität bei pH 9,5–10, besaß. Es wurde keine Autohydrolyse des Substrats bei pH-Werten von 11 oder weniger beobachtet.
  • Tabelle 2
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Die Temperaturstabilität der Aminopeptidase II wurde bestimmt unter Verwenden des folgenden Protokolls: 480 μl 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5 wurde bei 37°, 45°, 55°, 60°, 65°, 70° und 75°C für 30 Minuten in einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen vorinkubiert. Dann wurden 20 μl aufgereinigte Aminopeptidase II hinzugegeben und die Probe wurde dann für zusätzliche 20 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann auf Eis platziert. Sobald die Inkubationen für alle Temperaturen abgeschlossen waren, wurden die Proben auf die Aktivität hin überprüft unter Verwenden von Leu-pNA als Substrat.
  • Die Prüfung wurde durch ein Mischen von 100 μl der Inkubationsmischungen für die verschiedenen Temperaturen mit 100 μl 2 mg/ml Leu-pNA in 50 mM Natuumphosphat-pH 7,5-Puffer bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Extinktion bei 405 nm wurde für 5 Minuten überwacht. Die in Tabelle 3 dargestellten Resultate demonstrieren, dass die Aminopeptidase II 90% ihrer Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 60°C, pH 7,5, beibehielt.
  • Tabelle 3
    Figure 00470002
  • Die kinetischen Parameter für verschiedenen Aminopeptidase II-Substrate wurden bestimmt unter Verwendung des folgenden Protokolls. Es wurde gereinigte Ami nopeptidase II mit einem A280 von 0,581 verwendet. Jedes Substrat wurde in DMSO zu einer Konzentration von 100 mg/ml aufgelöst und dann 50-fach in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer zu 2 mg/ml verdünnt. Die Substrate enthielten Leu-pNA, Glu-pNA (Bachem, Torrence, CA) und Ala-pNA. In einer 96-Vertiefungsmikrotiterplatte wurden 10 μl gereinigte Aminopeptidase II mit jedem Substrat wie folgt inkubiert, mit der Ausnahme, dass 50 μl der gereinigten Aminopeptidase II mit Glu-pNA inkubiert wurde und die Extinktion bei 405 nm für 4 Minuten gemessen wurde:
    1. 200 μl 2 mg/ml Substrat + 0 μl 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5
    2. 100 μl 2 mg/ml Substrat + 100 μl 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5
    3. 50 μl 2 mg/ml Substrat + 150 μl 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5
    4. 25 μl 2 mg/ml Substrat + 175 μl 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5
  • Ein "Lineweaver-Burke"-Diagramm wurde konstruiert, um den Km und den kcat für jedes Substrat zu bestimmen, unter Verwenden eines Durchschnittsmolekulargewichts von 97 kDa für die verschieden glykolisierten Formen.
  • Für Leu-pNA wurde der Km und der kcat bestimmt, jeweils 5,78 mM und 230,9 Min–1 zu sein.
  • Für Glu-pNA wurde der Km und der kcat bestimmt, jeweils 1,17 mM und 8,217 Min–1 zu sein.
  • Für Ala-pNA wurde der Km und der kcat bestimmt, jeweils 1,49 mM und 34,638 Min–1 zu sein.
  • Beispiel 17: Zubereitung von Proteinhydrolysaten mit Aspergillus oryzae 1568 Aminopeptidase II
  • Die aufgereinigte Aminopeptidase II, beschrieben in Beispiel 11, wurde in Hydrolysegradprüfungen getestet unter Verwenden von Soja, Weizengluten und Kasein als Substrate, gemäß der folgenden Vorgehensweise.
  • Die Hydrolysegrad-(DH)-Prüfungen wurden bei 50°C für 18 Stunden als eine Mini-Hydrolyse auf einer 10 ml-Skala unter Verwenden von Sojabohnenmehltabletten, Weizenglutenmehltabletten und Natriumkaseinat bei einer 2%- igen Konzentration, eingestellt auf pH 7, wenn notwendig, mit keiner pH-Einstellung während der Hydrolyse, durchgeführt. Die Hydrolysate wurden bei 85°C für 3 Minuten in einem Wasserbad inaktiviert. Die verwendeten Enzyme waren FLAVOURZYMETM und Aminopeptidase II. Die Enzyme wurden wie folgt dosiert. Für Soja wurden 2 LAPUs und 5 LAPUs für Aminopeptidase II (rekombinant) hinzugegeben, verglichen mit 3 LAPUs FLAVOURZYMETM. Für Gluten wurden 2 LAPUs und 5 LAPUs Aminopeptidase II (rekombinant) hinzugegeben, verglichen mit 3 LAPUs FLAVOURZYMETM. Für Kasein wurden 1 und 2 LAPUs Aminopeptidase II (rekombinant) hinzugegeben, verglichen mit 3 LAPUs FLAVOURZYMETM. Ein LAPU (Leucine Amino Peptidase Unit, Leucin-Aminopeptidaseeinheit), ist die Enzymmenge, welche 1 Mikromol Lleucin-p-Nitroanilid pro Minute unter den folgenden Bedingungen, zersetzt: 26 mM L-leucin-p-nitroanilid in 0,1 M Tris-pH 8,0-Puffer bei 40°C für 10 Minuten. Bei der Hydrolyse wird p-Nitroanilid freigesetzt, welches die Lösung gelb verwandelt, welches überwacht wird 405 nm.
  • Der Hydrolysegrad (DH) wie definiert, wie beschrieben von Adler-Nissen (1986, Enzymatic Hydrolvsis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers), wurde bestimmt durch eine Reaktion des Überstandes mit OPA (ortho-Phthaldialehyd, Sigma Chemical Co., St. Louis MO) gemäß der folgenden Vorgehensweise. Das Hydrolysat wurde 100–fach verdünnt in destilliertem Wasser. Dann wurden 120 μl in 900 μl OPA-Reagens transferiert. Für das OPA-Reagens wurden 160 mg OPA in 4 ml Ethanol aufgelöst und in eine 200 ml-Volumenflasche transferiert, welche eine Lösung aus 7,62 g Dinatriumtetraboratdecahydrat, 200 mg Natriumdodecylsulfat und 176 mg Dithiothreitol enthielt und die Flasche wurde auf 200 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Lösung wurde dann gut geschüttelt und nach exakt 2 Minuten wurde die Extinktion bei 340 nm gemessen und verglichen mit der Extinktion von 0,95 mM L-Serin-(destilliertem Wasser)-Lösung nach Abzug des Blindwerts (Wasser, welches mit OPA-Reagens reagiert hat). Um den wahren DH zu bestimmen, wurden die Serinäquivalente, welche in den Hydrolysaten gemessen wurden, mit den Faktoren korrigiert, welche von Adler-Nissen für das Trinitrobenzensulfonsäure-Verfahren vorgeschlagen wurden (Adler-Nissen, 1979, Agricultural and Food Chemistry 17: 1256), welches die gleiche Antwort ergab, wie das beschriebene OPλ-Verfahren. Der DH wurde auf der Basis der Gesamtproteinmenge in der Hydrolysemischung (nicht auf der Basis des löslichen Proteins) berechnet.
  • Ein Volumen von 25 μl eines geeignet verdünnten Überstandes wurde mit 20 μl OPA-Reagens in einer Mikroplattenvertiefung gemischt und für exakt 2 Minuten bei 25°C reagieren gelassen. Die Extinktion bei 340 nm wurde in einem Mikroplattenleser gemessen und verglichen mit der Extinktion einer 95 mM L-Serinstandardlösung nach Abzug des Blindwertes (Wasser, welches mit OPA-Reagens reagiert hat). Um den wahren DH zu bestimmen, wurden die Serinäquivalente, welche in den Überständen gemessen wurden, mit den Faktoren korrigiert, welche von Adler-Nissen für das Trinitrobenzensulfonsäure-Verfahren vorgeschlagen wurden (Adler-Nissen, 1997, Agricultural and Food Chemistry 17: 1256), welches die gleiche Antwort ergab wie das beschriebene OPA-Verfahren. Der Hydrolysegrad wurde auf der Basis der Gesamtproteinmenge in der Hydrolysemischung (nicht auf der Basis des löslichen Proteins) berechnet.
  • Für Soja erhöhte die Zugabe von 2 LAPUs und 5 LAPUs Aminopeptidase II zu 3 LAPUs FLAVOURZYMETM den absoluten DH jeweils um mindestens 8% und 10% oberhalb der Proben mit 3 LAPUs FLAVOURZYMETM alleine.
  • Für Gluten erhöhte die Zugabe von 2 LAPUs und 5 LAPUs Aminopeptidase II zu 3 LAPUs FLAVOURZYMETM den absoluten DH um jeweils 6% und 9%.
  • Für Gelatine erhöhte die Zugabe von 2 LAPUs und 5 LAPUs Dipeptidaminopeptidase II zu 3 LAPUs FLAVOURZYMETM den absoluten DH um jeweils 4,9% und 5,3%.
  • Für Kasein erhöhte die Zugabe von 1 und 2 LAPUs Aminopeptidase II zu 3 LA-PUs FLAVOURZYMETM den absoluten DH jeweils um 7% und 9% über die Zugabe von 3 LAPUs FLAVOURZYMETM alleine.
  • Beispiel 18: Hydrolyse von Sojaprotein mit Aspergillus oryzae Aminopeptidase II
  • Sojaprotein in der Form von entfettetem Sojabohnenmehl wurde auf einer 10 ml-Skala (Mini-Hydrolyse) mit einem Anfangs-pH von 7,0 und einer Proteinkonzentration von 2% hydrolysiert. Die Hydrolysezeit und -temperatur betrugen jeweils 18 Stunden und 50°C. Die Enzyme wurden bei 85°C für 5 Minuten inaktiviert und die Hydrolysate wurden zentrifugiert. Die Überstände wurden auf den DH hin analysiert, unter Verwenden des OPA-Verfahrens. Der DH wie definiert, wie beschrieben von Adler-Niessen (1986, Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers) wurde bestimmt durch eine Reaktion des Überstandes mit OPA (ortho-Phthaldialdehyd, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gemäß Church et al., 1983, Journal of Dairy Science 66: 1219–1227. Für das OPA-Reagens wurden 160 mg OPA in 4 ml Ethanol aufgelöst und in eine 200 ml-Volumenflasche transferiert, welche eine Lösung aus 7,62 g Dinatriumtetraboratdecahydrat, 200 mg Natriumdodecylsulfat und 176 mg Dithiothreitol enthielt, und die Flasche wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Ausgewählte Proben wurden auf den Gehalt an freien Aminosäuren hin analysiert, unter Verwenden des Pico-Tag HPLC-Verfahrens (Waters Associates, Milford, MA) gemäß der Instruktionen des Herstellers.
  • Die Dosierungen der Enzyme zu jeder Hydrolyseflasche, welche 200 mg Sojaprotein enthielten, sind in Tabelle 4 unten dargestellt. Die Dosierung von FLAVOURZYMETM 1000L betrug in Prozent ("in percent") des Sojaproteinsubstrats, so dass 1,5% FLAVOURZYMETM 1000L 3 mg FLAVOURZYMETM 1000L, zugefügt zu 200 mg Sojaprotein, entspricht. Zusätzlich zu FLAVOURZYMETM 1000L wurde 1,5% ALCALASE® 2.4L zu allen Hydrolyseflaschen hinzugegeben, welches 3 mg pro 200 mg Sojaprotein entspricht. Die Aminopeptidase II wurde rekombinant hergestellt in Aspergillus oryzae, wie in Beispiel 10 beschrieben, und entsprechend aufgereinigt. Die Aminopeptidase II-Lösung hatte einen A280 von 8,1 und einen geschätzten Proteingehalt von 5 mg/ml von der Aminosäurebestimmung.
  • Die Resultate der DH-Analyse werden in Tabelle 4 dargestellt. Der DH wurde von der Gesamtproteinkonzentration von 2% berechnet – nicht des löslichen Proteingehalts.
  • Tabelle 4. Die DH-Resultate für die Hydrolysate
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Tabelle 5 stellt die relative %-Erhöhung der einzelnen freien Aminosäuren dar über eine Zugabe einer maximalen Aminopeptidase II-Dosierung (0,5 g/kg Sojaprotein) zu einer Hintergrunddosierung von FLAVOURZYMETM und 1,5% ALCALASE® 2.4L. Die Erhöhung wurde relativ zu der Freilassung von freien Aminosäuren, welche von der Hintergrundenzymdosierung resultieren, gemessen.
  • Tabelle 5. Relative Erhöhung an freien Aminosäuren, aufgrund der Zugabe von Aminopeptidase II
    Figure 00530002
  • Figure 00540001
  • Die Resultate stellten dar, dass, wenn Aminopeptidase II zu einer Dosierung von FLAVOURZYMETM (1,5%) plus 1,5% ALCALASE® 2.4L hinzugegeben wurde, Gly die höchste relative %-Erhöhung zeigte, gefolgt von Ser, Asp, Asn, Pro, Cys und Ala. Wenn die Aminopeptidase II zu einer hohen FLAVOURZYMETM-Dosierung (6%) plus 1,5% ALCALASE® 2.4L hinzugegeben wurde, zeigte Pro die höchste relative %-Erhöhung, gefolgt von Asp, Glu, Cys, Gly und Gln.
  • Beispiel 19: Erhöhte Proteinlöslichkeit und Freisetzung von Glutamat durch Desaminierung
  • Weizengluten (WG) wurde von Cargill (JOB 5141) erhalten und desaminiertes Weizengluten (DWG) wurde von StaPro Consultancy B.V., Lemdijk 32, 9422 TH Smilde, NL, erhalten. Es wurden Suspensionen von 8% Protein hergestellt durch ein Mischen von 11 g Gluten mit 89 g Wasser. Der pH wurde auf 6,5 mit NaOH eingestellt. Glutamat/Aspaitat-spezifische Protease (SP446), erhältlich, wie in WO 91/13554 beschrieben, oder Lysin/Arginin-spezifische Protease (SP387), erhältlich, wie beschrieben in WO 89/06270, wurde zu den Suspensionen hinzugegeben. Die Dosierung betrug 0,01 AU/g Protein für SP446 und 0,006 AU/g Protein für SP387. FLAVOURZYMETM (eine unspezifisch wirkende Proteasezubereitung, erhältlich von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark, welche Endo- und Exopeptidaseaktivitäteu enthält, und durch Fermentation von Aspergillus oryzae erhalten wird) wurde zu einigen der Hydrolysate mit einer Dosierung von 20 LAPU/g Protein hinzugegeben. Die Hydrolysate wurden bei 50°C durchgeführt, ohne weitere pH-Einstellung für 18 Stunden. Die Enzyme wurden durch Erhitzen bei 85°C für 15 Minuten inaktiviert. Der pH wurde auf 5 eingestellt und die Hydrolysate wurden zentrifugiert. Der Gehalt an Protein und freiem Glutamat in dem Überstand wurde bestimmt.
  • Der Proteingehalt wurde durch Kjeldahl-Analyse bestimmt, unter Verwenden eines Kjeldahl-Faktors von 6,25.
  • Der Gehalt an freiem Glutamat wurde bestimmt unter Verwenden eines Glutamatbestimmungs-Kits, gemäß der Instruktionen der Hersteller (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN. Das Verfahren wurde zur Verwendung in Mikrotiterplatten angepasst.
  • Wenn Weizengluten (WG) mit desaminierten Weizengluten (DWG) verglichen wurden, demonstrierten die in Tabelle 6 dargestellten Resultate, dass eine Desaminierung die Empfindlichkeit des Gluten gegenüber spezifischen Proteasen erhöht, so dass mehr Protein löslich wurde. Durch die Zugabe von FLAVOURZYMETM mit einer spezifischen Protease wurde die Freisetzung von Glutamat verdoppelt aufgrund der Desaminierung.
  • Tabelle 6
    Figure 00550001
  • Beispiel 20: Enzymatische Desaminierung und Freisetzung von Glutamat
  • Peptidoglutaminase II wurde hergestellt durch ein Wachsen des Bacillus circulans Stamms ATCC 21590 in Schuttelflaschen (400 ml), welche 200 ml eines Medi ums enthielten, zusammengesetzt aus 1% Polypepton, 0,5% Lactose, 0,025% MgSO 4-7H2O, 0,005% FeSO4-7H2O, 0,025% KH2PO 4 und 17% NaP2O4-12H2O (pH eingestellt auf 7,2) bei 30°C für 20 Stunden mit einem Mischen bei 270 rpm. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4.000 rpm in 1 Liter-Flaschen geerntet. Die Zellen wurden dann gefroren.
  • Die Rufreinigung der Peptidoglutaminase II von Bacillus circulans wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die gefrorenen Bacillus circulars Zellen wurden aufgetaut und in Lysispuffer (50 mM Tris/HCl; 25% (w/v) Sucrose; 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert, bis eine homogene Suspension erhalten wurde – 100 g nasse Zellen pro Liter Lysispuffer. Lysozym (10 mg/ml) und DNAse I (Sigma DN-25, 10 mg/ml) wurden in Lysispuffer aufgelöst. Dann wurden 100 ml Lysozymlösung, 10 ml 1,0 M MgCl2 und 1 ml DNAse I-Lösung hinzugegeben, pro Liter Zellsuspension. Die Enzyme wurden für 1 Stunde wirken gelassen.
  • Die Suspension wurde durch eine Seitz-Tiefenfilterplatte ("Seitz depth fetter plate") gefiltert und das Filtrat wurde in einen 10 mM KH2PO4/NaOH, pH 8,0 (Puffer A) auf einer Sephadex G25-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppala, Sweden) transferiert. Die Enzymlösung wurde auf eine SOURCE Q-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) angewendet, äquilibriert in Puffer A und eluiert mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 500 mM) in Puffer A. Fraktionen von der Säule wurden auf eine Peptidoglutaminase II-Aktivität hin analysiert, wie unten beschrieben, und Fraktionen mit einer Aktivität wurden zusammengefügt. Die Extinktion der gepoolten Fraktionen bei 280 nm betrug 1,78, daher wurde der Proteingehalt auf 1,8 mg/ml geschätzt.
  • Die Reinheit des Proteins in dem Glutamiuase II-Pool betrug ungefähr 25%, wie von einem SDS-PAGE-Gel beturteilt wurde. Daher enthielt die Zubereitung ungefähr 0,5 mg/ml reine Peptidoglutaminase II.
  • Die Peptidoglutaminase-Aktivität wurde bestimmt durch ein Messen des gebildeten Ammoniaks während der Hydrolyse von y-Carboxyamid von N-tert-Butoxycarbonyl-Gln-Pro (N-t-BOC-Gln-Pro; SIGMA Nr. B–4403) unter Verwenden des Boehringer-Mannheim-Kits für Ammoniakbestimmung (Cat. Nr. 1112732). In diesem Kit wird Ammoniak durch die Bestimmung des Verbrauchs von NADH durch Glutamatdehydrogenase gemessen und Blindwerte ohne die Zugabe von Nt-BOC-Gln-Pro wurden ebenso angewendet, um den Effekt von anderen NADHverbrauchenden Enzymen zu subtrahieren.
  • Eine Gesamtmenge von 200 mg Weizenglutenprotein wurde zu 9 ml kochendem Wasser hinzugegeben und nach Abkühlen wurde der pH auf 7,0 eingestellt. Dann wurden 250 μl der oben beschriebenen Peptidoglutaminase II-Zubereitung (PEP), hinzugegeben. Die Glutamat/Aspartat-spezifische Protease (SP446), beschrieben in Beispiel 19, wurde hinzugegeben in einer Menge von 0,04 AU/g Protein und FLAVOURZYMETM, beschrieben in Beispiel 19, wurde hinzugegeben in einer Menge von 20 LAPU/g Protein.
  • Die Hydrolyse wurde ohne pH-Einstellung für 18 Stunden bei 50°C fortfahren gelassen. Kontrollen ohne die Zugabe von Peptidoglutaminase wurden ebenfalls laufen gelassen. Die Hydrolysate wurden zentrifugiert und Glutamat wurde, wie in Beispiel 19 beschrieben, gemessen. Der DH wurde, wie in Beispiel 18 beschrieben, gemessen.
  • Die Resultate, wie unten in Tabelle 7 dargestellt, demonstrieren, dass eine Hydrolyse mit der Peptidoglutaminasezubereitung sowohl den DH als auch die Freisetzung von Glutamat erhöht.
  • Tabelle 7
    Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Beispiel 21: Herstellung von reinem Enzymextraktpulver von Sphingomonas capsulata
  • Sphingomonas capsulata IFO 12533 wurde bei 30°C für 9 Stunden mit Belüftung und Bewegung in einem 5 Liter-Fermenter, welcher 3 Liter eines Mediums enthielt, zusammengesetzt aus 0,5% Sucrose, 1% Gelatine, 0,5% Hefeextrakt, 1% Getreideeinweichflüssigkeit ("corn steep liquor"), 0,3% Natriumchlorid, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat-7H2O. Die Zellmasse wurde aus der Kulturbrühe gesammelt und zweimal in 10 mM Tris-HCl-pH 8,0-Puffer gewaschen, welches 43 g Nassgewicht an Zellmasse erzielte. Die Zellmasse wurde in 200 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-Puffer suspensiert und durch Zugabe von Lysozym und Triton X-100 bei Endkonzentrationen jeweils von 1 mg/ml und 0,1% lysiert und die Lösung wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Lösung wurde ultrabeschallt und dann bei 15.000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückerhalten (200 ml) und Protaminsulfat wurde zu einer Endkonzentration von 0,1% hinzugegeben, um die Nukleinsäuren zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation in der gleichen Weise verworfen und die resultierende Lösung wurde als Enzymextrakt verwendet.
  • Die Aktivität des rohen Enzymextrakts wurde bestimmt in Richtung auf verschiedene synthetische Peptide, wie in Tabelle 8 dargestellt. Die Resultate demonstrieren, dass das rohe Enzymextrakt Dipeptidylpeptidase N-, Leucinaminopeptidase-, Glycinaminopeptidase- und Prolyloligopeptidaseaktivität besitzt.
  • Tabelle B. Aktivitäten von verschiedenen Peptidaseaktivitäten in der rohen Enzymextraktlösung
    Figure 00580002
  • Figure 00590001
  • Das rohe Enzymextrakt wurde durch ein Hinzugeben eines gleichen Volumens kalten Acetons präzipitiert. Das Enzympräzipitat wurde in einem kleinen Volumen von 10 mM Phosphat-pH 6,0-Puffer aufgelöst und unlösliche Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt. Das Enzym wurde lipophilisiert, um ein rohes Enzympulver herzustellen.
  • Beispiel 22: Aufreinigung einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase II aus rohem Enzympulver
  • Das in Beispiel 21 beschriebene rohe Enzympulver wurde in 20 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer aufgelöst und verdünnt, bis die Leitfähigkeit der Probe äquivalent zu dem Ladepuffer, 20 mM Phosphat pH 7,0, war. Die Probe wurde auf ein Pharmacia Q-Sepharose oder eine Mono-Q-Säule geladen, voräquilibriert mit 20 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer. Die Durchflösse von diesen Säulen wurden auf eine Aminopeptidaseaktivität hin überpruft mit Alanin-para-nitroanilid (Ala-pNA), unter Verwenden der unten beschriebenen Vorgehensweise.
  • Eine Stammlösung aus 100 mg Ala-pNA pro ml in Dimethylsulfoxid wurde mit 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer verdünnt auf eine Konzentration von 2 mg pro ml. Die Reaktion der Aminopeptidase mit para-Nitroanilid wurde initiiert, wenn 10–50 μg Aliquot der Enzymlösung zu 200 μl in der Substratlösung in einer Mikrotiterplattenvertiefung hinzugegeben wurde. Die Analyse der Anfangshydrolysegrade des para-Nitroanilids wurde bei 405 nm bei Raumtemperatur in einem THERMOmax Mikroplattenleser (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA).
  • In dem Durchfluss war eine Aminopeptidaseaktivität vorhanden. Der Durchfluss wurde unter Verwenden einer DIAFLO® PM 10-Ultrafiltrationsmembran (Amicon, Inc., USA) konzentriert und der pH des konzentrierten Durchflusses wurde dann auf pH 6,0 eingestellt unter Verwenden von 70 mM Acetat-pH 4,0-Puffer.
  • Der konzentrierte Durchfluss wurde auf eine Pharmacia Mono S 5/5 vorbepackte 7 × 50 mm-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) aufgetragen, welche mit 50 mM MES-pH 6,0-Puffer voräguilibriert wurde. Die Fraktionen wurden wie oben auf eine Aminopeptidasealctivitität hin überprüft. Die gebundene Aminopeptidaseaktivität wurde mit einem Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 50 mM MES pH 6,0-Puffer eluiert. Die Fraktionen mit einer signifikanten Aktivität wurden dann wieder unter Verwenden einer PM 10-Ultrafiltrationsmembran konzentriert und dann in 50 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer, welcher 0,5 M (NH4)2SO4 enthielt, äquilibriert.
  • Die konzentrierte Probe wurde dann auf eine Phenyl Superose Säule geladen, welche mit 50 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer, welcher 0,5 M (NH4)2SO4 enthielt, voräquilibriert. Die Enzyme wurden mit einem Gradienten von 0,5 M Ammoniumsulfat, welches 50 mM Phosphatpuffer enthielt, bis 50 mM Phosphatpuffer, welcher kein Ammoniumsulfat enthielt, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt.
  • Eine SDS-PAGE-Analyse der aufgereinigten Aminopeptidase offenbarte eine Bande mit einem Molekulargewicht von 67 kDa. Die aufgereinigte Aminopeptidase wurde mit Sphingomonas capsuluta Aminopeptidase I benannt.
  • Beispiel 23: Aufreinigung einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I aus rohem Enzympulver
  • Das in Beispiel 21 beschriebene reine Enzympulver wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine CM Sepharose CL-6B Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), welche mit 15 mM Natriumphosphat-pH 6,0-Puffer voräquilibriert wurde, geladen. Die Aminopeptidaseaktivität wurde mit einem linearen Gradienten von 15 mM bis 60 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) eluiert. Es wurden Fraktionen von 7,4 ml gesammelt und auf Aminopeptidaseaktivität hin überprüft, wie in Beispiel 22 beschrieben.
  • Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen 15 mM Phosphat-pH 6,0-Puffer dialysiert. Das Dialysat wurde regelmäßig aufeinanderfolgend auf eine Hydroxylapatitsäule aufgeladen, welche mit 15 mM Natriumphosphat-pH 6,0-Puffer äquilibriert wurde. Die Aminopeptidase I-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten von 15 mM bis 300 mM Natriumphosphat-pH 6,0-Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf eine Aminopeptidaseaktivität hin überprüft. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.
  • Beispiel 24: Rufreinigung einer Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I
  • Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I wurde aus einem Kulturbrüheüberstand aufgereinigt, welcher durch eine Kultivierung des Sphingomonas capsulata-Stamm IFO 12533 für 15 Stunden bei 31°C. 250 rpm und einem Anfangs-pH von 7,45 in 1,5 Liter Medium, welches pro Liter zusammengesetzt war aus 10 g Bactopepton, 5 g Hefeextrakt, 3 g NaCl, 2 g K2HPO4, 0,1 g MgSO4-7H20 und 5 g Glucose (separat autoklaviert), produziert wurde.
  • Die Aminopeptidaseaktivität wurde, wie in Beispiel 22 beschrieben, mit Alaninpara-nitroanilid (Ala-pNA) gemessen.
  • Der Kulturbrühenüberstand (ungefähr 1 Liter) wurde zubereitet durch Zentrifugation, gefiltert unter Verwenden eines Whatman-Glasmikrofaserfilters (Whatman, Maidstone, England), gefiltert unter Verwenden von "Nalgene Filterware", ausgestattet mit einem 0,22 mm Filter, gefiltert und unter Verwenden eines Amicon Spiral-Ultrafiltrationssystem (Amicon, New Bedford, MA, USA) konzentriert, wurde äquilibriert mit 10 mM Natriumphosphat-pH 6,0-Puffer, bis die Leitfähigkeit und der pH gleich zu dem Ladepuffer, 50 mM MES pH 6,0, war. Die gefilterte Lösung wurde auf eine 24 × 390 mm Säule geladen, welche ungefähr 180 ml SP-Sepharose, Fast Flow (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) enthielt, welche mit 50 mM MES-pH 6,0-Puffer voräquilibriert war. Protein mit Aminopeptidase I-Aktivität wurde mit einem 240 ml Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 50 mM MES-pH 6,0-Puffer eluiert. Die Fraktionen mit Aminopeptidase I-Aktivität wurden gepoolt, entsalzen unter Verwenden einer DIAFLOTM PM 10-Ultrafiltrationsmembran (Amicon, New Bedford, MA, USA) und mit 20 mM Natriumphosphat-pH 7,0-Puffer äquilibriert.
  • Die gepoolte Lösung wurde dann auf eine Pharmacia MonoQ Beads-Säule, welche mit 20 mM Natruimphosphat-pH 7,0-Puffer voräguilibriert war, geladen. Protein mit Aminopeptidase I-Aktivität band nicht an die Säule und wurde in dem Durchfluss gesammelt. Der Durchfluss wurde unter Verwenden eines PM 10-Membransystems, i ie oben, konzentriert und der pH wurde mit 70 mM Natriumacetat-pH 4,0-Puffer auf 6,0 eingestellt.
  • Der konzentrierte Durchfluss wurde auf eine Pharmacia Mono S-Säule, welche mit 50 mM MES-pH 6,0-Puffer voräquilibriert wurde, geladen. Die Aminopeptidase wurde mit einem 60 ml Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 50 mM MES-pH 6,0-Puffer eluiert. Die Fraktionen mit signifikanter Ala-pNA-Aktivität wurden dann gepoolt, konzentriert und mit 50 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer, welcher 0,5 M (NH4)2SO4 enthielt, äquilibriert, unter Verwenden eines PM 10-Membransystems, wie oben.
  • Schließlich wurde die konzentrierte Probe auf eine Pharmacia Phenyl Superose 5/5 vorbepackte 7 × 50 mm-Säule (Pharnacia Biotech AB, Uppsala, Schweden), welche mit 50 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer, welcher 0,5 M (NH4)2SO4 enthielt, geladen. Protein mit Aminopeptidase I-Aktivität wurde dann mit einem 30 ml Gradienten von 0,5 bis 0 M (NH4)2SO4 in 50 mM Phosphat-pH 7,0-Puffer eluiert. Die Fraktionen, welche eine Aminopeptidase I-Aktivität enthielten, wurden durch SDS-PAGE analysiert und dann gepoolt.
  • Die SDS-PAGE-Analyse der aufgereinigten Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I offenbarte eine Bande mit einem Molekulargewicht von 67 kDa.
  • Beispiel 2: Aminosäuresequenzierung einer Sohingomonas capsulata Aminopeptidase I (67 kDa)
  • Eine 20 μl Probe der aufgereinigten Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I, beschrieben in Beispiel 22, wurde elektrophoresiert und nachfolgend Blottransferiert auf eine PVDF-Membran unter Verwenden von 10 mM CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure) pH 11 in 10% Methanol für 2 Stunden. Die PVDF-Membran wurde mit 0,1% Coommassie-Blue R-250 in 40% Methanol/1% Essigsäure für 20 Sekunden angefärbt und in 50% Ethanol entfärbt, um die Proteinbanden zu beobachten. Die Hauptbande von 67 kDa wurde ausgeschnitten und einer aminoterminalen Sequenzierung in einem Applied Biosystems Model 476A-Proteinseguenzierer unter Verwenden einer Blot-Kartusche („blot cartridge") und einer Flüssigphasen-TFA-Förderleistung („liquid phase TFA delivery") gemäß den Instruktionen des Herstellers, unterworfen. Für das Protein wurde gefunden, dass es N-terminal blockiert wurde zu Edman-Sequenzierzungschemie ("Edman sequencing chemistry").
  • Eine 1,0 ml Probe der aufgereinigten Aminopeptidase II, beschrieben in Beispiel 22, wurde in einem Savant Speed Vac AS160 getrocknet und dann mit 300 μl 70% Ameisensäure (wässrig) wiederhergestellt. Einige Kristalle Cyanbromid wurden hinzugegeben und bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht inkubiert. Die Probe wurde wiedergetrocknet in dem Speed Vac und wiederhergestellt in Tricinprobenpuffer (Novex, San Diego, CA, USA). Die Cyanbromidspaltungsfraginente wurden unter Verwenden eines 10 bis 20%-igen Polyacrylamidgel, aufgetrennt in Banden von 42, 30, 17, 15, 10, 6 und 4 kDa und Blot-transferiert auf eine PVDF-Membran. Die 6, 10, 15, 17, 30 und 42 kDa-Banden wurden ausgeschnitten und einer aminoterminalen Sequenzierung unterworfen. Die Nterminale Sequenz für die 10 kDa-Bande wurde bestimmt, die folgende Sequenz zu enthalten, während die N-terminalen Sequenzen der anderen Banden nicht schlüssig waren: AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI (SEQ ID NO: 11).
  • Beispiel 26: Charakterisierung der Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I (67 kDa)
  • Stammlösungen von 100 mg von jedem para-Nitroanilid pro ml Dimethylsulfoxid wurden mit 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer verdünnt auf Konzentrationen von 2 mg pro ml. Wo die Substrate unvollständig löslich waren, wurden ihre Suspensionen verwendet (dargestellt mit einem Stern in Tabelle 9 unten). Die Reaktion der Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I mit jedem para-Nitroanilid wurde initiiert, wenn ein 10 μl Aliquot der Enzymlösung in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 zu 190 μl einer Substratlösung in einer 96 Vertiefungsmikrotiterplatte hinzugegeben wurde. Analyse der Anfangsraten der Hydrolyse der para-Nitroanilide wurde bei 405 nm und 25°C überwacht in einem THER-MOmax-Mikroplattenleser (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA). Die Resultate (Tabelle 9) stellen dar, dass die Aminopeptidase I bevorzugt Ala-pNA hydrolysierte aber ebenfalls G1y-pNA hydrolysierte. Unter den Dipeptidsubstraten hydrolysierte die Aminopeptidase I Gly-Phe-pNA jedoch schneller als Ala-AlapNA. Tabelle 9. Substratspezifität der Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I
    Aminosäure p-Nitroanilide Relative Aktivität (%)
    Ala 100
    Met 24
    Gly* 20
    Leu 18,5
    Glu* 6
    Asp 4,5
    Lys 6
    Ile 0,5
    Val 0,5
    Phe* 0
    Pro 0
  • Das pH-Optimum für die 67 kDa Aminopeptidase wurde bestimmt unter Verwenden des folgenden Protokolls. Die Pufferlösungen bei verschiedenen pHs wurden durch ein Hinzugeben von destilliertem Wasser zu 4,25 g Natriumacetat und 3,78 g Tris (freie Base) zu einem Endvolumen von 250 ml und einem Einstellen des pH auf 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 5,80, 5,5 und 5,0 mit 36,5–38 %-iger HCl zubereitet. Bei jedem pH wurden Aliquots von 10 ml entfernt. Ein 20 μl Volumen einer 100 mg/ml Lösung Ala-pNA in DMSO wurde zu 980 μl jeder Pufferlösung hinzugegeben. Der pH wurde dann mit 8,5, 8,0, 7,57, 7,30, 7,09, 6,68, 6,14 und 5,25 für die Pufferlösungen bestimmt, nach der Zugabe des Substrats. Eine andere Substratlösung bei einer Konzentration von 2 mg/ml wurde bei de n verschiedenen pHs zubereitet. Die Reaktion wurde initiiert durch die Zugabe von 10 μl Enzymlösung, welche 5-fach verdünnt war in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, zu 200 μl Substrat bei den verschiedenen pHs bei Raumtemperatur und wurde bei 405 nm überwacht.
  • Die in Tabelle 10 dargestellten Resultate demonstrierten, dass die Aminopeptidase I ein pH-Optimum in dem Bereich von 5,3 bis 8,5, und bevorzugter in dem Bereich von 7,0 bis 7,5 (siehe Figur 6) besitzt. Es war keine detektierbare Autohydrolyse vou Ala-pNA in dem pH-Bereich 5,25–8,5 vorhanden. Bei pH 5,5 folgte die Hydrolyse von Ala-pNA, katalysiert durch die Aminopeptidase I, nicht den Michaelis-Menten-Kinetiken, wo der scheinbare Km und Vmax negative Werte hatte, aufgrund der Aktivierung des Enzyms durch ein Substrat. Bei pH 7,5 betrug der Km 2,5 mM. Tabelle 10. pH-Profil der Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I
    pH Relative Aktivität (%)
    5,25 24,9
    6,14 56,4
    6,68 78,4
    7,09 99,4
    7,30 100
    7,57 92,8
    8,0 61
    8,49 24,2
  • Das Temperaturoptimum wurde unter Verwenden von Ala-pNA als Substrat in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer über den Temperaturbereich von 30°C bis 55°C bestimmt. Die Resultate stellten dar, dass die Aminopeptidase I ein Temperaturoptimum in dem Bereich von 35°C bis 46°C, und bevorzugter in dem Bereich von 40°C bis 45°C bei pH 7,5, besitzt (siehe 7).
  • Die Temperaturstabilität der Aminopeptidase I wurde durch ein Inkubieren des Enzyms für 20 Minuten in 50 mM Natriumphosphat-pH 7,5-Puffer bei Temperaturen in dem Bereich von 35°C bis 55°C, gefolgt von einem Abkühlen auf Eis und einem Messen der restlichen Aktivität unter Verwenden von Ala-pNA als Substrat bei pH 7,5, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Resultate (siehe 8) stellten dar, dass die Aminopeptidase ungefähr 100% stabil bis 40°C bei pH 7,5 war. Bei 45°C behielt das Enzym ungefähr 60% restliche Aktivität, während bei 50°C das Enzym komplett inaktiviert war.
  • Beispiel 27: Vergleich zwischen dem DH-erhöhenden Effekt von roher und aufgereinigter Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I
  • Der DH-erhöhende Effekt der Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I (67 kDa wurde in einer Sojaproteinhydrolyse bewertet und verglichen mit der Leistung ("performance") des rohen Enzympulvers, zubereitet wie in Beispiel 21.
  • Der Hydrolysegrad (DH) des Sojaproteins wurde wie folgt bestimmt. Der DH, definiert wie beschrieben von Adler-Niessen (1986, Enzymic Hydrolysis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers) wurde durch eine Reaktion des Überstands mit OPA (ortho-Phthaldialdehyd, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bestimmt, im Wesentlichen wie beschrieben von Church et al., 1983, Journal of Diary Science 66: 1219–1227 mit Korrektionsfaktoren, wie bestimmt von Adler-Niessen, 1979, Agricultural and Food Chemistry 27: 1256–1262.
  • Die Aminopeptidase I wurde in erhöhender Dosierung zu entweder einem niedrigen Hintergrund (1,5% des Substratproteins) oder einem hohen Hintergrund (6% des Substratproteins) zu FLAVOURZYME 1000LTM und einer Dosierung von ALCALASE 2.4L® von 1,5% des Substratproteins hinzugegeben. Die Experimente wurden wie unten beschrieben durchgeführt:
    Die Hydrolyse wurde durchgeführt auf einer 10 ml Skala bei 50°C für 18 Stunden. Der Anfangs-pH betrug 7 mit keiner pH-Wiedereinstellung während der Hydrolyse. Die Inaktivierung des Enzyms wurde durchgeführt bei 85°C für 3 Minuten in einem Wasserbad. Die Substratkonzentration betrug 2% Sojabohnenmehl. Das Substrat wurde hitzebehandelt in einem Wasserbad bei 85°C für 3 Minuten. Die verwendeten Enzyme waren FLAVOURZYME 1000LTM, ALCALASE 2,4L®, reines Enzympulver (siehe Beispiel 21) und die aufgereinigten Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I, beschrieben in Beispiel 24.
  • Die verwendeten Aminopeptidasedosierungen wurden auf Alanyl-Aminopeptidase-Einheiten (alanyl-aminopeptidase units, AAU) basiert, bestimmt durch die Hydrolyse von Ala-pNA bei pH 7,5. Eine AAU-Einheit der Aminopeptidase I wird bestimmt als die Enzymmenge, welche 1,0 Nlikromol Ala-pNA pro Minute in 9,1 mM Lösung Ala-pNA bei pH 7,5, 22°C, und einer Ionenstärke von 50 mM hydrolysiert.
  • Die spezifische Aktivität der aufgereinigten Aminopeptidase I betrug ungefähr 12 AAU/mg Enzym. Daher entspricht zum Beispiel eine Dosierung von 0,24 AAU pro 200 mg Sojaprotein 0,1 g Enzym pro kg Sojaprotein.
  • Der DH als Funktion der Dosierung von AAU wird in 9 darstellt, für eine niedrige Hintergrunddosierung von FLAVOURZYMETM und in 10 für eine hohe Hintergrunddosierung von FLAVOURZYMETM.
  • 9 und 10 stellen dar, dass die Hydrolysate beinahe mit AAU gesättigt werden, bei der höchsten Dosierung von AAU. Das rohe Enzym war in der Lage, den DH von 44% auf 72% zu erhöhen, wenn es zu einer niedrigen Dosierung von FLAVOURZYMETM hinzugegeben wurde. Die aufgereinigte Aminopeptidase I erhöhte den DH auf 61–62%. Daher war die aufgereinigte Aminopeptidase I verantwortlich für (62–44)/(72–44) × 100% = 64% des DH-erhöhenden Effektes des rohen Enzyms. Das rohe Enzym erhöhte den DH von 61% auf 77%, wenn es zu einer hohen Dosierung von FLAVOURZYMETM hinzugegeben wurde. Die aufgereinigte Aminopeptidase I erhöhte den DH auf 71%. Daher war die aufgereinigte Aminopeptidase I verantwortlich für (71–61)/(77–61) × 100% = 63% des erhöhenden Effekts des reinen Enzyms.
  • Eine Alternative zu der Zugabe von Aminopeptidase I ist die Zugabe von mehr FLAVOURZYMETM. Die Zugabe von 0,5% extra FLAVOURZYMETM zu der Hintergrunddosierung von 1,5% erhöhte den DH von 44% auf 48%. Der Effekt des Hinzugebens von Aminopeptidase I wurde berechnet mit (62–48)/(72-48) × 100% = 58% des Effekts des rohen Enzyms zu sein.
  • Auf ähnliche Weise erhöhte die Zugabe von 1% extra FLAVOURZYMETM zu der Hintergrunddosierung von 6% FLAVOURZYMETM den DH von 61% auf 63%. Der Effekt der Aminopeptidase I wurde berechnet (71–63)/(77–63) × 100% = 57% des Effekts des rohen Enzyms zu sein.
  • Der höchste DH, der erhalten wurde, betrug 77%. Da der DH-Wert auf das Gesamtprotein basiert war und nicht auf das lösliche Protein, betrug die Proteinlöslichkeit um 85%. Daher betrug der DH in dem löslichen Protein um 91%, welches sehr nahe zu 100% war.
  • Beispiel 28: Freie Aminosäure-Analyse
  • Die %-relative Erhöhung der einzelnen freien Aminosäuren (free amino acids, FAA) aufgrund von AAU-Zugaben, sind in Tabelle 11 dargestellt. Hyp, Methioninsulfonsäure und Trp wurden in die Tabelle nicht eingeschlossen aufgrund sehr fluktuierender und unbestimmter Ergebnisse.
  • Tabelle 11. Relative Erhöhung der FAA aufgrund der Zugabe von Aminopeptidasen
    Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Die Resultate stellten dar, dass, wenn die rohe oder aufgereinigte Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I hinzugegeben wurde, Gyl die Aminosäure war, welche die höchste Erhöhung zeigte. Andere Aminosäuren, welche eine erhöhte Freisetzung zeigten, waren Ala, Glu, Gln, Asp und Ser, jedoch erschien das rohe Enzym für diese Aminosäuren mehr freizusetzen als die aufgereinigte Aminopeptidase I alleine, vermutlich aufgrund des Vorhandenseins von anderen Aminopeptidasen in dem rohen Enzym.
  • Es wurde ein hohes DH-Hydrolysat hergestellt durch die Verwendung einer hohen Dosierung von FLAVOURZYMETM. Der gleiche hohe DH und Freisetzung von FAA wurde erreicht durch ein Verwenden einer niedrigen Dosierung von FLAVOURZYMETM, ergänzt mit 67 kDa Aminopeptidase I oder dem rohen En zym. Gemäß Tabelle 12 wird ein Hydrolysat, welches durch die Verwendung einer geringen Dosierung von FLAVOURZYMETM, ergänzt mit 67 kDa Aminopeptidase I, erhalten wurde, ein höheres Level von besonders Gly, jedoch ebenfalls Ala, Glu und Asp und einen niedrigeres Level von Met, Pro und Ile besitzen, als verglichen mit den Hydrolysaten, welche durch ein Verwenden einer hohen Dosierung von FLAVOURZYMETM allein erhalten wird.
  • Beispiel 29: DH-erhöhender Effekt der Sphingomonas capsulata Aminopeptidase I in einer Gelatinehydrolyse
  • Der DH-erhöhende Effekt der Sphingomonas cnpsulata Aminopeptidase I wurde in Gelatinehydrolyse getestet.
  • Die Aminopeptidase I wurde in erhöhten Dosierungen zu entweder einem niedrigen oder einem hohen Hintergrund von FLAVOURZYME und ALCALASE® hinzugegeben und wie in Beispiel 27 durchgeführt.
  • Die Hydrolyse wurde in 200 μl Reaktionen in Eppendorf-Röhrchen durchgeführt. Das Substrat Gelatine (Merck) wurde in destilliertem Wasser bei 85°C für 5 Minuten aufgelöst. Nach einem Abkühlen auf 50°C wurde der pH auf 6,5 eingestellt. Die Endkonzentration der Gelatine wurde auf 2% nach der Zugabe der Enzyme eingestellt. Die Substratkonzentration in jeder Reaktion wurde mit 4 mg berechnet.
  • Die verwendeten Enzyme waren FLAVOURZYMETM, ALCALASE®, reines Enzympulver, aufgereinigte Aminopeptidase I. Es wurden die Glycinaminopeptidase-Einheiten (glycine aminopeptidase unit, GAPU) sowohl von rohem als auch gereinigtem Enzym gemessen, in 50 mM Tris-HCl-pH 7,5-Puffer bei 37°C unter Vewenden von G1y-pNA als Substrat. Die Aminopeptidase I wurde bei 37°C und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) überprüft. Gly-pNA (Bachem Feinchemikalien AG, Bubendorf, Schweiz) wurde in 40% Dioxan bei einer Konzentration von 2,5 mg/ml aufgelöst und 1,5 Volumen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) wurde zu einer Substratkonzentration von 1 mg/ml hinzugegeben. Die Enzymprobe wurde in 500 μl des gleichen Puffers verdünnt und 100 μl der Substratlösung wurden hinzugegeben und bei 37°C für 5 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 300 μl 1 M Natriumacetat-pH 4,0-Puffer beendet. Für die Blindreaktion wurde die Stop-Lösung zu der Enzymlösung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 37°C inkubiert und dann wurde die Substratlösung hinzugegeben. Die Extinktion bei 410 nm wurde sowohl für die Probe als auch die Blindreaktionen gemessen. Die Enzymaktivität wurde unter Verwnden des molekularen Extinktionskoeffizienten bei 410 nm für pNA als 9480 M–1 cm i berechnet. Eine Einheit GAPU wurde definiert als die Enzymmenge, die 1 Mikromol Gly-pNA bei 37°C pro Minute unter den oben beschriebenen Bedingungen hydrolysiert. Die spezifischen Aktivitäten der verwendeten rohen und aufgereinigten Aminopeptidase I betrugen jeweils 0,725 GAPU/mg und 6,45 GAPU/mg. Die Enzyme wurden zu dem 4 mg Protein gemäß des Schemas in Tabelle 12 dosiert.
  • Tabelle 12
    Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Die Enzym/Substrat-Verhältnisse sind in Klammern angegeben, nach den Enzymmengen, welche als Gewicht dargestellt werden.
  • Die Hydrolysereaktionen wurden bei 50°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Enzyme wurden bei 85°C für 5 Minuten inaktiviert, gefolgt durch eine Zentrifugation. Der DH wurde auf der Basis des Gesamproteingehalts des Hydrolysats unter Verwenden des OPA-Verfahrens berechnet.
  • Der DH-Erhöhungseffekt der aufgereinigten Aminopeptidase I, dargestellt in Figuren 11 und 12, demonstrierte, dass die Zugabe des rohen und des gereinigten Enzyms (0,2 U/4 mg Gelatine) zu dem geringen FLAVOURZYME -Hintergrund den DH von 38% auf jeweils 67% und 61% erhöhte. Der DH-Erhöhungseffekt war meistens bei dieser Dosis gesättigt.
  • Wenn die Dosis von FLAVOURZYMETM auf 7% erhöht wurde, erhöhte sich der Kontroll-DH auf 43%. Jedoch betrug der DH, welcher mit der aufgereinigten Aminopeptidase I erhalten wurde, 61%, welches sich meistens deckte mit solchen, welche in dein niedrigen FLAVOURZYMETM-Hintergrund erhalten wurden.
  • Die Resultate zeigten an, dass die Sphigomonas capsulata Aminopeptidase I-Proteine zu einem extrem hohen DH hydrolysieren. Weiterhin kann durch ein Verwenden der Aminopeptidase I die Dosierung anderer proteolytischer Enzyme reduziert werden, um den gleichen DH zu erhalten.
  • Hinterlegung von biologischen Materialien
  • Das folgende biologische Material ist hinterlegt worden unter den Bedingungen des Budapester Vertrages mit der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 181 University Street, Peoria, Illinois, 61604 und die folgende Zugangsnummer wurde vergeben:
  • Figure 00740001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001

Claims (30)

  1. Verfahren zum Herstellen eines Proteinhydrolysats, welches das Hinzufügen von einem oder mehreren Polypeptid/en mit Glycin-freisetzender Aktivität und einer oder mehreren zusätzlichen Proteasen zu einem proteinhaltigen Material umfasst, bei dem die Menge an hergestelltem Glycin größer ist als die Menge an Glycin, das durch die eine oder mehreren zusätzlichen Proteasen allein unter denselben Bedingungen hergestellt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem der Prozentanstieg an Glycin zwischen 25–400%, bevorzugt 50–350%, besonders bevorzugt 100–350%, ganz besonders bevorzugt 150–350% und am meisten bevorzugt 200–350% beträgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem der Hydrolysegrad zwischen 35–90%, bevorzugt 45–80%, besonders bevorzugt 50–75%, ganz besonders bevorzugt 55–75% und am meisten bevorzugt 60–70% beträgt.
  4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, in welchem das Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 50 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ II NO: 2 hat; (b) einem Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, welche unter mittleren stringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ II NO: 1, (ü) deren komplementärem Strang oder (iii) einer Untersequenz hiervon hybridisiert; (c) eine allelische Variante von (a) oder (b); und (d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), in welchem das Fragment Aninopeptidase-Aktivität hat; und (e) einem Polypeptid mit Aminopeptidase-Aktivität, mit physiochemischen Eigenschaften von (i) einem pH-Optimum in dem Bereich von ca. pH 7,27 bis ca. pH 10,95, bestimmt bei Raumtemperatur in Gegenwart von Ala-paranitroanilid; (ii) einer Temperaturstabilität von 90% oder mehr, relativ zur Anfangsaktivität, bei pH 7,5, bestimmt nach Inkubation für 20 Minuten bei 60° C in der Abwesenheit eines Substrats; und (iii) einer Aktivität in Richtung auf Xaapara-nitroanilid, in welchem Xaa ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Leu, Glu, Gly, Ala und Pro.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die einen Identitätsgrad zu der Aminosäuresequenz von SEQ II NO: 2 von mindestens ca. 50%, bevorzugt mindestens ca. 60%, bevorzugt mindestens ca. 70%, besonders bevorzugt mindestens ca. 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens ca. 90%, am meisten bevorzugt mindestens ca. 95% und ganz besonders am meisten bevorzugt mindestens ca. 97% hat, welches Aminopeptidase-Aktivität hat (nachfolgend "homologe Polypeptide").
  6. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem das Polypeptid von einem Aspergillus oryzae Stamm erhalten wird und am meisten bevorzugt von Aspergillus oryzae ATCC 20386 oder einem Mutantenstamm hiervon, z. B., das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2.
  7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, bei dem das Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 50 Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 hat; (b) einem Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, welche unter mittleren stringenten Bedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 10, (ii) ihrem komplementären Strang oder (iii) einer Untersequenz hiervon hybridisiert; (c) einer allelischen Variante von (a) oder (b); und (d) einem Fragment von (a), (b) oder (c), in welchem das Fragment Aminopeptidase-Aktivität hat; und (e) einem Polypeptid, welches (a) Aminopeptidase-Aktivität in dem pH-Bereich zwischen pH 5,0–8,5, gemessen bei 37° C hat, (b) einen isoelektrischen Punkt (pI) in dem Bereich von 7,4–8,5; (c) Aminopeptidase-Aktivität in dem Temperaturbereich von 20–55° C, gemessen bei pH 7,5 unter Verwendung von Gly-pNA in Tris-HCl-Puffer hat; (d) Ala-pNA, Gly-pNA, Leu-pNA, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA und Val-pNA hydrolysiert; (e) weder Phe-pNA noch Pro-pNA hydrolysiert; (f) durch Phenylmethansulfonylfluorid nicht inhibiert wird, durch EDTA, Diisopropylfluorphosphat, p-Chlorquecksilberbenzoesäure und Jodessigsäure leicht inhibiert wird, durch o-Phenanthrolin vollständig inhibiert wird und/oder (g) von einem Stamm, zugehörig zu Sphingomonas erhalten wird und eine Molekularmasse von 67 ± 5 kDa hat.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, in welchem das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die einen Identitätsgrad zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 von mindestens ca. 50%, bevorzugt mindestens ca. 60%, bevorzugt mindestens ca. 70%, besonders bevorzugt mindestens ca. 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens ca. 90%, am meisten bevorzugt mindestens ca. 95% und ganz besonders am meisten bevorzugt mindestens ca. 97% hat, welches eine Aminopeptidase-Aktivität hat (nachfolgend "homologe Polypeptide").
  9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Polypeptid von einem Sphingomonas capsulata Stanzen erhalten wird, z. B., Sphingomonas capsulata IFO 12533 ist, welches ein Bakterienstamm ist, der bei dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan, aufbewahrt wird, z. B., das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 (das vorhergesagte Signalpeptid besteht aus den ersten 32 Aminosäuren).
  10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4, 5, 7 oder 8, in welchem das Polypeptid von einer Bakterienquelle erhalten wird, wie einem grampositiven Bakterium, z. B., einem Bacillus Stamm, z. B., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulars, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis; oder einem Streptomyces Stamm, z. B., Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus; oder von einem gramnegativen Bakterium, z. B., E. coli oder Pseudomonas sp.
  11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4, 5, 7 oder 8, in welchem das Polypeptid von einer Pilzquelle erhalten wird, bevorzugt von einem Hefestamm, wie einem Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oder Yarrowia Stamm; oder einem filamentösen Pilzstamm, wie einem Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma Stamm.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4, 5, 7 oder 8, in welchem das Polypeptid von einem Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusatium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibtrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae Stamm erhalten wird.
  13. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, in welchem die eine oder mehreren zusätzlichen Proteasen Endopeptidasen sind.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die Endopeptidase eine Glutamylendopeptidase (EC 3.4.21.19); eine Lysylendopeptidase (EC 3.4.21.50); eine Leucylendopeptidase (EC 3.4.21.57); eine Glycylendopeptidase (EC 3.4.22.25); eine Prolylendopeptidase (EC 3.4.21.26); Trypsin (EC 3.4.21.4) oder eine Trypsin-ähnliche (Lysin/Arginin-spezifische) Endopeptidase; oder eine Peptidyl-Asp-Metalloendopeptidase (EC 3.4.24.33) ist.
  15. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–14, in welchem die eine oder mehreren zusätzlichen Proteasen eine Exopeptidase sind, die von jedem Enden des Peptids wirken kann.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, in welchem die Exopeptidase eine Aminopeptidase ist, wie eine Leucylaminopeptidase (EC 3.4.11.1); eine Dipeptidaminopeptidase oder eine Tripeptidaminopeptidase (EC 3.4.11.4).
  17. Verfahren nach Anspruch 16, in welchem die Expeptidase eine Carboxypeptidase ist, wie eine Prolincarboxypeptidase (EC 3.4.16.2); eine Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1); eine Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2); eine Carboxypeptidase C (EC 3.4.16.5); eine Carboxypeptidase D (EC 3.4.16.6); eine Lysin(Arginin-)carboxypeptidase (EC 3.4.17.3); eine Glycincarboxypeptidase (EC 3.4.17.4); eine Alanincarboxypeptidase (EC 3.4.17.6); eine Glutamatcarboxypeptidase (EC 3.4.17.11); eine Peptidyldipeptidase A (EC 3.4.15.1); oder eine Peptidyldipeptidase (EC 3.4.15.5)
  18. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–12, in welchem die eine oder mehreren zusätzlichen Proteasen eine Mischung von Proteasen ist, die von dem Aspergillus oryzae Stamm 1568 erhalten werden.
  19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–18, welches weiterhin das Hinzufügen von einem oder mehreren anderen Enzymen zu dem proteinhaltigen Material umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amylase, Carbohydrase, Cellulase, Esterase, alpha-Galactosidase, Beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Lipase, pectinolytisches Enzym, Peptidoglutaminase, Phytase, Transglutaminase oder Xylanase.
  20. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–19, in welchem das proteinhaltige Material ein Nahrungsmittel ist.
  21. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem das proteinhaltige Material tierischer Herkunft ist, wie z. B. Milchprotein, Molkeprotein, Casein, Fleischprotein, Fischprotein, Blutprotein, Eiweißgelatine oder Lactoalbumin.
  22. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–20, in welchem das proteinhaltige Material pflanzlicher Herkunft ist, bevorzugt Sojaprotein, Getreideproteine, z. B., Weizengluten, Maisgluten (corn gluten), Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Zein, Lupine, Baumwollsamenprotein, Rapssamenprotein, Erdnuss, Alfalfaprotein, Erbsenprotein, Fabaceaenbohnenprotein, Sesamsamenprotein oder Sonnenblume.
  23. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, welches das Unterwerfen des proteinhaltigen Materials einem Desamidierungsprozess entweder vor oder gleichzeitig mit der proteolytischen Behandlung, umfasst.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, in welchem der Desamidierungsprozess als ein enzymatischer Desamidierungsprozess ausgeführt wird, z. B. durch Transglutaminase und/oder Peptidoglutaminase.
  25. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in welchem das hergestellte Proteinhydrolysat in ein Tierfutterzusatzmittel eingefügt wird.
  26. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in welchem das hergestellte Proteinhydrolysat in ein Nahrungsmittelprodukt eingefügt wird, z. B. ein Backprodukt, z. B. Brot.
  27. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–26, in welchem das Proteinhydrolysat in ein Nahrungsmittelprodukt eingefügt wird, z. B. ein Backprodukt, wie Brot.
  28. Proteinhydrolysat, welches durch irgendein Verfahren der Ansprüche 1–26 erhältlich ist, in welchem: (a) der Hydrolysegrad zwischen 35–90%, bevorzugt 45–80%, besonders bevorzugt 50–75%, ganz besonders bevorzugt 55–75% und am meisten bevorzugt 60–70% ist; und (b) das Polypeptid wie in irgendeinem der Ansprüche 4–12 definiert ist.
  29. Proteinhydrolysat nach Anspruch 28, welches mit freier Glutaminsäure und/oder peptidgebundenen Glutaminsäureresten angereichert ist.
  30. Nahrungsmittelprodukt oder Tierfutterzusatzmittel, umfassend ein Proteinhydrolysat nach irgendeinem der Ansprüche 28–29.
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