KR101542600B1

KR101542600B1 - 전통장류에서 분리한 산막 형성 효모 증식 억제력을 가지는 바실러스 리케니포미스 scdb 34 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101542600B1
Application number: KR1020140011046A
Authority: KR
Inventors: 엄태붕; 김용상; 류명선; 전새봄; 정도연; 조승화
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2015-08-07
Also published as: KR20150090416A

Abstract

본 발명은 산막 형성 효모(film-forming yeast) 증식 억제력을 가지는, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCDB 34 균주(기탁번호 KCCM11493P), 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 된장 발효용 조성물, 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 된장의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 된장에 관한 것으로, 저염 된장 제조시 발생하는 산막 형성의 문제점을 해결함으로써, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

전통장류에서 분리한 산막 형성 효모 증식 억제력을 가지는 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주 및 이의 용도{Bacillus licheniformis SCDB 34 strain having activity inhibiting growth of film-forming yeast isolated from traditionally fermented soybean product and uses therof}

본 발명은 전통장류에서 분리한 산막 형성 효모 증식 억제력을 가지는 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산막 형성 효모(film-forming yeast) 증식 억제력을 가지는, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCDB 34 균주(기탁번호 KCCM11493P), 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 된장 발효용 조성물, 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 된장의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 된장에 관한 것이다.

장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로 안전성 확보는 무엇보다 중요한 과제이다. 김치, 장류, 젓갈 등의 고염도 발효식품이 발달한 식문화 습관 때문에 한국인은 식사를 통해 세계적으로 가장 높은 수준의 소금량인 하루 평균 12.2g(나트륨 함량 4.8g)을 섭취하며, 이는 WHO(World Health Organization) 권장량(5g/일)의 2.4배에 이른다. 소금의 과다 섭취는 심혈관 질환, 위암, 신장결석 등과 관련되어 있기 때문에 이의 섭취량을 줄이려는 노력이 범국가적으로 진행되고 있다. 2011년 국민건강영양조사에 따르면, 나트륨 섭취의 주요 급원은 소금으로부터 17.7%, 김치(배추김치, 총각김치 및 깍두기) 22.1%, 장류(된장, 고추장, 간장 및 쌈장) 20.6%로, 김치와 장류의 섭취만으로도 하루 소금량의 40% 이상을 섭취하는 것으로 보고되었다. 이에 대한 개선책으로 식품의약품 안전처에서는 장류 100g 당 나트륨 함량을 0.4g 더 줄여줄 것을 장류업체에 권고하였다. 그러나 단백질 및 지방이 풍부한 콩을 저염에서 발효하는 경우, 소금 때문에 증식이 억제되던 여러 종류의 유해균들이 빠르게 자라면서 부패와 함께 산막이 형성되기 쉽다. 산막은 발효제품의 상품성을 떨어뜨릴 뿐 아니라, 산소 공급의 차단으로 인해 발효미생물의 군집 특성을 변화시키며 산막의 자가 소화 분해로 여러 부패 균들의 증식을 유발한다. 부패균의 증식을 억제하기 위해 알코올이나 항균 활성을 가진 천연 향신료 등을 첨가할 수 있지만 장류의 고유한 풍미가 사라지는 단점이 있다. 이의 해결 방안으로 저염에서 증식하는 부패균에 대해 길항 작용하는 발효균을 선발한 뒤 이를 발효 공정에 사용하는 것이 가장 합당한 전략일 것이다. 이를 위해 저염 장류 제조 동안 형성되는 산막 형성 균들의 동정이 필요하지만, 현재까지는 일반적으로 사용하는 고염 숙성 간장에서 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 속의 산막 형성 효모가 동정되었다는 보고 이외에는 알려진 바가 없었다. 전통 장류에서 아스퍼질러스(Aspergillus) 속과 함께 발효에 주 역할을 하는 바실러스(Bacillus) 속은 발효에 관여하는 많은 세균 군집 가운데 가장 우위를 점하고 있으며, 특히 바실러스 속의 일부 균주들은 항생물질 또는 계면 활성제를 분비하여 항세균 및 항진균 작용을 가지는 것으로 보고되어 왔다. 장류의 저염화에 따른 문제 해결 방안이 필요한 상황에서 본 발명은 저염 된장 제조 동안 증식한 산막 형성 부패균들을 동정하고, 이들 부패균에 대해 길항 능력을 갖는 유익 바실러스 속 균들을 분리하여 위생적인 저염 장류를 제조하려는데 목표를 두었다.

한국등록특허 제0368183에는 '바실러스 리케니포미스 비1 균주 및 이의 이용'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0120081호에는 '청국장 제조에 유용한 바실러스 리케니포미스 균주 및 이를 이용하여 제조한 청국장, 및 상기 청국장 분말을 포함하는 두부'가 개시되어 있으나, 본 발명의 전통장류에서 분리한 산막 형성 효모 증식 억제력을 가지는 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 전통 장류로부터 산막 형성 효모 증식 억제력을 지니는 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주를 분리한 내용에 관한 것으로, 상기 균주가 산막을 형성하는 피키아 쿠드리아브제비에 대한 길항력을 지니며 항균 특성을 나타내는 리케니신 합성 유전자를 보유하고 있음를 확인함으로써, 저염 장류를 생산할 수 있는 효과적인 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 산막 형성 효모(film-forming yeast) 증식 억제력을 가지는, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCDB 34 균주(KCCM11493P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 된장 발효용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 된장의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 된장을 제공한다.

본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주가 저염 된장 제조시에 산막을 형성하는 효모의 증식을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 항균 특성을 지니는 리케니신 합성 유전자를 보유하고 있는 것을 확인하였다. 본 발명의 균주를 이용한다면 저염 된장 제조시 발생하는 산막 형성의 문제점을 해결함으로써, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 산막 형성 효모(film-forming yeast) SCS FY10 균주의 주사전자현미경 사진이다.
도 2는 산막 형성 효모(film-forming yeast) 균주들의 ITS 영역 염기서열 내 단일 염기차이를 보여주는 그림이다. ITS 영역의 정렬을 위해 피키아 쿠드리아브제비(P. kudriavzevii) 표준 균주의 ITS 영역 염기서열(EF568018)을 사용하였다.
도 3은 8% 저염수로 침지하여 제조한 된장으로부터 분리된 산막 형성 효모(film-forming yeast) 균주들과 근연관계가 가까운 효모 균주들 사이의 관계를 ITS 염기서열(484 bp)에 기초하여 최대가능도법(Maximum Likelihood method)으로 그린 계통도이다.
도 4는 바실러스(Bacillus) 속에 관하여 전통 장류로부터 분리된 균주의 위치를 나타내기 위해 ITS 염기서열에 기초하여 최대가능도법(Maximum Likelihood method)으로 그린 계통도이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산막 형성 효모(film-forming yeast) 증식 억제력을 가지는, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCDB 34 균주를 제공한다.

본 발명에 따른 산막 형성 효모(film-forming yeast) 증식 억제력을 가지는 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주는 전통 장류에서 분리하였다. 전통 장류로부터 분리된 균주들 중에서 특히 바이오제닉 아민인 퓨트레신과 티아민 분해력이 높으며 유해균인 바실러스 세레우스를 억제하고 프로테아제 활성이 좋아 발효 균주로서 활성이 가장 높은 균주를 선발하여 SCDB 34 균주로 명명한 것이다.

본 발명의 균주 바실러스 리케니포미스 SCDB 34 균주를 한국미생물보존센터에 2013년 12월 3일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11493P).

또한, 본 발명은 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 된장 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 된장을 제공한다.

본 발명의 균주를 이용하여 된장을 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 메주 제조 및 된장 분리

된장 제조를 위해 메주용 콩(순창산) 20kg을 수세 침지하여 121℃에서 30분간 증자하고 냉각하였다. 증자한 콩에 전통 고추장에서 분리한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SKM7 포자액(3~7×10⁷ cfu/㎖)과 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 배양액(2~10×10⁸ cfu/㎖)을 각 0.1%(v/w)와 0.05%(v/w)농도로 동시에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 발효시켰고, 이를 60℃에서 24시간 동안 건조한 후 낱알 메주를 제조하였다. 아스퍼질러스 오리재 SKM7는 PDA 배지에서 28℃, 14일 동안 배양 후, 10㎖ 0.01% 트리톤 X-100을 사용하여 포자를 수집한 뒤 여과하여 사용하였다. 바실러스 리케니포미스 SCK B11은 37℃에서 18시간 동안 NB 배지에 배양한 후 접종하였다. 각 2kg 단위의 낱알 메주에 8%(w/v) 및 14%(w/v)의 천일염수 6ℓ를 각각 첨가한 뒤 총 질소량이 1.0% 이상 되는 시점인 약 45일간 침지 발효하였고, 이후 염수를 제거하여 된장을 분리하였다.

분리된 된장은 실온에서 6주간 숙성시킨 후, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 유기산을 분석하였다.

2. 산막 형성 미생물의 분리 및 동정

산막 형성 미생물을 분리하기 위해 각 시료에서 산막을 분리하여 증류수로 희석하고 이를 효모 및 곰팡이 분리용 3M 페트리필름(Petrifilm)에 접종한 뒤 27℃에서 48시간 동안 배양하였다. 형성된 집락들을 PDA에 접종하여 배양하고 이를 새 PDA에서 다시 분리 배양하여 전자현미경으로 형태를 확인하였다.

산막 형성 미생물을 동정하기 위해 분리된 균주를 효모용 제노믹 DNA 프렙 키트(genomic DNA prep kit, 솔젠트사)를 사용하여 제노믹 DNA를 추출하고, 유니버셜 프라이머인 ITS1F(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; 서열번호 2)와 ITS4R(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; 서열번호 3)을 사용하여 ITS 영역을 증폭하였으며, 증폭은 95℃ 2분 처리 후, 95℃ 20초, 50℃ 40초, 72℃ 1분 반응을 30회 반복하고 72℃에서 5분 반응하여 종결하였다. 반응 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 하여 확인하였고, PCR 정제 키트(PCR purification kit, Qiagen, 독일)를 사용하여 정제한 뒤, 마크로젠(서울, 한국)에 의뢰하여 염기 서열을 분석하였다.

StrainInfo의 Advanced Search와 GenBank 데이터베이스로부터 표준 균주들의 ITS 유전자 염기서열들을 얻고, 본 발명의 8종의 미생물 ITS 염기서열과의 상호 비교를 위해 CLUSTAL W를 사용하였다. 계통도 분석은 균주들의 ITS 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 갭(gap)이 최소화 되도록 보정한 후 타무라-네이 모델(Tamura-Nei model)에 기초를 둔 최대가능도법(Maximum Likelihood method)을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 부트스트랩(Bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며 계통분석과 부트스트랩 분석은 메가 프로그램(MEGA program)을 사용하였다.

3. 산막 형성 효모( firm - forming yeast ) 증식 억제력을 지닌 바실러스 균주의 선발

저염 장류 발효에 적합한 균주를 선발하기 위하여, 장류에서 우수 발효 능력을 지닌 바실러스 속 균을 1차로 선발한 뒤 산막 형성 효모에 대한 길항 능력을 조사했다. 먼저 우수 발효 능력을 지닌 바실러스 속 균주의 선발을 위해 장류에서 분리한 균들을 대상으로 색소생산 바실러스 세레우스 선택배지(chromogenic B, cereus 선택배지, Oxoid, UK)를 이용하여 바실러스 세레우스 그룹에 속하는지를 조사하고, 설사, 구토, 호흡 독소를 생산하는 10종의 바실러스 세레우스 독소 합성 유전자 존재 유무와 pH 지시약 함유 배지에서 바이오제닉 아민(biogenic amine) 생성 유무, HPLC에 의한 바이오제닉 아민 분해능력, 세포 외 글루타메이트(glutamate) 생성량, 프로타아제(protease) 및 아밀라아제(amylase) 생성 능력을 기준으로 삼아 김 등(2012, Korean J. Microbiol., 48, 220-224)의 방법에 따라 선별하였다.

상기 과정으로 선발된 균주를 대상으로 산막 형성 효모 증식 억제력을 조사하였다. 선별된 균주는 PDB에서 28℃, 18시간 배양 후 200㎕를 취해 PDA 배양 접시 표면에 고르게 펼친 다음 6mm 직경의 페이퍼 디스크(Toyo Roshi, 일본)를 얹었다. 선별된 균주를 NB 배지에 37℃, 48시간 동안 배양 후 원심분리하고 상층액 20㎕를 취해 페이퍼 디스크 위에 분주하였으며, 이를 30℃ 항온조에서 24시간 동안 더 배양한 후 페이퍼 디스크 주위에 형성된 투명환 직경을 측정하여 억제력이 가장 좋은 균주를 선발하였다.

4. 선발된 바실러스 균주의 동정

산막 형성 효모에 대한 억제력을 지닌 바실러스 속 균주의 생화학적 동정을 위해 NA 배지에 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이 집락을 NB 배지에 희석한 후 46종의 건조배지와 생화학 반응물로 구성된 바실러스 동정 카드(BCL ID card; bioMerieux Vitek Inc., Hazelwood, USA)에 주입하였고, 14시간 후 배양 또는 반응 결과를 VITEK 2 Compact™ software(bioMerieux Vitek)에 저장된 표준 균주의 생화학적 데이터베이스와 비교하여 동정하였다.

선발된 균주의 분자유전학적 동정을 위하여, 유니버셜 프라이머로서 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 4)와 1,492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 5)을 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭한 후, 동정에 중요한 가변 염기 영역을 포함하는 1,443bp를 빅다이 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트를 사용하여 해독하였다. 계통도 분석은 균주들의 16S rRNA 유전자 염기 서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 갭(gap)이 최소화 되도록 보정한 후 타무라-네이 모델(Tamura-Nei model)에 기초를 둔 최대가능도법(Maximum Likelihood method)을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 부트스트랩(Bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며 계통분석과 부트스트랩 분석은 메가 프로그램(MEGA program)을 사용하였다.

5. 선발된 균주의 항균 계면활성제 보유 여부 조사

바실러스 리케니포미스나 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 대표적 항균 계면활성제인 리케니신(lichenysin)이나 서펙틴(surfactin) 유전자를 선발 균주들이 함유하는지 확인하기 위해 바실러스 리케니포미스의 리케니신 합성 효소 유전자인 lchAA, lchAB, lchAC와 바실러스 서브틸리스의 서펙틴 합성효소 유전자 srfAA, srfAB, srfAC를 선택하여 PCR을 수행하였다. 표 1의 프라이머들을 이용하여, 94℃에서 2분간 초기 변성시키고 94℃에서 1분간 변성, 56℃에서 1분간 결합, 72℃에서 1분간 증폭과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하여 항균 계면활성제 보유 여부를 조사하였다.

항균 계면활성제 보유 여부 확인을 위해 사용한 프라이머 목록

서열 번호	프라이머	염기서열	목표유전자 (GeneBank accession no)	증폭산물 크기(bp)
6	lchAF	ACGGCCGATCAGGAGCTTTC	Lichenysinsynthetase, lchAA (AJ005061)	557
7	lchAR	TCTCAGCGCCTTCGATCTGC	Lichenysinsynthetase, lchAA (AJ005061)	557
8	lchBF	TTTGACCCGGAGCTCGTTGA	Lichenysinsynthetase, lchAB (AJ005061)	706
9	lchBR	CTGAGGGCGGAAAGCAGGAT	Lichenysinsynthetase, lchAB (AJ005061)	706
10	lchCF	CATGTATACGGGCCGACGGA	Lichenysinsynthetase, lchAC (AJ005061)	1173
11	lchCR	CTGAAGGCCGGAGATGGCTT	Lichenysinsynthetase, lchAC (AJ005061)	1173
12	srfAF	CAGCGGCAGCGGATTAAATG	Surfactinsynthetase AA, srfAA (NC000964)	1025
13	srfAR	GGCCTTCAAAATCGCCTGCT	Surfactinsynthetase AA, srfAA (NC000964)	1025
14	srfBF	CGGTGTGTCATGGCGGATTT	Surfactinsynthetase AB, srfAB (NC000964)	696
15	srfBR	TCGAAAGCGGACGGTTCAAA	Surfactinsynthetase AB, srfAB (NC000964)	696
16	srfCF	TTCACTGTCGGAGGCGGAAA	Surfactinsynthetase AC, srfAC (NC000964)	933
17	srfCR	ACCGGCAGATAGGCTGCTCC	Surfactinsynthetase AC, srfAC (NC000964)	933

실시예 1. 염수 농도에 따른 된장의 염도

아스퍼질러스 오리재와 바실러스 리케니포미스를 접종하여 만든 낱알 메주에 8%(w/v) 및 14%(w/v)의 천일염수를 각각 첨가하여 제조한 된장의 염도를 측정하였다. 염도계(Takemura, 일본)로 측정한 결과, 8% 저염수로 침지하여 제조한 된장은 8±0.4%(w/w)의 소금을, 14% 고염수에 침지했던 된장은 14±0.5%(w/w)의 소금을 함유하였다.

실시예 2. 염수 농도에 따른 된장의 특성 분석

염수 분리한 된장을 실온에서 다시 6주간 더 숙성시키는 동안, 14% 고염수에 침지하여 제조한 된장에서는 고유의 된장 향미가 있으면서 산막이 없었으나, 8% 저염수에 침지하여 제조한 된장 시료들에서는 모두 표면에 흰 산막이 형성되었고 부패한 신 냄새가 났다.

HPLC(Agilent, USA)를 통한 유기산 분석 결과, 14% 고염수에 침지하여 제조한 된장에서는 숙신산(succinic acid), 젖산(lactic acid), 아세트산(acetic acid) 함량이 kg당 각각 66±4 mg, 221±7 mg, 1238±8 mg이었던 반면, 8% 저염수로 침지하여 제조한 된장에서는 86±5 mg, 680±9 mg, 2864±13 mg으로, 된장의 저염화에 따라 숙신산은 약 1.3배, 젖산은 약 3배, 아세트산은 약 2.3배 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 3. 산막 형성 미생물의 분리 및 동정

8% 저염수로 침지하여 제조한 된장의 산막으로부터 8종의 효모를 분리했다. 효모 형태와 크기를 전자현미경으로 확인한 결과, 이들은 타원형으로 약 1.7-2.5 ㎛×3.1-5.2㎛의 크기였다(도 1). 분리된 효모의 동정을 위해 ITS 영역을 증폭하여 얻은 476-723bp의 염기서열을 CLUSTAL W에서 비교 분석한 결과, 8종 균주들의 공통 ITS 영역(484bp)은 하나의 염기 서열 차이를 제외하고 완전히 동일하였으며(도 2), BLASTN search로 근연 관계들을 비교했을 때 이들은 모두 피키아(Pichia) 속 효모에 속했다. 균주 동정을 위하여 Strain Info의 search와 메가 프로그램 데이타베이스(MEGA Program database)에서 찾은 표준 균주들의 ITS 영역 염기서열을 이용하여 계통적 유연 관계를 분석한 결과, 8종 효모는 모두 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii)로 동정되었다(도 3). 특히, 저염 된장의 주 산막 형성 효모로서 피키아(Pichia) 속의 발견은 본 발명이 처음이라는 것에 의의가 있다.

실시예 4. 산막 형성 효모( firm - forming yeast ) 증식 억제력을 지닌 바실러스 균주의 선발

전통 장류의 고유한 풍미를 유지시키면서 저염 장류에서 산막을 형성하는 효모의 증식을 억제하는 장류 발효균을 선발하기 위해서, 장류 발효에 가장 중요한 역할을 하는 11종의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 분리하였다(표 2). 이 균주들 중 가장 뛰어난 발효균주인 SCDB 34를 선발하여 산막 형성 효모 증식 억제력을 조사하였다.

SCDB 34에 의한 산막 형성 효모 억제력은 표 3과 같다. SCDB 34 균주는 모든 산막 효모에 대해 길항 능력을 보였다. 배양한 균주를 원심 분리하여 세포가 제거된 상층액만 페이퍼 디스크에 분주했기 때문에 산막 형성 효모의 증식을 억제하는 물질은 SCDB 34 균주의 세포외 방출 물질로 추정되었다.

분리된 바실러스(Bacillus) 속 균주들의 특성

균주	퓨트레신 분해(%)	티아민 분해(%)	바실러스 세레우스 억제	글루타메이트 함량 (mg/g)	바실러스 세레우스 독소 유전자	프로테아제 활성^a	아밀라아제 활성^b
SCKB 17	64±2	99±1	++	0.96±0.12	none	+++	+++
SCKB 18	56±1	95±1	++	1.28±0.09	none	++++	+++
SCDB 19	68±2	92±3	++	0.96±0.05	none	++++	+++
SCCB 32	88±2	94±2	+++	4.47±0.08	none	+++	+++
SCKB 33	78±3	92±2	++	3.84±0.10	none	+++	+++
SCDB 34	83±1	91±3	+++	3.83±0.08	none	++++	+++
SCDB 35	83±3	88±1	++	3.21±0.13	none	++++	+++
SCDB 36	84±2	91±2	++	2.24±0.15	none	++++	+++
SCCB 37	98±1	90±1	+++	3.20±0.08	none	+++	+++
SCSB 38	90±3	87±1	++	3.23±0.07	none	++	+++
SCSB 39	94±2	91±2	++	4.79±0.12	none	++++	+++

^a할로 반지름. ++++; 10 mm 이상, +++; 7-9mm; ++, 5-6mm

^b할로 반지름. +++; 7-9mm

된장으로부터 분리된 바실러스 균주에 의한 산막 형성 효모의 성장 억제

산막 형성 효모	바실러스 균주에 의한 상대적 억제 범위^a
산막 형성 효모	SCDB 34
SCS FY6	1.6±0.05
SCS FY7	1.2±0.01
SCS FY8	1.2±0.01
SCS FY9	1.3±0.03
SCS FY10	1.6±0.04
SCS FY11	1.4±0.02
SCS FY12	1.4±0.01
SCS FY13	1.5±0.01

^a할로 반지름/페이퍼 디스크 반지름

실시예 5. 선발된 바실러스 균주의 동정

선발된 바실러스 균주를 BCL ID 카드를 사용하여 동정한 결과 95%의 높은 확률로 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 동정되었다(표 4). 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과 또한 바실러스 리케니포미스로 동정되었다(도 4).

테스트	반응	테스트	반응
β-Xylosidase	-	D-Mannitol	+
L-Lysine arylamidase	-	D-Mannose	+
L-Aspartate arylamidase	-	D-Melezitose	-
Leucinearylamidase	+	N-Acetyl-D-glucosamine	(-)
Phenylalanine arylamidase	+	Palatinose	+
L-Prolinearylamidase	-	L-Rhammose	-
β-Galactosidase	+	β-Gluse	+
L-Pyrrolydonylarylamidase	+	β-Mannosidase	+
α-Galactosidase	-	Phosphorylcholine esterase	-
Alanine arylamidase	-	Pyruvate	(-)
Tyrosine arylamidase	+	α-Glucosidae	+
β-N-Acetyl-glucosaminidase	-	D-Tagatose	+
Ala-Phe-Pro-arylamidase	-	D-Trehalose	+
Cyclodextrin	+	InuLin	-
D-Galactose	-	D-Glucose	+
Glycogen	+	D-Ribose	+
Myoinositol	+	Putrescine assimilation	-
Methyl-a-D-glucopyranose	+	Growth in 6.5% NaCl	+
Ellman	-	Kanamycin resistance	-
Methyl-D-xylosidase	-	Oleandomycin resistance	-
α-Mannosidase	-	Esculin hydrolase	+
Maltotriose	+	Tetrazolium red	+
Glycine arylamidase	+	Polymyxin B resistance	+

실시예 6. 선발된 균주의 항균 계면활성제 보유 여부 조사

선발된 균주가 대표적 항균 계면활성제인 리케니신 또는 서펙틴 유전자를 보유하는지를 확인한 결과, 리케니신 합성 유전자를 보유하고 있었다(표 5).

선발된 바실러스 균주의 계면활성제 합성유전자 보유 유무

균주	계면활성제 합성유전자^a
균주	lchAA	lchAB	lchAC	srfA	srfB	srfC
바실러스 리케니포미스 SCDB 34	+	+	+	-	-	-

^a+; 존재함, -; 존재하지 않음.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11493P

20131203

<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Bacillus licheniformis SCDB 34 strain having activity inhibiting growth of film-forming yeast isolated from traditionally fermented soybean product and uses therof <130> PN13438 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1454 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 1 ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggaccgac gggagcttgc tcccttaggt 60 cagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120 gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgatt gaaccgcatg gttcaatcat aaaaggtggc 180 ttttagctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240 caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360 acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga 420 agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480 taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540 gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600 gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660 gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720 aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagcaaac 840 gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900 gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960 ggtcttgaca tcctctgaca accctagaga tagggcttcc ccttcggggg cagagtgaca 1020 ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080 cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140 caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200 cacgtgctac aatgggcaga acaaagggca gcgaagccgc gaggctaagc caatcccaca 1260 aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320 taatcgcgga tcagcatgcc gcggtggaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380 cacaccacga agagtttgta acacccgaag tcgggtgagg taaccttttt ggagccagcc 1440 gccgaaggtg ggac 1454 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acggccgatc aggagctttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tctcagcgcc ttcgatctgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tttgacccgg agctcgttga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctgagggcgg aaagcaggat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catgtatacg ggccgacgga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgaaggccg gagatggctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cagcggcagc ggattaaatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggccttcaaa atcgcctgct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cggtgtgtca tggcggattt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tcgaaagcgg acggttcaaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttcactgtcg gaggcggaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 accggcagat aggctgctcc 20

Claims

피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) 증식 억제력을 가지는, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCDB 34 균주(KCCM11493P).
삭제
제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 된장 발효용 조성물.
제1항의 균주를 증자된 대두에 접종하고 발효하여 제조된 된장.