KR101684628B1 - 비독성 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효시킨 장류 - Google Patents
비독성 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효시킨 장류 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 독소 및 바이오제닉 아민류 유전자가 없는 비독성 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효시킨 장류에 관한 것으로서, 본 발명을 통하여 장류 식품 생산에 있어 안전성을 강화시키고, 나아가 전통식품 산업 발전에 기여 할 수 있다.
Description
본 발명은 비독성 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효시킨 장류에 관한 것으로, 보다 상세하게는 독소 및 바이오제닉 아민류 유전자가 없는 비독성 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효시킨 장류에 관한 것이다.
우리나라의 전통 발효 식품의 제조공정은 주원료에 부재료를 첨가, 혼합하여 원료나 공기 중에서 유입된 천연 미생물에 의한 자연발효 과정을 이용한다. 예를 들어 전통 메주의 경우 장기간 자연발효를 실시하므로, 표면에 유해곰팡이가 발생하게 되어 인체에 유해한 곰팡이 독소가 생성될 수 있다.
메주 표면의 발효 균주와 외형적으로 거의 비슷한 유해곰팡이 Aspergillus flavus가 번식하게 되면 강력한 발암 물질인 아플라톡신을 생성하게 된다. 마찬가지로 청국장의 경우 Bacillus subtilis 또는 Bacillus licheniformis 균이 주로 발효에 관여하게 되는데, 자연발효의 경우 관여하는 그런 균들의 안전성을 확인하기 어려운 실정이다.
따라서, 안전성이 확보된 종균의 이용으로 보다 안전한 전통장류를 생산할 수 있을 것이다.
생물생성 아민(biogenic amines; BAs)은 보통 미생물을 포함한 생물에서 아미노산의 효소적 탈탄산 반응에 의해 생성되는 저분자의 유독 질소 화합물을 말한다. 특히 탈탄산효소 생산 미생물에 의해 단백질 함유 식품의 부패나 발효, 숙성 과정에서 많이 생성되며, 인체 및 동물체내에서 중추신경의 신경전달물질 또는 간접적인 혈관계 조절에 관여한다(Suzzi G., et al., Int. J. Food Microbiol. 88: 41-54, 2003).
또한, BAs는 N-니트로사민(N-nitrosamine)과 같은 발암 물질로 전환될 수 있는 잠재적인 위험성이 있으며(Shalaby AR. et al., Food Res. Int. 29:675-690, 1996), 대두 발효식품인 청국장과 나또에서는 BAs 중에서 특히 히스타민(histamine)과 티아민(tyramine)함량이 높은 것으로 보고되었다(Han GH. et al., Korean J. FoodSci. Technol. 39:541-545, 2007).
히스타민과 티아민의 생성에 관여하는 유전자는 hdc gene(histamine decarboxylase)과 tdc gene(tyrosine decarboxylase)이다.
또한, BAs 이외에 잠재적인 독소 유전자들도 존재하는데, 주로 구토 독소 세레울라이드(cereulide) 합성 효소 유전자(cesA , cesB), 설사 독소 발현 전사조절 유전자(plcR)가 있다.
항균 물질 유전자의 존재 유무도 중요한 요소인데, 바실러스 속의 경우 일부 균주에서 다양한 종류의 계면활성제나 항생 물질을 생산하여 경쟁 관계에 있는 주위 균들의 증식을 저해하는 것으로 보고된 바 있다(Grangemard I., et al, Appl. Biochem. Biotechnol. 90: 199-210, 2001).
따라서, 식품 종균으로 사용하기 위해서는 항생물질, 특히 리케니신(lichenysin) 합성 효소 유전자(lchA , lchB , lchC)와 란티바이오틱(lantibiotic) 수식 효소 유전자(lanM1 , lanM2), 그리고 서팩틴(surfactin) 합성 효소 유전자(srfA , srfB , srfC)의 유무를 확인할 필요가 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 지속적으로 연구를 수행한 결과, 전통장류로부터 독소 및 바이오제닉 아민류 유전자가 없는 신규한 무독성 바실러스 서브틸리스 AFY-2 균주를 분리동정하고, 상기 균주를 이용한 장류 생산 및 그 특성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 전통 장류 생산에 있어 보다 안전한 식품을 제조하기 위하여, BAs 생성 유전자 및 독소 유전자 그리고 항균물질 생성 유전자가 없는 신규한 바실러스 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 무독성 바실러스 속 미생물을 이용하여 발효시킨 장류를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 AFY-2 균주(KACC 91988P)를 이용하여 발효시킨 장류를 제공한다.
본 발명에 의한 신규한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P)는 독소 및 바이오제닉 아민류 유전자가 없는 비독성 균주로서, 폴리글루타메이트를 생산하고, 청국장 등과 같은 장류의 발효시 발효능이 우수하며, 아미노태 질소 함량을 증가시켜 풍미를 증진시킬 수 있기 때문에, 상기 균주를 통하여 보다 전통장류의 안전성 및 풍미가 강화된 장류 식품의 생산이 가능하다.
도 1은 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주의 집락 형태를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주의 혈전용해 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주의 16S rRNA 염기서열에 기반한 계통도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주를 이용하여 청국장을 제조하는 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주의 혈전용해 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주의 16S rRNA 염기서열에 기반한 계통도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주를 이용하여 청국장을 제조하는 공정도를 나타낸 것이다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P)를 제공한다.
본 발명에 의한 상기 균주는 반복 재현성을 담보하기 위햐여, 2014년 10월 17일에 농업유전자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KACC91988P).
본 발명에 의한 상기 균주는 독소를 생산하지 않는(non-toxic) 특징을 갖는다.
본 발명에 의한 상기 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amin)을 생산하지 않는 특징을 갖는다.
본 발명에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 상기 균주는 항생물질을 생산하지 않는 특징을 갖는다.
본 발명에서, 상기 항생물질은 리케니신(lichenysin), 란티바이오틱(lantibiotic) 및 서팩틴(surfactin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 상기 균주는 혈전용해 활성(fibrinolytic activity)을 갖는다.
한편, 본 발명에 의한 상기 균주는 아미노태 질소를 생산하는 것을 특징을 갖기 때문에, 상기 균주를 이용하여 청국장 등 과 같은 장류 제조시에 아미노태 질소 함량을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 AFY-2 균주(KACC 91988P)를 이용하여 발효시킨 장류를 제공한다.
본 발명에서, 상기 장류는 상기 장류는 메주, 한식 간장, 양조 간장, 혼합 간장, 한식 된장, 조미 된장, 고추장, 조미 고추장, 춘장 및 청국장으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전통장류로부터 균주의 분리
전통 방법에 따라 제조한 100종의 된장, 청국장, 막장, 간장 등을 구입 한 후, 생리식염수 9 ㎖에 시료 1g 혹은 1㎖을 넣어 교반기로 5분 간 진탕시킨 후, 정치시킨 다음, 상등액을 표준 희석법으로 희석하여 균주 분리를 위한 시료로 사용하였다.
평판당 적절한 콜로니가 나타나도록 상기 시료를 1%의 스킴 밀크가 포함된 뉴트리언트 아가(NA; DIFCO사, USA) 평판 배지에 도말하고, 30℃에서 24~48시간 배양한 후, 투명환(clear zone)을 나타내는 균주를 1차 선발하였다.
도 1은 본 발명에 의한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주의 집락 형태를 나타낸 것이다.
<실시예 2> 혈전용해 활성의 측정
혈전용해 효소 분비능 측정실험을 통하여, 단백질분해효소(protease) 활성이 우수한 균주를 선발한 후, Astrup과 Mullerttz의 방법(Astrup, T. and S. Mullertz, 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Archs. Biochem. Biophys. 40, 346-350)을 변형하여 피브리노겐(fibrinogen)을 0.3%가 되도록 PBS용액(0.1 M, pH 7.4)에 녹인 후, 평판에 잘 부은 다음, 1.5% 아가로스(agarose) 용액을 동량 첨가하여 혼합하였다.
여기에 트롬빈(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 100㎕ 첨가하여 상온에서 정치한 후, 균 배양액 20㎕를 분주하여 페이퍼 디스크 방법으로 활성을 측정하였다.
이때, 양성 대조구로는 플라스민(plasmin; 1.0 U/mL Sigma Co.)을 사용하였고, 음성 대조구는 뉴트리언트 브로쓰 배지를 사용하였다.
혈전용해 활성은 투명환 크기를 측정하여, 하기 수학식 1에 의해 혈전용해 활성을 갖는 균주를 2차 선발하였다 (도 2 참조).
<실시예 3> 2차 선발 균주의 유전적 동정
16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균주 동정을 위하여, 유니버설 프라이머(universal primer)로서 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'; 서열번호 1)과 1492R(5'-TACGGATACCTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 2)을 이용하여 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후, 전체 약 1.4Kbp 염기서열을 마크로젠(Macrogen Inc., Korea)에 의뢰하여 해독하였는 바, 그 결과는 서열번호 3과 같다.
상기 16S rRNA 유전자의 염기서열은 NCBI 데이타베이스로부터 BLAST N 프로그렘을 사용하여 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 상동성을 비교하였다.
이때, 표준 균주와 함께, 16S rRNA 유전자의 염기서열과 높은 일치도를 보이는 균주들간의 상호 비교는 CLUSTAL W 프로그램(Thompson, J.D., D.G. Higgins, and T.J. Gibson. 1994. CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing position-specific gap penalties and weight matrix choice. NucleicAcidsRes.22,4673-4680)을 사용하였다.
도 3은 16S rRNA 시퀀스(1,458 bp)에 기반한 계통도로 AFY-2와 인접한 균주들간의 계통발생론적 관계에 대한 것이다.
상기의 결과를 이용하여 Bacillus 속으로 동정된 균주를 다시 3차 선발하여 BAs 및 독소 유전자 유무 확인을 위하여 사용하였다.
<실시예 4> 3차 선발 균주들의 BAs, 독소, 항균물질 유전자 유무의 확인
3차 선발 균주들의 BAs(히스타민, 티라민)합성 유전자, 구토 독소 합성 효소 유전자(cesA, cesB), 설사독소 발현 전사조절 유전자(plcR - papR) 및 항균물질 합성 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열들은 표 1과 같고, PCR 조건은 94℃에서 1분간 초기 변성 후, 94℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간 증폭과정을 28회 반복하고 72℃에서 7분간 마지막 증폭을 실시하였는 바, 그 결과는 표 2와 같다.
이때, 양성 대조군(positive control)으로는 Bacillus cereus KACC 11240, Bacillus licheniformis KACC 10476, Bacillus subtilis KACC 14394 균주를 사용하였고, 음성 대조군(negative control)으로는 뉴트리언트 브로쓰(NB) 배지를 이용하였다.
독소 및 항균물질 유전자가 검출되지 않은 균주 중에서 혈전용해 활성이 상대적으로 가장 높았던 균주를 "바실러스 서브틸리스 AFY-2"로 명명하고, 생화학적 동정을 실시하였다.
<실시예 5> AFY-2 균주의 생화학적 동정
생화학적 검사는 API 50CHB kit(API bioMerieux Co.)을 이용하여 키트(kit) 시스템에 따라 조작하였고 판독하였다.
계통도 분석 결과, AFY-2 균주는 Bacillus subtilis 과 가장 가까운 근연관계로서, 16S rRNA 유전자 서열의 상동성은 99.0%이었다.
따라서, 생화학 분석과 계통학적 분류를 고려하여 상기 AFY-2 균주를 Bacillus subtilis 로 최종 동정하였다. 하기 표 3은 AFY-2의 생화학적 특성에 관한 것이다.
<실시예 6> 청국장 적용 시험
청국장 제조시에 AFY-2 균주를 접종하여 청국장을 제조하기 위하여, 상기 AFY-2 균주 배양액 20㎖을 삶은 콩 2kg에 접종 한 후, 72 시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다 (도 4 참조).
이때, 대조군으로는 상기 AFY-2 균주를 접종하지 않은 것과 시판되는 수입 종균(Takahasi연구소, 청국장/낫도 종규, 한홍순농수산 판매)을 동일한 조건으로 처리하였다.
제조한 청국장의 혈전용해 활성을 측정하기 위하여, 청국장 10g을 증류수 50㎖에 균일하게 현탁하여 원심분리한 후, 상등액 20㎕를 분주하여 24시간 동안 배양한 다음, 상기 실시예 2에 의한 방법으로 측정하였다.
또한, 청국장 품질의 척도인 아미노태질소 함량과 폴리글루타메이트(PGA)도 측정하였는 바, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
이때, 상기 아미노태질소 함량은 식품공전(제2권 1.1.3.2 아미노산질소, 홀몰적정법)에 따라 측정하였다.
또한, 상기 폴리글루타메이트(PGA)는 청국장을 백금이로 취한 후, 서서히 늘어뜨려 PGA가 생성되는 길이를 측정하였는데, PGA의 길이가 < 5 cm인 것은 +, < 10 cm인 것은 ++, 10 cm < 인 것은 +++로 표시하였다.
이상에서 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
또한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 않되고, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 의한 신규한 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P)는 독소 및 바이오제닉 아민류 유전자가 없는 비독성 균주로서, 폴리글루타메이트를 생산하고, 청국장 등과 같은 장류의 발효시 발효능이 우수하며, 아미노태 질소 함량을 증가시켜 풍미를 증진시킬 수 있기 때문에, 상기 균주를 통하여 보다 전통장류의 안전성 및 풍미가 강화된 장류 식품의 생산이 가능하므로, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.
<110> Kangwon-Do
<120> Non-toxic new Bacillus subtilis AFY-2 and fermented soybean
products using the same
<130> 9901
<160> 29
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
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<212> DNA
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<220>
<223> forwrad primer of 27F
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tacggatacc ttgttacgac tt 22
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<212> DNA
<213> 16S rRNA of Bacillus subtilis AFY-2
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gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ctgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg 180
gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg 420
aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540
ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600
ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720
taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtctccg ccccttagtg ctgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac 1260
aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc 1440
cgaaggttac agaatgct 1458
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tcccgcatgc tgcagaaaat 20
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cagcggcagc ggattaaatg 20
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<213> Artificial Sequence
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ggccttcaaa atcgcctgct 20
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<400> 26
cggtgtgtca tggcggattt 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 27
tcgaaagcgg acggttcaaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of SRFC-F
<400> 28
ttcactgtcg gaggcggaaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of SRFC-R
<400> 29
accggcagat aggctgctcc 20
Claims (10)
16S rRNA가 서열번호 3의 염기서열을 갖는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
제1항에 있어서, 상기 균주는 구토 독소 및 설사 독소로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 독소를 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
제1항에 있어서, 상기 균주는 히스타민 및 티라민으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 리케니신(lichenysin), 란티바이오틱(lantibiotic) 및 서팩틴(surfactin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생물질을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 혈전용해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
제1항에 있어서, 상기 균주는 아미노태질소를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 장류의 발효에 사용되는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
제9항에 있어서, 상기 장류는 메주, 한식 간장, 양조 간장, 혼합 간장, 한식 된장, 조미 된장, 고추장, 조미 고추장, 춘장 및 청국장으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 AFY-2(Bacillus subtilis AFY-2) 균주(KACC91988P).
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140157273A KR101684628B1 (ko) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 비독성 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효시킨 장류 |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Korean Journal of Microbiology. 2012, Vol. 48, No. 3, pp. 220-224.* |
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