KR100588521B1

KR100588521B1 - 혈전용해능과 면역세포 활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｃｈｋｊ1339균주

Info

Publication number: KR100588521B1
Application number: KR1020040031505A
Authority: KR
Inventors: 차성관; 임성일; 김승호
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2004-05-04
Filing date: 2004-05-04
Publication date: 2006-06-14
Also published as: KR20050106303A

Abstract

본 발명은 혈전용해능과 면역증강기능이 있는 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 균주를 제공한다. 상기 균주를 청국장의 제조시 콩발효를 위한 미생물로 사용하는 경우 혈전용해능과 면역증강기능이 강화된 청국장을 제조할 수 있다.

바실러스 서브틸리스, 청국장

Description

혈전용해능과 면역세포활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ＣＨＫＪ1339균주{Bacillus subtilis CHKJ1339 with Higher Ability of Blood Clot Dissolution and Activating Immune Cells}

본 발명은 콩을 발효시켜 제조되는 식품분야에 유용한 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전용해능과 면역세포활성기능이 높아 고부가가치 식품의 제조에 사용이 가능한 신규 미생물에 관한 것이다.

전분질을 주식으로 섭취해 왔던 극동 아시아에서는 단백질 함량이 높은 콩을 발효시켜 부식으로 이용하여 영양을 보충하였다. 특히 청국장은 제조기간이 짧고 독특한 맛, 향과 색을 띄고 있으며, 각종 유기산 및 비타민 함량이 높아 영양학적 가치가 높은 식품으로 알려져 있다. 최근 고혈압, 뇌출혈 등의 원인이 되는 혈전을 분해하는 효소를 생산하는 바실러스 속균을 사용하여 발효시킨 청국장이 성인병 예방기능이 있는 건강식으로 인기가 높아지고 있다.

하지만, 현재까지 알려진 이들 미생물들의 혈전용해능이나 면역세포활성기능은 그리 만족할 만한 수준이 아니어서 실제 산업적인 규모로서 활용하기 위해서는 더욱 우수한 균주의 확보가 요구되고 있다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 콩을 발효시켜 제조되는 식품분야에 유용하며, 특히 혈전용해능과 면역세포활성기능이 높은 식품의 제조에 사용이 가능한 신규 미생물을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 청국장의 제조에 적합하며 혈전용해능과 면역세포활성기능이 높은 고부가가치 상품의 제조에 사용가능한 신규미생물을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 혈전용해능과 면역증강기능이 있는 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 (KCTC 10576BP)을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 균주가 청국장 발효용도인 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 (KCTC 10576BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 (KCTC 10576BP)를 첨가하여 콩을 발효시켜 제조되는 청국장을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 신규 미생물은 청국장으로부터 분리된다. 먼저, 본 발명의 미생물은 청국장으로부터 분리된 미생물 중에서 단백질 분해력과 점질물질 생성력이 강한 미생물을 1차 선별하고, 이들 1차 선별된 미생물 중에서 혈전용해 효소활성도 및 면역세포 활성도를 측정하여 우수한 것으로 인정되는 균주를 2차 균주로 선발하여 얻을 수 있다.

1차 균주 선발을 위한 단백질 분해활성의 측정은 청국장으로부터 분리된 균주를 스킴밀크 1％가 첨가된 표준한천 배지에 접종하여 배양한 후 생성된 집락 주변이 투명해지는 정도를 측정함으로써 달성될 수 있다.

또한, 점질물질 생성력은 소정 조성의 점질물질 생성배지에 균을 접종하여 배양한 후 루프(loop)를 이용하여 집락을 떼어 올렸을 때 점질물질이 따라 올라오는 길이를 측정함으로써 측정될 수 있다.

2차 균주 선발을 위한 혈전용해 효소활성도는 피브린 플레이트에 페이퍼 디스크를 얹고, 상기 1차 선별된 균주를 포함하는 측정시료를 분주하여 페이퍼 디스크 주위에 생성되는 투명한 부위의 직경을 측정함으로써 얻을 수 있다. 또한, 면역세포활성도는 매크로파지 유사 세포주인 RAW 264.7 세포가 생성하는 NO의 함량을 측정하는 방법에 의해 얻을 수 있다.

상기 과정에 의해 우수한 특성을 가지는 것으로 선발된 본 발명의 미생물 균주의 동정을 위하여, 탄소원을 이용한 동정방법인 에피아이(API)킷트가 이용될 수 있다. 에피아이 킷트를 이용하여 동정한 결과에서 상기 미생물은 바실러스 서브틸리스에 속하는 균주로 확인되었으며, 종래 밝혀진 타 균주에 비하여 혈전용해 효소활성도와 면역세포활성능이 매우 우수한 것으로 확인되어 이를 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 10576BP로서 2003년 12월 29일자로 기탁하였다.

상기 본 발명에 따른 미생물은 콩을 재료로 하여 발효시켜 제조되는 어떠한 식품 분야에도 적용될 수 있다. 대표적인 식품으로 전통 장류가 있으며, 보다 바람직하게는 청국장이 좋다. 청국장의 제조시에 콩의 발효를 위해 상기 미생물을 적정 농도로서 첨가하는 경우 혈전용해능 및 면역증강기능이 강화된 제품의 제조가 가능하게 되어 고부가가치의 제품을 얻을 수 있다. 상기 본 발명의 미생물은 청국장의 제조시 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 기능성을 강화시키고자 하는 목적을 달성하기 위하여 청국장 메주콩에 TSB 배지에 키운 배양액을 전체 무게대비 0.5∼3중량％ 바람직하게는 0.8∼1.5중량％ 정도 첨가되어질 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 미생물의 분리

청국장으로부터 미생물을 분리하기 위하여 청국장 발효과정 중 정해진 날짜 별로 무균적으로 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 펩톤 희석액을 이용하여 20배 희석시킨 후, 멸균봉투에 넣어 스토마커(stomacher)로 균질화 시켰고, 10배 희석법으로 시료를 희석한 후, 표준한천배지를 사용하여 균수를 측정하였다. 균수측정에 사용된 표준한천배지 플레이트로부터 25∼50개 정도의 집락을 형성한 플레이트를 선정하고, 시료당 50개 정도의 미생물을 순수분리하였다. 순수분리된 미생물을 대 상으로 집락 및 세포의 형태학적인 성질조사와 그램염색, 카탈라아제 시험, 옥시다아제 시험을 실시하여 간이동정 및 발효과정 중의 균총 분포도의 변화를 조사하였다 (표 1 참조).

<표 1>

미생물 균총 발효일수	그램+ 카탈라아제+ 옥시다아제+ 구균	그램+ 카탈라아제- 옥시다아제+ 구균	그램+ 카탈라아제- 옥시다아제- 구균	그램+ 카탈라아제+ 옥시다아제+ 간균	그램+ 카타라아제+ 옥시다아제- 간균	그램-
0 일	17	2	23	25	12	6
1 일	0	0	0	100	0	0
2 일	0	0	0	100	0	0
3 일(제품)	0	0	0	100	0	0

간이동정 방법으로 청국장 발효과정 중의 미생물 균총 변화를 조사한 결과 청국장 발효 1일 이후에 이미 바실러스로 추정되는 그램양성, 카탈라아제 양성, 옥시다아제 양성 간균이 미생물 균총의 주종을 이루고 있는 것으로 밝혀졌다(표1 참조). 청국장으로부터 분리된 미생물은 간이동정 후 발효 1일째 시료와 발효 3일째(제품) 시료에서 분리한 100개의 미생물 균주를 Biomerieux사의 API 킷트를 사용하여 세부동정하였다. 즉, 플레이트 집락의 균을 백금이를 이용하여 2㎖의 멸균 증류수에 현탁한 후, 바실러스를 동정하기 위한 CHB 배지에 현탁액을 섞고 탁도를 맞추어 미생물을 준비하였다. 바실러스 동정 킷트 스트립에 미생물을 분주하여 배양한 후, 결과를 판독하여 API 분석프로파일지수로 동정하였다. 세부동정결과 발효 1일째 및 3일째 청국장의 주 발효균은 바실러스 리케니포르미스로 밝혀졌고 바실러스 서브틸리스가 그 다음 중요한 균으로 밝혀졌다 (표 2 참조).

<표 2>

발효기간	균 종류(출현 빈도 수)
1 일	바실러스 리케니포르미스 (21) 바실러스 서브틸리스 (3) 바실러스 스테아로써모필러스 (1)
3 일(제품)	바실러스 리케니포르미스 (22) 바실러스 서브틸리스 (4) 바실러스 코아귤란스 (1) 바실러스 서큐란스 (1) 바실러스 메가테리움 (1)

1차적인 균주선별의 지표로 단백질분해활성과 점질물 생성력의 정도를 측정하였다. 단백질 분해활성의 측정은 청국장으로부터 분리된 201개 균을 스킴밀크 1％ 첨가된 표준한천 배지에 접종하여 배양한 후 생성된 집락 주변이 투명해지는 정도로서 측정하였으며, 점질물질 생성능의 측정은 점질물질 생성배지(피톤 1.5％, 글루탐산 나트륨염 1.5％, 수크로오즈 3％, KH₂PO₄ 0.25％, Na₂HPO ₄ 0.17％, NaCl 0.05％, MgCl₂ㆍ7H₂O 0.05％, 바이오틴 100㎕, 한천 1.5％)에 201개의 균을 접종하여 배양한 후, 루프를 이용하여 집락을 떼어 올렸을 때 점질물질이 따라 올라오는 길이를 측정하여 우수균을 선별하였다. 단백질 분해력과 점질물질 생성정도를 조사한 결과는 표 3에서 나타낸 바와 같다. 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이 원숫자로 표시된 28개 미생물이 1차적으로 단백질 분해력과 점질물질 생성력이 우수한 균으로 선별되었다.

<표 3> 청국장으로부터 분리된 미생물의 단백질 분해력 및 점질물질 생성능력의 측정결과(숫자는 미생물 균수)^****

Test 발효기간	단백질분해력 점질물질	0	+	++	+++^*
0일	0	14	4	3	12
	+	1	4	0	2
	++	1	0	1	0
	+++	0	0	0	2
	++++^**	0	0	2	① ^***
1일	0	0	1	1	0
	+	0	0	9	10
	++	0	0	4	3
	+++	0	2	3	3
	++++	2	3	7	②
2일	0	0	2	0	1
	+	0	5	3	1
	++	1	7	3	1
	+++	3	3	0	1
	++++	5	0	4	⑭
3일	0	0	0	0	0
	+	1	5	13	32
	++	0	0	2	0
	+++	0	2	0	2
	++++	0	0	1	⑪

* 단백질분해력 0 : 프로테아제 활성 없음, 단백질분해력 + : 균체정도 약간투명, 단백질분해력 ++ : 균체정도 투명, 단백질분해력 +++ : 균체주변 투명

** 점질물질 0 : 점질물질 미생성, 점질물질 + : 1cm 미만 생성, 점질물질 ++ : 3cm 생성, 점질물질 +++ : 5cm 생성, 점질물질 ++++ : 5cm 이상 생성

*** 원문자 숫자는 계속적으로 혈전분해능 및 면역세포 활성 측정에 사용된 미생물 균수 숫자임

**** 바실러스 서브틸리스 (KFRI 183) 균은 단백질분해력이 +++, 점질물질 생성이 +++ 이었고, 바실러스 나토 (KFRI 170) 균은 단백질분해력이 +++ 그리고 점질물질 생성이 ++++ 이었음

청국장으로부터 분리된 미생물 중 단백질 분해력과 점질물질 생성에 따라 1차 선별된 28개의 미생물들을 대상으로 2차적으로 혈전용해 효소 활성도와 면역세포 활성을 측정하였다. 혈전용해 효소활성도의 측정을 위하여 1차 선발된 미생물들을 TSB 배지에 1일 배양한 후, 24시간 물에 침지한 메주콩을 20g씩 삼각플라스크에 담아 121℃에서 15분간 멸균시켰고, 멸균시킨 메주콩에 선발된 미생물 배양액을 1％ 접종하고, 37℃에서 24시간 배양하여 청국장을 제조하였다. 상기 제조된 청국장에 20㎖ 생리식염수를 넣어 희석하여 혈전용해 효소 활성도 측정을 위한 시료로 사용하였다.

혈전용해 효소 활성도의 측정은 0.01M 인산완충용액(pH 7.25)에 피브리노겐을 0.3㎖가 되도록 용해시킨 후, 샬레에 10㎖을 분주하고 트롬빈 20유닛을 가하여 실온에서 30분 방치하여 만든 피브린 플레이트에 페이퍼 디스크를 얹고 측정 시료 20㎕을 분주한 후, 3시간 실온에 방치하여 페이퍼 디스크 주위에 생성된 투명한 부위의 직경을 측정하였다. 청국장으로부터 분리된 미생물들 중 1차적으로 선발된 균주들의 혈전용해 효소 활성도의 측정결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.

1차 선별된 미생물들의 면역세포 활성을 측정하기 위하여 매크로파지 유사 세포주(macrophage-like cell line)인 RAW 264.7 세포가 생성한 산화질소(NO)의 양을 측정하였다. 시료는 혈전 용해능에 사용한 시료를 100℃에서 30분 처리 후 농도별로 희석하여 사용하였다. RAW 264.7 세포주는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (GIBCO)에 10％ 우태아혈청(Fetal Bovine serum)과 pen/strep (100×) 1％를 첨가하여 만든 배지로 배양하였으며, 고착성을 갖는 세포를 세포 스크레이퍼(cell scraper)로 회수 부유시켜 사용하였다. Raw 264.7 세포를 96웰에 2×10⁴ cells/well이 되도록 분주한 후, 농도별로 희석한 시료와 함께 37℃ CO₂ 인큐베이터(SANYO)에서 48시간 배양하였고, 각 웰로부터 상등액을 50㎕ 취하여 다른 플레이트에 옮기고 그리스시약(Griess reagent)를 동량 첨가하여 10분간 반응시키고, 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.

<표 4> 청국장 미생물을 이용하여 제조한 청국장의 점질물질의 생성, 흰막 형성유무 및 청국장으로부터 분리된 미생물의 혈전분해능, 면역세포 NO 생성능 및 API 동정결과

Stain No.		점질 물질*	흰막 형성유무 **	혈전분해능 (투명환 지름)	면역세포 NO 생성능		API 동정결과
Stain No.		점질 물질*	흰막 형성유무 **	혈전분해능 (투명환 지름)	1/10	1	API 동정결과
대 조 군	B.subtilis (KFRI 183)	x	x	1.2	0.05	0.3
	B.natto (KFRI 170)	O	O	2.4	0.061	0.15
	청국장제품			1.2	0.061	0.06
CHKJ1237		O	O	1	0.057	0.25	B.subtilis
CHKJ1248		O	O	1	0.063	0.14	B.subtilis
CHKJ1249		O	X	2.3	0.09	0.31	B.subtilis
CHKJ1303		O	O	1.6	0.071	0.25	B.stearothermophilus
CHKJ1307		X	X	1	0.061	0.098	unidentified
CHKJ1308		O	O	1.5	0.053	0.068	B.subtilis
CHKJ1311		O	O	1.5	0.051	0.061	B.stearothermophilus
CHKJ1315		O	O	1	0.06	0.0058	unidentified
CHKJ1326		O	O	2.3	0.063	0.25	B.licheniformis
CHKJ1329		O	O	1.1	0.064	0.25	B.stearothermophilus
CHKJ1332		O	O	1	0.068	0.13	B.subtilis
CHKJ1339		O	O	2.3	0.057	0.15	B.subtilis
CHKJ1348		O	O	1.2	0.06	0.158	B.stearothermophilus
Blank(콩)				0	0.053	0.06
Blank(희석수)				0	0.051	0.05

* 점질물질 유무는 삼각플라스크에 배양된 청국장 콩을 기울여 보았을 때 끈끈한 점액물질의 생성여부

** 흰막 생성유무는 삼각플라스크에 배양된 청국장 콩 주위에 형성된 흰막 유무

<실시예 2> 선별균주를 이용한 청국장의 혈전분해능 비교 조사

혈전분해능 및 면역활성이 우수한 것으로 확인된 5종의 미생물들을 선별하고, 이들 미생물을 콩에 접종하여 콩 발효 중의 혈전분해능을 측정할 목적으로 피브린 플레이트를 이용하여 시료를 동일한 양으로 처리한 후 분해한 지름을 조사하였다. (표 5)

<표 5> 청국장 미생물을 콩에 접종하여 청국장 제조시 혈전분해능의 측정결과

^*샘플 테스트	단위	KFRI183	KFRI170	CHKJ1249	CHKJ1326	CHKJ1339	제품
혈전분해능지름	cm	1.2	2.4	2.3	2.3	2.4	1.2

*sample 콩에 접종한 균번호

<실시예 3> 선별균주를 이용한 청국장의 면역 증강기능 비교 조사

면역 증강기능이 있는 바실러스 균주를 선별하기 위하여 매크로파지 세포에 해당하는 쥐의 마크로파지 세포주 RAW 264.7을 이용하였고, 조사된 면역 매개 물질로서는 암 괴사인자 티엔에프 알파(TNF-α), 인터류킨(IL)-1α 등의 사이토카인과 산화질소(NO)를 대상으로 하였다.

콩발효 중 혈전분해능과 면역세포에서 NO 생성능이 높은 물질을 많이 생산하는 2차 선별균주를 대상으로 쥐의 매크로파지 세포주 RAW 264.7을 이용하여 이들 균주들의 암 괴사인자 티엔에프 알파(TNF-α), 인터류킨(IL)-1α 그리고 산화질소(NO)의 생성능을 조사하였다. (표 6)

표 6에 나타낸 바와 같이 CHKJ1249, CHKJ1326, CHKJ1339 균주 모두는 암 괴사인자 티엔에프 알파(TNF-α)와 인터류킨(IL)-1α를 매우 높은 수준으로 생성하였으며, 시료의 농도가 증가할수록 사이토카인 생산능이 일반적으로 증가하였다. (표 6)

<표 6> 면역세포에 제조한 청국장 처리시 생성한 사이토카인 분석

*샘플 테스트	희석배수		KFRI 183 (B.subtilis)	KFRI 170 (B.natto)	CHKJ1249 (B.subtilis)	CHKJ1326 (B.licheni formis)	CHKJ1339 (B.subtilis)	BLANK (콩)
NO test	S/3	(ug/ml)	0.27	0.56	0.79	0.41	0.59	0.2
NO test	S	(ug/ml)	0.44	0.75	1.39	1.26	1.16	0.18
TNF-α	S/3	(pg/ml)	7399	7365.67	7032.33	7099	6565.67	0
TNF-α	S	(pg/ml)	8799	8466	7666	7566	7332	2.33
IL-1α	S/3	(pg/ml)	0.77	0	0	0	0	0
IL-1α	S	(pg/ml)	143.8	138.7	95.9	146.9	123.8	0

혈전용해활성과 면역능력이 우수한 균주로 최종 선발된 CHKJ1339 균주를 탄소원 이용을 이용한 동정방법인 에피아이(API) 킷트를 이용하여 동정한 결과, 본 발명에 따른 균주는 D-아라비노우스, 라이보즈, D-글루코즈, D-프락토즈, D-만노우즈, 만니톨, 소르비톨, 알파-메틸-D-글루코사이드, N-아세틸글루코사민, 에술린, 말토우즈, 말리보우즈, 사카로즈, 트레할로즈, 이눌린, D-라피노우즈, 아미돈, 글 리코젠과 글루코네이트 같은 탄소원을 잘 이용하는 것을 나타나 바실러스 서브틸리스로 동정되었다.

본 발명에 따른 미생물 균주는 콩을 발효시켜 제조되는 식품분야에 유용하며, 이를 발효과정에 이용하면 혈전용해능과 면역세포활성기능이 높은 식품을 제조할 수 있다. 특히, 본 발명의 미생물 균주는 청국장의 제조에 적합하며 기능성이 강화된 고부가가치 상품을 얻게 한다.

Claims

혈전용해능과 면역증강기능이 있는 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 (KCTC 10576BP)
제 1항에 있어서, 상기 균주는 청국장 발효용도인 바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 KCTC (10576BP)
바실러스 서브틸리스 CHKJ1339 (KCTC 10576BP)를 첨가하여 콩을 발효시켜 제조되는 청국장