KR100963684B1 - 바실러스 서브틸리스 ｋｃｃｍ-10839ｐ 균주를 이용한분리대두단백발효물 및 그 추출물의 제조방법 - Google Patents
바실러스 서브틸리스 ｋｃｃｍ-10839ｐ 균주를 이용한분리대두단백발효물 및 그 추출물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈전용해효소, 단백질 분해효소 및 점질물 생산성이 우수한 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1(KCCM-10839P) 균주를 이용하여 분리대두단백을 발효한 발효물의 제조방법과 분리대두단백 발효추출물의 제조방법 및 기능성에 관한 것이다.
바실러스 서브틸리스 BN-NUC1(KCCM-10839P), 분리대두단백, 고초균, 점질물, 혈전용해효소, 콜레스테롤 흡수저해, 혈소판응집저해.
Description
본 발명은 단백질 가수분해효소, 혈전용해효소 및 점질물 생산이 우수한 미생물을 분리 대두단백 원료에 배양시킨 발효물의 제조방법 및 발효추출물의 특성에 관한 것이다.
청국장은 우리나라의 대두발효 식품으로써, 발효숙성 과정 중에 Bacillus natto, Bacillus subtilis 등이 생산하는 효소작용에 의해 대두에 없던 성분인 효소 및 다양한 생리활성물질이 만들어지며, 콩 단백질이 분해되어 그 특유의 구수한 맛과 냄새를 내는 동시에 끈적끈적한 점질물이 생성된다.
고초균은 암모니아, 인돌 및 아민 등의 발암촉진물질의 생성을 감소시키며, 이러한 유해물질들을 흡착하여 변과 함께 배설시키기도 한다. 그리고 병원균에 대해 항균작용을 하며, 유기산을 생성하여 장을 자극해 소화가 잘 되게 돕기도 한다.
청국장은 원료인 콩이 가지는 영양성분 이외에도 인체의 건강증진을 위한 생리활성 물질이라고 알려진 식이섬유, 인지질, 아이소플라본 (isoflavones: genistein, daidzein, etc.), 페놀화합물 (phenolic acids), 사포닌 (saponins), 피틱산 (phytic acid) 등의 성분이 들어있어 동맥경화, 심장병, 당뇨병 예방효과, 노인성 치매 예방효과, 항암효과(유방암, 대장암, 폐암 등), 골다공증 억제 등의 성인병 예방효과가 있음이 발표 되었다. 이외에도 청국장이 미생물에 의한 발효과정 중 기능성 펩타이드 등의 생리활성 물질을 생성하여 혈압 상승 억제효과 및 지질 대사 개선 효과, 항 돌연변이성 및 항암성, 항균작용 등을 나타내는 것으로 보고되고 있다.
또한 청국장에 풍부한 비타민 B2는 간의 원활한 해독작용을 도움을 주며, 고초균에 의한 콩 발효 중에 다양한 효소들이 생산되며, 특히 혈전분해효소는 혈전을 녹이는 작용을 하므로 심근경색 및 뇌혈전 등을 예방하는데 효과가 있다는 연구보고도 있다.
지금까지 고초균 발효에 대한 연구는 주로 콩을 주원료로 하여 청국장을 제조하는 것이며, 전통방법으로 발효를 수행함으로써 잡균의 오염이 가능하며, 균일한 품질의 청국장발효 제품을 제조하는데 어려움이 있다. 전통 재래식 청국장제조시에 볏짚에 부착된 고초균을 이용하는 경우에 청국장 제품이 품질에 차이가 있으며, 동시에 잡균에 의한 풍미의 저하 또는 점질물 등의 생리활성 물질의 생산이 저해된다. 이러한 잡균에 의한 청국장 품질의 저하을 방지하기 위해서는 청국장 발효용 종균을 사용하여야 하고, 종균의 사용으로 일정한 품질의 청국장을 위생적으로 제조할 수 있다.
한편, 청국장의 발효중에서 혈전용해제에 대한 개발이 많이 이루어지고 있으며, 예로서 일본의 수미(sumi)등 (Fibrinolysis, 2(1), 67, 1988)이 낫도(natto)를 발효하여 그 점질물에 혈전용해 효소가 존재하는 것을 발견하고 기능성 식품으로서의 개발을 시도한 바 있으며, 이를 사람에게 경구투여하여 혈액으로부터 혈전용해작용의 활성을 확인한 바 있다.
또한, 이와 관련된 특허출원으로서는 1995-0008682(혈전 용해능이 있는 효소를 생산하는 신균주 바실러스속 CK), 1995-0014305(바실러스속 균주가 생산,분비하는 혈전용해 능력이 있는 효소의 분리. 정제방법), 1997-0070187(바실러스 속 신균주 및 본 균주가 생산하는 혈전분해성 효소 단백질), 1998-0056257(새로운 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 및 본 균주가 생산하는 혈전용해성 효소 단백질), 2002-0071646(토양에서 분리한 신규한 바실러스 속 ＷＲＤ-2 및 이 균주가 생산하는 세포외 단백질분해효소를 유효성분으로 하는 혈전용해제 조성물), 2003-0084073(바실러스 속 ＢＲＤ-54 균주(ＫＣＴＣ 10183ＢＰ) 및 이 균주로부터 생산된 혈전용해능을 갖는 효소단백질), 2004-0012229(바실러스 속 ＨＬＮ-21 균주 유래의 혈전용해효소 및 이를 분리, 정제하는 방법), 2002-0079719(신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42와 이로부터 생산되는 신규 혈전 분해효소), 2005-0014451(신규한 바실러스 속 균주 및 이로부터 생산되는 항혈전성 물질), 2005-0052418(혈전용해효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 비비-1) 등이 알려져 있다.
본 발명에서는 종래에 청국장 제조에 사용하지 않았던 분리대두단백에 점질물생성능, 혈전용해능 등이 우수한 바실러스 서브틸리스 KCCM-10839P 균주를 배양시켜 대두단백 발효물을 획득하고, 콜레스테롤 저하 및 혈전용해 기능을 가지는 발효추출물을 얻는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 고품질의 대두 발효물을 획득하고자 지방성분이 거의 제거되고 단백질의 함량이 높은 대두단백 원료에 바실러스 서브틸리스 KCCM-10839P 균주를 종균으로 점질물 생산이 증진되고, 기능성과 각종 생리활성 물질들을 포함하는 대두단백 발효물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 점질물, 혈전용해효소 및 단백질 분해효소의 활성이 우수한 바실러스 서브틸리스 KCCM-10839P를 발효미생물로 사용하여 혈전용해능과 콜레스테롤 개선능을 가지는 대두단백 발효추출물을 제공하는 것이다.
본 발명은 분리대두단백에 점질물, 혈전용해효소 및 가수분해효소의 활성이 뛰어난 바실러스 서브틸리스 KCCM-10839P를 배양한 발효물 및 대두단백 발효추출물을 제공한다.
대두단백 원료는 대두에서 단백질을 분리, 정제하여 식용에 적합하도록 제조, 가공한 것으로 혈중 콜레스테롤 수치의 개선에 도움이 되는 건강기능식품의 원료이고, 기능적으로 우수한 원료를 발효시켜 제조한 발효추출물을 획득하고, 발효추출물의 기능성을 확인하였다.
본 발명의 실시 예에 따른 대두단백 발효물의 제조 방법은 분리대두단백 파쇄물에 물을 1~4배 중량부, 바람직하게는 2~3배 중량부 첨가하여 살균, 증자하는 단계; 상기 증자된 대두단백 파쇄물 100 중량부에 바실러스 서브틸리스 KCCM-10839P 2% 중량부 내외를 접종하는 단계; 및 상기 접종된 대두단백 파쇄물을 발효시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 발효 단계는 35-48℃, 바람직하게는 42℃에서 24~48시간 동안 수행될 수 있다.
또한 제조된 대두단백 발효물에 물을 10배 중량부 내외를 첨가하여 2~5시간 실온에서 추출 후 원심분리하여 획득한 상등액을 농축 동결건조하여 대두단백 발효추출물을 획득할 수 있다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1(KCCM-10839P)을 대두단백원료에 발효시킨 발효추출물은 혈전용해능과 콜레스테롤의 세포내 흡수저해능, 혈액혈소판 응집 저해효과 등의 기능성을 나타내어 기능성 원료로 이용될 수 있는 가능성이 크다.
이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명에 따른 대두단백 발효물의 제조
1-1. 원료처리
대두단백 파쇄물은 ADM사(USA)에서 제조한 grit형태의 Textured soy protein concentrate를 사용하였으며 이 대두단백 원료에 증류수를 원료대비 2.5배 중량비로 첨가한 후, 고압 멸균기로 121℃에서 15분간 증자하였다. 증자된 대두단백 파쇄물을 실온에서 50~60℃로 냉각하여 실험에 사용하였다.
2-2 균주 접종 및 발효
균 접종을 위해 5 중량%의 대두분말 용액에서 48시간 배양한 배양액(1억마리 이상/ml)을 상기 냉각시킨 대두단백 파쇄물에 2 중량%가 되게 접종 후 40℃에서 24시간 발효시켰다.
2-3 건조 및 분쇄
24시간 발효한 대두단백 발효물을 50℃에서 열풍건조 혹은 동결건조 후 분쇄하여(50mesh) 대두단백 발효분말을 제조하였다. 이때 제조된 발효물의 균함량은 1억마리이상/g이었다.
(실험예 1) 대두단백 발효물의 일반성분 함량
대두단백 발효물의 일반성분 함량은 식품공전상의 일반성분 함량시험법을 참조하여 분석하였으며, 표 1과 같이 지방이나 콜레스테롤은 거의 들어있지 않고 단백질의 함량이 58%로 높게 나타났다.
[표 1]대두단백 발효물의 일반성분
| 항 목 | 함 량 |
| 수 분 | 5.99g/100g |
| 회 분 | 6.79/100g |
| 단백질 | 58g/100g |
| 지 방 | 0 |
| 조섬유 | 1.6g/100g |
| 탄수화물 | 28g/100g |
| 열 량 | 345kcal/100g |
| 나트륨 | 10mg/100g |
| 포화지방 | 0 |
| 트랜스지방 | 0 |
| 당 류 | 0 |
| 콜레스테롤 | 0 |
<
실시예
2> 본 발명에 따른
대두단백
발효추출물의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 발효분말을 물로 추출하였다. 구체적으로는, 대두단백 발효분말대비 10배 중량부의 물을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 추출한 뒤 10000rpm에서 15분간 원심분리한 상층액을 필터하여 동결건조 후 사용하였다.
(
실험예
1)
대두단백
발효추출물의
혈전용해능
대두단백 발효추출물의 혈전용해능을 측정하기 위하여 대두단백 발효분말 1g을 0.1 M 인산완충용액(phosphate buffer)(pH 7.5) 9mL에 혼합한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
혈전용해효소활성은 피브린 플레이트법(fibrin plate method)의 일종인 아스트럽 및 뮬러츠법(Astrup and Mullertz method)을 사용하여 측정하였다. 피브린 플레이트(Fibrin plate)는 0.5% 피브리노겐(fibrinogen)을 0.067M 인산화 나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.4)에 용해시켜서 직경 9cm인 페트리 접 시(petri dish)에 10mL을 가하였다.
여기에 0.067M 인산화 나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)에 용해된 트롬빈(thrombin)(100 NIH/mL) 0.1 mL를 가하고 신속하게 혼합하고 균일한 평판을 제조한 후 실온에서 30분 방치하여 사용하였다. 피브린 플레이트(Fibrin plate)에 시료 점적 위치를 표시하고 배양 상등액(조효소액)을 20㎕씩 각 표시한 위치에 점적하여 37℃ 항온기에서 2시간 반응시킨 후 투명환의 크기를 측정하였으며, 대조군으로 5unit/mL human plasmin(Sigma)을 20ul 사용하여 효소활성을 비교하였다.
도 1에서 보는 바와 같이 혈전용해환이 가장 큰 대두단백 발효추출물(4번시료)의 플라즈민 대비 효소역가는 8.75unit/ml로 월등한 것으로 나타났다. (1번시료: Bacillus licheniformis로 제조한 대두단백 발효물시료, 2번시료: 시판되고 있는 일반 가루청국장, 3번시료: 대두단백 원료, 5번시료: 대두단백분해물의 동결건조분말)
(
실험예
2)
대두단백발효추출물의
세포내외의
콜레스테롤 대사에 미치는 영향
대두단백발효추출물이 세포내외의 콜레스테롤 대사에 미치는 영향을 알아보기 위하여 HepG2 세포배양 시 세포내 외액의 총콜레스테롤 함량을 측정하였다.
먼저 세포배양은 DMEM 배지에 10% heat-inactivated FBS과 항생물질인 penicillin-streptomycin을 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
배양된 세포를 5×106/well 개수로 씨딩한 다음 48시간 배양 후 cholesterol 10 ug/ml과 sample( 최종농도 10%)을 첨가하였다.
8시간 후 세포를 수거하여 kit를 사용하여 세포 외액과 내액의 콜레스테롤 함량을 측정하였다.
4번 대두단백 발효추출물을 열풍건조한 분말시료를 처리한 세포 내액에는 다른 대조구에 비해 월등히 콜레스테롤 함량이 낮았고, 세포외에서는 콜레스테롤함량이 높게 나타난 결과는 열풍건조 분말시료가 세포내로 콜레스테롤 흡수 억제능이 우수하여 세포내에서는 콜레스테롤함량이 낮고, 세포외에서는 높은 것을 알 수 있었다(도2).
(실험 예 3)
대두단백
발효추출물의 혈소판응집
억제능
대두단백 발효추출물의 혈액내 혈소판 응집 억제능을 알아보기 위하여 쥐의 혈액내 혈소판을 채취하여 실험하였다.
본 실험에 사용된 Sprague-Dewley rat은 ㈜오리엔트바이오에서 분양 받아 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 스트레스를 최소화하고, 몸무게 250-300 g의 male을 실험에 사용하였다.
Washed platelet의 조제-Rat를 ethyl ether로 마취하고, 항응고제 0.15 M sodium citrate를 혈액과 1:9(v/v)의 비율이 되도록 함유한 주사기로 복대동맥으로 부터 채혈하였다. Platelet rich plasma(PRP)는 200 Xg에서 10분간 원심분리하여 상등액의 PRP를 얻었고, 계속해서 800Xg에서 15분간 원심분리하고, 침전된 혈소판 washing buffer(137 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1mM MgCl2, 5 mM glucose, 12 mM NaHCO3, 0.34 mM Na2HPO4, 1 mM EDTA, 20 mM HEPES, 0.25% BSA, pH 7.4)로 2회 세척한 후 suspension buffer(137 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, 12 mM NaHCO3, 0.34 mM Na2HPO4, 20 mM HEPES, 0.25% BSA, pH 7.4)에 현탁시켜서 washed platelet로 하였다. 혈소판 응집 억제능에 사용한 washed platelet는 cell counter(Hema-vet HV 950FS, Drew Scientific, USA)를 이용하여 혈소판 수를 계측하고 buffer로 희석하여 혈소판 3X108 platelet/ml이 되도록 조정하였다. 혈소판은 저온에서 응집되므로 이상의 실험은 상온에서 실행하였다.
혈소판응집 억제능 측정-Rat의 혈소판 응집 억제능은 Aggregometer (Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA, USA)를 이용한 탁도 측정법으로 측정하였다. Washed platelet를 37℃에서 3분간 incubation 시킨 후 농도별로 시료를 처리하고 2분후 혈소판 응집을 유도하는 물질 Adenisine diphosphate(ADP 6uM)로 응집을 유도하였으며, 10분간 측정한 후 억제정도를 계산하였다.
혈액응고를 유도하는 ADP의 혈소판 응집력을 100%로 보았을 때 대두단백발효추출물의 농도가 증가함에 따라 혈소판의 응집을 저해하는 효과가 비례하여 증가하는 경향을 나타내었다(도 3).
<참고
실시예
1> 본 발명에 따른 균주의 분리 및 동정
1-1. 균주의 분리
본 발명자들은 시판되고 있는 재래식 청국장 시료 1g을 멸균 증류수 9 mL에 첨가하여 잘 현탁시킨 후 5분 동안 방치한 다음 그 상층액을 각각 104~107까지 희석하고 미리 준비한 MRS 아가 플레이트에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 다량의 점질물을 생산하는 균주를 개별 분리하였다.
도 4와 도 5는 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1 균주의 16S rDNA 염기서열에 근거하여 작성한 계통도이다. 상기에서 분리한 균주의 염기서열은 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 보였다.
상기 결과들을 기초로 하여 상기에서 분리된 균주를 한국미생물보존협회(KCCM)에 특허기탁 후 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1 KCCM-10839P로 명명하였다. (기탁번호 KCCM-10839, 2007. 1. 24)
1-2. 분리된 미생물의 동정 및 특성
MRS agar plate 상에서 균들을 배양한 후 콜로니의 형태, 색깔, 크기 및 점질물 생성을 확인 하였으며(도 6), plate에서 두 균주(KCCM-10839와 대조로서 바실러스 서브틸리스 ATCC-23857)를 24시간 동안 배양하였을 때 온도에 따른 성장속도와 균의 크기를 알아본 결과 두 균주 모두 42℃에서 성장이 제일 양호하였으며, KCCM-10839 균주는 전체 온도 걸쳐 모두 잘 자랐으며, plate 상에서 점질성의 불규 칙한 돌출된 형태를 확인할 수 있었다. 도 6은 MRS agar plate상에서의 두 균주의 형태학적 특성을 나타낸다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 분리대두 단백발효추출물의 혈전용해능비교 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 분리대두 단백발효추출물의 콜레스테롤 흡수저해능을 비교한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 분리대두 단백발효추출물의 혈소판 응집 저해능을 나타낸 사진이다.
도 4와 도 5는 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1 균주의 16S rDNA 염기서열에 근거하여 작성한 계통도이다.
도 6은 MRS agar plate상에서의 균주의 형태학적 특성을 나타낸다.
Claims (5)
- 분리대두단백 파쇄물에 물을 1~4배 중량부 첨가하여 살균, 증자하는 단계;상기 증자된 분리대두단백 파쇄물에 바실러스 서브틸리스 KCCM-10839P를 접종하는 단계; 및상기 접종된 대두단백 파쇄물을 35-48℃에서 24-48시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는,콜레스테롤 개선능을 갖는 분리대두단백의 발효 방법.
- 삭제
- 제1항에 따라 제조된 콜레스테롤 개선능을 갖는 분리대두단백 발효물.
- 제3항에 기재된 분리대두단백 발효물에 물을 첨가하여 2-5시간 실온에서 추출한 후, 원심분리하여 획득한 상등액을 농축 동결건조하는 것을 특징으로 하는, 콜레스테롤 개선능을 갖는 분리대두단백 발효추출물의 제조 방법.
- 삭제
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| KR1020070109401A KR100963684B1 (ko) | 2007-10-30 | 2007-10-30 | 바실러스 서브틸리스 ｋｃｃｍ-10839ｐ 균주를 이용한분리대두단백발효물 및 그 추출물의 제조방법 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102987052A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-03-27 | 东北农业大学 | 一种高纤维化大豆蛋白的制取方法 |
| KR20200132330A (ko) * | 2019-05-17 | 2020-11-25 | 서울도시가스 주식회사 | 효소 분비능을 가진 Bacillus subtilis 균주를 이용한 발효 콩 제품의 제조 방법 |
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Citations (3)
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| KR100519484B1 (ko) * | 2003-07-09 | 2005-10-06 | 조은경 | 인삼을 첨가하여 불쾌취와 갈변현상을 감소시킨 기능성 청국장 및 그의 제조방법 |
| KR20050106303A (ko) * | 2004-05-04 | 2005-11-09 | 한국식품연구원 | 혈전용해능과 면역세포 활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｃｈｋｊ1339균주 |
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