KR101067837B1

KR101067837B1 - 비타민 ｋ2 생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 ｗ351

Info

Publication number: KR101067837B1
Application number: KR1020090093560A
Authority: KR
Inventors: 임상동; 김기성; 도정룡; 김인호; 조혜정; 노해원
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-09-27
Also published as: KR20110035731A

Abstract

본 발명은 비타민 Ｋ₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비타민 K₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(streptococcus macedonicus) Ｗ351(KACC91483P)을 분리하여 동정하고, 상기의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351을 발효유용 스타터로 사용하여 제조된 발효유에 관한 것이다.

본 발명의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351은 종래의 젖산균에 비하여 비타민 K₂생성능이 뛰어날 뿐만 아니라 항생제 내성, 효소활성, 담즙과 pH 내성 및 항균력을 가지는 기능성 균주로서의 역할을 한다. 따라서 상기 신균주를 사용한 발효유 등의 제조에도 유용하게 이용될 수 있다.

비타민K, 발효유, 스트렙토코커스 마세도니커스, MRS배지

Description

비타민 Ｋ2 생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351{Novel strains of Streptococcus macedonicus W351 having the production-ability of vitamin K2}

본 발명은 비타민 Ｋ₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비타민 K₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(streptococcus macedonicus) Ｗ351(KACC91483P)을 분리하여 동정하고, 상기의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351를 발효유용 스타터로 사용하여 제조된 발효유에 관한 것이다.

비타민 K는 혈액 응고 인자로 알려져 왔다. 비타민 K는 곁사슬의 종류에 따라 비타민 K₁과 비타민 K₂로 분류된다. 다양한 연구들을 통하여 비타민 K₂는 골형성 촉진과 골흡수 억제 두가지 작용에 의해 칼슘대사를 정상적으로 조절하는 물질로 알려져 있으며, 이외에도 장관으로부터 칼슘의 흡수를 촉진하는 새로운 작용도 보 고되고 있다(Price, Annu Rey Nutr. 8, 565, 1988). 비타민 K₂는 Osteocalcin의 Gla화 이외에도 골조직에 직접 작용하는 것으로 알려져 있고, 비타민 K₂제제는 골다공증의 골량 및 동통의 개선제로서 이미 이용되고 있어 골작용을 가진 영양소로서 예방차원의 효과가 알려진 바 있다(Pack et al. Korean J. Nephrol. 23(6), 934, 2004). 인간 수명연장에 따른 고령인구의 증가로 골다공증에 대한 관심이 고조되고 있으며, 폐경기 여성이나 노인에게서 나타나는 골절의 주된 원인이 되고 있으며, 국내에는 약 200만명의 골다공증 환자가 있는 것으로 추산되고 있다. 세계적으로 골다공증이 고령화 사회의 중요한 의료문제로 대두됨에 따라 예방 및 치료제 개발에 많은 연구가 진행되어 수많은 약재들이 개발되었으나 부작용 등으로 인하여 사용이 제한되어 있는 상태이다.

비타민 K₂를 생산하는 균에 관한 연구를 보면 Tani 등(1986)은 Flavobacterium meningosepticum mutant가 배양액 L당 MK 함량이 34mg이었고, 건조 cellg 당 5.5mg이었다고 하였다(Tani et al. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 32(2), 137, 1986). 또한 Sato 등(2001)은 natto에서 분리한 B. subtillis MH-1와 diphenylamine 내성 돌연변이 균주인 D200-41을 10% 대두추출물, 5% glycerol, 0.5% yeast extract와 0.05% K₂HPO₄(pH 7.3) 배지에 37℃에서 1일 교반 배양 후 45℃ 5일 정치 배양했을 때 최대 MK 함량이 60 mg/l 이었다고 하였다(Sato et al. J. Biosci. Bioeng. 91(1), 16. 2001). 또한 Tsukamoto 등(2002)은 비타민 K₂(menaquinone-7)가 골단백인 osteocalcin의 카르복실화에 중요한 역할을 하며, Natto제품이 다른 식품에 비해 높은 MK7을 함유하고 있다고 하였다. 이들은 B. subtiis mutant 균주로 생산된 Natto 제품의 MK7함량이 1719mug/100g natto으로서 상업균주로 제조된 natto 제품에 비해 2배 더 높은 함량을 보였다고 하였다(Tsukamoto et. al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65(9), 2007). 또한 Hojo 등(2007)은 Propionibacteria가 주요 menaquinone(비타민 K₂)인 tetrahydromenaquinone-9(MK-9)를 생산한다고 밝혔으며, propionibacteria로 발효시킨 치즈 중 Norwegian Jarlsberg 치즈와 에멘탈치즈가 아펜젤라치즈나 그루웨어 치즈보다 MK-9 함량이 200-650ng/g으로서 매우 높은 함량을 나타내었다고 하였다(Hojo et al. J. Dairy Sci. 90, 4078, 2007).

비타민 K를 생산하는 젖산균에 관한 연구로는 유일하게 Morishita 등(1999)이 발표하였는데 Lactococcus lactis ssp. cremoris YIT 2001과 Leuconostoc lactis YIT 3001 균주가 환원탈지유나 두유배지에 배양되었을 때 menaquinone(비타민 K₂) 함량이 29-123㎍/L으로 나타나 유제품이나 기타 식품 발효용 스타터로 사용될 수 있음을 시사하였으나 실제로 개발된 사례는 없다(Morishita et. al. J. Dairy Sci. 82, 1897, 1999). 국내에서는 이 등(1998)이 항진균성 항생물질을 생산하는 Bacillus sp.LAM 97-44 균주가 Bacillus속 세균의 전형적인 isoprenoid 쇄가 7개인 menaquinone(MK-7)을 가지고 있음(이 등, 한국농화학회지, 41(3), 208, 1998)을 밝혔으나 비타민 K₂를 생산하는 젖산균에 관한 연구는 전무한 실정이다. 이 에 따라 국내에서 개발된 젖산균을 이용하여 제품을 만든다면, 제품 및 젖산균의 수입대체효과와 더 나아가 외국에 수출할 수 있는 국제경쟁력을 키울 수 있으리라 여겨진다.

종래에 발견된 Streptococcus macedonicus는 Greek Kasseri cheese로부터 분리되어 다양한 연구를 통해 치즈 생산에서의 우수성이 보고되었으며(Anastasiou et al., International Dairy Journal, 17, 208, 2007), 유제품 제조시 bacteriocin을 생성하는 유용한 starter로서 평가되고 있지만(Georgalaki et al. Appl. Environ. Microbiol. 68(12), 5891, 2002), 현재까지 Streptococcus macedonicus의 비타민 K₂ 생성에 대한 연구는 없을뿐더러 현재까지 발효유제품의 스타터로서 이용된 사례가 없어 이에 관한 연구가 필요한 시점이라 할 수 있다.

본 발명의 목적은 종래의 젖산균주들보다 비타민 K₂생성능이 뛰어나며, 발효유 제조에 적합한 신균주를 제공하고자 함이며, 신균주를 이용한 발효유를 다수인에 제공하여 국민생활건강에 이바지하고자 함이다.

상기의 과제를 해결하고자, 본 발명은 비타민 K₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(streptococcus macedonicus) Ｗ351(KACC91483P)을 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351를 발효유용 스타터로 사용하여 제조된 발효유를 제공한다.

본 발명의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351는 종래의 젖산균에 비하여 비타민 K₂생성능이 뛰어날 뿐만 아니라 항생제 내성, 효소활성, 담즙과 pH 내성 및 항균력을 가지는 기능성 균주로서의 역할을 한다. 따라서 상기 신균주를 사용한 발효유 등의 제조에도 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 비타민 K₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) Ｗ351(KACC91483P)을 제공한다.

본 발명에서 상기 균주는 항생제 내성, 효소활성, 담즙내성, pH 내성 및 항균력 중에서 선택된 어느 하나 이상의 기능을 가질 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 균주는 브롬크레졸 퍼플(Bromcresol purple) 및 소디엄 아자이드(Sodium azide)를 첨가한 변형 MRS배지에서 배양되어질 수 있다.

본 발명은 또한 상기의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스 Ｗ351를 발효유용 스타터로 사용하여 제조된 발효유를 제공한다.

이하 본 발명의 비타민 K₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) Ｗ351에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 신규 미생물은 원유에서 분리되었으며, 후술하는 실시예 및 실험예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정되어질 수 있다. 미생물의 동정은 그의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어진다. 원유에서 분리한 신규의 젖산균이 젖산 및 비타민 K₂ 생성능력이 우수하여 발효유 제조에 적합함을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 원유내에 포함된 균주를 변형 MRS배지에서 배양한 다음, 각 균락을 순수분리하고 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하고, 선발된 균주를 전기 변형 MRS 배지에서 도말한 후, 호기배양하여 순수분리 하였다. 순수분 리된 균주를 동정한 결과, 균주는 그램양성 연쇄상 구균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하고 카탈라제와 운동성에 대해서는 음성으로 밝혀졌다. 또한, 15℃와 45℃에서 생장하였으며, 글루코스(glucose)로부터 가스와 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 스트렙토코커스(Streptococcus)에 속하는 것으로 확인하였다.

한편, 종명을 확인하기 위하여 20종의 당발효 시험을 실시한 결과, 락토스 등 6종으로부터 산을 생성하였고, ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 스트렙토코커스 마세도니커스로 판명되었다. 원유에서 분리한 탈지유 응고균주들 중 탈지유 응고속도와 비타민 K₂ 생성능력이 우수한 균주를 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) W351로 명명하였다.

본 발명의 신균주의 생균수와 pH를 측정하여 젖산균의 생장을 시험한 결과, 최적온도는 40℃이며, 발효유의 최적 pH 조건인 pH 4.3-4.4에 도달하는데 15시간 소요되었다. 또한, 항생제 내성시험을 통해 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC)값을 측정한 결과, 타 계열의 항생제에 비해 가나마이신, 폴리마이신 B와 스트렙토마이신에 대해 내성이 있는 반면 반코마이신, 리팜피신과 노보바이오신에 감수성이 높다. 효소활성시험을 통해 나타난 결과, 에스테라제, 나프톨 포스포하이드로라제에서 효소 활성이 높게 나타났다.

또한 Benzopyrene을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-glucuronidase의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있었다. 담즙내성 을 MRS배지에서의 젖산균 성장을 시험함으로써 측정하였는바 7시간 동안 배양 후에 O.D.값이 0.3% oxgall을 첨가하지 않았을 때는 1.135, 0.3% oxgall을 첨가하였을 때는 1.047로서 거의 억제되지 않음에 따라 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.

본 발명의 신균주의 pH 내성을 시험한 결과, 대조구인 pH 6.4의 균수와 비교한 결과 3시간 이후의 균수의 차이가 pH 6.4에서 0.05(log) 증균 했으며, pH 2.0와 3.0에서는 각 0.20, 0.16(log)만큼 증균 한 것으로 나타나 생존의 변화가 거의 없어 내산성이 있음을 보였다. 항균력 시험에서는 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 억제력이 없었으나, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 51.1%, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 24.7%의 억제력을 보였다. 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 스트렙토코커스 마세도니커스 W351이 발효유 제조에 적합한 젖산균임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 분리된 스트렙토코커스 마세도니커스 W351은 2009년 7월 10일 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁되었고, 2009년 7월 29일자로 미생물의 명칭은 streptococcus macedonicus Ｗ351이며, 수탁번호는 KACC91483P를 부여받았다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통해 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예 등은 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 등으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 균주(미생물)의 분리

경북가축위생시험소에서 수거한 원유를 브롬크레졸 퍼플(Bromcresol purple)과 소듐아자이드(sodium azide)이 첨가된 변형 MRS배지(이하 표 1 참조)에 0.3㎖씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 균주를 배양하였다. 배양 후 생긴 각각의 균락을 전기 변형 MRS 배지에서 순수분리하고, 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 3회 백금이로 도말한 후 호기배양 하여 순수분리 하였다. 순수분리 균주를 10% 환원 탈지유(Difco Laboratories, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 응고여부를 확인하였다.

[표 1] 본 발명의 균주 분리에 사용된 변형 MRS 배지의 조성

성 분	성분비(g/L)
프로테오스 펩톤 #3	10.0
쇠고기 추출물	10.0
효모 추출물	5.0
락토오스	20.0
트윈 80	1.0
암모늄 시트레이트	2.0
소디움 아세테이트	5.0
마그네슘 설페이트	0.1
망간 설페이트	0.05
디포타시움 포스페이트	2.0
소듐 아자이드	0.25
브롬크레졸 퍼플	0.04

<실시예 2> 비타민 K₂ 생성능력이 우수한 젖산균주 선발

1. 상기 실시예 1에서 순수분리된 젖산균주를 MRS 액체배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 다카하시 등(Takashi et al., J. Dairy Sci., 82, 1897, 1999)의 방법을 변형하여 만든 Rogosa 배지(이하 표 2 참조)에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 균체는 변형된 Rogosa 배지에서 4,000rpm 15분간 원심분리하여 회수하였고, 멸균생리식염수로 2회 씻어낸 다음 동결 건조하였다. 환원탈지유 배지(reconstituted skim milk culture, 이하 표 3 참조)에 젖산균주를 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양 후 회수 없이 사용하였다.

[표 2] 변형 로가사(Rogosa) 배지의 조성

성 분	성분비(g/L)
덱스트로즈	20.0
트립틱케이스 펩톤	20.0
트립토스 펩톤	3.0
효모 추출물	5.0
트리 암모늄 시트레이트	2.0
K₂PO₄(인산칼륨)	3.0
K₂HPO₄(인산제2칼륨)	3.0
마그네슘 설페이트	0.575
황산철	0.034
망간 설페이트	0.1
L-시스테인	0.2
소디움 아세테이트	1.0
트윈 80	1.0

[표 3] 환원탈지유 배지(reconstituted skim milk culture)액의 조성

성 분	성분비(g/L)
탈지분유	100
효모추출물	5
염화칼슘	2
L-시스테인	0.3

2. 상기 1.의 배양물 중 비타민 K₂ 생성이 확인된 W351, W352, U118, U154, U281, U528의 6개 젖산균에서 추출된 용출액 및 비타민 K₂ (menaqinone-4) 표준품을 HPLC로 분석하여 그 결과는 이하 표 4에 정리하였다. 또한 대표적인 크로마토그람 은 도 1 및 도 2와 같았다.

[표 4] HPLC를 이용하여 선발된 젖산균으로부터 생성된 비타민 K₂ 함량

선발균주	비타민 K₂ 함량 (㎍/L)
선발균주	Rogosa 배지	환원탈지유
W351	58.0	15.7
W352	29.6	7.3
U118	37.5	8.2
U154	13.0	3.2
U281	7.6	1.8
U528	27.7	6.6

*R²=0.9986

상기 표 4에서 알 수 있듯이, 분리된 젖산균 중 W351의 젖산균의 경우, 배양액에서 58.0㎍/L로 가장 많이 나왔으며 환원탈지유 배지에서 15.7㎍/L로 가장 많이 나온 것이 확인되어, 비타민 K₂ 생성능력이 우수한 균주로 선발되었다.

<실시예 3> 균주의 동정

미생물(균주)의 분류학적 동정은 Hammes 등[The prokaryotes, 1563-1578, 2nd Edition, Springer-Verlag Co.(1992)]의 방법에 따라 수행하였으며, 그 결과는 이하 표 5와 같았다. 이들 균주는 공히 그램 양성, 연쇄상 구균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하였고, 카탈라제와 운동성은 음성이었다. 또한, 15~45℃에서 생장하였으며 포도당(glucose)으로부터 가스(gas)와, 아르기닌(arginine)으로부터 암모니아를 생성하지 않아 Streptococcus 속(genus) 임을 알 수 있었다.

균주의 종(species)을 정하기 위하여, 상기 균주를 20STREP kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 20종의 당발효 시험을 실시하였을 때 락토스 등 6 종으로부터 산을 생성하였고, ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 스트렙토코커스 마세도니커스로 판명되었다. 원유에서 분리한 탈지유 응고균주들 중 젖산 및 비타민 K₂ 생성능력이 우수한 균주를 Streptococcus macedonicus W351로 명명하고, 2009년 7월 10일 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하고, 2009년 7월 29일자로 수탁 번호 KACC 91483P를 부여받았다.

[표 5] 본 발명의 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) W351의 생리적 및 생화학적 특성

그램 반응 세포 형태 포자 형성 운동성 호기적 성장 혐기적 성장 카탈라제 반응 15℃에서 성장 45℃에서 성장 포도당으로 부터 가스생성 알기닌으로 부터 암모니아 생성	+ cocci - - + + - + + - -
기질이용 능력
Sodium pyruvate Hippuric acid Esculin ferric citrate Payroglutamic acid-β-naphthylamide 6-Bromo-2-naphthyl-αD-galactopyranoside Naphthol ASBI-glucuronic acid 2-Naphthyl-phosphate L-Leucine - β - naphthylamide L-Arginine D-Ribose L-Arabinose D-Mannitol D-Sorbitol D-Lactose(bovine origin) D-Trehalose Inulin D-Raffinose Starch(2) Glycogen	+ + - - + - - - + - - - - + + - - - -

상기 실시예들에 근거하여 발효유용 스타터로서 적합한지 여부를 확인하기 위하여 스트렙토코커스 마세도니커스(Streptococcus macedonicus) W351을 10% 환원탈지유에 배양하면서 실험에 사용하였다.

<실험예 1> 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 생장실험

젖산균의 생장은 생균수, pH를 측정하여 실험하였다. 생균수는 10% 탈지유 150㎖에 균주를 1㎖용 피펫으로 1방울 접종한 후 34, 37, 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양한 각 시료를 0.1% 펩톤용액에 희석하여 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 35℃에서 48시간 배양하여 계수하였고, 온도 및 시간별로 pH 변화를 측정하고 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 상기 도 3과 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 최적온도는 40℃이며, 발효유의 최적 pH 조건인 pH 4.3~4.4에 도달하는데는 15시간이 걸린다는 것을 알 수 있었다(도 3 및 4 참조).

<실험예 2> 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 항생제 내성실험

항생제 내성실험은 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, Difco, USA)를 사용하여 2배 희석방법에 의해 생장여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC) 값을 정하였으며, 측정한 결과를 이하 표 6에 나타내었다.

[표 6] 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 항생제 감수성 결과

항생제	최저억제농도(㎍/㎖)
아미노글리코사이드계
아미카신	1600
겐타마이신	6400
가나마이신	16000
네오마이신	1600
스트렙토마이신*	9600
β-락탐계
페니실린-G*	200
메치실린	1600
옥사실린	240
암피실린	1280
그램-양성 스펙트럼
바시트라신*	60
리팜피신	15
노보바이오신	20
린코마이신	800
그램-음성 스펙트럼
폴리마이신B*	12,000
광범위 스펙트럼
클로람페니콜	160
반코마이신*	1.56

* : units/㎖

상기 표 6에서 알 수 있듯이, 스트렙토코커스 마세도니커스 W351는 타 계열의 항생제에 비해 가나마이신, 폴리마이신 B와 스트렙토마이신에 대해 내성이 있는 반면 반코마이신, 리팜피신과 노보바이오신에 감수성이 높다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 3> 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 효소활성실험

효소활성실험은 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 균주를 생리식염수로 희석하여 10⁵ ~ 10⁶cfu/㎖ 수준의 시료를 조제한 후, API ZYM kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 37℃에서 5시간 동안 배양한 다음 효소반응을 시켰다. 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0~5의 수치로 표시하였고, 그 결과를 이하 표 7에 나타내었다.

[표 7] 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 효소활성 비교

효 소

효소활성

알칼라인 포스파타제
에스테라제(C4)
에스테라제 리파제(C8)
리파제(C14)
류신 아릴아미다제
발린 아릴아미다제
시스틴 아릴아미다제
트립신
카이모트립신
산 포스파타제
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라제
α-갈락토시다제
β-갈락토시다제
β-글루크로니다제
α-글루코시다제
β-글루코시다제
N-아세칠-β-글루코스아민니다제
α-만노시다제
β-푸코시다제

1
5
4
0
3
1
1
1
1
4
5
0
1
0
2
0
1
0
0

* : 0 에서 5까지 단계별로 표준색이 명시되어 있으며, 0은 음성이고 5는 최대의 강도를 나타낸다. 1은 5나노몰(nanomoles), 2는 10나노몰, 3은 20나노몰, 4는 30나노몰, 5는 40나노몰 이상의 효소활성을 나타낸다.

상기 표 7에서 알 수 있듯이, 스트렙토코커스 마세도니커스 W351은 에스테라제, 나프톨 포스포하이드로라제에서 효소 활성이 높게 나타났다. Benzopyrene을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-glucuronidase의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 담즙내성실험

담즙내성실험은 길리랜드와 월커의 방법(Gilliland & Walker, J. Dairy Sci., 73, 905, 1990)에 따라 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 도 5에서 알수 있는 바와 같이, 7시간 동안 배양 후에 O.D.값이 0.3% oxgall을 첨가하지 않았을 때는 1.135 였으나, 0.3% oxgall을 첨가하였을 때는 1.047로서 거의 억제되지 않음에 따라 담즙에 대한 내성이 있다는 결론을 얻을 수 있었다.

<실험예 5> 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 pH 내성실험

pH 내성실험은 클라크 등의 방법(Clark et al., Cultured Dairy Products J., 28(4), 11, 1993)에 따라 측정하였고, 그 결과를 이하 표 8에 나타내었다.

[표 8] pH와 배양시간별 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 내성측정 결과(단위 : CFU per ㎖(Log number))

배양시간 (hr)	pH 2	pH 3	pH 4	pH 6.4
0	7.72	7.79	7.81	7.80
1	7.77	7.85	7.88	7.85
2	7.89	7.89	7.91	7.91
3	7.96	7.92	7.94	7.98

상기 표 8에서 알 수 있듯이, 대조구인 pH 6.4에 비해, 강산인 pH 2에서 조차도 거의 영향이 없음에 따라 본 발명의 균주는 내산성이 있음을 알 수 있었다.

<실험예 6> 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 항균력실험

항균력실험은 길리랜드와 스펙(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 따라 측정하였고, 그 결과를 이하 표 9에 나타내었다.

[표 9] MRS 배지에서 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 식중독균 억제(*)정도 결과

식중독균	생 장
	식중독균^a		S. macedonicus W351^a		억제율(%)
	CFU/㎖	pH	CFU/㎖	pH
Escherichia coli	2.15×10⁶	6.41	1.62×10⁶	5.64	24.65
Salmonella typhimurium	2.25×10⁶	5.64	1.10×10⁶	5.21	51.11
Staphyloccous aureus	4.55×10⁷	5.82	2.25×10⁸	5.61	0

* 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 초기 수 : 2.1×10⁶CFU/㎖

^a 37℃에서 6시간 배양 후 측정

상기 표 9에서 알 수 있듯이, 스트렙토코커스 마세도니커스 W351은 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 억제력이 없었으나, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 51.1%, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 24.7%의 억제력을 보인다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 신균주는 비타민 생성능이 우수하고, 항생제 내성, 효소활성, 담즙과 pH 내성 및 항균력 등의 기능을 가져 유용한 발효용 스타터로 이용이 가능하여 다수의 소비자들의 생활건강에 도움을 주며, 생산자의 이윤창출을 도모하고, 궁극적으로 국가의 산업발전에 이바지 할 것으로 기대된다.

도 1은 비타민 K₂ (menaqinone-4) 표준품의 크로마토그람이다.

도 2는 젖산균에서 추출된 용출액의 크로마토그람이다.

도 3은 스트렙토코커스 마세도니커스 W351을 10% 환원탈지유에 접종하였을 때의 성장을 나타낸 그래프이다.

도 4는 스트렙토코커스 마세도니커스 W351을 10% 환원탈지유에 접종하였을 때의 pH변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 담즙첨가 유무에 따라 L-시스테인이 함유된 MRS배지에서의 스트렙토코커스 마세도니커스 W351의 성장을 나타낸 그래프이다.

Claims

비타민 K₂생성능을 가지는 신균주 스트렙토코커스 마세도니커스(streptococcus macedonicus) Ｗ351(KACC91483P).