KR101349139B1

KR101349139B1 - 락토바실러스 퍼멘텀 ｌｃ２７２ 균주를 이용한 비타민 ｋ２의 생산 방법 및 이 균주를 이용한 발효유의 제조 방법

Info

Publication number: KR101349139B1
Application number: KR1020120019605A
Authority: KR
Inventors: 임상동; 김기성; 도정룡; 성기승; 조성아
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2014-01-10
Also published as: KR20130101661A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주를 이용한 비타민 K₂의 생산 최적화 방법을 제공한다. 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주와, 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus), 비피도박테리움 롱검(B. longum) 및 스트렙토코커스 서머필러스(S. thermophilus)로 이루어지는 혼합균주를 이용한 발효유 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 발효유는 다량의 비타민 K₂를 포함하며, 골형성을 증가시킨다.

Description

락토바실러스 퍼멘텀 ＬＣ２７２ 균주를 이용한 비타민 Ｋ２의 생산 방법 및 이 균주를 이용한 발효유의 제조 방법{Method for Preparing Vitamin K2 and Fermented Milk Using Lactobacillus fermentum LC272}

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주를 이용한 비타민 K₂의 생산 방법, 이 균주를 이용한 발효유의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 발효유에 관한 것이다.

발효유(Fermented milk)라 함은 우유(牛乳), 양유(羊乳) 따위를 유산균이나 효모균으로 발효시켜 만든 유제품을 말한다. 발효유는 통상적으로 몸의 영양을 돕는 자양 식료로 쓰이는 것이 일반적이며, 현재 발효유에 사용하는 젖산균으로는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 등이 주로 사용되어 있으며, 상기 발효유에 사용하는 젖산균은 매년 수입에 의존하고 있는 실정이다. 따라서 상기에서 언급한 젖산균 외에 외국에서 수입하지 않고서도 국내에서 원활한 공급이 이루어질 수 있는 신규의 젖산균 개발에 대한 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 원유 및 분변에 다양한 특성이 있는 젖산균이 존재할 것임에 착안하고, 비타민 Ｋ₂생성 능력이 있는 발효유의 제조에 합당한 젖산균을 확보하고자 연구 노력한 결과, 원유로부터 신규의 젖산균인 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) LC272 (KACC91565P)를 분리하고, 이 균주가 비타민 Ｋ₂생성 능력이 매우 우수함을 확인하고,‘비타민 Ｋ₂생성능을 가지는 신균주 락토바실러스 퍼멘텀 LC272’로 상기 균주에 대한 특허를 등록받았다(특허등록번호 제10-1101894호, 2011년 12월 27일).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 본 발명자들이 이미 동정한 비타민 K₂ 생성능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 (KACC91565P) 균주를 배양하여 비타민 K₂를 고수율로 생산하는 방법과, 이 균주를 발효시켜 발효유를 제조하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 락토바실러스 퍼멘텀LC272 (KACC91565P) 균주를 사용하여 비타민 K₂ 생산량 증진이 가능한 배양액 조성을 탐색하여 탄소원, 질소원 및 미량원소의 배합 조건을 도출함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 락토바실러스 퍼멘텀LC272 (KACC91565P) 균주를 이용한 비타민 K₂의 생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 발효유 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 발효유를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 젖산균을 이용한 비타민 K₂의 생산 방법을 제공한다:

(a) 탈지유, 분리대두단백, 리보오스 및 KH₂PO₄를 포함하는 배지 조성물을 살균하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LC272 (KACC91565P) 균주를 접종하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 발효시키는 단계.

본 발명자들은 본 발명자들이 이미 동정한 비타민 K₂ 생성능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LC272 (KACC91565P) 균주를 배양하여 비타민 K₂를 고수율로 생산하는 방법과, 이 균주를 발효시켜 발효유를 제조하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 락토바실러스 퍼멘텀LC272 (KACC91565P) 균주를 사용하여 비타민 K₂ 생산량 증진이 가능한 배양액 조성을 탐색하여 탄소원, 질소원 및 미량원소의 배합 조건을 도출함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 비타민 K₂ 생성능이 우수한 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주를 발명한 바 있으며(대한민국 등록특허 제10-1101894호), 본 발명에서는 상기 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주의 비타민 K₂ 생성능을 증진시킬 수 있는 배양 조건을 도출하였다.

본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주의 비타민 K₂ 생산 증진을 위해 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소에서의 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주의 비타민 K₂ 생성능을 탐색하였고, 그 결과 탈지유를 배지 기초물질로 이용하면서 탄소원으로서 리보오스, 질소원으로서 분리대두단백, 미량원소로 KH₂PO₄를 선발하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 비타민 K₂ 생산용 배지 조성물은 탈지유 1.0-20.0 중량%, 분리대두단백 0.1-10.0 중량%, 리보오스 0.1-10.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.1-5.0 중량%를 포함한다.

바람직하게는 탈지유 1.0-15.0 중량%, 분리대두단백 0.1-5.0 중량%, 리보오스 0.1-5.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.1-2.0 중량%를 포함하고, 보다 바람직하게는 탈지유 5.0-15.0 중량%, 분리대두단백 0.1-3.0 중량%, 리보오스 0.1-3.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.1-1.5 중량%를 포함하며, 보다 더 바람직하게는 탈지유 5.0-12.0 중량%, 분리대두단백 0.5-3.0 중량%, 리보오스 0.5-3.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.1-1.0 중량%를 포함하고, 가장 바람직하게는 탈지유 5.0-10.0 중량%, 분리대두단백 0.5-2.0 중량%, 리보오스 0.5-2.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.1-0.5 중량%를 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 발효유 제조방법을 제공한다.

(a) 원유 혼합물을 살균하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 (i) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LC272 (KACC91565P) 균주 및 (ⅱ) 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus)로 이루어지는 혼합균주를 접종하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 발효시키는 단계.

본 발명자들은 비타민 K₂ 생성능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주를 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주와 혼합하여 원유 혼합물을 발효시킴으로써 다량의 비타민 K₂를 포함하고 기호성(예컨대, 색깔, 맛 및 조직감)이 우수한 발효유의 제조 방법을 도출하였다.

본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 원유 혼합물의 제조 및 살균 단계

본 발명에 따르면, 본 발명의 원유 혼합물은 원유, 탈지유, 분리대두단백 및 미량원소를 포함한다.

본 발명의 원유 혼합물에서 미량원소는 바람직하게는 KH₂PO₄, ZnSO₄, MgSO₄, FeSO₄, MnSO₄, CuSO₄ 또는 CaCl₂이고, 보다 바람직하게는 KH₂PO₄, MgSO₄, FeSO₄, MnSO₄ 또는 CaCl₂이며, 보다 더 바람직하게는 KH₂PO₄, MnSO₄ 또는 MgSO₄이고, 가장 바람직하게는 KH₂PO₄이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 원유 혼합물은 원유 80-95 중량%, 탈지유 1.0-10.0 중량%, 분리대두단백 0.1-3.0 중량% 및 미량원소 0.1-2.0 중량%를 포함한다. 바람직하게는 원유 85-95 중량%, 탈지유 1.0-8.0 중량%, 분리대두단백 0.1-2.0 중량% 및 미량원소 0.1-1.5 중량%를 포함하고, 보다 바람직하게는 원유 90-95 중량%, 탈지유 1.0-5.0 중량%, 분리대두단백 0.1-1.5 량% 및 미량원소 0.1-1.0 중량%를 포함하며, 가장 바람직하게는 원유 92-95 중량%, 탈지유 3.0-5.0 중량%, 분리대두단백 0.5-1.5 중량% 및 미량원소 0.1-0.7 중량%를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 원유 혼합물은 배합하여 완전히 녹인 후 균질화한다. 바람직하게는 원유 혼합물의 배합은 50-80℃, 보다 바람직하게는 50-70℃, 보다 더 바람직하게는 55-70℃, 가장 바람직하게는 55-65℃에서 실시한다. 바람직하게는 균질화는 150 kgf/cm²-350 kgf/cm², 보다 바람직하게는 150 kgf/cm²-300 kgf/cm², 보다 더 바람직하게는 150 kgf/cm²-280 kgf/cm², 가장 바람직하게는 180 kgf/cm²-250 kgf/cm² 압력 조건에서 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 균질화 시킨 원유 혼합물은 고온 살균한다. 바람직하게는 80-98℃, 보다 바람직하게는 83-98℃, 보다 더 바람직하게는 83-95℃, 가장 바람직하게는 85-95℃에서 실시한다. 바람직하게는 살균은 1-50분, 보다 바람직하게는 3-40분, 가장 바람직하게는 5-30분 동안 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 고온 살균한 원유 혼합물은 35-45℃로 냉각시킨다.

단계 (b): 살균된 원유 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주 및 혼합균주를 접종하는 단계

상기 단계 (a)에서 살균 후 냉각시킨 원유 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주와, 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주를 접종한다.

상기 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주는 본 발명자들이 발명한 균주로서 이에 대한 내용은 대한민국 등록특허 제10-1101894호에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 방법에서는 상기 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주에, 상기 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주(ABT-D)를 더 첨가하여 접종한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 접종하는 (i) 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주와 (ⅱ) 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주의 비율은 1:1의 비율이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 접종하는 (i) 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주 및 (ⅱ) 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주의 양은 상기 원유 혼합물 100중량부에 대하여 0.1 - 5.0 중량부이며, 보다 바람직하게는 0.1 - 3.0 중량부이며, 보다 더 바람직하게는 0.1 - 2.0 중량부이고, 가장 바람직하게는 0.5 - 2.0 중량부이다.

단계 (c): 혼합균주가 첨가된 원유 혼합물의 발효

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 원유 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주 및 상기 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주(ABT-D)를 첨가하고 최종 pH가 4.0-4.8이 될 때 까지 배양시킨다. 바람직하게는 상기 최종 pH 4.1-4.7이고, 보다 바람직하게는 pH 4.2-4.6이며, 보다 더 바람직하게는 pH 4.3-4.5이고, 가장 바람직하게는 pH 4.4이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 원유 혼합물은 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주 및 ABT-D의 혼합균주를 첨가하여 배양한 배양액을 15-20℃로 냉각시킨다.

본 발명에 따르면, 상기 단계 (c)에서 얻은 발효액에 부재료를 첨가하여 발효유의 기호성(예컨대, 색깔, 맛 및 조직감)을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 부재료는 상기 단계 (c)에서 얻은 발효액 70-90 중량%에 10-30 중량％를 혼합한다. 바람직하게는 발효액은 75-90 중량%이고, 보다 바람직하게는 77-87 중량%이며, 보다 더 바람직하게는 80-87 중량%이고, 가장 바람직하게는 82-85 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 부재료는 당시럽, 과일추출물 및 정제수로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로 구성된다. 바람직하게는 당시럽은 과당, 설탕, 포도당 또는 덱스트린이고, 보다 바람직하게는 과당, 설탕 또는 포도당이며, 보다 더 바람직하게는 과당 또는 설탕이고, 가장 바람직하게는 액상과당이다. 과일추출물은 다양한 과일로부터 당업계에 공지된 다양한 추출 및 가공방법을 통해 수득할 수 있으며 바람직하게는 과일즙, 과일엑기스 또는 과일쨈이다. 보다 바람직하게는 사과즙, 딸기즙, 블루베리즙, 매실즙, 사과엑기스, 딸기엑기스, 블루베리엑기스, 매실엑기스, 사과쨈, 딸기쨈, 블루베리쨈 또는 매실쨈이고, 보다 더 바람직하게는 사과즙, 매실즙, 매실엑기스, 딸기쨈, 블루베리쨈이며, 가장 바람직하게는 사과즙, 딸기쨈, 블루베리쨈, 매실엑기스이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 부재료는 바람직하게는 액상과당 3.0-7.0 중량％, 딸기쨈 또는 블루베리쨈 4.0-12.0 중량％, 사과즙 0.1-2.0 중량％, 매실엑기스 0.1-2.0 중량％ 및 정제수 0-10.0 중량％이고, 보다 바람직하게는 액상과당 4.0-7.0 중량％, 딸기쨈 또는 블루베리쨈 5.0-12.0 중량％, 사과즙 0.5-2.0 중량％, 매실엑기스 0.5-2.0 중량％ 및 정제수 0-7.0 중량％이며, 가장 바람직하게는 액상과당 4.0-6.0 중량％, 딸기쨈 또는 블루베리쨈 5.0-10.0 중량％, 사과즙 0.5-1.5 중량％, 매실엑기스 0.5-1.5 중량％ 및 정제수 0-5.0 중량％이다.

본 발명의 일 구체예인 하기 실시예 8에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 발효유는 시판되고 있는 발효유에 비해 색깔, 맛 및 조직감에서 우수하였다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된 발효유를 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 발효유의 가장 큰 특징 중 하나는 다량의 비타민 K₂를 포함한다는 것이다. 이러한 특징은 비타민 K₂ 생성능을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주로부터 유래된 것이다.

비타민 K는 골아세포 형성을 촉진시키고 골파괴세포를 감소시켜 골형성은 돕고 골흡수는 막아주는 역할을 한다고 보고되었다(Koshihara Y et al., J Endocrinol 176(3):339-348(2003)).

본 발명의 일 구체예인 하기 실시예 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 발효유는 오스테오칼신의 혈청 농도를 증가시켜 결과적으로 골형성을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 발효유는 골다공증의 개선 용도의 식품원료로 사용될 수 있다.

본 발명이 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법으로 제조한 발효유를 유효성분으로 포함하는 골다공증 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 상기 발효유 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 상기 발효유 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주를 이용한 비타민 K₂의 생산 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주 및 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주를 이용한 발효유 제조 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 방법에 의해 제조된 발효유를 제공한다.

(ⅳ) 본 발명의 방법에 의하면 비타민 K₂를 대량으로 생산할 수 있으며, 비타민 K2가 다량 함유된 발효유를 제조할 수 있고, 본 발명의 발효유는 다량의 비타민 K₂를 포함하므로 골형성을 증가시켜 골다공증의 개선용도도 사용될 수 있다.

도 1은 탈지유 10 중량%, 대두분리단백 1.0 중량%, 리보오스 1 중량% 및 KH₂PO₄ 0.2 중량% 배지 조건 하에서 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P)를 배양하면서 비타민 K₂ 함량, pH 및 젖산균수 변화 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 6주간 실험식이 섭취한 Sprague-Dawley 랫트의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 6주간 실험식이 섭취한 Sprague-Dawley 랫트의 오스테오칼신 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 6주간 실험식이 섭취한 Sprague-Dawley 랫트의 대퇴골과 경골의 골밀도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 6주간 실험식이 섭취한 Sprague-Dawley 랫트의 대퇴골과 경골의 골무기질함량을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 젖산균주의 비타민 K ₂ 생산 조건의 확립

비타민 K ₂ 생산증진 위한 배양조성물 탐색

본 발명자들이 분리 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주를 배양하여 비타민 K₂의 최대 생산 조건을 확립하였다.

탄소원

본 발명 균주에 대한 비타민 K₂ 생산증진 위한 배양조성 탐색을 위하여 탄소원 선정은 MRS 액체배지에서 40℃, 18시간 배양된 각각의 균주를 MRS 배지 조성 중 Glucose(20g/L) 대신 25종의 탄소원으로 대체 첨가된 MRS 배지에 1% 접종하였고, 40℃에서 18시간 배양하여 OD₆₂₀값을 측정한 결과는 표 1과 같다.

유산균 성장에 대한 탄소원의 효과

탄소원	L. fermentum 272 (OD₆₂₀)
L-아라비노스	1.23
D-리보오스	1.37
D-갈락토오스	1.60
D-글루코오스	1.73
D-프룩토오스	1.59
D-만노오스	1.51
만니톨	1.22
소르비톨	1.04
α-메틸-D-만노사이드	1.17
N-아세틸-글루코사민	1.01
아미그달린	1.14
아르부틴	1.02
에스쿨린	1.01
살리신	1.13
셀로비오스	1.07
말토오스	1.25
락토오스	1.68
멜리비오스	1.09
수크로오스	1.20
트레할로오스	1.16
멜레지토오스	1.13
라피노오스	1.07
겐티오비오스	1.10
D-타가토오스	1.00
글루콘산염	1.09

표 1에서 보는 바와 같이 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P)는 D-갈락토오스, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-만노오스, 락토오스를 첨가하였을 경우 OD값이 1.50이상으로 높게 나옴에 따라 OD값이 1.50 이상인 것을 선발하였고, 다만, 락토오스 사용시에도 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P)의 성장이 우수하였으나, 발효유 제조 시 우유 베이스를 이용함에 따라 선정에서 제외하였다.

질소원 및 미량원소

질소원과 미량원소는 MRS 배지조성, Rogosa 배지조성 및 시중 식용 가능한 소재를 감안하여, 질소원은 ISP, 효모 추출물, 두유를 선정하였고, 미량원소는 KH₂PO₄, MgSO₄7H₂O, FeSO₄7H₂O, MnSO₄4H₂O 및 CaCl₂를 선정하였다.

탄소원 , 질소원, 미량원소별 비타민 K ₂ 생산 효율 분석

본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주를 이용하여 탈지유 10%를 베이스로 하고 여기에 탄소원, 질소원 및 미량원소별로 첨가한 다음 40℃에서 18시간 또는 24시간 배양한 다음 비타민 K₂ 함량과 pH를 측정한 결과는 다음 표 2와 같다.

비타민 K₂ 생산에 대한 탄소원, 질소원, 미량원소의 효과

원료		L. fermentum 272
		비타민 K₂(㎍/L)	pH
		비타민 K₂(㎍/L)	18시간	24시간
질소	효모 추출물 0.5%	0.00	4.50	-
	효모 추출물 1.0%	8.75	4.42	-
	두유 0.5%	0.00	-	4.73
	두유 1.0%	56.59	4.55	-
	분리대두단백 0.5%	15.23	-	4.88
	분리대두단백 1.0%	65.00	4.50	-
탄소	소르비톨 1%	-	-	-
	만노오스 1%	6.02	-	4.79
	갈락토오스 1%	10.23	-	4.86
	리보오스 1%	25.45	4.45	-
	글루코오스 1%	0.00	4.55	-
	프룩토오스 1%	6.36	-	4.68
미량원소	MgSO₄7H₂O 0.01%	5.34	-	4.77
	KH₂PO₄ 0.2%	39.55	-	4.62
	FeSO₄7H₂O 0.0034%	11.02	-	4.91
	MnSO₄4H₂O 0.005%	23.07	-	4.86
	CaCl₂ 0.2%	15.91	-	4.81
대조군² ⁾		33.03	4.47	-

ISP¹ ⁾: Isolated Soy Protein

대조군² ⁾ : 탈지유 10% + 효모 추출물 0.5% + CaCl₂ 0.2% + L-시스테인HCl 0.03%

락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주는 탈지유 10%를 베이스로 하고 여기에 질소원 중에서 ISP 1.0% 첨가했을 때 비타민 K₂ 함량이 65 ㎍/L으로 가장 높은 함량을 보였고, 두유 1.0%도 대조구보다 높은 56.59 ㎍/L 값을 나타내었다. 탄소원 중에서는 리보오스 1%일 때 25.45 ㎍/L을, 미량원소 중에서 KH₂PO₄이 39.55 ㎍/L 값을 나타내었다.

비타민 K ₂ 생산을 위한 발효 조건 설정

락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주는 ISP 1.0%, 리보오스 1%, KH₂PO₄ 0.2%를 함유한 탈지유 10% 배지에 90℃에서 30분간 살균한 후 1% 접종하여 40℃에서 6시간 간격으로 24시간까지 비타민 K₂ 함량, pH 및 젖산균수의 변화를 측정하여 발효조건을 설정한 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 보는 바와 같이 배양 6시간 일 때 비타민 K₂ 함량이 28.91 ㎍/L로 증가되었고, 배양 24시간일 때 pH 4.2이었으며, 이때 비타민 K₂ 함량이 85.12 ㎍/L로서 꾸준히 증가되었다. 발효유 관능적 최적 pH가 4.3을 감안할 때 대략 80 ㎍/L으로 예측되었다.

실시예 2: 발효유의 제조(1)

종균 및 벌크 접종균의 제조

상기 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P) 벌크 접종균은 원유에서 분리된 종균인 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)를 환원탈지유에 1％(v/v)로 접종하고, 39.5± 2.5℃에서 18± 6시간 동안 배양한 다음, 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)가 배양된 상기의 배양액 종균을 85± 5℃에서 45± 15분간 열처리된 환원탈지유에 1％(v/v)로 접종하고, 39.5± 2.5℃에서 18± 6시간 동안 배양한 것을 사용하였다.

발효유의 제조

원유 94.89 중량%, 탈지유 3.90 중량%, 분리대두단백 1.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.21 중량%를 첨가하고 65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 215±35 kgf/㎠의 압력으로 균질화하였다. 90℃에서 5분간 살균하고, 40℃로 냉각시킨 다음 상기 냉각시킨 균질화물 100 중량부에 대하여 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와, 혼합균주 [락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus), 비피도박테리움 롱검(B. longum) 및 스트렙토코커스 서머필러스(S. thermophilus)의 혼합균주(ABT-D 균주), Rhone-poulenc 사]를 50:50 비율로 1.0 중량부를 접종하여 최종 pH가 4.4로 감소할 때까지 배양시킨 다음 교반기로 서서히 교 반하면서 배양액을 17±2.5℃로 냉각하여 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 ABT-D균주를 포함하는 발효액을 얻었다. 상기에서 얻은 발효액 83 중량％에 액상과당 5.0 중량％, 딸기쨈 6.0 중량％, 사과즙 1.0 중량%, 매실엑기스 1.0 중량%, 정제수 4.0 중량％를 첨가하여 혼합한 다음 교반하여 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 ABT-D균주를 포함하는 발효유를 얻었다.

실시예 3: 발효유의 제조(2)

딸기쨈 6.0 중량％ 대신에 8.0 중량％, 정제수 4.0 중량％ 대신에 2.0 중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 혼합균주(ABT-D 균주)를 포함하는 발효유를 제조하였다.

실시예 4: 발효유의 제조(3)

딸기쨈 6.0 중량％ 대신에 10.0 중량％, 정제수 4.0 중량％ 대신에 0 중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 혼합균주(ABT-D 균주)를 포함하는 발효유를 제조하였다.

실시예 5: 발효유의 제조(4)

딸기쨈 6.0 중량％ 대신에 블루베리쨈 6.0 중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 혼합균주(ABT-D 균주)를 포함하는 발효유를 제조하였다.

실시예 6: 발효유의 제조(5)

딸기쨈 6.0 중량％ 대신에 블루베리쨈 8.0 중량％, 정제수 4.0 중량％ 첨가 대신에 2.0 중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 혼합균주(ABT-D 균주)를 포함하는 발효유를 제조하였다.

실시예 7: 발효유의 제조(6)

딸기쨈 6.0 중량％ 대신에 블루베리쨈 10.0 중량％, 정제수 5.0 중량％ 첨가 대신에 0 중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) LC272 균주(KACC91565P)와 ABT-D 균주를 포함하는 발효유를 제조하였다. 하기 표 3은 실시예 2 내지 실시예 7의 발효유 성분을 비교하여 기재한 것이다. 단위는 중량％이다.

발효유의 성분

항목(중량％)	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6	실시예 7
원 유	78.76	78.76	78.76	78.76	78.76	78.76
탈지유	3.24	3.24	3.24	3.24	3.24	3.24
분리대두단백	0.83	0.83	0.83	0.83	0.83	0.83
KH₂PO₄	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17
액상과당	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
딸기쨈*	6.0	8.0	10.0	-	-	-
블루베리쨈**	-	-	-	6.0	8.0	10.0
사과즙	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
매실엑기스	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
정제수	4.0	2.0	0	4.0	2.0	0

* 당도 61.2 Brix, 딸기 함량 45%인 딸기쨈.

** 당도 62 Brix, 블루베리 함량 40%인 블루베리쨈.

실시예 8: 관능검사

발효유 관련분야에서 2년 이상 근무한 13명의 인원을 관능검사요원으로 하여 상기 실시예 2 내지 실시예 7의 방법에 의해 제조한 발효유 및 대조구 발효유의 색깔, 맛, 조직감 및 종합적 기호도와 같은 관능검사를 9점 평점법으로 실시하여 그 결과를 아래의 표 4에 정리하여 나타내었다.

항목	관능검사
항목	색깔	맛	조직감	종합적기호도
실시예 1	6.97±1.59	6.36±1.77	6.48±1.25	6.41±1.48
실시예 2	6.90±1.27	7.14±1.12	6.67±1.26	7.13±1.11
실시예 3	6.79±1.56	7.33±1.28	7.12±0.87	7.20±0.95
실시예 4	6.47±1.34	6.54±1.45	6.59±1.79	6.54±1.36
실시예 5	7.14±1.35	6.68±1.58	6.91±1.29	6.85±1.42
실시예 6	7.51± 1.52	7.37± 1.52	7.16± 1.27	7.33± 1.14
대조구**	6.14± 1.50	6.39± 0.97	6.58± 1.79	6.45± 1.28

* 1: 매우 좋지 않음 5: 보통 9: 매우 좋음

** 대조구는 서울우유사의 퓨오레 제품

상기 표 4에서처럼 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 균주와 ABT-D 균주를 함유한 발효유에 당시럽 및 과일쨈을 첨가하여 기호성(예컨대, 색깔, 맛 및 조직감)이 우수한 발효유를 제조할 수 있었다.

실시예 9: 동물실험

본 발명의 균주를 배양하여 제조한 발효유의 골 강화 증진 효과를 알아보기 위하여 암컷 Sprague-Dawley 랫트 40두를 대상으로 하여 탈지유를 투입한 난소 절제하지 않은 그룹(위군, Sham), 탈지유를 투입한 난소절제 그룹(대조군), 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) LC272 균주와 혼합균주[락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus), 비피도박테리움 롱검(B. longum) 및 스트렙토코커스 서머필러스(S. thermophilus)로 이루어지는 혼합균주(ABT-D), Rhone-poulenc 사)를 50:50으로 혼합하여 배양한 발효유를 투입한 난소절제 그룹(A)와, 혼합균주(ABT-D)만을 이용한 발효유를 투입한 난소절제 그룹(B)을 각각 설정하고 경구투여 방법을 선택하여 각각의 발효유를 각각 5 ml/kg/day씩 Sprague-Dawley 랫트 40두의 위내로 6주(week) 동안 직접 투여하였다. 시료 용량은 시판되고 있는 드링크 발효유 150 ml 2개 용량/성인 체중 60 kg을 1일 기준으로 결정하였다.

체중변화 측정

각 군의 랫트들의 성장 여부를 조사하기 위하여 체중변화를 조사하였다. 그 결과 도 2에서 보는 바와 같이, 난소 절제하지 않은 위군(sham)은 타 처리군에 비해 유의차가 있었다.

장기무게 측정

전체 실험 기간 중 간 무게는 A 군이 위군에 비해 유의성이 있는 반면 신장은 유의성 있는 변화를 보이지는 않았다(표 5). 자궁의 무게는 위군이 0.65 g으로 가장 높았으며 다른 난소 절제한 군에 비해 유의성이 있었다.

Sprague-Dawley 랫트의 장기 무게 변화(g/mice)

장기 무게(g)	위군	대조군	A	B
간	7.57 ±0.35^b	8.47 ±1.12^ab	8.83 ±1.00^a	7.96 ±1.28^ab
신장	1.96 ±0.12^ns	2.02 ±0.18	1.99 ±0.10	1.96 ±0.28
자궁	0.65 ±0.36^a	0.13 ±0.03^b	0.10 ±0.03^b	0.14 ±0.02^b

1) Values are means±SD

2) ns: not significant

3) Values with different superscript within the row are significantly

different at α=0.05 by Duncan's multiple range test.

오스테오칼신

오스테오칼신은 조골세포에 의해 합성되며 뼈의 세포외기질에 결합된다. 새로 결합된 오스테오칼신의 일부는 순환계로 방출되는데 오스테오칼신과 조직학적으로 증명된 골형성 정도와 좋은 상관성을 나타내므로 혈청 중 오스테오칼신의 농도는 조골세포의 활성도를 직접적으로 반영한다고 볼 수 있다. 도 3은 6주간 급여한 Sprague-Dawley 랫트의 오스테오칼신 농도 변화에 관한 것으로 A 처리군의 혈청 오스테오칼신이 가장 높은 값을 보였고 타 처리군에 비해 유의성이 있었다.

골밀도

도 4는 6주간 급여한 Sprague-Dawley 랫트의 대퇴골과 경골의 골밀도에 관한 것으로 유의차는 없었지만 위군 다음으로 A 처리군이 높았다.

골무기질함량

도 5는 6주간 급여한 Sprague-Dawley 랫트의 대퇴골과 경골의 골무기질함량에 관한 것으로 A 처리군이 대조군과 B 처리군에 비해 유의성(p<0.05)이 인정되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 젖산균을 이용한 비타민 K₂의 생산 방법:
(a) 탈지유, 분리대두단백, 리보오스 및 KH₂PO₄를 포함하는 배지 조성물을 살균하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LC272 (KACC91565P) 균주를 접종하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 발효시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 배지 조성물은 탈지유 1-15 중량%, 분리대두단백 0.1-5.0 중량%, 리보오스 0.1-5.0 중량% 및 KH₂PO₄ 0.1-2.0 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 발효유 제조방법:
(a) 원유, 탈지유, 분리대두단백 및 미량원소를 포함하는 원유 혼합물을 살균하는 단계; 상기 미량원소는 KH₂PO4, ZnSO₄, MgSO₄, FeSO₄, MnSO₄, CuSO₄ 또는 CaCl₂이고,
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 (i) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LC272 (KACC91565P) 균주 및 (ⅱ) 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus)로 이루어지는 혼합균주를 접종하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 발효시키는 단계.
삭제
삭제
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 접종하는 (i) 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주와 (ⅱ) 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주의 비율은 1:1의 비율인 것을 특징으로 하는 발효유 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 접종하는 (i) 락토바실러스 퍼멘텀 LC272 (KACC91565P) 균주 및 (ⅱ) 락토바실러스 에시도필러스, 비피도박테리움 롱검 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어지는 혼합균주의 총량은 상기 단계 (a)의 원유 혼합물 100중량부에 대하여 0.1 - 5.0 중량부인 것을 특징으로 하는 발효유 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 결과물에 당시럽, 과일추출물 및 정제수로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 부재료를 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 발효유 제조방법.
삭제
제 3 항, 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 발효유.
제 10 항의 발효유를 유효성분으로 포함하는 골다공증 개선용 기능성 식품 조성물.