CN104542977B - 一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，并涉及制备得到的该饮品，属于食品饮料技术领域。所述制备方法，包括将以山药提取物、低聚木糖、大豆多糖、大豆蛋白胨、脱脂牛乳、乳酸钙、复合枸杞浓缩汁等为主要原料的发酵培养液，按照特定条件灭菌后，依次接种植物乳杆菌菌液和两歧双歧杆菌菌液，在厌氧发酵罐中保持一定罐压发酵得到发酵乳基料，灌装或调配灌装，得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。具有活菌含量高、发酵时间短、活菌存活率高，其中两歧双歧杆菌的发酵性、耐酸性和耐胃酸性良好，益生效果显著的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，并涉及制备得到的该饮品，属于食品饮料技术领域。
背景技术
山药能有效改善高血糖，山药中的黏滑成分也是由黏蛋白形成的。黏蛋白能包裹肠内的其他食物，使糖分被缓慢地吸收。这一作用能抑制饭后血糖急剧上升，同时也可以避免胰岛素分泌过剩，使血糖得到较好调控。山药还含有胰岛素分泌必不可少的镁和锌等有效成分，以及维生素B1、维生素B2。这些成分促进了血液中葡萄糖的代谢。此外，山药还含有淀粉酶，这是消化糖类的酶，可使血液中不再积存糖分。
双歧杆菌(bifidobacterium longum)是健康人群消化道内具有益生作用的优势菌群，其具有的生理功能包括：调整肠道菌群，增强免疫系统，防止便秘，治疗溃疡性结肠炎，产生抗生素，提高蛋白质和维生素的代谢，抗衰老，治疗肝损伤，抗肿瘤，降低胆固醇等。随着年龄的增长，肠道中双歧杆菌的数量逐渐减少，而产气荚膜梭状茵、大肠杆菌等有害腐败细菌逐渐增加。同时一些负面因素，如服用抗生素、放疗、化疗、情绪压抑、身体衰弱、缺乏免疫力等，也会导致双歧杆菌大量消亡，有害细菌大量繁殖，造成人体健康状态不佳，对疾病的抵抗力降低，医学专家建议，要健康长寿，在其他条件得到保证的前提下，设法增加肠道中双歧杆菌的数量也是促进健康长寿的一种捷径。目前对两歧双歧杆菌的研究日益受到人们的重视，如何提高其在发酵性、耐酸性、耐胃酸性等方面的性能，是本行业人员面临的较大挑战。
申请公布号CN 103462093A《一种排毒养颜者食用的特殊膳食》公开了一种将山药、郁李仁、枸杞、红枣、桂圆、火麻仁等多种药食同源食材烘炒、粉碎后，配以膳食纤维、阿胶、荞麦花粉、共轭亚油酸、水苏糖、螺旋藻、玉米花粉、紫云英花粉、盐藻提取物、抗性糊精、人参等，再混合并干燥100℃灭菌4小时，然后与嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌等多种益生菌混匀制成的特殊膳食。具有食疗、预防、调理三重功效。
上述发明成分过于复杂，易引起过敏反应的因素较多，不适用人群较广，且仅是将各种成分简单地混合在一起制成，益生菌活菌含量低，不能充分发挥各成分的营养保健功效，不适合作为保健食品长期食用。
申请公布号CN 103656076A的发明《具有降血糖功能的益生菌-中草药复合物制剂》公开了一种具有降血糖功能的益生菌中草药复合物制剂，由下列组分按重量份混合组成：山药25-30份、葛根15-25份、肉桂20-30份、枸杞子20-40份、益生菌冻干粉30-40份；其中益生菌是由以下重量百分比菌组成：青春双歧杆菌40％、长双歧杆菌40％、植物乳杆菌10％、鼠李糖乳杆菌10％。本制剂具有降血糖功能。
上述发明存在营养构成不够合理，不能满足益生菌大量增殖的需求，造成益生菌活菌含量较低，发酵周期过长，且适应人群不够广泛的缺点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，通过选择合适的菌种，混合发酵，优化培养基及培养条件，制备一种营养构成合理、活菌含量高、保健效果好的保健饮品。所述制备方法发酵周期短，适于推广应用。同时提供上述方法制备得到的含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按以下配方称取原料：以质量计，山药提取物1-10％，低聚木糖0.5-1％，大豆多糖0.05-0.2％，大豆蛋白胨0.1-0.2％，脱脂牛乳10-30％，Nacl0.2-0.5％，乳酸钙0.5-1％,复合枸杞浓缩汁1-2％，其余为软化水；
将脱脂牛乳95℃，5分钟单独加热灭菌，备用；同时，将软化水加热至50-60℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，90-100℃灭菌5-20分钟，趁热加入已灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，得到发酵培养液；
(2)向步骤(1)发酵培养液中接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为1-3％；培养温度32-37℃，罐压0.02-0.03MPa,培养时间2-3小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为4-6％，并补加复合枸杞浓缩汁1-2％、山药提取物0.5-1％；培养温度35-37℃，罐压0.04-0.06MPa,培养时间6-10小时，得到发酵乳基料，直接灌装或调配后灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品；
所述调配为：将发酵乳基料与甜味剂、增稠剂、食用香精和水中的一种或多种，按照保健饮品相关标准要求混合。
较佳地，所述调配，是将发酵乳基料与其它原料按以下配方混合均匀，以质量计：2-3‰的大豆多糖、维生素C 0.12-0.24‰、山药提取物0.5-1％、低聚木糖1-3％、果糖5-10％、发酵乳基料补足至100％。
优选的，所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加18-20倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为500-800W，频率2450MHz；超声波功率800-1000W，频率40KHz，时间为15-45min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于3-4倍纯净水，真空浓缩，真空干燥至水分低于10％，粉碎后过80-100目筛备用。
优选的，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9405；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
所述两歧双歧杆菌在种子培养基中活化培养三次，以种子培养基质量计：第一次，接种量3％，37℃厌氧培养36h，第二次按4％接种量进行接种，37℃厌氧养24h，第三次按5％接种量进行接种，37℃厌氧培养12h，得到两歧双歧杆菌菌液；
所述种子培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，低聚木糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014，于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号.中国科学院微生物研究所.邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.9405，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
所述植物乳杆菌菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。
所述植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→亚硝基胍(NTG)诱变→等离子体诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。
所述出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d,当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。
植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌株。
经验证发现：该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1.1mg/h/kg)，能够耐1％胆盐。
所述植物乳杆菌菌液的制备：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌CGMCC NO.9405斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照5％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间20小时；
(3)三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，种子培养基装量1000毫升，培养温度37℃，培养时间18小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度37℃，罐压0.05MPa,培养时间12小时；
所述种子培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,脱脂牛乳20mL，乳酸钙1％,山药提取物1％，复合枸杞浓缩汁2％，余量为水,pH6.8；
所述发酵培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8。
所述复合枸杞浓缩汁可以由以下方法制备：
枸杞冲洗后迅速冷冻至-40--30℃；升华干燥，真空度400-500Pa，干燥至水分＜12％；控制温度在-10--2℃粉碎至粒径在1.5mm以下；将枸杞、黄芪和灵芝子实体粉碎物混合，添加上述混合物重量3-6倍的柠檬酸水溶液，控制溶液的pH值为4-5，添加混合物重量0.5-1％的复合酶，所述复合酶由酸性果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶组成，三种酶的重量比为2.5∶1∶1.5，酶解温度为40-48℃，酶解时间为1.5-2hr；之后将pH值调整为5.1-5.6，温度升到50-60℃，同时添加混合物重量0.2-0.5％的果胶酶、0.2-1％的葡聚糖酶，作用时间为2.5-3hr；酶解液在5-10℃过滤；滤液冷冻浓缩获得复合枸杞浓缩汁；
所述枸杞、黄芪、灵芝子实体的质量份数比为：8：1：0.5。
有益效果：
两歧双歧杆菌对培养条件具有严格的选择性，本发明将两歧双歧杆菌与植物乳杆菌混合发酵，通过优化培养基，将食品原辅料进行筛选并按照特定比例组合，克服了传统培养基原料组成复杂，含有非食品成分，不宜用于食品发酵的缺陷，通过控制培养基及培养条件，使两歧双歧杆菌与植物乳杆菌产生良好的协同促进作用，提高了两歧双歧杆菌的活菌含量，缩短了发酵时间，并提高了两歧双歧杆菌的发酵性、耐酸性和耐胃酸性。并且在调配混合的过程中，添加低聚木糖、山药提取物，加强了对活菌的保护作用，试验证明，各实施例保健饮品在4-10℃保持2小时后，活菌存活率平均达到41.7％。
通过在培养各过程中添加并补充山药提取物和复合枸杞浓缩汁，促进了植物乳杆菌和两歧双歧杆菌的生长，菌种的生物活性又能充分发挥药食同源物品的保健作用，在利用天然添加物增进口感的同时，使益生菌与药食同源物品相辅相成，取得了很好的保健效果。
保健饮料中所含活性益生菌，在人体肠道内的定植能力强、定植时间长，有效抑制了肠道有害菌尤其是革兰氏阴性菌的生长及繁殖，对肠道菌群的组成进行了有益调整，从而益生效果显著且适宜人群广泛。
通过耐冷试验、模拟胃液及肠液耐受试验表明，该保健饮品能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到41.7-45.3％，益生性显著；经小鼠肠道性能试验表明：饲喂保健饮品小鼠体重平均增长率47.46％，显著高于自然恢复组32.14％；饲喂保健饮品后肠道大肠杆菌数量显著下降，平均降低74.8％，显著高于自然恢复组24.78％，表明本发明保健饮品中的益生菌在小白鼠肠道内迅速定植，形成优势菌群，并有效抑制大肠杆菌等病原菌的生长繁殖，并且定植时间长，能持续、有效地改善肠道性能。
植物乳杆菌CGMCC NO.9405乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；能够在pH为1.80的条件下存活。与两歧双歧杆菌CICC21712协同作用，相互促进，使制得的保健饮品益生性能更加优越。
感官品评试验也证明了：本发明制备的含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品从外观、香气、风味和口感各方面均明显优于市售同类保健饮品。
具体实施方式
实施例1
一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按以下配方称取原料，以质量计，山药提取物5％，低聚木糖1％，大豆多糖0.1％，大豆蛋白胨0.2％，脱脂牛乳30％，Nacl0.2％，乳酸钙0.5％,复合枸杞浓缩汁2％，其余为软化水；
脱脂牛乳95℃，5分钟单独加热灭菌，备用；
软化水加热至55℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，95℃，15分钟灭菌，趁热加入灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，作为发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为2％；培养温度35℃，罐压0.02MPa,培养时间3小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为6％，并补加复合枸杞浓缩汁2％、山药提取物1％；培养温度37℃，罐压0.06MPa,培养时间8小时，得到发酵乳基料，其中植物乳杆菌活菌数2×108CFU/mL，两歧双歧杆菌活菌数3×1010CFU/mL；
以质量计，按如下组分：3‰的大豆多糖、维生素C 0.24‰、山药提取物0.5％、低聚木糖2％、果糖6％、发酵乳基料补足至100％，混合均匀后灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加19倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为650W，频率2450MHz；超声波功率900W，频率40KHz，时间为30min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于3倍纯净水，真空浓缩，真空干燥，至水分低于10％，粉碎后过90目筛备用。
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9405；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
所述两歧双歧杆菌在种子培养基中活化培养三次，以培养基质量计：第一次，按3％接种量进行接种，37℃厌氧培养36h，第二次按4％接种量进行接种，37℃厌氧养24h，第三次按5％接种量进行接种，37℃厌氧培养12h，得到两歧双歧杆菌菌液；
所述种子培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，低聚木糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8。
所述植物乳杆菌菌液的制备：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌CGMCC NO.9405斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照5％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间20小时；
(3)三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，种子培养基装量1000毫升，培养温度37℃，培养时间18小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度37℃，罐压0.05MPa,培养时间12小时；
所述种子培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,脱脂牛乳20mL，乳酸钙1％,山药提取物1％，复合枸杞浓缩汁2％，余量为水,pH6.8；
所述发酵培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g,软化水补足1000mL,pH6.8。
所述复合枸杞浓缩汁由以下方法制备：
枸杞冲洗后迅速冷冻至-40℃；升华干燥，真空度450Pa，干燥至水分＜12％；控制温度在-10℃粉碎至粒径在1.5mm以下；将枸杞、黄芪和灵芝子实体粉碎物混合，添加上述混合物重量4倍的柠檬酸水溶液，控制溶液的pH值为4.5，添加混合物重量1％的复合酶，所述复合酶由酸性果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶组成，三种酶的重量比为2.5∶1∶1.5，酶解温度为45℃，酶解时间为2hr；之后将pH值调整为5.4，温度升到55℃，同时添加混合物重量0.3％的果胶酶、0.6％的葡聚糖酶，作用时间为2.5hr；酶解液在5℃过滤；滤液冷冻浓缩获得复合枸杞浓缩汁；
所述枸杞、黄芪、灵芝子实体的质量份数比为：8：1：0.5。
实施例2
一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按以下配方称取原料，以质量计，山药提取物10％，低聚木糖1％，大豆多糖0.2％，大豆蛋白胨0.2％，脱脂牛乳30％，Nacl0.5％，乳酸钙1％,复合枸杞浓缩汁2％，其余为软化水；
脱脂牛乳95℃，5分钟单独加热灭菌，备用；
软化水加热至50℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，90℃，20分钟灭菌，趁热加入灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，作为发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为3％；培养温度35℃，罐压0.03MPa,培养时间3小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为6％，并补加复合枸杞浓缩汁2％、山药提取物1％；培养温度35℃，罐压0.04MPa,培养时间10小时，得到发酵乳基料，其中植物乳杆菌活菌数1×108CFU/mL，两歧双歧杆菌活菌数9.5×109CFU/mL；
以质量计，按如下组分：蔗糖6％、山药提取物0.2％、稳定剂0.2％、软水10％、发酵乳基料补足至100％，混合均匀后灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
所述山药提取物为本领域常规产品；
所述植物乳杆菌为本领域常用菌种；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
所述两歧双歧杆菌菌液制备同实施例1；
所述植物乳杆菌菌液的制备：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照5％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间20小时；
(3)三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，种子培养基装量1000毫升，培养温度37℃，培养时间18小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度37℃，罐压0.05MPa,培养时间12小时；
所述种子培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,脱脂牛乳20mL，乳酸钙1％,山药提取物1％，复合枸杞浓缩汁2％，余量为水,pH6.8；
所述发酵培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8。
所述复合枸杞浓缩汁为本领域常规产品。
实施例3
一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按以下配方称取原料，以质量计，山药提取物1％，低聚木糖1％，大豆多糖0.2％，大豆蛋白胨0.2％，脱脂牛乳30％，Nacl0.3％，乳酸钙1％,复合枸杞浓缩汁2％，其余为软化水；
脱脂牛乳95℃，5分钟单独加热灭菌，备用；
软化水加热至60℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，100℃，5分钟灭菌，趁热加入灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，作为发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为1％；培养温度32℃，罐压0.02MPa,培养时间3小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为6％，并补加复合枸杞浓缩汁1％、山药提取物1％；培养温度35℃，罐压0.04MPa,培养时间10小时，得到发酵乳基料，其中植物乳杆菌活菌数1×108CFU/mL，两歧双歧杆菌活菌数3.3×1010CFU/mL；
灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加18倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为500W，频率2450MHz；超声波功率800W，频率40KHz，时间为45min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于4倍纯净水，真空浓缩，真空干燥至水分低于10％，粉碎后过80目筛备用。
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9405；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
所述两歧双歧杆菌菌液制备同实施例1；
所述植物乳杆菌菌液制备同实施例1：
所述复合枸杞浓缩汁为本领域常规产品。
实施例4
一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按配方称取以下原料，以质量计，山药提取物7％，低聚木糖0.8％，大豆多糖0.2％，大豆蛋白胨0.1％，脱脂牛乳30％，Nacl0.3％，乳酸钙1％,复合枸杞浓缩汁1.5％，其余为软化水；
脱脂牛乳95℃，5分钟单独加热灭菌，备用；
软化水加热至55℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，加热90℃，5分钟灭菌，趁热加入灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，作为发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为3％；培养温度37℃，罐压0.03MPa,培养时间3小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为4％，并补加复合枸杞浓缩汁1％、山药提取物0.5％；培养温度37℃，罐压0.06MPa,培养时间8小时，得到发酵乳基料，其中植物乳杆菌活菌数3×108CFU/mL，两歧双歧杆菌活菌数2×1010CFU/mL；
以质量计，按如下组分：2.5‰的大豆多糖、维生素C 0.12‰、山药提取物0.5％、低聚木糖3％、果糖10％、发酵乳基料补足至100％，混合均匀后灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加20倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为800W，频率2450MHz；超声波功率1000W，频率40KHz，时间为15min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于3倍纯净水，真空浓缩，真空干燥，真空度至水分低于10％，粉碎后过100目筛备用。
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9405；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
所述两歧双歧杆菌菌液制备同实施例1；
所述植物乳杆菌菌液制备同实施例1：
所述复合枸杞浓缩汁由以下方法制备：
枸杞冲洗后迅速冷冻至-30℃；升华干燥，真空度500Pa，干燥至水分＜12％；控制温度在-10℃粉碎至粒径在1.5mm以下；将枸杞、黄芪和灵芝子实体粉碎物混合，添加上述混合物重量3倍的柠檬酸水溶液，控制溶液的pH值为4，添加混合物重量1％的复合酶，所述复合酶由酸性果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶组成，三种酶的重量比为2.5∶1∶1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为2hr；之后将pH值调整为5.1，温度升到50℃，同时添加混合物重量0.2％的果胶酶、0.2％的葡聚糖酶，作用时间为3hr；酶解液在5℃过滤；滤液冷冻浓缩获得复合枸杞浓缩汁；
所述枸杞、黄芪、灵芝子实体的质量份数比为：8：1：0.5。
实施例5
一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按配方称取以下原料，以质量计，山药提取物8％，低聚木糖0.8％，大豆多糖0.1％，大豆蛋白胨0.2％，脱脂牛乳10％，Nacl0.5％，乳酸钙0.5％,复合枸杞浓缩汁2％，其余为软化水；
脱脂牛乳95℃，5分钟单独加热灭菌，备用；
软化水加热至60℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，100℃，20分钟灭菌，趁热加入灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，作为发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为2％；培养温度35℃，罐压0.025MPa,培养时间2.5小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为6％，并补加复合枸杞浓缩汁2％、山药提取物1％；培养温度37℃，罐压0.06MPa,培养时间8小时，得到发酵乳基料，其中植物乳杆菌活菌数2×108CFU/mL，两歧双歧杆菌活菌数3.5×1010CFU/mL；
将发酵乳基料与两倍质量的软化水混合均匀后灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加18倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为600W，频率2450MHz；超声波功率860W，频率40KHz，时间为20min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于4倍纯净水，真空浓缩，真空干燥至水分低于10％，粉碎后过100目筛备用。
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9405；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
所述两歧双歧杆菌菌液制备同实施例1；
所述植物乳杆菌菌液制备同实施例1；
所述复合枸杞浓缩汁由以下方法制备：
枸杞冲洗后迅速冷冻至-35℃；升华干燥，真空度500Pa，干燥至水分＜12％；控制温度在-6℃粉碎至粒径在1.5mm以下；将枸杞、黄芪和灵芝子实体粉碎物混合，添加上述混合物重量6倍的柠檬酸水溶液，控制溶液的pH值为5，添加混合物重量0.61％的复合酶，所述复合酶由酸性果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶组成，三种酶的重量比为2.5∶1∶1.5，酶解温度为46℃，酶解时间为2hr；之后将pH值调整为5.3，温度升到56℃，同时添加混合物重量0.5％的果胶酶、0.5％的葡聚糖酶，作用时间为3hr；酶解液在5℃过滤；滤液冷冻浓缩获得复合枸杞浓缩汁；
所述枸杞、黄芪、灵芝子实体的质量份数比为：8：1：0.5。
试验例1
含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的益生性试验
以本发明实施例1、2、6制备的含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品，进行下述试验：
1、将实施例1、2、6的保健饮品，采用十倍逐级稀释至10-8，取1mL稀释液在灭菌平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板上，迅速摇匀；同时将在4-10℃保持2小时的各实施例保健饮品十倍逐级稀释至10-8，取1mL稀释液在灭菌平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板上并迅速摇匀；分别在37℃条件下培养24h后计数，将各实施例冷藏前后结果分别进行对照。
结果表明，活菌存活率分别达到了实施例175％、实施例260％、实施例665％,平均为66.7％。2、.模拟胃液及肠液的耐受试验：取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水100mL使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL各实施例保健饮品加入到9mL的模拟胃液中，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于30-45℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，分别与原活菌数进行比较，结果表明，活菌存活率分别为实施例155％、实施例235％、实施例646％，平均为45.3％。然后取在人工胃液中消化不同时间的培养液各1mL，分别接种于9mL pH值为6.8的人工肠液中，置于30-45℃静置培养2-4h，并分别在0、3、6、24h取样，测定其活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率分别为实施例150％、实施例233％、实施例642％，平均为41.7％。
试验例2小鼠肠道性能试验
以本发明实施例1、2、6制备的含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品，做以下试验；
选取普通昆明小白鼠180只，雌雄各半，18-20g，常规词养。从中随机挑选120只，每天早晨9:00灌胃盐酸林可霉素0.2mL(20mg)/只，其它作为对照组，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续一周，制备肠道菌群失调的小鼠模型。模型组小鼠饮食下降，未出现死亡和明显的腹泻现象，排软粪，外形正常含水分较多，垫料潮湿。将120只肠道菌群失调小鼠，随机分为4组，每组30只，组1、组2、组3作为治疗组，每天分别灌胃实施例1、2、6制备的保健饮品2ml/只，组4作为自然恢复组，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续两周。整个试验期21天，每天观察小白鼠的生长和排便情况，于第8、21天对各组的小鼠进行称重，计算各组体重平均增长率，结果如表1；每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，计算平均数，结果如表2。取小鼠粪便约0.1g，于无菌操作台内加入3粒玻璃珠(以0.1g粪样加0.5mL稀释液)，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数。
各组编号对应如下：组1—实施例1、组2—实施例2、组3—实施例6、组4—自然恢复组
表1小鼠增重情况
| 分组 | 平均始重(g/只) | 平均末重(g/只) | 平均增长率(％) |
| 组1 | 20.41±1.42 | 31.29±1.75 | 53.31 |
| 组2 | 20.52±1.35 | 29.12±1.56 | 41.91 |
| 组3 | 20.61±1.38 | 30.33±1.45 | 47.16 |
| 组4 | 20.69±1.33 | 27.34±1.59 | 32.14 |
表2小鼠粪便中大肠杆菌数的情况
| 分组 | 初始(×105cfu/g) | 结束(×105cfu/g) | 降低率(％) |
| 组1 | 5.81±0.25 | 1.11±0.08 | 80.90 |
| 组2 | 5.63±0.12 | 1.89±0.25 | 66.43 |
| 组3 | 5.89±0.34 | 1.36±0.16 | 77.08 |
| 组4 | 5.77±0.53 | 4.34±0.19 | 24.78 |
治疗组小鼠体重平均增长率分别为53.31％、41.91％、47.16％，均显著高于自然恢复组的32.14％；饲喂保健饮品后肠道大肠杆菌数量显著下降，分别降低80.90％、66.43％、77.08％，降低率也显著高于自然恢复组的24.78％，表明本发明含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品中的两歧双歧杆菌和植物乳杆菌可在小白鼠肠道内迅速定植，形成优势菌群，并有效抑制大肠杆菌等病原菌的生长繁殖，并且定植时间长，持续、有效改善了肠道性能。
试验例3本发明含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的品评实验
将本发明实施例1-6制备的保健饮品与市售的两种保健饮品分别编号，编号对应如下：1—实施例1、2—实施例2、3—实施例3、4—实施例4、5—实施例5、6—实施例6、7—市售产品1、8—市售产品2，邀请60人进行盲品、打分；分数项为：外观20分、香气25分、风味30分、口感25分，打分人员独立进行，互不影响，以保证品评结果准确。对品评结果进行统计，各项平均分取近似值，保留整数，记作均值，具体见表3：
表3感官品评统计结果
以上结果表明，本发明制备的含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品从外观、香气、风味和口感各方面均明显优于市售同类保健饮品。
Claims (8)
1.一种含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按以下配方称取原料：以质量计，山药提取物1-10％，低聚木糖0.5-1％，大豆多糖0.05-0.2％，大豆蛋白胨0.1-0.2％，脱脂牛乳10-30％，Nacl0.2-0.5％，乳酸钙0.5-1％,复合枸杞浓缩汁1-2％，其余为软化水；将脱脂牛乳95℃，灭菌5分钟，备用；同时，将软化水加热至50-60℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，90-100℃灭菌5-20分钟，加入已灭菌的脱脂牛乳，混匀，入厌氧发酵罐冷却，得到发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为1-3％；培养温度32-37℃，罐压0.02-0.03MPa,培养时间2-3小时；
(3)再接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为4-6％，并补加复合枸杞浓缩汁1-2％、山药提取物0.5-1％；培养温度35-37℃，罐压0.04-0.06MPa,培养6-10小时，得到发酵乳基料，灌装或调配后灌装；
其特征在于，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9405；所述两歧双歧杆菌为CICC21712；
所述植物乳杆菌菌液的制备方法如下：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌CGMCC NO.9405斜面菌种1-2环，接入500毫升摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照5％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间20小时；
(3)三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，种子培养基装量1000毫升，培养温度37℃，培养时间18小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度37℃，罐压0.05MPa,培养时间12小时。
2.根据权利要求1所述含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，其特征在于，所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加18-20倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为500-800W，频率2450MHz；超声波功率800-1000W，频率40KHz，时间为15-45min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于3-4倍纯净水，真空浓缩，真空干燥至水分低于10％，粉碎后过80-100目筛备用。
3.根据权利要求1所述含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，其特征在于，所述复合枸杞浓缩汁由以下方法制备：
枸杞冲洗后迅速冷冻至-40--30℃；升华干燥，真空度400-500Pa，干燥至水分＜12％；控制温度在-10--2℃粉碎至粒径在1.5mm以下；将枸杞、黄芪和灵芝子实体粉碎物混合，添加上述混合物重量3-6倍的柠檬酸水溶液，控制溶液的pH值为4-5，添加混合物重量0.5-1％的复合酶，所述复合酶由酸性果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶组成，三种酶的重量比为2.5∶1∶1.5，酶解温度为40-48℃，酶解时间为1.5-2hr；之后将pH值调整为5.1-5.6，温度升到50-60℃，同时添加混合物重量0.2-0.5％的果胶酶、0.2-1％的葡聚糖酶，作用时间为2.5-3hr；酶解液在5-10℃过滤；滤液冷冻浓缩获得复合枸杞浓缩汁；
所述枸杞、黄芪、灵芝子实体的质量份数比为：8：1：0.5。
4.根据权利要求1所述含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，其特征在于，所述调配，按以下配方进行，以质量计：2-3‰的大豆多糖、维生素C 0.12-0.24‰、山药提取物0.5-1％、低聚木糖1-3％、果糖5-10％、发酵乳基料补足至100％。
5.根据权利要求1所述含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，其特征在于，所述两歧双歧杆菌菌液制备方法如下：
两歧双歧杆菌在种子培养基中活化培养三次，以种子培养基质量计：第一次，接种量3％，37℃厌氧培养36h，第二次接种量4％，37℃厌氧养24h，第三次接种量5％，37℃厌氧培养12h；
所述种子培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，低聚木糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8。
6.根据权利要求1所述含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，其特征在于，
所述种子培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,脱脂牛乳20mL，乳酸钙1％,山药提取物1％，复合枸杞浓缩汁2％，余量为水,pH6.8；
所述发酵培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8。
7.根据权利要求1所述含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)按以下配方称取原料，以质量计，山药提取物5％，低聚木糖1％，大豆多糖0.1％，大豆蛋白胨0.2％，脱脂牛乳30％，Nacl0.2％，乳酸钙0.5％,复合枸杞浓缩汁2％，其余为软化水；
脱脂牛乳95℃，灭菌5分钟，备用；
软化水加热至55℃，依次加入剩余原料溶解并混合均匀后，95℃灭菌15分钟，加入灭菌的脱脂牛乳，入厌氧发酵罐冷却并混匀，得到发酵培养液；
(2)接种植物乳杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为2％；培养温度35℃，罐压0.02MPa,培养时间3小时；
(3)接种两歧双歧杆菌菌液，以发酵培养液质量计：接种量为6％，并补加复合枸杞浓缩汁2％、山药提取物1％；培养温度37℃，罐压0.06MPa,培养时间8小时，得到发酵乳基料，其中植物乳杆菌活菌数2×108CFU/mL，两歧双歧杆菌活菌数3×1010CFU/mL；
以质量计，按如下组分：3‰的大豆多糖、维生素C 0.24‰、山药提取物0.5％、低聚木糖2％、果糖6％、发酵乳基料补足至100％，混合均匀后灌装得到含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品；
所述山药提取物制备方法如下：
山药去皮、称重、切块、磨浆，按照去皮山药重量加18-20倍软水进行微波协同超声波提取，微波功率为500-800W，频率2450MHz；超声波功率800-1000W，频率40KHz，时间为15-45min；提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80％，醇沉14hr后过滤；滤渣溶于3-4倍纯净水，真空浓缩，真空干燥至水分低于10％，粉碎后过80-100目筛备用；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014保藏编号为CGMCC NO.9405；
所述两歧双歧杆菌CICC21712购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述两歧双歧杆菌在种子培养基中活化培养三次，以培养基质量计：第一次，接种量3％，37℃厌氧培养36h，第二次接种量4％，37℃厌氧养24h，第三次接种量5％，37℃厌氧培养12h，得到两歧双歧杆菌菌液；
所述种子培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，低聚木糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g，软化水补足1000mL,pH6.8；
所述植物乳杆菌菌液的制备：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌CGMCC NO.9405斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照5％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，种子培养基装量100毫升，培养温度37℃，培养时间20小时；
(3)三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，种子培养基装量1000毫升，培养温度37℃，培养时间18小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度37℃，罐压0.05MPa,培养时间12小时；
所述种子培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,脱脂牛乳20mL，乳酸钙1％,山药提取物1％，复合枸杞浓缩汁2％，余量为水,pH6.8；
所述发酵培养基组成为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂牛乳40mL，葡萄糖10.0g，山药提取物5.0g，复合枸杞浓缩汁2.0g，乳酸钙0.5g,Nacl0.2g,软化水补足1000mL,pH6.8；
所述复合枸杞浓缩汁由以下方法制备：
枸杞冲洗后迅速冷冻至-40℃；升华干燥，真空度450Pa，干燥至水分＜12％；控制温度在-10℃粉碎至粒径在1.5mm以下；将枸杞、黄芪和灵芝子实体粉碎物混合，添加上述混合物重量4倍的柠檬酸水溶液，控制溶液的pH值为4.5，添加混合物重量1％的复合酶，所述复合酶由酸性果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶组成，三种酶的重量比为2.5∶1∶1.5，酶解温度为45℃，酶解时间为2hr；之后将pH值调整为5.4，温度升到55℃，同时添加混合物重量0.3％的果胶酶、0.6％的葡聚糖酶，作用时间为2.5hr；酶解液在5℃过滤；滤液冷冻浓缩获得复合枸杞浓缩汁；
所述枸杞、黄芪、灵芝子实体的质量份数比为：8：1：0.5。
8.根据权利要求1-7任一所述方法制备的含山药提取物和两歧双歧杆菌的保健饮品。
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