CN105950499A - 一种植物乳杆菌x7021及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物乳杆菌X7021及其应用；该植物乳杆菌X7021的保藏编号为CCTCCNo.M2015039，其具有亚硝酸盐耐受特性和亚硝酸盐降解特性，能够用于降解亚硝酸盐及制备发酵乳制品。采用植物乳杆菌X7021降解亚硝酸盐的方法包括：将含亚硝酸盐的样品溶解于MRS液体培养基中，灭菌后制成样品溶液；将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021以占MRS液体培养基的体积2％的接种量接种于样品溶液中，得到含菌溶液；将含菌溶液于37℃连续培养24或72小时，得到降解液。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物乳杆菌X7021及其应用。
背景技术
亚硝酸盐作为一种添加剂在食品领域中得到了广泛的应用，可被用作肉类食品的增色剂和抗腐蚀剂等。同时，在许多腌制食品中由于微生物的作用也存在着大量的亚硝酸盐。
少量的亚硝酸盐具有一定的药用效果，对脑血管痉挛、高血压及中风等都有较好的治疗作用，且治疗后很少出现副作用。但是，较大剂量的亚硝酸盐会对人体健康会造成非常大的损害。研究表明，成人摄入超过3g的亚硝酸盐即可致死。
研究表明，亚硝酸盐的毒理作用为：其能把人体血液中的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，导致人体组织失去携带氧气的能力而引起组织缺氧、呼吸中枢麻痹等症状。亚硝酸盐中毒后发病迅速、潜伏期短，危害性极大。
另外，亚硝酸盐同时还是一种致癌物质，其致癌机理为：在适当的条件下，亚硝酸盐能与仲胺、叔胺、氨基酸及酰胺等食品中的蛋白质分解产物反应生成强致癌物N-亚硝基化合物。
再者，N-亚硝基化合物还具有较强的致畸作用，主要使神经系统畸形，包括无眼、脑积水、脊柱畸变和多趾等，且有量效关系。因此，如何控制食品中亚硝基化合物前体亚硝酸盐的含量便成为当前普遍关注的重要问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种植物乳杆菌X7021。
本发明的另一个目的在于提供一种植物乳杆菌X7021在降解亚硝酸盐中的应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种植物乳杆菌X7021，其保藏编号为CCTCC No.M2015039，其具有亚硝酸盐耐受特性和亚硝酸盐降解特性。
该种植物乳杆菌X7021可以用于降解亚硝酸盐。
一种使用上述的植物乳杆菌X7021降解亚硝酸盐的方法，其包括如下步骤：
(1)、将含亚硝酸盐的样品溶解于MRS液体培养基中，灭菌后制成样品溶液；
(2)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021以占MRS液体培养基的体积2％的接种量接种于样品溶液中，得到含菌溶液；
(3)、将含菌溶液于37℃培养24或72小时，得到降解液。
其中，在步骤(1)中，样品溶液中亚硝酸盐的浓度为70-700mg/L。
在步骤(2)中，含菌溶液中的植物乳杆菌X7021的菌体浓度为1.0×1010到5.0×1011CFU/mL。
在步骤(2)中，进入对数生长期的植物乳杆菌X7021的制备方法包括如下步骤：
(a)、将甘油管中保存的含植物乳杆菌X7021的菌液按照2％的体积比接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时；
(b)、挑取部分培养后的菌液在MRS平板上划线，于37℃培养1-2天；
(c)、从MRS平板上挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时，得到进入对数生长期的植物乳杆菌X7021。
上述的植物乳杆菌X7021还可以用于制备发酵乳制品。该发酵乳制品包括发酵牛奶、酸奶油或干酪。
一种植物乳杆菌发酵剂，其是由含有上述的植物乳杆菌X7021的菌液通过冷冻干燥法制备而成的粉剂，其含有1.0×1011-5.0×1011CFU/g以上的活菌。
上述的植物乳杆菌发酵剂也可以用于制备发酵乳制品。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的植物乳杆菌X7021同时具有亚硝酸盐降解能力和乳制品发酵能力，因此，植物乳杆菌X7021在对乳制品进行发酵的过程中能同时降解亚硝酸盐，从而得到不含亚硝酸盐的乳制品。
另外，本发明的植物乳杆菌X7021还具有亚硝酸盐耐受能力，在亚硝酸盐的浓度为70-700mg/L的环境中仍然能生长并且降解亚硝酸盐，能够用于处理富含亚硝酸盐的样品，降低其中亚硝酸盐含量。
附图说明
图1为本发明的亚硝酸盐在0-72h的降解量的曲线图。
图2为本发明的亚硝酸盐在0-24h的降解量的曲线图。
图3为本发明的植物乳杆菌X7021的生长曲线图。
图4为本发明的亚硝酸盐的降解率的曲线图。
图5为本发明实施例2的牛奶发酵过程中的pH值变化图。
图6为本发明实施例4的牛奶发酵过程中的pH值变化图。
保藏说明
一种具有亚硝酸盐耐受特性和亚硝酸盐降解特性的植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarumX7021)菌株，又名植物乳杆菌S1L12(Lactobacillus plantarumS1L12)，已于2015年1月16日保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2015039。
具体实施方式
本发明提供了一种植物乳杆菌X7021及其应用。
<植物乳杆菌X7021>
一种植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarum X7021)，又名植物乳杆菌S1L12(Lactobacillus plantarumS1L12)，其具有亚硝酸盐耐受特性和亚硝酸盐降解能力。
植物乳杆菌X7021是从臭豆腐卤液中筛选出来的，其筛选方法如下：
将上海某豆制品厂发酵使用5年以上的臭豆腐卤液，按10-1-10-6依次稀释，取100μL于MRS平板培养基中，均匀涂布后于厌氧培养箱中30℃培养3天，选取形态不同的单菌落进行多次划线培养，再次观察，根据菌落形态不同分离出20株乳酸菌，并对这些乳酸菌进行16S rDNA鉴定，其中有一种乳酸菌经鉴定为植物乳杆菌，并命名为植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarum X7021)。
<植物乳杆菌X7021在降解亚硝酸盐中的应用>
植物乳杆菌X7021为食品用乳酸菌，对亚硝酸盐有着高效的降解能力，可以在含亚硝酸盐的MRS液体培养基中快速降解亚硝酸盐。研究表明，植物乳杆菌X7021能有效抑制有硝酸盐还原能力的杂菌的生长，且其生长代谢产物可降解相当部分的亚硝酸盐，二者的综合作用使得亚硝酸盐的含量下降。实验证明，在含亚硝酸盐的MRS液体培养基中于37℃培养24小时后，亚硝酸盐(例如NaNO2)的降解率可达98.3％；在培养36小时，亚硝酸盐的降解率可达到99.5％以上。
植物乳杆菌X7021降解亚硝酸盐的方法具体包括如下步骤：
(1)、将含亚硝酸盐的样品溶解于MRS液体培养基中，灭菌后制成样品溶液；
(2)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021以占MRS液体培养基的体积2％的接种量接种于上述样品溶液中，得到含菌溶液；
(3)、将含菌溶液于37℃培养24或72小时，得到降解液。
其中，在步骤(1)中，MRS液体培养基的配方如下：
10.0g蛋白胨、5.0g牛肉粉、4.0g酵母粉、20.0g葡萄糖、1.0mL吐温80、2.0g磷酸氢二钾、5.0g乙酸钠、2.0g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰和1000mL蒸馏水。
在步骤(1)中，MRS液体培养基的配制方法如下：
将除蒸馏水以外的各个成分加入蒸馏水中，加热使各个成分溶解，分装后于115℃高压灭菌20分钟，即得到MRS液体培养基。
在步骤(1)中，样品溶液中亚硝酸盐的浓度应调节为70-700mg/L。
在步骤(2)中，进入对数生长期的植物乳杆菌X7021的制备方法包括如下步骤：
(a)、将甘油管中保存的含植物乳杆菌X7021的菌液按照2％的体积比接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时；
(b)、挑取部分培养后的菌液在MRS平板上划线，于37℃培养1-2天；
(c)、从MRS平板上挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时，得到进入对数生长期的植物乳杆菌X7021。
在步骤(2)中，含菌溶液中的植物乳杆菌X7021的菌体浓度应在1.0×1010到5.0×1011CFU/mL之间。
<植物乳杆菌X7021在制备发酵乳制品中的应用>
植物乳杆菌X7021还能够用于制备发酵乳制品，发酵乳制品包括发酵牛奶、酸奶油或干酪。
植物乳杆菌X7021的发酵方法包括如下步骤(以牛奶为例进行说明)：
(1)、取乳制品10g，按1:10加水冲调，配制成蛋白含量为3.1％的牛奶，于65℃灭菌30min，冷却至室温，得到灭菌牛奶；
(2)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021按照1％(v/v)的接种量接种入步骤(1)所得的灭菌牛奶中；
(3)、于37℃保温发酵6-8h，得到发酵乳制品。
<植物乳杆菌发酵剂>
一种植物乳杆菌发酵剂，其由含有上述的植物乳杆菌X7021的菌液通过冷冻干燥工艺制备而成的粉剂，其含有1.0×1011-5.0×1011CFU/g以上的活菌。
该植物乳杆菌发酵剂的制备方法包括如下步骤：
(a)、将甘油管中保存的含植物乳杆菌X7021的菌液按照2％的体积比接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时；
(b)、挑取部分培养后的菌液在MRS平板上划线，于37℃培养1-2天；
(c)、从MRS平板上挑取单菌落接种入10L的发酵罐中，于37℃培养18小时，得到进入对数生长期的植物乳杆菌X7021；
(d)、6000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次，然后在冻干保护剂中乳化重悬，悬浮均匀后得到乳化液；
(e)、将乳化液置于低于-45℃的温度下预冻4-8h，再放入冻干机中真空冷冻干燥，获得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum X7021)冻干菌粉(即植物乳杆菌发酵剂)，其活菌数可达1.0×1011-5.0×1011CFU/g。
其中，在步骤(d)中，冻干保护剂含有10-20wt％的奶粉、5-20wt％的海藻糖、1-5％的谷氨酸钠、1-4％的甘油、0.5-1％半胱氨酸盐酸盐，余量为水(水作为溶剂)。
冻干保护剂的制备方法为：将上述组分混合后于115℃灭菌15min后即得。
<实验1：植物乳杆菌X7021降解亚硝酸盐能力实验>
本实验的操作步骤如下：
(1)、向500mL水中加入0.04g NaNO2，得到80mg/L的NaNO2水溶液；
(2)、使用80mg/L的NaNO2水溶液溶解MRS培养基固体粉末，得到含80mg/LNaNO2的MRS 液体培养基，将得到的MRS液体培养基分装入试管中，每管装液5mL，试管密封后灭菌；
(3)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021按照MRS液体培养基体积计2％的接种量接种于含有MRS液体培养基的试管中，在37℃的温度下进行培养，分别在0-72h每隔12h取一次样，分别测定每个样品的MRS液体培养基的pH值，并根据“GB 5009.33-2010”测定每个样品的MRS液体培养基中亚硝酸盐的含量并计算其降解率；将未接入菌液的含亚硝酸钠的MRS液体培养基在同样条件下进行培养并测定，其结果作为空白对照结果。
实验结果如图1所示。从图1可以得知，在0-24h的生长时间内，MRS液体培养基的pH值下降迅速，说明此时植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarumX7021)在此期间快速生长，而且这一时期的亚硝酸钠的含量快速下降，至24h时的降解率达98.3％，亚硝酸钠已经几乎被完全降解，说明植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarumX7021)对亚硝酸盐有高效的降解能力。
<实验2：植物乳杆菌X7021降解亚硝酸盐能力实验>
为了进一步观察植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarum X7021)在0-24h时对亚硝酸钠的降解情况，因此分别在0-24h每隔4h取一次样，测定MRS液体培养基的pH值，根据“GB 5009.33-2010”测定MRS液体培养基中亚硝酸盐的含量并计算其降解率，本实验的其它步骤同实验1。
实验结果如图2所示。由图2可以看出，在0-12h的生长时间内，MRS液体培养基的pH值下降迅速，这一期间植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarum X7021)快速生长，MRS液体培养基内有机酸快速积累，此时亚硝酸钠的降解率不高，但仍逐渐上升。亚硝酸钠的降解与MRS液体培养基中的有机酸量有很大的相关性，在16-24h，MRS液体培养基中的有机酸开始大量的积累，因此，这一时期的亚硝酸钠的含量相比0-12h时迅速下降，至24h时降解率达到99.0％，亚硝酸钠几乎被完全降解，说明植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarum X7021)对亚硝酸盐的降解快速且高效，在24h已经几乎完全降解了亚硝酸盐。
<实验3：植物乳杆菌X7021耐受亚硝酸盐能力实验>
本实验的操作步骤如下：
(1)、向100mL水中加入0.01g NaNO2，得到100mg/L的NaNO2水溶液；使用100mg/L的NaNO2水溶液溶解MRS培养基固体粉末，得到含100mg/LNaNO2的MRS液体培养基；以同样方式分别配制含有200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L与700mg/LNaNO2浓度的MRS液体培养基；
(2)、将得到的液体MRS培养基分装入试管中，每管装液5mL，试管密封后灭菌；
(3)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X702按照以MRS液体培养基体积计2％的接种量分别接种于含NaNO2的MRS液体培养基中，在37℃的条件下进行培养，分别在0-24h每隔4h取一次样，测定MRS液体培养基的OD600值，结果如图3所示；
(4)、根据“GB 5009.33-2010”测定MRS液体培养基中亚硝酸盐的含量并计算其降解率，实验结果如图4所示。将未接入菌液的含NaNO2的MRS液体培养基，在同样条件下进行培养并测定，其结果作为空白对照结果。
如图3所示，从8h开始，高浓度的亚硝酸钠组的OD600的值低于低浓度的亚硝酸钠组的OD600的值，说明在不同的亚硝酸钠浓度下，植物乳杆菌X7021(Lactobacillus plantarum X7021)生长都受到抑制，并且随着亚硝酸钠浓度升高，抑制情况逐渐增强。
如图3和图4所示，低浓度的亚硝酸钠对植物乳杆菌X7021生长的抑制较小，且亚硝酸钠的降解率较高，而高浓度的亚硝酸钠对植物乳杆菌X7021生长的抑制较大，但植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumX7021)仍能生长，未被完全抑制，且仍可对亚硝酸钠进行降解。因此，其结果表明植物乳杆菌X7021在含有100-700mg/L的NaNO2的MRS培养液均能生长并降解NaNO2，提示植物乳杆菌X7021对亚硝酸盐具有良好的耐受能力。
<实施例1：进入对数生长期的植物乳杆菌X7021的制备>
植物乳杆菌X7021发酵菌指的是进入对数生长期的植物乳杆菌X7021(其已经在MRS培养基中培养18h以上，并且MRS培养基的pH值在4.5以下)，其能够直接用于对各种乳制品进行发酵。
进入对数生长期的植物乳杆菌X7021的制备方法包括如下步骤：
(a)、将甘油管中保存的含植物乳杆菌X7021的菌液按照2％的体积比接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时；
(b)、挑取部分培养后的菌液在MRS平板上划线，于37℃培养1-2天；
(c)、从MRS平板上挑取单菌落再次接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时，得到进入对数生长期的植物乳杆菌X7021。
在步骤(2)中，含菌溶液中的植物乳杆菌X7021的菌体浓度应在1.0×1010到5.0×1011CFU/mL之间。
<实施例2：利用进入对数生长期的植物乳杆菌X7021制备发酵牛奶>
利用进入对数生长期的植物乳杆菌X7021制备发酵牛奶的方法包括如下步骤：
(1)、取脱脂牛奶10g(3.4g蛋白质/100g)，按1:10加水冲调，配制成蛋白含量为3.1％的牛奶，于65℃灭菌30min，冷却至室温，得到灭菌牛奶；
(2)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021(即植物乳杆菌X7021发酵菌)按照1％(v/v)的接种量接种入步骤(1)所得的灭菌牛奶中；
(3)、将步骤(2)所得的灭菌牛奶于37℃保温发酵6-8h，得到呈凝乳态的发酵牛奶(制备完毕后于4℃下冷藏)。
在发酵过程中每隔2h取样，检测0-12h牛奶的pH值变化情况，结果如图5所示。
由图5可知，发酵时间在0-8h时，pH值下降明显，说明植物乳杆菌X7021在快速增殖；当发酵时间在8-12h后，pH值已经趋于稳定状态，下降的幅度不大，提示发酵6-8h后即可 得到发酵牛奶。
<实施例3：植物乳杆菌发酵剂的制备方法>
一种植物乳杆菌发酵剂，其由含有植物乳杆菌X7021的菌液通过冷冻干燥工艺制备而成的粉剂，其含有1.0×1011-5.0×1011CFU/g以上的活菌。
该植物乳杆菌发酵剂的制备方法包括如下步骤：
(a)、将甘油管中保存的含植物乳杆菌X7021的菌液按照2％的体积比接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时；
(b)、挑取部分培养后的菌液在MRS平板上划线，于37℃培养2天；
(c)、从MRS平板上挑取单菌落接种入10L的发酵罐中，于37℃培养18小时，得到进入对数生长期的植物乳杆菌X7021；
(d)、6000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次，然后在冻干保护剂中乳化重悬，悬浮均匀后得到乳化液；
(e)、将乳化液置于低于-45℃的温度下预冻8h，再放入冻干机中真空冷冻干燥，获得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum X7021)冻干菌粉(即植物乳杆菌发酵剂)。
其中，在步骤(d)中，冻干保护剂含有10-20wt％的奶粉、5-20wt％的海藻糖、1-5％的谷氨酸钠、1-4％的甘油、0.5-1％半胱氨酸盐酸盐、余量为水(水作为溶剂)。
<实施例4：利用植物乳杆菌发酵剂制备发酵牛奶的方法>
本实施例利用实施例3制得的植物乳杆菌发酵剂来制备发酵牛奶，其包括如下步骤：
(1)、取脱脂奶粉10g(3.4g蛋白质/100g)，按1:10加水冲调，配制成蛋白含量为3.1％的复原乳；
(2)、将复原乳在65℃下灭菌30min，冷却至室温，得到灭菌复原乳；
(3)、将实施例3制得的植物乳杆菌发酵剂按照复原乳重量的0.1-0.2％接种入灭菌复原乳中，在37℃下保温发酵至凝乳，得到发酵牛奶(制备完毕后于4℃下冷藏)
在发酵的过程中，不断取样并测定复原乳的pH值变化，结果如图6所示。
如图6所示，发酵时间在0-8h时，pH值下降明显，说明植物乳杆菌X7021在快速增殖；当发酵时间在8-12h后，pH值已经趋于稳定状态，下降的幅度不大，提示发酵6-8h后即可得到发酵牛奶。
总之，本发明的该植物乳杆菌X7021具有亚硝酸盐耐受特性和亚硝酸盐降解特性，能够用于某些食品中亚硝酸盐的降解。同时，其可用于相关发酵乳制品的生产。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌X7021，其特征在于：该植物乳杆菌X7021的保藏编号为CCTCCNo.M2015039，其具有亚硝酸盐耐受特性和亚硝酸盐降解特性。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌X7021在降解亚硝酸盐中的应用。
3.一种使用如权利要求1所述的植物乳杆菌X7021降解亚硝酸盐的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)、将含亚硝酸盐的样品溶解于MRS液体培养基中，灭菌后制成样品溶液；
(2)、将进入对数生长期的植物乳杆菌X7021以占MRS液体培养基的体积2％的接种量接种于所述样品溶液中，得到含菌溶液；
(3)、将所述含菌溶液于37℃连续培养24或72小时，得到降解液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述样品溶液中亚硝酸盐的浓度为70-700mg/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含菌溶液中的植物乳杆菌X7021的菌体浓度为1.0×1010到5.0×1011CFU/mL。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述进入对数生长期的植物乳杆菌X7021的制备方法包括如下步骤：
(a)、将甘油管中保存的含植物乳杆菌X7021的菌液按照2％的体积比接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时；
(b)、挑取培养后的菌液在MRS平板上划线，于37℃培养1-2天；
(c)、从所述MRS平板上挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，于37℃培养18小时，得到进入对数生长期的植物乳杆菌X7021。
7.如权利要求1所述的植物乳杆菌X7021在制备发酵乳制品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述发酵乳制品包括发酵牛奶、酸奶油或干酪。
9.一种植物乳杆菌发酵剂，其特征在于：该植物乳杆菌发酵剂是由含有如权利要求1所述的植物乳杆菌X7021的菌液通过冷冻干燥法制备而成的粉剂，其含有1.0×1011-5.0×1011CFU/g以上的活菌。
10.如权利要求9所述的植物乳杆菌发酵剂在制备发酵乳制品中的应用。
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