CN104531578A - 具有高效降解亚硝酸盐和强产酸功能的植物乳杆菌菌株及其用途 - Google Patents
具有高效降解亚硝酸盐和强产酸功能的植物乳杆菌菌株及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株具有高效降解亚硝酸盐和强产酸功能的植物乳杆菌菌株及其用途，属于生物工程技术领域。从沈阳农户家中传统的发酵酸菜中选到1株具有高效降解亚硝酸盐和强产酸能力的植物乳杆菌新菌株，命名为FM-LP1-1，经鉴定为植物乳杆菌( Lactobacillius plantarum )，该菌株于2014年8月4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO.9488.以FM-LP1-1作为蔬菜发酵的发酵剂，能够有效降低发酵蔬菜制品的亚硝酸盐含量，缩短蔬菜的发酵时间，提高蔬菜的发酵风味，具有广泛的应用前景。
Description
一、技术领域
本发明涉及一株具有高效降解亚硝酸盐功能和强产酸能力的植物乳杆菌新菌株及其用途，属于生物工程技术领域。
二、背景技术
发酵蔬菜是我国传统的蔬菜加工制品之一，风味独特，具有开胃健脾的功效，自古以来在餐桌上占有不可替代的一席之地。传统的发酵蔬菜是以蔬菜为原料，利用蔬菜自身携带的微生物(主要是乳酸菌)进行发酵产酸，降低发酵蔬菜pH值，在乳酸菌的代谢过程中，产生细菌素，提高发酵蔬菜的抗菌活性，结合食盐的高渗透压作用，共同抑制其他有害微生物的生长，防止蔬菜腐败变质；另外在蔬菜的发酵过程中会形成具有独特风味的有机物质(多糖、柠檬酸、乳酸、醋酸、双乙酰等)；而乳酸菌本身具有协调人体代谢、抗肿瘤、降低胆固醇水平、改善肝功能、缓解乳糖不耐症和增强免疫等保健功能活性。蔬菜通过发酵加工可延长保质期，便于包装运输，调剂蔬菜淡旺季，从而做到全年均衡供应，满足人们对蔬菜制品日益增长的需要。
传统发酵蔬菜存在发酵周期长，生产力不高，产品质量不易控制，不利于工厂化，规模化和标准化生产，同时还存在食盐、亚硝酸盐含量高等问题。在日常膳食中，高盐的摄入会使人产生高血压，骨质疏松等症状。
亚硝酸盐含量超标是一个困扰蔬菜发酵生产厂家和消费者的严重问题，亚硝酸盐会对人体产生多种危害，微生物和酶对蔬菜中蛋白质、多肽和氨基酸有降解作用，致使发酵蔬菜中存在一定量的胺类物质，这些物质与亚硝酸盐在一定条件下合成强致癌物质N-亚硝基化合物。胃癌、食道癌等消化系统癌症高发地区往往与其膳食中过量的硝酸盐和亚硝酸盐有关。因此，严格控制发酵蔬菜中亚硝酸盐含量是保证其食用安全的一个重要措施。
接种发酵技术不仅避免了季节的限制，而且通过发酵过程的控制能够有效的避免有害微生物的侵害，缩短发酵周期，降低发酵蔬菜中亚硝酸盐的含量，提高发酵蔬菜制品质的稳定性。因此，筛选具有降解亚硝酸盐功能的优良发酵菌种是当前研究的热点。
三、发明内容
技术问题 目前对发酵蔬菜中乳酸菌的分离鉴定进行了大量的研究工作，但真正实现工业化生产的还不多见。针对这一现状，本发明提供一株具有高效降解亚硝酸盐功能和强产酸能力的植物乳杆菌菌株FM-LP1-1及其在蔬菜发酵中的用法，用于发酵蔬菜的工业化生产。
技术方案
本发明涉及一株具有高效降解亚硝酸盐和强产酸能力的植物乳杆菌菌株FM-LP1-1及其用法，其内容和实施方案如下：
一株具有高效降解亚硝酸盐和强产酸功能的植物乳杆菌菌株，命名为FM-LP1-1，经鉴定该菌为植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)，该菌株于2014年8月4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCC NO.9488。
所述的植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1可以作为发酵菌的应用。
植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1在含有200mg/L NaNO2的MRS培养液中，接种该菌的菌体密度为1.01×107∽1.54×107cfu/ml，25℃条件下培养24h，NaNO2的降解率达到97.5％以上，培养48h,NaNO2的降解率达到99.1％以上。在MRS培养液中培养24h，培养液的pH值达到3.51。
所述植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1可以在制作泡菜或酸菜的发酵剂方面的应用。
用所述植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1制作的泡菜或酸菜的发酵剂。
所述的发酵剂，其特性在于，植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1生长至稳定前期的FM-LP1-1菌液经离心浓缩后，用冻干保护液进行重悬后，-20℃预冻5～8h后用冷冻干燥器进行冻干，获得FM-LP1-1菌的冻干粉，冻干粉的菌体密度在1.01×1011∽5.01×1011cfu/g。
用所述的植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1发酵获得的泡菜产品。
用所述的植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1发酵制作的酸菜产品。
有益效果
本发明以MRS培养基为筛选培养基，从南京地区家庭自制泡菜及沈阳地区农家自制酸菜样品中分离筛选到51株单菌落，根据革兰氏染色和过氧化氢接触酶实验结果，初步鉴定出23株乳酸菌，以亚硝酸盐降解率、产酸能力和菌体的生长性能为目标进行筛选，筛选出5株亚硝酸盐降解率大于80％、菌液pH值低于3.80和菌液的OD600大于2.30的菌株。然后以胆盐耐受性试验、耐酸性试验、耐渗透压试验进行复筛，综合复筛试验结果，筛选出一株具有高效降解亚硝酸盐、产酸能力强、耐酸性能高和耐渗透压性能高的乳酸菌，命名为FM-LP1-1，通过测定16s rDNA序列进行系统发育分析和生理生化试验鉴定该菌株，鉴定结果是该菌株为植物乳杆菌，于2014年8月4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCC NO：9488。
本发明提供一株新的植物乳杆菌菌株FM-LP1-1，该菌株不仅具有高效降解亚硝酸盐能力、强产酸能力、较高的耐胆盐能力，并且该菌具有优良的发酵性能和耐渗透压性能，可以作为发酵菌种进行蔬菜发酵，经该菌株发酵的泡菜和酸菜，发酵风味优良，且亚硝酸盐含量低，为发酵蔬菜的工业化生产提供可靠的菌株资源。FM-LP1-1接种发酵明显缩短泡菜的发酵时间，在发酵3d，发酵泡菜的pH值达到了3左右，已经成熟，亚硝酸盐的含量为0.89mg/kg左右，远低于发酵蔬菜中亚硝酸盐的规定标准(<20mg/kg)而自然发酵的泡菜还没有成熟，其pH值为4.4左右，亚硝酸盐的含量为23.24±2.33mg/kg，高于发酵蔬菜中亚硝酸盐含量的标准。
本发明的主要优点和积极效果如下：
1.植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1，来源于南京地区的传统的发酵蔬菜制品中，来源比较安全。
2.植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1，不仅具有高效的降解亚硝酸盐的能力、较高的产酸和耐酸能力和较高的耐胆盐能力，并且具有较强耐渗透压能力和优良的发酵性能，可作为发酵菌种进行蔬菜的发酵，提高蔬菜发酵制品的食用安全性。
3.植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)FM-LP1-1，为蔬菜发酵的工业化生产提供可靠的菌种资源。
四、附图说明
图1FM-LP1-1平板菌落形态
图2FM-LP1-1菌体形态
生物保藏
FM-LP1-1，植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)，于2014年8月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏号是CGMCC NO.9488。
五、具体实施方式
1、菌株的初筛
从南京地区家庭自制的传统发酵泡菜和沈阳地区农家自制的传统发酵酸菜中发酵蔬菜汁，将样品用无菌水进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)，取后四个梯度稀释样品100ul均匀涂布至MRS琼脂培养基上，每个梯度做3个平行，30℃恒温培养48h，挑选具有典型乳酸菌菌落形态的单菌落在MRS平板上进行划线纯化，传代3-4次，经镜检为纯种后，结合菌落形态，革兰氏染色和接触酶试验，初筛获得23株乳酸菌，将其依次编号为FM-LP1-1、FM-LP1-2、FM-LP1-3、FM-LP1-4、FM-LP1-5、FM-LP1-6、FM-LP1-7、FM-LP1-8、FM-LP1-9、FM-LP2-1、FM-LP2-2、FM-LP2-3、FM-LP2-4、FM-LP2-5、FM-LP2-6、FM-LP2-7、FM-LP3-1、FM-LP3-2、FM-LP3-3、FM-LP3-4、FM-LP3-5、FM-LP3-6、FM-LP3-7。挑取初步筛选出的23株目标菌株的单菌落接种MRS液体培养基，30℃静止培养至稳定期，按1％的接种量接种至含有200mg/L的MRS液体培养液中进行培养，培养48h后，采用格里斯比色法测定MRS液体中NaNO2的含量，采用分光光度法检测菌体密度，用pH计测定菌液的pH值，结果见表1。从表1中可以看出，菌株FM-LP1-1、FM-LP1-2、FM-LP1-7、FM-LP2-1、FM-LP3-5的降解亚硝酸盐的活性较高，亚硝酸盐降解率在80％以上，菌体密度OD600值在2.30以上，菌液的pH值在3.80以下。
表1不同菌株的菌体密度和亚硝酸盐降解率
2、菌株的耐酸性、耐渗透压、耐胆盐和耐人工胃液能力测定
经过初步筛选出的FM-LP1-1、FM-LP1-2、FM-LP1-7、FM-LP2-1、FM-LP3-5的5株菌，挑单菌落接种于MRS液体培养基中，30℃静止培养至稳定期，按2％的接种量接种至50ml MRS液体培养基中，30℃静止培养18-20h，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，用PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤菌体两次，洗涤后的菌体重悬于10ml pH为7.2的PBS缓冲液中(6.02×109∽8.21×109cfu/ml)，作为抗逆性测定样品。取0.5ml样品重悬于1.5ml pH为3.0的PBS缓冲液中，4h后采用平板培养法测定菌体密度；取0.5ml样品接种于1.5ml牛胆汁盐含量为0.5％(w/v)的PBS(pH 7.2)缓冲液中，4h后采用平板培养法测定菌体密度；取0.5ml样品接种于1.5ml NaCl含量为8％的PBS(pH 7.2)缓冲液中，4h后采用平板培养法测定菌体密度；取0.5ml样品接种于1.5ml人工胃液中，人工胃液的配方参照辛羚等(2005)文献中的配方，4h后采用平板培养法测定菌体密度；每个处理三次重复，菌体密度值采用Log10N表示。结果见表2，从表2中可以看出，菌株FM-LP1-1比较耐酸，在PH(3.0)的PBS缓冲液中4h后，菌体密度仍能保持在2.18×108cfu/ml；其耐胆盐能力也较强，在牛胆汁盐含量为0.5％(w/v)、PH(7.2)的PBS缓冲液中保持4h，菌体密度能保持在3.46×107cfu/ml。在NaCl含量为8％，PH(7.2)的PBS缓冲液中保持4h，菌体密度能保持在6.92×107cfu/ml。其人工胃液中保持4h，菌体密度能保持在2.24×107cfu/ml。
表2不同菌株的耐逆能力测定
综合菌株的降解亚硝酸盐的能力、产酸能力、生长性能和耐逆性试验结果，发现FM-LP1-1菌株具有高效降解亚硝酸盐能力，强的产酸能力，快速的生长性能和较高的耐逆性能，其来源于南京地区的传统的发酵蔬菜中，适合作为发酵蔬菜的菌种，后面的研究针对该菌株进行鉴定和应用研究。
3、菌株的系统发育分析和生理生化鉴定
提取FM-LP1-1的基因组，利用16S r DNA通用引物，以基因组为模版进行PCR扩增，扩增出的产物经纯化后送上海生物工程有限公司进行测序。用Blast搜索程序从GenBank数据库中调出相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列，经过序列多重比对和系统发育进化分析，发现菌株FM-LP1-1与Lactobacilius plantarum strain B23(KC 166237)序列相似性高达99％，并且系统发育分析结果显示该菌与植物乳杆菌Lactobacilius plantarumstrain B23(KC 166237)自然聚为一支，说明该菌株是植物乳杆菌种的成员。FM-LP1-1的16s rDNA序列在NCBI上的登录号为KP217194。FM-LP1-1的菌落和菌体形态分别见图1和图2,该菌在MRS培养基平板上培养48h的菌落形态呈现规则圆形，湿润，颜色为乳黄色，菌落直径为0.30～0.5mm；菌体长度为1.1～2.5μm，菌体细胞典型杆状，单个或链状排列，无芽孢；其生理学特性是革兰氏染色为阳性、氧化酶和过氧化氢酶试验为阴性，该菌株的糖发酵结果见表3，结合系统发育分析结果、形态学及主要生物学特性把菌株FM-LP1-1-4鉴定为植物乳杆菌(Lactobacilius plantarum)。
表3 FM-LP1-1部分糖发酵结果
注：“+”：表示阳性反应，“-”：表示阴性反应。
4、FM-LP1-1发酵剂的制备
挑取甘油管中保存的菌液在MRS平板划线，30℃培养48-72h,挑取单菌落接种至3ml的MRS液体培养基中，30℃静止培养稳定期，按2％的接种量接种至100mlMRS液体培养基中，30℃静止培养18-20h，作为种子液，以2％接种至10L自动发酵罐(发酵培养基8L)中，发酵培养基的配方为：乳清粉80g/L，浓缩乳清蛋白粉20g/L，酵母提取物8g/L，碳酸钙6g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.03g/L，番茄原汁50ml/L，发酵的过程以NaOH(1M)调整pH保持在5.5，培养20h后，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，用冻干保护液重悬菌体，保护液的配方是脱脂乳10-12％，甘油1％，蔗糖为2％，海藻糖为3％，保护液经115℃灭菌10min。重悬后的菌液放置在-20℃预冻5～8h，用冷冻干燥器进行冻干处理，获得FM-LP1-1的冻干粉，活菌体密度在菌体密度在1.01×1011∽5.01×1011cfu/g。
5、FM-LP1-1在泡菜制作中的应用
从农贸市场上购买新鲜的蔬菜，适合制作泡菜的蔬菜种类，例如白菜、黄瓜、莴苣、萝卜等，本实例中的蔬菜来源于江苏省农业科学院蔬菜研究所，从蔬菜大棚中收集西兰花的茎干，经过挑选、去皮、清洗、沥干，然后用冷开水制作泡菜汁，其中盐分含量为3-4％，冰糖含量为2-3％，另外含有适量的青椒、红椒、大蒜、姜片、花椒、八角、桂皮。发酵采取接种FM-LP1-1和自然发酵两种处理方式，其中FM-LP1-1可以用菌种冻干粉，也可以直接用新鲜培养的菌体，新鲜菌体获得方式为MRS液体培养18-20h，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水菌体1～2次，所得菌体用少量无菌生理盐水重悬，按照泡菜液中初始菌体密度1.01×107∽2.01×107cfu/ml进行接种菌悬液，也可以直接按照0.5‰-1‰的量进行接种冻干粉。自然发酵的泡菜处理中按1-2％(V/V)的量加入高粱酒。20-25℃条件下发酵泡菜，3d结束发酵，发酵结束后组织专业技术人员15名对发酵泡菜进行感观评定，同时测定样品的亚硝酸盐含量、pH值和泡菜的脆度，具体结果见表4。从表中可以看出，FM-LP1-1接种发酵明显缩短泡菜的发酵时间，在发酵3d,发酵泡菜的pH值达到了3.2左右，已经成熟，亚硝酸盐的含量为1.38±0.16mg/kg，远低于发酵蔬菜中亚硝酸盐的规定标准(<20mg/kg)而自然发酵的泡菜还没有成熟，其pH值为4.85左右，亚硝酸盐的含量为64.24±2.33mg/kg。发酵泡菜的感观评定高于自然发酵的泡菜。
表4 FM-LP1-1接种发酵泡菜和自然发酵泡菜的比较
6、FM-LP1-1在酸菜制作中的应用
从江苏省农科院蔬菜研究所的蔬菜大棚中采摘大白菜，去除老叶，切成4瓣，经太阳晒3-5天，清洗干净后经95～98℃热水漂烫2-3min，然后用冷开水制作泡菜汁，其中盐分含量为3-4％，分为接种FM-LP1-1和自然发酵两种处理方式，其中FM-LP1-1可以用菌种冻干粉，也可以直接用新鲜培养的菌体，菌体处理方式为MRS液体培养18-20h，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水菌体两次，所得菌体用少量无菌生理盐水重悬，按照泡菜液中初始菌体密度1.01×107∽2.01×107cfu/ml进行接种菌悬液，也可以直接按照0.5‰-1‰的量进行接种冻干粉。10-15℃条件下制作泡菜，30d后结束。发酵结束后组织专业技术人员15名对发酵泡菜进行感观评定，具体结果见表5。从表中可以看出，FM-LP1-1接种发酵明显缩短泡菜的发酵时间，在发酵30d，发酵泡菜的pH值达到了3.2左右，已经成熟，亚硝酸盐的含量为0.89mg/kg左右，远低于发酵蔬菜中亚硝酸盐的规定标准(<20mg/kg)而自然发酵的泡菜还没有成熟，其pH值为4.4左右，亚硝酸盐的含量为23.24±1.36mg/kg，高于发酵蔬菜中亚硝酸盐含量的标准。接种FM-LP1-1的酸菜的感观评定高于自然发酵的泡菜。
表5 FM-LP1-1接种发酵酸菜和自然发酵酸菜的比较
本实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，并非对本发明的适用范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案作出的各种改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一株具有高效降解亚硝酸盐和强产酸功能的植物乳杆菌菌株，命名为FM-LP1-1，经鉴定该菌为植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)，该菌株于2014年8月4在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCC NO.9488。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，是指植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1作为发酵菌的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，是指植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1在含有200 mg /L NaN02的MRS培养液中，接种该菌的菌体密度为1.01×107∽1.54×107 cfu/ml，25℃条件下培养24 h，NaN02的降解率达到97.5 %以上，培养48h，NaN02的降解率达到99.1 %以上。
5.根据权利要求2或3所述的应用，是指植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1在MRS培养液中培养24 h，培养液的pH 值达到3.51。
6.根据权利要求2所述的应用，是指植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1在制作泡菜或酸菜的发酵剂方面的应用。
7.用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1制作的泡菜或酸菜的发酵剂。
8.根据权利要求7所述的发酵剂，其特性在于，植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1生长至稳定前期的FM-LP1-1菌液经离心浓缩后，用冻干保护液进行重悬后，-20℃预冻5~8 h 后用冷冻干燥器进行冻干，获得FM-LP1-1菌的冻干粉，冻干粉的菌体密度在1.01×1011∽5.01×1011 cfu/g。
9.用权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1发酵获得的泡菜产品。
10.用权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillius plantarum)FM-LP1-1发酵制作的酸菜产品。
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Denomination of invention: Plant Lactobacillus strains with efficient nitrite degradation and strong acid production functions and their uses Effective date of registration: 20231110 Granted publication date: 20170322 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Lishui branch Pledgor: NANJING CUIERSHUANG VEGETABLE FOOD CO.,LTD. Registration number: Y2023980064692 |
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