CN103937709B - 具有耐酸性和高还原活性的副干酪乳杆菌fm-lp-4及其用途 - Google Patents
具有耐酸性和高还原活性的副干酪乳杆菌fm-lp-4及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株具有耐酸性和高还原活性的副干酪乳杆菌（<i>Lactobacillus？paracasei）</i>FM-LP-4及其用途，属于生物工程技术领域。从新疆骆驼酸奶中分离、筛选到1株具有耐酸和高还原活性的副干酪乳杆菌新菌株，命名为FM-LP-4，经鉴定为副干酪乳杆菌FM-LP-4，该菌具有较强抗氧化能力，优良的发酵性能和较好的耐酸性能，并且具有很高的还原活性。本发明的副干酪乳杆菌FM-LP-4，对提高其作为发酵菌种的发酵制品的抗氧化性能有很大的作用，具有广泛的应用前景。
Description
一、技术领域
本发明涉及具有较好的耐酸性能和较高的还原力活性的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4及其用途，属于生物工程技术领域。
二、背景技术
乳酸菌(Lacticacidbacteria，LAB)是一类能利用碳水化合物产生乳酸的非病原性、革兰氏阳性细菌的通称，包括乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌(Latobacillus)双歧杆菌(Bifidobacterium)等20多个属，是一类具有长久安全食用历史的公认安全(GRAS)的食品级微生物，广泛存在自然发酵乳制品、发酵植物食品及人的肠道中。由于具有特定的生理功能和适宜生物加工的属性，是食品工业上常用的菌种，与人类关系密切。经乳酸菌发酵的食品，其风味、营养价值和保存期都会有所改善，并且对人体具有多方面的保健功能，如提高免疫力、缓解乳糖不耐症、调节肠道菌群、增强抗过敏、降低胆固醇等。因此，乳酸菌已经成为食品与药物等相关产品的主要配料，用于生产功能性发酵食品、保健品或是抗衰老药品。
在生物体体内存在促氧化和抗氧化的动态平衡，当促氧化因素超出了细胞抗氧化机制的调节能力，促氧化和抗氧化的动态平衡被打破而偏向于促氧化方向时，一些自由基和活性氧的水平就会超出正常水平，由此机体和细胞就会处在一个氧化应激(Oxidativestress)的状态。氧化应激与损伤与一些常见的疾病如糖尿病、高血压、哮喘、过敏、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、慢性炎症、癌症等有着十分密切的关系。目前，活性氧和自由基与疾病的关系越来越受到重视，已成为生命科学和医学的前沿和热点，与之相应的抗氧化剂开发也成为食品学科的重要课题。
从食品安全性上考虑，天然抗氧化物质具有合成抗氧化剂无法比拟的优势，现已成为当今食品开发的重要方向。乳酸菌是长久安全食用的公认安全(GRAS)的食品级微生物，其代谢过程中分泌出一些具有抗氧化活性的酶类同样具有高度安全性。另外，乳酸菌还可以利用环境中的天然物质如阿魏酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等产生抗氧化能力。开发具有自主知识产权的抗氧化功能的乳酸菌种将会是今后科技攻关与产品创新的重点和难点，也是一个热点，已经成为一个很有实际意义的研究课题。
三、发明内容
技术问题具有抗氧化能力的乳酸菌有发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、植物乳杆菌(lactobacillus,paraplantarum,)等，但真正成功利用于发酵功能食品只有为数不多的几株菌，其中包括发酵乳杆菌ME-3，299v菌株。针对这一现状，本发明提供一株具有耐酸性能且具有高还原活性的副干酪乳杆菌菌株FM-LP-4及其用法，用于抗氧化功能发酵食品的开发。
技术方案本发明涉及一株具有耐酸性能强和高还原力的副干酪乳杆菌新菌株及其用法，其内容和实施方案如下：
一株具有耐酸性和高还原活性的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4，该菌株于2013年12月18在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO：8600。
所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4可以作为发酵菌种的应用。
用所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4制备的发酵剂。
用所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4发酵获得的发酵酸奶产品。
用所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4发酵制作的泡菜产品。
有益效果
本发明以MRS培养基为筛选培养基，从新疆骆驼酸奶、酸马奶、江西开菲儿发酵奶、西藏灵菇奶四种传统发酵奶制品的样品中分离筛选到150株单菌落，根据革兰氏染色和过氧化氢接触酶实验结果，初步鉴定出85株乳酸菌，以DPPH清除率为初筛实验，筛选出12株DPPH清除率大于50％的菌株。然后以Fe2+螯合能力、Cu2+螯合能力、还原活性测定实验、总超氧化化物歧化酶活力测定试验、谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试验、胆盐耐受性试验、耐酸性试验进行复筛，综合复筛试验结果，筛选出一株具有耐酸性能好和高还原力的乳酸菌，命名为FM-LP-4，通过测定16srDNA序列进行系统发育分析和生理生化试验鉴定该菌株，鉴定结果是该菌株为副干酪乳杆菌。
本发明提供一株新的副干酪乳杆菌菌株FM-LP-4，该菌株不仅具有较好的耐酸性能和高还原力；并且该菌株具有较好的发酵性能，可以作为发酵菌种进行奶制品发酵，经该菌株发酵的酸奶，其抗氧化性能显著提高；还可以利用该菌株进行泡菜发酵，经该菌株发酵制作的泡菜的抗氧化能力也显著提高，为抗氧化保健食品的开发提供可靠的菌株资源。
本发明的主要优点和积极效果如下：
1.副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4,分离自新疆牧民家中的传统的骆驼酸奶中，来源比较安全。
2.副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)FM-LP-4,具有较高的抗氧化活性，特别是还原力较高，并且具有较好的耐酸能力和发酵性能，可作为发酵菌种进行奶制品及蔬菜的发酵，提高发酵制品的抗氧化能力。
3.经测定，菌株FM-LP-4的还原活性特别高，相当于356.88uM的半胱氨酸的还原活性,在菌体密度为1.01×109∽1.54×109cfu/ml条件下，在目前已发表的文献中还未见到具有如此高还原活性的菌株。另外，菌株FM-LP-4的总超氧化物歧化酶的活力和谷胱甘肽过氧化物酶的活力也很高，分别为8.85U/ml和799.56U/ml，综合测定的体外抗氧化性能实验结果，FM-LP-4是一株具有高抗氧化活性的菌株，特别是其还原活性特别高。
4.试验证明，菌株FM-LP-4比较耐酸，在PH(2.5)的PBS缓冲液中保持4h，菌体密度仍能保持在1.61×108cfu/ml；其耐胆盐能力也较强，在牛胆汁盐含量为0.5％(w/v)、PH(8.0)的PBS缓冲液中保持4h，菌体密度能保持在1.12×107cfu/ml。
FM-LP-4接种酸奶的凝乳时间比商业酸奶的凝乳时间长约0.6h，其发酵奶的粘度高于接种商业酸奶的粘度。经FM-LP-4发酵的酸奶的抗氧化性能显著提高，其DPPH的清除率是商业发酵剂发酵酸奶的2.18倍，混合接种的酸奶的DPPH的清除率也有1.92倍的提高；经FM-LP-4发酵的酸奶的还原活性是商业酸奶发酵剂的5.01倍，混合接种的酸奶还原活性也有3倍的提高。可见FM-LP-4能显著提高酸奶的抗氧化性能。
FM-LP-4接种发酵泡菜的产酸能力强，相同的发酵时间内，泡菜汁的pH值比自然发酵的泡菜的pH值低约0.9，经FM-LP-4发酵的泡菜的抗氧化能力显著提高，其DPPH的清除率是自然发酵的泡菜的2.04倍，是未发酵包菜的5.07倍，经FM-LP-4发酵的泡菜的还原活性是自然发酵包菜的3.19倍，是未发酵包菜的12.04倍。发酵泡菜的感观评定高于自然发酵的泡菜。
四、附图说明
图1FM-LP-4平板菌落形态
图2FM-LP-4菌体形态(10×100)
图3FM-LP-4不同培养时期的菌液状态
生物保藏
FM-LP-4，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei),于2013年12月18在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏号是CGMCCNO：8600。
五、具体实施方式
1、菌株的筛选
从新疆骆驼酸奶、酸马奶、江西开菲儿发酵奶、西藏灵菇奶四种传统发酵奶制品中取样，将样品用无菌水进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)，取后四个梯度稀释样品100ul均匀涂布至MRS琼脂培养基上，每个梯度做3个平行，35℃恒温培养48h，挑选具有典型乳酸菌菌落形态的单菌落在MRS平板上进行划线纯化，传代3-4次，经镜检为纯种后，结合菌落形态，革兰氏染色和接触酶试验，初筛获得85株乳酸菌。挑单菌落接种MRS液体培养基，35℃静止培养18h，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，以无菌生理盐水洗涤菌体两次，再以无菌生理盐水调整菌体密度为1.01×109∽1.54×109cfu/ml，以清除DPPH试验为初筛实验，筛选出12株DPPH清除率在50％的乳酸菌，将其依次编号为FM-LP-1、FM-LP-2、FM-LP-3、FM-LP-4、FM-LP-5、FM-LP-6、FM-LP-7、FM-LP-8、FM-LP-9、FM-LP-10、FM-LP-11、FM-LP-12。将上述获得的菌株分别以2％的接种量(菌体含量在1.02×107∽3.01×107cfu/ml)接种至20mlMRS液体培养基中，35℃静止培养18h，4℃条件下5000rpm/min离心5min,收集菌体，以无菌生理盐水洗涤菌体两次，再以无菌生理盐水调整菌体密度为1.01×109∽1.54×109cfu/ml，参照JeongminLee等(JMedFood,2005)的方法测定菌体细胞的Fe2+螯合能力、Cu2+螯合能力，参照JeongminLee等(JMedFood,2005)和陈晓华(博士论文，2011)中的方法测定菌体细胞和还原力活性；利用南京建成生物科技有限公司的总超氧化化物歧化酶活力测定试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒对筛选出的乳酸菌进行总超氧化化物歧化酶活力和谷胱甘肽过氧化物酶活性测定，具体测定方法参照说明书，结果见表1。从表1中可以看出，菌株FM-LP-4的还原活性特别高，相当于356.88uM的半胱氨酸的还原活性,在菌体密度为1.01×109∽1.54×109cfu/ml条件下，在目前已发表的文献中还未见到具有如此高还原活性的菌株。另外，菌株FM-LP-4的总超氧化物歧化酶的活力和谷胱甘肽过氧化物酶的活力也很高，分别为8.85U/ml和799.56U/ml，综合测定的体外抗氧化性能实验结果，FM-LP-4是一株具有高抗氧化活性的菌株，特别是其还原活性特别高。
表1不同菌株的体外抗氧化指标的测定
2、菌株的耐酸、耐胆盐能力测定
将编号为FM-LP-1、FM-LP-2、FM-LP-3、FM-LP-4、FM-LP-5、FM-LP-6、FM-LP-7、FM-LP-8、FM-LP-9、FM-LP-10、FM-LP-11、FM-LP-12的菌株分别以2％的接种量(菌体含量在1.02×107∽3.01×107cfu/ml)接种至100mlMRS液体培养基中，35℃静止培养18h，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，用pH为7.2的PBS缓冲液洗涤菌体两次，然后重悬于5mlpH为2.5的PBS缓冲液中，菌体密度为1.01×109∽1.54×109cfu/ml，4h后采用平板培养法测定菌体密度；洗涤后的菌体重悬于5mlpH为7.2的PBS缓冲液中，菌体密度为1.01×109∽1.54×109cfu/ml，其中牛胆汁盐含量为0.5％(w/v)，4h后采用平板培养法测定菌体密度测定菌体密度。结果见表2，从表2中可以看出，菌株FM-LP-4比较耐酸，在PH(2.5)的PBS缓冲液中保持4h，菌体密度仍能保持在1.61×108cfu/ml；其耐胆盐能力也较强，在牛胆汁盐含量为0.5％(w/v)、PH(8.0)的PBS缓冲液中保持4h，菌体密度能保持在1.12×107cfu/ml，从耐酸和耐胆盐性能来看，该菌株作为含有活性乳酸菌的抗氧化功能产品的开发中具有较好的应用前景。
表2不同菌株的耐酸和耐胆盐能力测定
综合菌株的抗氧化能力和耐酸和耐胆盐试验结果，发现FM-LP-4菌株具有较高的抗氧化能力、耐酸和耐胆盐能力，其来源于新疆的骆驼酸奶中，适合作为开发具有抗氧化保健功能的发酵制品的菌种，后面的研究针对该菌株进行鉴定和应用研究。
3、菌株的鉴定
提取FM-LP-4的基因组，利用16SrDNA通用引物，以基因组为模版进行PCR扩增，扩增出的产物经纯化后送上海生物工程有限公司进行测序。用Blast搜索程序从GenBank数据库中调出相似性较高的相关菌株的16SrRNA基因序列，经过序列多重比对和系统发育进化分析，发现菌株FM-LP-4与副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)序列相似性高达99％，并且系统发育分析结果显示该菌与副干酪乳杆菌(LactobacillusparacaseiKF418817)自然聚为一支，说明该菌株是副干酪乳杆菌种的成员。FM-LP-4的菌落和菌体形态及液体培养状态分别见图1、图2和图3。该菌在MRS培养基平板上培养48h的菌落形态呈现扁平型、中间有突起、边缘不整齐，颜色为乳白色，菌落直径为0.9～3.5mm；菌体细胞杆状，单个或链状排列，无芽孢，大小0.5um×1～2μm；液体培养时稳定期之前是菌液成浑浊，但稳定期后菌体沉于底部，呈现白色沉淀；其生理学特性是革兰氏染色为阳性、氧化酶和过氧化氢酶试验为阴性、能水解七叶灵、厌氧条件下能生长、10℃和40℃条件下能生长。菌株能代谢纤维二糖、麦芽糖、L-山梨糖、蔗糖、水杨苷、熊果苷、海藻糖、、D-松二糖、松三糖、甘露糖、D-果糖、D-葡萄糖；不能代谢D-木糖、D-阿拉伯糖醇、淀粉、肌醇、鼠李糖、卫矛醇、赤藓醇、木糖醇、L-阿拉伯糖、2-酮基-葡萄糖酸盐、D-来苏糖。结合形态学、主要生物学特性和16SrDNA系统发育分析把菌株FM-LP-4鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。
4、FM-LP-4在发酵酸奶中的应用
配制含有10％的脱脂奶粉和8％的蔗糖的溶液，105℃灭菌10min,冷却至37℃左右，分别接种商业的酸奶发酵剂、商业酸奶发酵剂和FM-LP-4、FM-LP-4，菌体总量控制在1.01×108∽2.01×108cfu/ml，其中商业酸奶发酵剂和FM-LP-4混合接种处理的两者之间的菌体量比例为1：1。接种之后置于37℃条件下发酵，观察发酵凝乳时间；发酵结束后测定发酵酸奶的粘度；测定发酵奶的清除DPPH能力和还原活性；组织专业技术人员10名对发酵酸奶感观评定；具体结果见表3。从表中可以看出，FM-LP-4接种酸奶的凝乳时间比商业酸奶的凝乳时间长约0.6h，其发酵奶的粘度高于接种商业酸奶的粘度。经FM-LP-4发酵的酸奶的抗氧化性能显著提高，其DPPH的清除率是商业发酵剂发酵酸奶的2.18倍，混合接种的酸奶的DPPH的清除率也有1.92倍的提高；经FM-LP-4发酵的酸奶的还原活性是商业酸奶发酵剂的5.01倍，混合接种的酸奶还原活性也有3倍的提高。可见FM-LP-4能显著提高酸奶的抗氧化性能。
表3FM-LP-4和商业酸奶发酵剂接种发酵酸奶的比较
5、FM-LP-4在泡菜制作中的应用
从江苏省农科院蔬菜研究所的蔬菜基地采摘包菜，经过挑选、清洗、沥干，然后用冷开水制作泡菜汁，其中盐分含量为3％，冰糖含量为2％，另外含有适量的青辣椒、姜片、花椒。分为接种FM-LP-4和自然发酵两种处理方式，其中FM-LP-4的接种量1.02×108∽2.01×108cfu/ml。菌体处理方式为MRS液体培养18h，4℃条件下5000rpm/min离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水菌体两次，所得菌体用无菌生理盐水重悬，按设计的菌体密度进行接种发酵泡菜。自然发酵的泡菜处理中按1.5％(V/V)的量加入高粱酒。20-25℃条件下制作泡菜的时间为6d，结束后测定泡菜的pH；泡菜的清除DPPH能力和还原活性；组织专业技术人员10名对发酵泡菜进行感观评定，具体结果见表4。从表中可以看出，FM-LP-4接种发酵泡菜的产酸能力强，相同的发酵时间内，泡菜汁的pH值比自然发酵的泡菜的pH值低约0.9，经FM-LP-4发酵的泡菜的抗氧化能力显著提高，其DPPH的清除率是自然发酵的泡菜的2.04倍，是未发酵包菜的5.07倍，经FM-LP-4发酵的泡菜的还原活性是自然发酵包菜的3.19倍，是未发酵包菜的12.04倍。发酵泡菜的感观评定高于自然发酵的泡菜。
表4FM-LP-4接种发酵泡菜和自然发酵泡菜的比较
注：NC为未测定。
Claims (5)
1.一株具有耐酸性和高还原活性的副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）FM-LP-4，该菌株于2013年12月18在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号是CGMCCNO：8600。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）FM-LP-4作为发酵菌种的应用。
3.用权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）FM-LP-4制备的发酵剂。
4.用权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）FM-LP-4发酵获得的发酵酸奶产品。
5.用权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）FM-LP-4发酵制作的泡菜产品。
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| "副干酪乳杆菌N1115的耐酸耐胆盐特性研究";卢晓莉 等;《农业工程技术（农产品加工业）》;20110531(第5期);第32页右栏第1段和第34页右栏第2段 * |
| 卢晓莉 等."副干酪乳杆菌N1115的耐酸耐胆盐特性研究".《农业工程技术（农产品加工业）》.2011,(第5期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103937709A (zh) | 2014-07-23 |
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