CN105969681A - 一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌jr4及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR14，该菌株的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11928，保藏时间为2015年12月24日。本发明还提供了该菌株在抗氧化方面和制备青贮饲料方面的应用。本发明菌株具有优秀的抗氧化能力、耐胆盐能力和耐酸能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株高抗氧化耐热耐酸植物乳杆菌JR4及其应用。
背景技术
植物乳杆菌是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，可以定植于肠道并发挥益生作用，被广泛应用于乳制品和医疗保健领域。
然而，在实际利用植物乳杆菌的过程中，由于现有很多植物乳杆菌的耐酸、耐胆盐能力不佳，限制了其有益作用的发挥。而一些具有较强耐酸、耐胆盐能力的植物乳杆菌，却不具备较好的抗氧化性能，难以发挥较好的有益作用。如中国专利CN 105018379A公布的植物乳杆菌对超氧自由基的清除率最高仅为53.99％，而最低甚至低至14.85％。
因此，寻求一种既具有优秀的耐酸、耐胆盐能力，又同时具备高抗氧化性，特别具有优秀的超氧自由基清除能力的植物乳杆菌，成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR4，其具有优秀的抗氧化能力、耐胆盐能力和耐酸能力。该菌 株的分类命名为为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.11928，保藏时间为2015年12月24日。
如本发明的实施例所示，本发明所得菌株具有很好的耐酸能力，在pH＝2.5的环境下24小时之后的活率仍高达80.39％；本发明所得菌株还具有很好的耐胆盐能力，在胆盐浓度为0.15％时，活率高达1182.98％，也即是说细菌在该浓度胆盐下，还具备很好的生长能力；本发明所得菌株同时还具有很好的抗氧化能力，其菌体本身、无细胞破碎液和发酵液对羟自由基的抑制率分别为29.47％、27.56％和42.74％，其发酵液对于超氧自由基的抑制率高达89.38％。
本领域技术人员应该理解，同时具备上述多种性能的植物乳杆菌十分难得。本发明的发明人经过大量实验摸索，意外的分离出了该菌株。
本发明的目的之二在于提供该菌株在抗氧化方面的应用。所述应用包括在清除羟基自由基和在清除超氧自由基方面上的应用。
具体的，在清除羟基自由基时，利用的是植物乳杆菌JR4菌体、植物乳杆菌JR4无细胞破碎液、植物乳杆菌JR4发酵液中的至少一种。
具体的，在清除超氧自由基时，利用的是植物乳杆菌JR4发酵液。
优选的，所述植物乳杆菌JR4无细胞破碎液的制备方法为：将细菌培养后，取菌体利用生理盐水冲洗，加入溶菌酶处理，然后进行超声破碎处理，即得。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在制备青贮饲料、食品防腐剂、发酵乳制品食品添加剂方面的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明菌株同时具有很好的耐酸、耐胆盐和抗氧化性能；
2、本发明菌株具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明菌株植物乳杆菌JR4的菌落形态图；
图2为本发明菌株植物乳杆菌JR4的革兰氏染色图；
图3为本发明菌株植物乳杆菌JR14的PCR扩增电泳图，其中“14”为JR14菌株，“M”为蛋白标记物；
图4为本发明菌株对羟自由基的抑制率和抑制能力的测试结果图，
其中，“1”为菌体、“2”为无细胞破碎液、“3”为发酵液；
图5为本发明菌株对超氧自由基清除能力的测试结果图，其中“1”为发酵液，“2”为菌体，“3”为无细胞破碎液。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1、实验原料及方法
1.1菌株来源
自制的传统自然发酵泡菜。
1.2培养基
MRS培养基：牛肉膏(粉)10g，蛋白胨10g，酵母膏(粉)5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，柠檬酸铵2g，K2HPO4 2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL(配制固体培养基需加琼脂粉18g)，加热溶解，调节pH至6.0～6.4，121℃灭菌15min。
1.3主要试剂
冰乙酸AR，成都市科龙化工试剂厂；
细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司；
2000DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司；
羟自由基测试盒50T/48T，南京建成生物工程研究所；
抗超氧阴离子试剂盒50T/48T，南京建成生物工程研究所；
总蛋白定量测定试剂盒(BCA法)，南京建成生物工程研究所。
1.4 16S rDNA的PCR扩增引物
细菌通用引物由华大科技提供：
上游引物P1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
下游引物P2:5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'
1.5仪器与设备
电子天平，sartorius；
高压灭菌锅，GI54DW；
高速冷冻离心机，SorvallST 16R；
PCR扩增仪；
紫外可见分光光度计；
超声波破碎仪。
1.6乳酸菌的分离纯化
采用10倍梯度稀释法将泡菜水样品稀释到10-5、10-6、10-7的稀释度。每个稀释度吸取1mL菌液，并用含1.5％CaCO3的MRS固体培养基倾注平板，37℃培养48h，挑选有明显溶钙圈的不同形态的菌落进行革兰氏染色观察，挑取革兰氏阳性的菌落到另一个含有 1.5％CaCO3的MRS固体平板上划线培养，并将固体培养基平板上得到的单个菌落接种在一个装有5mL MRS液体培养基的试管中，于37℃下培养24h，然后用接种环挑取菌液继续划线，重复2-3次，直至菌落镜检结果表现为菌体形态一致，即可保存菌株。
1.7菌株的保存
将得到的单一菌株在液体培养基中活化2-3次，划线接种于MRS固体斜面中培养48h后置于4℃冰箱内短期保存，或将液体培养物与40％的灭菌甘油按1:1的比例混合，在-20℃条件下进行长期保存。
1.8乳酸菌的鉴定
(1)乳酸菌的形态特征
将菌液划线接种于固体培养基上，37℃培养48h观察并记录菌落形态，同时进行革兰氏染色镜检，观察并记录其菌体形态特征。
(2)生理生化特征
对初步分离筛选得到的耐受消化道环境的菌株进行产H2S试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚产生试验、乳糖试验、甘露糖试验、棉籽糖试验、海藻糖试验、七叶苷试验、麦芽糖试验、纤维二糖试验、果糖试验、鼠李糖试验、木糖试验、半乳糖试验、阿拉伯糖试验、苦杏仁苷试验，参照伯杰细菌鉴定手册(第八版)对比生化反应结果，并对菌株进行初步种群归类。
(3)16S rDNA鉴定
①细菌总DNA的提取：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取目的菌体DNA，并用1.0％TBE琼脂糖凝胶电泳检测提取结果。
②16S rDNA基因的PCR扩增：将提取得到的DNA模板进行PCR扩增，26μLPCR反应体系：上下游引物各1μL(10μmol/L)，模板DNA2μL，2xlong Taq PCR MasterMix 9.5μL，ddH2O12.5μL。
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃、1min，60℃、1min，72℃、2min，循环30次；72℃延伸10min，用1.0％TBE琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。PCR扩增产物4℃保存，交由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。
③序列分析：登陆NCBI网站，进行同源性分析，并采用MEGA6.06软件将测得序列与GenBank中的模式菌株16S rDNA序列进行分析，制作系统发育树。
1.9耐消化道环境的乳酸菌的初筛
(1)耐酸实验
37℃条件下，在试管中培养12h的菌液按1％的接种量接种于100mLMRS液体培养基中，37℃℃静置培养24h。将菌液按1％的接种量(调整菌液浓度为107cfu/mL)分别接种至pH7.0，pH2.0，pH2.5的MRS培养基中(盐酸调节)，37℃℃静置培养24h，分别在0h和 24h测定不同pH值培养基的A600，判断菌株在酸性环境下的耐受情况。每组设2个重复。
(2)耐胆盐实验
37℃条件下，将在试管中培养12h的菌液按1％的接种量接种于100mLMRS液体培养基中，37℃静置培养24h。将菌液按1％的接种量(调整菌液浓度为107cfu/mL)分别接种至含0％(空白)，0.15％，0.3％(W/V)三号胆盐的MRS培养基100mL中，摇匀，37℃静置培养24h后测A600，计算菌株对三号胆盐的耐受能力的大小。每组设2个重复[24,25]。
1.10耐消化道环境的乳酸菌的复筛
(1)耐酸实验
37℃条件下，在试管中培养12h的菌液按1％的接种量接种于100mLMRS液体培养基中，37℃静置培养24h。将菌液稀释100倍后按1％的接种量(调整细胞浓度约为105cfu/mL)分别接种至pH2.0，pH2.5的MRS培养基中(盐酸调节)，37℃静置培养24h。在0h和24h分别倾注平板进行活菌计数，并计算存活率，以此来判断菌株的耐酸能力。
(2)耐胆盐实验
37℃条件下，将在试管中培养12h的菌液按1％的接种量接种于100mLMRS液体培养基中，37℃静置培养24h。将菌液稀释100倍后按1％的接种量(调整细胞浓度约为105cfu/mL)分别接种至含0.15％，0.3％(W/V)三号胆盐的MRS培养基100mL中，摇匀，37℃静置培养24h。在0h和24h分别倾注平板进行活菌计数，并计算存活率，以此来判断菌株的耐胆盐能力。
1.11乳酸菌抗氧化的测定
种子液的制备：分别将保藏于4℃条件的菌种接种在MRS固体培养基上，37℃，培养24h，待用。分别挑1-2环活化的菌株接种于8mLMRS液体培养基中，37℃，静置培养12h，即为种子液。
无细胞提取物的制备：将种子液按1％的比例，接种在MRS液体中，37℃静置培养24h，在8000r/min，10min，4℃条件下将发酵液离心，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次，菌体重悬于生理盐水中，制成菌悬液，A600为2.473。在菌悬液中加入10％的溶菌酶37℃处理2.5h，将处理后的菌悬液置于冰浴中，在功率为800W条件下超声破碎细胞，工作5s，间歇7s，全程时间50min。然后在10000r/min，10min，4℃条件下将破碎后的液体离心，收集上清液，上清液即为无细胞提取物[21]。
(1)清除羟自由基(·OH)能力的测定
以羟自由基测试盒为参照(其中蛋白浓度用BCA法测定)，测定原理为Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH·量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH·的多少成正比关系。
具体操作方法如下(简要过程见表1)：
试剂组成与配制：
试剂一：3％H2O2标准品贮备液0.5mL×1支，4℃保存3个月。
0.03％标准品应用液的配制：3％H2O2标准品贮备液：双蒸水＝1:99稀释，现用现配。
试剂二：底物贮备液1mL×1支，4℃保存3个月。
底物应用液的配制：
本样品为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，
则底物应用液的配制：底物贮备液：双蒸水＝1:99稀释，现用现配。
试剂三：甲液贮备液2mL×1支，4℃保存3个月，用时加双蒸水1:9稀释成应用液。
乙液：7mL×2支，4℃保存3个月。
试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比例混合，按需配制，余下4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存3个月。用时加双蒸水稀释至100mL，制备应用液，4℃
保存。若有结晶，则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。
试剂五：液体30mL×1瓶，避光4℃冰箱保存3个月。
试剂六：液体30mL×1瓶，避光4℃冰箱保存3个月。
试剂七：分析纯的冰乙酸(冰醋酸)自备。
显色剂的配制：试剂四应用液：试剂五：试剂六：冰乙酸＝8:3:3:2，现用现配。
操作步骤：
以上配制好的应用液，先在37℃水浴中预温3分钟，以下操作在37℃水浴中进行。混匀，室温放置20分钟，波长550nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
当清除率在20％-50％之间可利用公式计算其抑制羟自由基能力，羟自由基清除率计算公式如下：
MRS发酵液与上清液抑制羟自由基能力的计算公式如下：
菌体抑制羟自由基能力的计算公式如下：
(2)清除超氧阴离子自由基(O2·)能力的测定
以抗超氧阴离子试剂盒为参照(其中蛋白浓度用BCA法测定)，具体操作方法如下(简要过程见表2)：
试剂组成与配制：
试剂一：液体5mL×1瓶，(天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用)；
试剂一应用液的配制：用时每瓶5mL贮备液加双蒸水稀释至50mL，4℃保存1年。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存1年。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存1年。
试剂四：贮备液350μL×1支，4℃保存，不可冷冻；稀释液5mL×1瓶，4℃保存半年。
试剂四应用液的配制：按贮备液：稀释液＝1:14比例配制，现用现配，4℃保存，不可冷冻。
试剂五：粉剂×1支，用时加70～80℃热双蒸水37.5mL溶解。配好后4℃避光保存。
试剂六：粉剂×1支，用时加双蒸水37.5mL溶解后备用。配好后的试剂4℃避光保存。
显色剂的配制：按照5号试剂：6号试剂：冰乙酸＝3:3:2的体积比配 成显色剂，4℃避光保
存3个月(冰乙酸自备)。
试剂七：Vc标准品×4支。
Vc标准品贮备液配制：将一支Vc标准品加双蒸水定容至5mL(Vc标准配制后当天内使用)
0.15mg/mL Vc标准品应用液配制：取1mL贮备液加4mL双蒸水，5倍稀释现用现配。
[注]：Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/mL Vc标准应用液需30分钟内检测
操作表：
混匀，静置10分钟，双蒸水调零，波长550nm，光径1cm，测定各管吸光度OD值。
当清除率在10％-60％之间可利用公式计算其抗超氧阴离子活力单位，超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：
MRS发酵液与上清液抗超氧阴离子活力单位的计算公式如下：
菌体抗超氧阴离子活力单位的计算公式如下：
表1.清除羟自由基能力的测定
表2.清除超氧阴离子自由基的测定
2实验结果
选出的JR14的菌落形态如图1所示，革兰氏染色结果如图2所示。
2.1植物乳酸菌JR14产酸定性结果
植物乳酸菌JR14在pH值为7.0的条件下培养24h后，pH值下降到3.75，说明植物乳酸菌JR14产酸良好。
2.2植物乳酸菌JR14的耐酸结果
植物乳酸菌JR14经24h培养后耐酸结果如表3所示。
进行活菌计数后，植物乳酸菌JR14在pH2.5的条件下保持24h的存活率为80.39％，如表3所示。
表3
2.3植物乳酸菌JR14的耐胆盐结果
进行活菌计数后，植物乳酸菌JR14的耐胆盐结果如表4所示。
表4
2.4植物乳酸菌JR14的生理生化鉴定结果
参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)可知菌株植物乳酸菌 JR14为植物乳杆菌属，鉴定结果见表5。
表5生化试验及糖发酵试验鉴定结果
2.5 16S rDNA鉴定
菌株PCR扩增后进行100V，30min电泳，图3为电泳条带图，菌株分子量在2000bp到1000bp之间，将送检结果经过16S rDNA基 因序列比对分析，制作进化树，可知JR14与植物乳杆菌同源性达到了89％，可能为植物乳杆菌变种。
2.6清除羟自由基(·OH)能力的测定
由图5可知，JR14菌株的发酵液、上清液以及菌体对于羟自由基的抑制率分别为29.47％、27.56％和42.74％。由于发酵液稀释了125倍，因此可知发酵液的抑制效果最好，其次是菌体，上清液的抑制率最低，通过计算得知发酵液和上清液的抑制能力分别22.4U/mL和20.95U/mL，菌体的抑制能力为11.75U/mgprot。即发酵液的抑制能力最强，上清液次之，菌体最弱。
2.7清除超氧自由基(O2·)能力的测定
JR14菌株对超氧阴离子自由基的抑制能力，经过测定发现发酵液的抑制率为89.38％，而菌体及上清液几乎无抑制效果。
实施例2
将植物乳酸菌JR14发酵液喷洒至青贮饲料原料中，搅拌均匀，控制青贮饲料的水分为60％(wt％)，密封常温发酵3周，即得青贮饲料。
Claims (7)
1.一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR4，其特征在于，所述植物乳杆菌JR4的分类命名为植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.11928，保藏时间为2015年12月24日。
2.权利要求1所述植物乳杆菌JR4在抗氧化方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括在清除羟基自由基和在清除超氧自由基方面上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在清除羟基自由基时，利用的是植物乳杆菌JR4菌体、植物乳杆菌JR4无细胞破碎液、植物乳杆菌JR4发酵液中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在清除超氧自由基时，利用的是植物乳杆菌JR4发酵液。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌JR4无细胞破碎液的制备方法为：将细菌培养后，取菌体利用生理盐水冲洗，加入溶菌酶处理，然后进行超声破碎处理，即得。
7.权利要求1所述植物乳杆菌在制备青贮饲料、食品防腐剂、发酵乳制品食品添加剂方面的应用。
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