CN101851664A - 一种酸牛奶中双歧杆菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酸牛奶中双歧杆菌的检测方法，包括稀释液、培养基和抗生素溶液配制；样品处理培养物培养；菌落计数；显微镜检查、革兰氏染色和过氧化氢酶试验。所述抗生素溶液包含硫酸新霉素和硫酸巴龙霉素。本发明方法能够有效的排除其他乳酸菌的干扰，准确检测出含有4种乳酸菌酸牛奶中双歧杆菌的活菌数量，降低检测成本，提高检测效率。

Description

一种酸牛奶中双歧杆菌的检测方法

技术领域

本发明涉及一种酸牛奶中双歧杆菌的检测方法，更具体地涉及一种含有4种乳酸菌的酸牛奶中双歧杆菌的检测方法。属于微生物制品的检测技术领域。

背景技术

双歧杆菌是人类最早发现的生理性细菌，是能在健康人肠道内定植的益生菌。母乳喂养的婴儿肠道内该菌占总菌群的92％以上，现在已确认双歧杆菌的数量和品质是人体健康的重要标志之一。国内外研究报道双歧杆菌具有多种生理活性功能，可作为宿主氮的来源之一，同时，具有合成维生素、润肠通便、增强机体的免疫功能、降低胆固醇和甘油三酯、抑癌作用以及抗衰老作用等功能。

随着科技研究水平的提高和乳品加工业的快速发展，双歧杆菌在酸奶中的应用越来越广泛。人们在食用这些乳品的同时，通过其中活菌的作用可以改善胃、肠道内微生态的平衡，抑制病原菌的生长，从而促进身体健康。但要达到此作用，一般认为其活菌数要在106cfu/g(mL)以上。然而，人们长期忽视了对准确检测酸奶中双歧杆菌活菌数的方法的需要，导致市场上许多发酵奶制品中双歧杆菌活力甚微而又难以检出。与此同时，对健康有益的乳酸菌如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等被越来越多地添加到发酵乳中，加之酸奶加工使用的发酵剂中的嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌，这些乳酸菌的存在均对双歧杆菌的检测带来干扰。

2004年国家发布了《GB/T 4789.34-2008食品中双歧杆菌的检测方法》，此方法采用的培养基为非选择性培养基计数，可以实现双歧杆菌的活菌检测，但是对于酸奶产品而言，酸奶中其他乳酸菌均能在该培养基上生长，每次检验都需要多步鉴定才能得到准确的数据，检测时间长，成本高。中国专利CN1880471A“乳制品中双歧杆菌检测方法”中公开了一种乳制品中双歧杆菌的检测方法，在培养基中添加抗菌素抑制其他杂菌生长，发明中采用了氯化锂、丙酸钠、双氯青霉素3种抗菌素。双氯青霉素为广谱青霉素类抗生素，双歧杆菌对该类抗生素敏感，对双歧杆菌的生长也有一定的抑制作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸牛奶中双歧杆菌的检测方法，完全避免酸牛奶中其他乳酸菌对双歧杆菌检测数量的影响，以便及时对含有嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌乳亚种酸牛奶产品质量进行监督和控制。

本发明的酸牛奶中双歧杆菌的检测方法包括以下步骤：

1)稀释液、MRS培养基、抗生素溶液和培养液的配制；

2)样品稀释；

3)接种培养；

4)菌落计数；

5)显微镜检查、革兰氏染色和过氧化氢酶试验；

所述抗生素溶液包含硫酸新霉素和硫酸巴龙霉素。

酸牛奶样品是含有4种乳酸菌(嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌)的酸牛奶。酸牛奶中长双歧杆菌菌粉来自蒙牛乳业(北京)有限责任公司保藏菌种，CGMCC No.2265。

所使用的稀释液是用灭菌的0.9％的生理盐水。

所述MRS培养基的组成为(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐温801.0ml，磷酸氢二钾(7H₂O)2.0，乙酸钠(3H₂O)5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁(7H₂O)0.2，硫酸锰(4H₂O)0.05，琼脂15.0。

将上述成分溶解在蒸馏水中，将pH调节到6.2±0.1，并用蒸馏水定容至1000mL，121℃，高压灭菌15min。

所述抗生素溶液的组成为：硫酸新霉素80～120mg，硫酸巴龙霉素35～65mg，LiCl 1.5～4.5g，丙酸钠15～45g，半胱氨酸盐酸盐0.25～0.75g，蒸馏水50mL。

制法：0.45μm微孔滤膜过滤后加入灭菌瓶中。4℃下保藏一个月。

在无菌条件下，在1000mL47℃MRS培养基中加入50mL抗生素溶液，混匀，制成本发明检测方法中使用的培养液。

所述样品稀释是通过无菌操作，将充分混匀的检样酸牛奶25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成1∶10的均匀稀释液。再用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇均匀，做成1∶100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此操作，每递增一次，换用1支1mL灭菌吸管，制成几个适当倍数的均匀稀释液。

所述接种培养包括选择2个～3个适宜的稀释度，分别注入灭菌培养皿中，然后将融化并冷却至45℃左右的培养液倾注于平皿中，培养液的用量恰好覆盖平皿底部一薄层，迅速与稀释菌液混匀，凝固后培养，同时作灭菌生理盐水空白对照。

待琼脂表面干后，翻转平皿，放在厌氧罐内，加入厌氧产气包并快速关紧厌氧罐，或关紧厌氧罐后抽充高纯氮气三次。从稀释样品到倾注平板及放入厌氧罐的过程要迅速，在20分钟内完成操作。将厌氧罐置于36℃±1℃恒温培养箱内培养72h±3h。

菌落计数：计数原则同GB4789.2-2003种菌落总数计数原则。选取菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数。计数出平皿内的双歧杆菌菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。例如，检样1×10⁴倍的稀释液在MRS琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1mL样品中双歧杆菌数为：35×4/5×10⁴＝2.8×10⁴。

菌落形态：菌体细胞末端膨大，呈骨棒状，微弯曲，0.63～1.25×3.12～6.25μm，单个、成对或栏栅状排列，无芽孢，革兰氏阳性，严格厌氧，菌落乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。

菌种鉴定：随机挑取五个可疑菌落进行如下3项鉴定。

①革兰氏染色

挑取琼脂培养基上培养的菌落，按以下方法进行染色鉴定：

a.涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液染色1min，水洗；

b.滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

c.滴加脱色酒精，约30s；

d.水洗，滴加番红复染1min，水洗，待干，镜检。

结果：革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

②菌体形态

显微镜观察呈现“Y”或“V”型的分叉状、棒状等多形态的杆菌。

③过氧化氢酶试验：

过氧化氢酶阴性。

具体方法：用接种环挑取一小环琼脂培养基上培养的菌落，接到涂有3％过氧化氢的玻片上，用竹签搅动，有气泡出现者为阳性，无气泡为阴性。

本发明的优点是：本发明针对酸牛奶产品的特点，采用双歧杆菌不敏感或中度敏感的氨基糖苷类抗生素作为选择性试剂，使得培养基对其他乳酸菌有一定程度的抑制，从而选择性计数酸奶中的双歧杆菌，减少鉴定步骤，在48小内得到准确的检测数据。能够有效的排除其他乳酸菌的干扰，准确检测出含有4种乳酸菌的酸牛奶中双歧杆菌的活菌数量，降低检测成本，提高检测效率。

附图说明

图1是显示乳双歧杆菌细胞形态的显微照片；

图2是显示长双歧杆菌细胞形态的显微照片；

图3是显示青春双歧杆菌细胞形态的显微照片；

图4是显示乳双歧杆菌菌落形态的照片。

具体实施方式

实施例1

待测样品：已知乳双岐杆菌活菌数1.0×10⁵cfu/mL的酸牛奶样品

样品的制备：将已知活菌数的乳双歧杆菌菌粉(科·汉森公司产品)按一定比例添加到酸牛奶产品中，使酸牛奶中嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌的活菌数量分别达到1.0×10⁵，嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的数量总计达到1.0×10⁶。

仪器和设备：超净工作台(苏净集团安泰公司、BCM-1000A)、高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂、LDZX-50KB)、厌氧罐(长沙市驭仪电子科技有限公司、2.5L)、电热恒温培养箱(黄石恒丰医疗器械有限公司、SKP02.600)、生物显微镜(重庆光学仪器厂，XSZ-4)。

试剂：0.9％的灭菌生理盐水。

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐温80 1.0ml，磷酸氢二钾(7H₂O)2.0，乙酸钠(3H₂O)5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁(7H₂O)0.2，硫酸锰(4H₂O)0.05，琼脂15.0。将上述成分溶解在蒸馏水中，将pH调节到6.2±0.1，并用蒸馏水定容至1000mL，121℃，高压灭菌15min。

抗生素溶液的组成为：硫酸新霉素80mg，硫酸巴龙霉素65mg，LiCl 1.5g，丙酸钠15g，半胱氨酸盐酸盐0.25g，蒸馏水50mL。

制法：0.45μm微孔滤膜过滤后加入灭菌瓶中。4℃下保藏一个月。

在无菌条件下，在1000mL47℃MRS培养基中加入50mL抗生素溶液，混匀，制成培养液。

操作步骤：样品稀释是通过无菌操作，将充分混匀的检样酸牛奶25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成1∶10的均匀稀释液。再用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇均匀，做成1∶100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此操作，每递增一次，换用1支1mL灭菌吸管，制成几个适当倍数的均匀稀释液。选择2个～3个适宜的稀释度，分别注入灭菌培养皿中，然后将融化并冷却至45℃左右的培养液倾注于平皿中，培养液的用量恰好覆盖平皿底部一薄层，迅速与稀释菌液混匀，凝固后培养，同时作灭菌生理盐水空白对照。待琼脂表面干后，翻转平皿，放在厌氧罐内，加入厌氧产气包并快速关紧厌氧罐，或关紧厌氧罐后抽充高纯氮气三次。从稀释样品到倾注平板及放入厌氧罐的过程要迅速，在20分钟内完成操作。将厌氧罐置于36℃±1℃恒温培养箱内培养72h±3h。

菌落计数：计数原则同GB4789.2-2003种菌落总数计数原则。选取菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数。计数出平皿内的双歧杆菌菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。例如，检样1×10⁴倍的稀释液在MRS琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1mL样品中双歧杆菌数为：35×4/5×10⁴＝2.8×10⁴。

菌落形态观察结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，培养基上生长的菌落乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。

菌种鉴定：随机挑取五个可疑菌落进行如下3项鉴定。

①革兰氏染色

挑取琼脂培养基上培养的菌落，按以下方法进行染色鉴定：

a.涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液染色1min，水洗；

b.滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

c.滴加脱色酒精，约30s；

d.水洗，滴加番红复染1min，水洗，待干，镜检。

结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，按革兰氏染色鉴定方法，镜检均为革兰氏阳性菌。

②菌体形态

受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，按革兰氏染色鉴定方法，在显微镜(1000倍)下观察菌体形态，呈现“Y”或“V”型的分叉状、棒状等多形态的杆菌。

③过氧化氢酶试验：

具体方法：用接种环挑取一小环琼脂培养基上培养的菌落，接到涂有3％过氧化氢的玻片上，用竹签搅动，有气泡出现者为阳性，无气泡为阴性。

结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，过氧化氢酶试验为阴性。

结果：活菌数为5.1×10⁵cfu/mL。

为了验证本实施例1中计数结果的可靠性，提取本次检测中培养基上生长的菌落，采用生理生化和分子生物技术鉴定方法对培养菌落进行鉴定，验证方法及结果如下：生理生化和基因鉴定方法对培养菌落进行鉴定，验证方法：

形态特征：在培养基上菌落形态为乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。革兰氏染色，电子显微镜下镜检，菌体革兰氏阳性，无芽孢，细胞末端膨大，呈骨棒状。微弯曲，0.63～1.25×3.12～6.25μm，单个、成对或栏栅状排列。

生理生化特征：

16SrDNA基因序列分析：

培养菌落按细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生化科技有限公司)说明提取基因组DNA。以提取的细菌基因组DNA为模板，PCR扩增16SrDNA，细菌域的16SrDNA基因扩增的通用引物：

27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。

PCR反应体系(30ul体系)：1.5ul引物1，1.5ul引物2，5ul 5×buffer，0.2ul Mg(250mM)，1.2ul dNTP(2.5mM)，18.4ul H₂O，1ul模板(5ng)。

PCR过程为94℃预变性3min后，进行下述30个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，最后72℃保温10min。

PCR结束后，取15ul反应混和物在1％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中添加EB替代物，电泳缓冲液1×TAE缓冲液。电泳结束后在紫外光下观察，可见相应大小为1.5kb的条带。用DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物送样到测序公司测序(美国英杰生命技术有限公司)，将得到的碱基序列在NCBI数据库进行同源序列搜索(blast)，找出与数据库中同源性最高的模式菌株。结果如下：

基因序列(序列数字标识：1)：

cgcgttgcgt ggcattgaag tccaccgacg gcttggtgcg tggcgccatc gtgcacgaca    60

ccggcggccc gatcgaggtg ccggtcggcg atgttaccaa gggccatgtg ttcgacgttt    120

ccggccacat tctcaacaag aagccgggcg agaagatcgt gatcaaggag cgctggccca    180

tccaccgcaa cccgccggca ttcgatcagc tcgagtcgaa gacgcagatg ttcgagacgg    240

gcatcaaggt catcgatctg ctcaccccgt acgtgcaggg cggcaagatc ggtctgttcg    300

gcggcgcagg cgtgggcaag accgttctga tccaggagat gatccagcga gtggcgcaga    360

accacggcgg cgtctccgtg ttcgcaggcg tcggcgagcg cacccgtgag ggcaacgacc    420

tgatcggcga gatggacgag gccggagtgc tcgagaagac cgcgctggtc ttcggccaga    480

tggatgagca gccgggcacc cgtcttcgtg tgccgctcac cgcactgacc atggcggagt    540

acttccgcga tgtgcagaat caggacgtgc tgctgttcat cgacaacatc ttccgcttca    600

cgcaggcggg ttccgaggtg tccacgctgc ttggccgcat gccatccgca gtgggctacc    660

agccgaacct ggccgatgag atgggctccc tgcaggagcg catcacctcg acccgtggcc    720

attcgatcac gtcgctgcag gccatttacg tgcctgccga cgattacacc gacccggccc    780

ctgccaccac cttcgcccac ttggacgcca ccacggagct ttcccgtgac atcgcctcgc    840

gaggcatcta cccggccgtg gatccgctgg cctccacctc gcgaatcctc gacccgcggt    900

acgtgggcca ggcgcactac gactgcgcga accgcgtcaa ggcgattctg cagcgcaaca    960

aggagcttca ggacatcatc gccctcatcg gcattgacga gctcggcgag gaagacaaga    1020

ccacagtgaa ccgcgcccgc aagatcgagc agttcctcgg ccagaacttc tacgtggccg    1080

agaagttcac cggtgtcccc ggctcctacg tgcctgcgga ggagaccatc gaggccttca    1140

cccgcatctg cgacggcgtg tacgacaacg tgccggagca ggcatctcgg ca    1192

系统发育分析结果：菌株BB-1216SrDNA基因序列与B.animalis subsp.lactis DSM 10140T同源性为100％，与B.animalis subsp.animalisATCC25527T同源性为97.2％，与B.bifidum ATCC 29521同源性为96.1％，与双歧杆菌属内其它种同源性均低于90％，在亚种水平上有很好的分辨率。

鉴定结论：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。

在实施例1中，受试样品按本发明方法操作步骤进行接种、培养、计数和菌种鉴定，活菌数计数结果为5.1×10⁵cfu/mL。为了验证本实施例中计数结果的可靠性，提取本次检测中培养基上生长的菌落，采用生理生化和分子生物技术鉴定方法对培养菌落进行鉴定，鉴定结论表明培养物为乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis，与本实施例1样品中所添加的双歧杆菌为同一种属菌种，表明受试样品按本发明方法操作步骤进行培养和计数，可准确计数双歧杆菌活菌数数量。

实施例2

待测样品：已知长双岐杆菌活菌数1.0×10⁶cfu/mL的酸牛奶样品

样品的制备：将已知活菌数的长双歧杆菌菌粉(蒙牛乳业(北京)有限责任公司保藏菌种，CGMCC No.2265)按一定比例添加到酸牛奶产品中，使酸牛奶中嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌的活菌数量分别达到1.0×10⁶cfu/mL，嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的数量达到1.0×10⁶cfu/mL。

试剂：0.9％的灭菌生理盐水。

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐温801.0ml，磷酸氢二钾(7H₂O)2.0，乙酸钠(3H₂O)5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁(7H₂O)0.2，硫酸锰(4H₂O)0.05，琼脂15.0。将上述成分溶解在蒸馏水中，将pH调节到6.2±0.1，并用蒸馏水定容至1000mL，121℃，高压灭菌15min。

抗生素溶液的组成为：硫酸新霉素100mg，硫酸巴龙霉素50mg，LiCl3g，丙酸钠30g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水50mL。

制法：0.45μm微孔滤膜过滤后加入灭菌瓶中。4℃下保藏一个月。

在无菌条件下，在1000mL47℃MRS培养基中加入50mL抗生素溶液，混匀，制成培养液。

操作步骤：样品稀释是通过无菌操作，将充分混匀的检样酸牛奶25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成1∶10的均匀稀释液。再用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇均匀，做成1∶100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此操作，每递增一次，换用1支1mL灭菌吸管，制成几个适当倍数的均匀稀释液。选择2个～3个适宜的稀释度，分别注入灭菌培养皿中，然后将融化并冷却至45℃左右的培养液倾注于平皿中，培养液的用量恰好覆盖平皿底部一薄层，迅速与稀释菌液混匀，凝固后培养，同时作灭菌生理盐水空白对照。待琼脂表面干后，翻转平皿，放在厌氧罐内，加入厌氧产气包并快速关紧厌氧罐，或关紧厌氧罐后抽充高纯氮气三次。从稀释样品到倾注平板及放入厌氧罐的过程要迅速，在20分钟内完成操作。将厌氧罐置于36℃±1℃恒温培养箱内培养72h±3h。

菌落计数：计数原则同GB4789.2-2003种菌落总数计数原则。选取菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数。计数出平皿内的双歧杆菌菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。例如，检样1×10⁴倍的稀释液在MRS琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1mL样品中双歧杆菌数为：35×4/5×10⁴＝2.8×10⁴。

菌落形态观察结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，培养基上生长的菌落乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。

菌种鉴定：随机挑取五个可疑菌落进行如下3项鉴定。

①革兰氏染色

挑取琼脂培养基上培养的菌落，按以下方法进行染色鉴定：

a.涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液染色1min，水洗；

b.滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

c.滴加脱色酒精，约30s；

d.水洗，滴加番红复染1min，水洗，待干，镜检。

结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，按革兰氏染色鉴定方法，镜检均为革兰氏阳性菌。

②菌体形态

受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，按革兰氏染色鉴定方法，在显微镜(1000倍)下观察菌体形态，呈现“Y”或“V”型的分叉状、棒状等多形态的杆菌。

③过氧化氢酶试验：

具体方法：用接种环挑取一小环琼脂培养基上培养的菌落，接到涂有3％过氧化氢的玻片上，用竹签搅动，有气泡出现者为阳性，无气泡为阴性。

结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，过氧化氢酶试验为阴性。

经以上鉴定步骤，本次样品中双歧杆菌计数结果：活菌数为3.0×10⁶cfu/mL。

为了验证本实施例中计数结果的可靠性，提取本次检测中培养基上生长的菌落，采用生理生化和分子生物技术鉴定方法对培养菌落进行鉴定，验证方法及结果如下：

形态特征：在培养基上菌落形态为乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。革兰氏染色，显微镜下镜检，菌体革兰氏阳性，无芽孢，杆状、多形态。

生理生化特征：接触酶阴性，氧化酶阴性，严格厌氧生长，果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶阳性，发酵葡萄糖产生乳酸。

16SrDNA基因序列分析：

培养菌落按细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生化科技有限公司)说明提取基因组DNA。以提取的细菌基因组DNA为模板，PCR扩增16SrDNA，细菌域的16SrDNA基因扩增的通用引物：

27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。

PCR反应体系(30ul体系)：1.5ul引物1，1.5ul引物2，5ul 5＊buffer，0.2ulMg(250mM)，1.2ul dNTP(2.5mM)，18.4ul H₂O，1ul模板(5ng)。PCR过程为94℃预变性3min后，进行下述30个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，最后72℃保温10min。PCR结束后，取15ul反应混和物在1％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中添加EB替代物，电泳缓冲液1×TAE缓冲液。电泳结束后在紫外光下观察，可见相应大小为1.5kb的条带。用DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物送样到测序公司测序(美国英杰生命技术有限公司)，将得到的碱基序列在NCBI数据库进行同源序列搜索(blast)，找出与数据库中同源性最高的模式菌株。结果如下(序列数字标识：2)：

ttagacggct ccatcccaca aggggttagg ccaccggctt cgggtgctgc ccactttcat    60

gacttgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcgacgt tgctgattcg    120

cgattactag cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagac    180

cggttttcag ggatccgctc cgcgtcgccg cgtcgcatcc cgttgtaccg gccattgtag    240

catgcgtgaa gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc accttcctcc    300

gagttaaccc cggcggtccc ccgtgagttc ccggcataat ccgctggcaa cacggggcga    360

gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat    420

gcaccacctg tgaacccgcc ccgaagggaa gccgtatctc tacgaccgtc gggaacatgt    480

caagcccagg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg    540

cgggcccccg tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggatgc    600

ttaacgcgtt agctccgaca cggaacccgt ggaacgggcc ccacatccag catccaccgt    660

ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag    720

cgtcagtaac ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat atctacacat    780

tccaccgtta caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tcaagcccgc ccgtacccgg    840

cgcggatcca ccgttaagcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg cctacgagcc    900

ctttacgccc aataattccg gataacgctt gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca    960

cgtagttagc cggtgcttat tcaacgggta aactcactct cgcttgctcc ccgataaaag    1020

aggtttacaa cccgaaggcc tccatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc    1080

attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtatc tcagtcccaa    1140

tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgaagc cacggtgggc cgttaccccg    1200

ccgtcaagct gataggacgc gaccccatcc cataccgcga aagctttccc agaagaccat    1260

gcgatcaact ggagcatccg gcattaccac ccgtttccag gagctattcc ggtgtatggg    1320

gcaggtcggt cacgcattac tcacccgttc gccactctca ccaccaagca aagcctgatg    1380

gatcccgttc gacttgca                                                  1398

鉴定结论：长双歧杆菌Bifidobacterium longum。

本实施例中，受试样品按本发明方法操作步骤进行接种、培养、计数和菌种鉴定，活菌数计数结果为3.0×10⁶cfu/mL。为了验证本实施例2中计数结果的可靠性，提取本次检测中培养基上生长的菌落，采用生理生化和分子生物技术鉴定方法对培养菌落进行鉴定，鉴定结论表明培养物为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，与本实施例样品中所添加的双歧杆菌为同一种属菌种，表明受试样品按本发明方法操作步骤进行培养和计数，可准确计数双歧杆菌活菌数数量。

实施例3

待测样品：已知青春双岐杆菌活菌数1.0×10⁶cfu/mL的酸牛奶样品

样品的制备：将已知活菌数的青春双歧杆菌菌粉(蒙牛乳业(北京)有限责任公司保藏菌种，CGMCC No.2264)按一定比例添加到酸牛奶产品中，使酸牛奶中嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的活菌数量分别达到1.0×10⁶cfu/mL，嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的数量达到1.0×10⁶cfu/mL。

试剂：0.9％的灭菌生理盐水。

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐温801.0ml，磷酸氢二钾(7H₂O)2.0，乙酸钠(3H₂O)5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁(7H₂O)0.2，硫酸锰(4H₂O)0.05，琼脂15.0。将上述成分溶解在蒸馏水中，将pH调节到6.2±0.1，并用蒸馏水定容至1000mL，121℃，高压灭菌15min。

抗生素溶液的组成为：硫酸新霉素120mg，硫酸巴龙霉素35mg，LiCl 4.5g，丙酸钠45g，半胱氨酸盐酸盐0.75g，蒸馏水50mL。

制法：0.45μm微孔滤膜过滤后加入灭菌瓶中。4℃下保藏一个月。

在无菌条件下，在1000mL47℃MRS培养基中加入50mL抗生素溶液，混匀，制成培养液。

操作步骤：样品稀释是通过无菌操作，将充分混匀的检样酸牛奶25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成1∶10的均匀稀释液。再用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇均匀，做成1∶100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此操作，每递增一次，换用1支1mL灭菌吸管，制成几个适当倍数的均匀稀释液。选择2个～3个适宜的稀释度，分别注入灭菌培养皿中，然后将融化并冷却至45℃左右的培养液倾注于平皿中，培养液的用量恰好覆盖平皿底部一薄层，迅速与稀释菌液混匀，凝固后培养，同时作灭菌生理盐水空白对照。待琼脂表面干后，翻转平皿，放在厌氧罐内，加入厌氧产气包并快速关紧厌氧罐，或关紧厌氧罐后抽充高纯氮气三次。从稀释样品到倾注平板及放入厌氧罐的过程要迅速，在20分钟内完成操作。将厌氧罐置于36℃±1℃恒温培养箱内培养72h±3h。

菌落计数：计数原则同GB4789.2-2003种菌落总数计数原则。选取菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数。计数出平皿内的双歧杆菌菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。例如，检样1×10⁴倍的稀释液在MRS琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1mL样品中双歧杆菌数为：35×4/5×10⁴＝2.8×10⁴。

菌落形态观察结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，培养基上生长的菌落乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。

菌种鉴定：随机挑取五个可疑菌落进行如下3项鉴定。

①革兰氏染色

挑取琼脂培养基上培养的菌落，按以下方法进行染色鉴定：

a.涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液染色1min，水洗；

b.滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

c.滴加脱色酒精，约30s；

d.水洗，滴加番红复染1min，水洗，待干，镜检。

结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，按革兰氏染色鉴定方法，镜检均为革兰氏阳性菌。

②菌体形态

受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，按革兰氏染色鉴定方法，在显微镜(1000倍)下观察菌体形态，呈现不规则杆菌。

③过氧化氢酶试验：

具体方法：用接种环挑取一小环琼脂培养基上培养的菌落，接到涂有3％过氧化氢的玻片上，用竹签搅动，有气泡出现者为阳性，无气泡为阴性。

结果：受试样品在本发明方法所述条件下培养，从培养基上随机挑取五个可疑菌落，过氧化氢酶试验为阴性。

经以上鉴定步骤，本次样品中双歧杆菌计数结果：活菌数为2.1×10⁶cfu/mL。

为了验证本实施例3中计数结果的可靠性，提取本次检测中培养基上生长的菌落，采用生理生化和分子生物技术鉴定方法对培养菌落进行鉴定，验证方法及结果如下：

形态特征：在培养基上菌落形态为乳白色，湿润，液滴状，圆形，表面光滑，突起，不透明，边缘整齐。革兰氏染色，显微镜下镜检，菌体革兰氏阳性，无芽孢，杆状、多形态。

生理生化特征：接触酶阴性，氧化酶阴性，严格厌氧生长，果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶阳性，发酵葡萄糖产生乳酸。

16SrDNA基因序列分析：

培养菌落按细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生化科技有限公司)说明提取基因组DNA。以提取的细菌基因组DNA为模板，PCR扩增16SrDNA，细菌域的16SrDNA基因扩增的通用引物：

27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。

PCR反应体系(30ul体系)：1.5ul引物1，1.5ul引物2，5ul 5＊buffer，0.2ulMg(250mM)，1.2ul dNTP(2.5mM)，18.4ul H₂O，1ul模板(5ng)。PCR过程为94℃预变性3min后，进行下述30个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，最后72℃保温10min。PCR结束后，取15ul反应混和物在1％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中添加EB替代物，电泳缓冲液1×TAE缓冲液。电泳结束后在紫外光下观察，可见相应大小为1.5kb的条带。用DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物送样到测序公司测序(美国英杰生命技术有限公司)，将得到的碱基序列在NCBI数据库进行同源序列搜索(blast)，找出与数据库中同源性最高的模式菌株。结果如下(序列数字标识：3)：

ccaggagctt gctcctgggt gagagtggcg aacgggtgag taatgcgtga ccgacctgcc    60

ccatacaccg gaatagctcc tggaaacggg tggtaatgcc ggatgctcca gttgactgca    120

tggtcctctg ggaaagcttt tgcggtatgg gatggggtcg cgtcctatca gcttgatggc    180

ggggtaacgg cccaccatgg cttcgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacat    240

tgggactgag atacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg    300

ggcgcaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg cgggatgacg gccttcgggt tgtaaaccgc    360

ttttgactgg gagcaagccc ttcggggtga gtgtaccttt cgaataagca ccggctaact    420

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta    480

aagggctcgt aggcggttcg tcgcgtccgg tgtgaaagtc catcgcttaa cggtggatcc    540

gcgccgggta cgggcgggct tgagtgcggt aggggagact ggaattcccg gtgtaacggt    600

ggaatgtgta gatatcggga agaacaccaa tggcgaaggc aggtctctgg gccgtcactg    660

acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggka gtccacgccg    720

taaacggtgg atgctggatg tggggaccat tccacggtct ccgtgtcgga gccaacgcgt    780

taagcatccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaagaaat tgacgggggc    840

ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggc    900

ttgacatgtt cccgacagcc gtagagatac ggtttccctt cggggcgggt tcacaggtgg    960

tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagccccgca acgagcgcaa    1020

ccctcgccct gtgttgccag cacgtcgtgg tgggaactca cgggggaccg ccggggtcaa    1080

ctcggaggaa ggtggggatg acgtcagatc atcatgcccc ttacgtccag ggcttcacgc    1140

atgctacaat ggccggtaca acgggatgcg acaccgcgag gtggagcgga tcccttaaaa    1200

ccggtctcag ttcggattgg agtctgcaac ccgactccat gaaggcggag tcgctagtaa    1260

tcgcggatca gcaacgccgc ggtgaatgcg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa    1320

gtcatgaaag tgggtagcac ccgaagccgg tggcccaa                            1358

鉴定结论：青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis

本实施例中，受试样品按本发明方法操作步骤进行接种、培养、计数和菌种鉴定，活菌数计数结果为2.1×10⁶cfu/mL。为了验证本实施例中计数结果的可靠性，提取本次检测中培养基上生长的菌落，采用生理生化和分子生物技术鉴定方法对培养菌落进行鉴定，鉴定结论表明培养物为青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，与本实施例样品中所添加的双歧杆菌为同一种属菌种，表明受试样品按本发明方法操作步骤进行培养和计数，可准确计数双歧杆菌活菌数数量。

Claims (7)

1.一种酸牛奶中双歧杆菌的检测方法，包括以下步骤：

1)稀释液、MRS培养基、抗生素溶液和培养液配制；

2)样品稀释；

3)接种培养；

4)菌落计数；

5)显微镜检查、革兰氏染色和过氧化氢酶试验；

其特征在于所述抗生素溶液包含硫酸新霉素和硫酸巴龙霉素。

2.如权利要求1中所述的方法，步骤1)所述的稀释液为0.9％灭菌生理盐水，培养液由灭菌MRS培养基和抗生素溶液组成，抗生素溶液的组成为硫酸新霉素80～120mg，硫酸巴龙霉素35～65mg，LiCl 1.5～4.5g，丙酸钠15～45g，半胱氨酸盐酸盐0.25～0.75g，蒸馏水50mL。

3.如权利要求1所述的检测方法，所述的步骤1)中培养液是将通过0.45μm微孔滤膜过滤后的抗生素溶液加入到灭菌的47℃MRS培养基中混匀制备的。

4.如权利要求1所述的检测方法：所述的步骤2)包括通过无菌操作，将充分混匀的检样酸牛奶25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内制成1∶10的均匀稀释液；用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇均匀，做成1∶100的稀释液；另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此操作，每递增一次，换用1支1mL灭菌吸管，制成几个适当倍数的均匀稀释液。

5.如权利要求4所述的检测方法：所述步骤3)包括选择其中2个～3个稀释度，分别注入灭菌培养皿中，然后将融化并冷却至45℃左右的培养液倾注于平皿中，培养液的用量恰好覆盖平皿底部一薄层，迅速与稀释菌液混匀，凝固后培养，同时作灭菌生理盐水空白对照，待琼脂表面干后，翻转平皿，放在厌氧罐内，加入厌氧产气包并快速关紧厌氧罐，或关紧厌氧罐后抽充高纯氮气三次。

6.如权利要求5所述的检测方法：所述步骤4)和5)包括选取菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行显微镜检查、革兰氏染色和过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性，无芽孢，显微镜下出现“Y”或“V”型的分叉状或棒状形态的杆菌为双歧杆菌。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所说培养液是在无菌条件下，在1000mL 47℃MRS培养基中加入50mL抗生素溶液，混匀后制成的。

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