CN107805656B - 一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法 - Google Patents

一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，公开了一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法。本发明所述检测双歧杆菌的培养基包括基础培养基、乳糖和半胱氨酸盐酸盐；其中，所述基础培养基由哥伦比亚血琼脂基础培养基、棉子糖、氯化锂、丙酸钠和水制成，pH 5.1。本发明所述培养基除了哥伦比亚血琼脂基础培养基外还包括乳糖、棉籽糖和半胱氨酸盐酸盐氯化锂和丙酸钠，同时其中乳糖、棉籽糖和半胱氨酸盐酸盐作为营养剂促进双歧杆菌的生长。采用本发明所述培养基进行双歧杆菌总数检测，双歧杆菌菌落生长大，容易判读，特异性好，且对瑞士乳酸杆菌的有很好的抑制作用，能准确检测双歧杆菌和乳杆菌组合营养品中双歧杆菌的含量。

Description

一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法，尤其是一种检测双歧杆菌和乳杆菌组合中双歧杆菌的培养基及检测方法。
背景技术
发酵食品中含有丰富的乳酸菌，其可发酵糖产生大量的乳酸，对人体的消化、免疫相关生理功能具有积极的影响。常见的食品乳酸菌包含乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌等几种菌属，常常将它们按照需要进行混合，制备为功能性食品或营养品。然而对这种乳酸菌组合的检测，特别是双歧杆菌的检测目前还没有很准确及特异的方法。对于乳杆菌和双歧杆菌的检测，有国标方法GB4789.35-2016，检验程序如图1所示，对于双歧杆菌总数检测，GB4789.35-2016中使用的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基并不能准确的检测出双歧杆菌数量，因为乳杆菌也能在该培养基上生长，使得双歧杆菌检出值不准确。而对于GB4789.34-2016中使用的双歧杆菌培养基(BBL培养基)，乳酸杆菌也能在BBL培养基上生长，检测结果包含了乳酸杆菌和双歧杆菌，而不能只代表双歧杆菌。
目前现行常用技术检测的操作程序如下：无菌操作称取1g样品于无菌均质袋中，加入99ml无菌磷酸盐缓冲溶液，于8000r/min-10000r/min均质1min-2min，制成1:10样品菌液；2)用1ml无菌吸管吸取1:10样品菌液1ml，沿管壁缓慢注于装有9ml无菌磷酸盐缓冲溶液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品菌液；3)按上述操作顺序，做10倍递增样品菌液；4)对于双歧杆菌的检测，选择2-3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1ml样品匀液于改良哥伦比亚琼脂培养基平板(哥伦比亚血琼脂基础培养基38克，半胱氨酸盐酸盐0.5克，棉子糖0.5克，氯化锂2克，丙酸钠3克，加入1升蒸馏水中，用6N盐酸调pH到5.1，121℃高压灭菌10分钟)，使用灭菌L型棒进行表面涂布，每个稀释度做2个平板，于36±1℃，厌氧培养48h±2h后计数平板上的所有菌落数，从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成；5)菌落计数并报告。上述方法对双歧杆菌和乳杆菌组合营养品中双歧杆菌检测特异性比较好，但是对于放置一段时间活菌数下降后的乳酸菌组合中双歧杆菌检测特异性不好，培养基上还是会同时出现乳杆菌和双歧杆菌，不能准确检测双歧杆菌。并且该检测方法菌落生长特别小，难以准确读数，在结果读数时比较困难。因此需要建立一个新的双歧杆菌检测方法，以便能准确、方便的检测双歧杆菌和乳杆菌组合中的双歧杆菌。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种准确、方便的检测双歧杆菌的培养基及方法，以便能准确、方便的检测双歧杆菌和乳杆菌组合中的双歧杆菌。
为实现本发明的目的，本发明公开了如下技术方案：
一种检测双歧杆菌的培养基，包括基础培养基、乳糖和半胱氨酸盐酸盐。
其中，所述基础培养基由哥伦比亚血琼脂基础培养基、棉子糖、氯化锂、丙酸钠和水制成，pH5.1。
作为优选，所述基础培养基中各成分的用量为哥伦比亚血琼脂基础培养基38g/L、棉子糖0.5g/L-1g/L、氯化锂2.5-3.5g/L、丙酸钠4g/L-6g/L，余量为水。
作为优选，本发明所述检测双歧杆菌的培养基中，所述乳糖的终浓度为3v/v％～7v/v％。
作为优选，本发明所述检测双歧杆菌的培养基中，所述半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL～1000μg/mL。
本发明还提供了所述检测双歧杆菌的培养基的制备方法，分别制备基础培养基、乳糖储备液、半胱氨酸盐酸盐储备液，除菌后将乳糖储备液和半胱氨酸盐酸盐储备液加入冷却的基础培养基中混匀后倾倒平皿。
其中，所述除菌可以选择本领域技术人员公知的任意一种除菌方法进行。
在一些实施方案中，所述基础培养基的制备方法为分别取配方量的哥伦比亚血琼脂基础培养基、棉子糖、氯化锂、丙酸钠和水混匀，调pH值至5.1，高压蒸汽灭菌法除菌。
进一步的，所述高压蒸汽灭菌法除菌优选为121℃、高压灭菌10分钟。
本领域技术人员可以根据实际情况选择常用的酸性溶液对基础培养基的pH值进行调节。在一些具体实施例中，用6N盐酸调pH值。
在一些实施方案中，所述乳糖储备液的制备方法为取乳糖加入水中混匀，微孔滤膜过滤除菌。在一些具体实施例中，所述乳糖储备液的制备方法为称取10g乳糖(AR)加入到100mL蒸馏水中。
在一些实施方案中，所述半胱氨酸盐酸盐储备液制备方法为取半胱氨酸盐酸盐加入到水中，微孔滤膜过滤除菌。在一些具体实施例中所述半胱氨酸盐酸盐储备液制备方法为称取1.5g半胱氨酸盐酸盐加入到10ml蒸馏水中。
进一步的，所述微孔滤膜过滤除菌为0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
作为优选，本发明所述乳糖储备液和半胱氨酸盐酸盐储备液现配现用。
本发明所述检测双歧杆菌的培养基的制备方法中将乳糖储备液和半胱氨酸盐酸盐储备液加入基础培养基之前需要先将高压蒸汽灭菌法除菌的基础高温冷却。优选冷却至46±1℃。
本发明还提供了一种检测双歧杆菌的方法，待测样品用无菌磷酸盐缓冲溶液进行梯度稀释，然后选择2-3个连续的稀释度的待测样品菌液，分别吸取0.1mL涂布于上述检测双歧杆菌的培养基平板中，于36±1℃、厌氧培养72h±2h后计数平板上的所有菌落数。
作为优选，所述的梯度稀释为无菌操作称取10g待测样品于无菌均质袋中，加入90ml无菌磷酸盐缓冲溶液，于8000r/min-10000r/min均质1min-2min，制成1:10待测样品菌液，无菌吸管吸取1:10待测样品菌液1ml，沿管壁缓慢注于装有9ml无菌磷酸盐缓冲溶液的试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的待测样品菌液；按上述操作顺序，做10倍递增的梯度稀释。
作为优选，本发明所述检测双歧杆菌的方法中每个选择的稀释度待测样品菌液至少涂布3个平板，使用灭菌L型棒进行表面涂布。
进一步的，本发明所述检测双歧杆菌的方法中从待测样品稀释到平板涂布在15min内完成。
本发明所述检测双歧杆菌的方法在涂布待测样品菌液培养后需要对生长的菌落进行计数。本领域技术人员可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器。如果分离情况不好成链状生长时，应重新实验。
在一些实施方案中，所述的计数具体为记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示，选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用三个平板的平均数。
本发明所述检测双歧杆菌的方法在计数后还包括报告菌落数的步骤。
在一些实施方案中，所述报告菌落数具体为以CFU/g为单位报告，菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数。
本领域技术人员可以理解，菌落数大于或等于100CFU时，也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法。本发明所述检测双歧杆菌的培养基包括基础培养基、乳糖和半胱氨酸盐酸盐；其中，所述基础培养基由哥伦比亚血琼脂基础培养基、棉子糖、氯化锂、丙酸钠和水制成，pH 5.1。本发明所述培养基除了哥伦比亚血琼脂基础培养基外还包括乳糖、棉籽糖和半胱氨酸盐酸盐，氯化锂和丙酸钠，可有效抑制乳酸菌的生长，同时其中乳糖、棉籽糖和半胱氨酸盐酸盐作为营养剂促进双歧杆菌的生长。采用本发明所述培养基进行双歧杆菌总数检测，双歧杆菌菌落生长大，容易判读，特异性好，且对瑞士乳酸杆菌的有很好的抑制作用，能准确检测双歧杆菌和乳杆菌组合中双歧杆菌的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示国标方法GB4789.35-2016检验程序；
图2示GB4789.35-2016法检测双歧杆菌和乳杆菌组合营养品的菌落图，平皿上有很多细小的菌落(图中黑色圆圈内)，难以计数；
图3示现行常用技术检测双歧杆菌和乳杆菌组合营养品的菌落图，平皿上有些菌落较小(图中黑色圆圈内)，很难判读和计数；
图4示本发明实施例1所述方法检测双歧杆菌和乳杆菌组合营养品的菌落图，平皿上菌落清晰易计数。
具体实施方式
本发明公开了一种检测双歧杆菌的培养基及检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1本发明所述检测方法
1、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1恒温培养箱：36℃±1℃；
1.2均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵；
1.3冰箱：2℃～5℃；
1.4天平：感量0.1g；
1.5无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；
1.6无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)
1.7螺旋接种仪或L型玻璃涂抹棒
1.8厌氧培养箱箱或厌氧罐及配套耗材
1.9旋涡振荡器
2、培养基和试剂
2.1大豆蛋白胨
2.2MRS培养基
2.3氯化锂：分析纯
2.4丙酸钠：化学纯
2.5棉籽糖：生化试剂，纯度>99％
2.6半胱氨酸盐酸盐：生化试剂
2.7乳糖：分析纯
2.8磷酸氢二钾：分析纯
2.9磷酸二氢钾：分析纯
2.10磷酸盐缓冲液：取1g大豆蛋白胨，1.21g磷酸氢二钾和0.34g磷酸二氢钾，加1L蒸馏水溶解，121℃灭菌10分钟。
3、检测程序
3.1无菌操作称取10g样品于无菌均质袋中，加入90ml无菌磷酸盐缓冲溶液，于8000r/min-10000r/min均质1min-2min，制成1:10样品菌液。
3.2用1ml无菌吸管吸取1:10样品菌液1ml，沿管壁缓慢注于装有9ml无菌磷酸盐缓冲溶液的试管中，振揺试管使其混合均匀，制成1:100的样品菌液。
3.3按上述操作顺序，做10倍递增样品菌液。
3.4对于双歧杆菌的检测，选择2-3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1ml样品匀液于改良哥伦比亚琼脂基础培养基平板(本发明所述检测双歧杆菌的培养基，RAF)，使用灭菌L型棒进行表面涂布，每个稀释度做3个平板，于36±1℃，厌氧培养72h±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。
3.5改良哥伦比亚血琼脂基础培养基的配制方法：
3.5.1基础培养基制备：取哥伦比亚血琼脂基础培养基38克，棉子糖0.5-1克，氯化锂2.5～3.5克，丙酸钠4-6克，加入950ml蒸馏水中，用6N盐酸调pH到5.1，121℃.高压灭菌10分钟。
3.5.2乳糖储备液制备:称取10g乳糖(AR)加入到100mL蒸馏水中，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。现配现用。
3.5.3半胱氨酸盐酸盐储备液制备:称取1.5g半胱氨酸盐酸盐加入到10ml蒸馏水中，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。现配现用。
3.5.4制法：将灭菌好的基础培养基在水浴中冷却至46±1℃，加入无菌乳糖储备液和无菌半胱氨酸盐酸盐储备液，使得培养基中乳糖的浓度3％～7％(v/v)，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500～1000μg/mL。充分混匀，倾倒平皿待用。
4、菌落计数
4.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示。
4.2选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
4.3如果分离情况不好成链状生长时，应重新实验。
5、菌落数的报告。以CFU/g为单位报告。
5.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
5.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
实施例2、
选取3批双歧杆菌和乳杆菌组合产品，每批产品进行2次重复实验。同时使用GB4789.35-2016中规定的莫匹罗星锂盐改良MRS培养基加半胱氨酸盐酸盐(MRS+M+L)和实施例1所述的改良哥伦比亚琼脂培养基(RAF)进行检测，分别选择生理盐水和磷酸盐缓冲溶液作为稀释液。结果见表1。
表1检测双歧杆菌的结果
Figure BDA0001507838520000081
注：TNTC为太多无法计数；X为背景有很多细小透明菌落，多不可数
表1结果可见，在双歧杆菌的计数级别中(10-7)，MRS+M+L平板上有很多细小透明的菌落，直径<0.1mm，很难看清，要举高平皿对着光线才能看到(如图2)，且多不可数(TNTC)，该方法不能抑制产品中的瑞士乳杆菌，无法准确进行双歧杆菌计数。而实施例1所述的方法菌落生长大，最小菌落约0.3mm以上，容易判读(如图4)，特异性好，能准确检测双歧杆菌和乳杆菌组合中双歧杆菌的含量。
GB4789.35-2016中规定使用生理盐水，而本发明所述方法使用磷酸盐缓冲溶液。对比两种稀释液，使用磷酸盐缓冲溶液的检测结果高于生理盐水的检测结果。
此外，按照上述方法对瑞士乳杆菌原料进行检测，结果见表2。
表2检测瑞士乳杆菌原料的结果
Figure BDA0001507838520000091
注：TNTC为太多无法计数；X为背景有很多细小透明菌落，多不可数
结果显示，对于瑞士乳杆菌的检测，MRS+M+L在10-7和10-8级别均有菌落生长，而双歧杆菌和乳杆菌组合中的双歧杆菌的计数级别中瑞士乳杆菌的含量约是瑞士乳杆菌原料10-8级别的含量，约为2×103CFU。在该级别，RAF的平板计数为0，说明本发明所述方法对瑞士乳酸杆菌的有很好的抑制作用。

Claims (10)

1.一种检测双歧杆菌的培养基，其特征在于，由基础培养基、乳糖和半胱氨酸盐酸盐组成；其中，所述基础培养基由哥伦比亚血琼脂基础培养基、棉子糖、氯化锂、丙酸钠和水制成，pH 5.1。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基中各成分的用量为哥伦比亚血琼脂基础培养基38g/L、棉子糖0.5g/L-1g/L、氯化锂2.5-3.5g/L、丙酸钠4g/L-6g/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述乳糖的终浓度为3v/v％～7v/v％。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL～1000μg/mL。
5.权利要求1所述检测双歧杆菌的培养基的制备方法，其特征在于，分别制备基础培养基、乳糖储备液、半胱氨酸盐酸盐储备液，除菌后将乳糖储备液和半胱氨酸盐酸盐储备液加入冷却的基础培养基中混匀后倾倒平皿。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基的制备方法为分别取配方量的哥伦比亚血琼脂基础培养基、棉子糖、氯化锂、丙酸钠和水混匀，调pH值至5.1，高压蒸汽灭菌法除菌；所述乳糖储备液的制备方法为取乳糖加入水中混匀，微孔滤膜过滤除菌；所述半胱氨酸盐酸盐储备液制备方法为取半胱氨酸盐酸盐加入到水中，微孔滤膜过滤除菌。
7.一种检测双歧杆菌的方法，其特征在于，以权利要求1所述的培养基培养待测样品后计数。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法具体为待测样品用无菌磷酸盐缓冲溶液进行梯度稀释，然后选择2-3个连续的稀释度的待测样品菌液，分别吸取0.1mL涂布于权利要求1所述的培养基平板中，于36±1℃、厌氧培养72h±2h后计数平板上的所有菌落数。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的梯度稀释为无菌操作称取10g待测样品于无菌均质袋中，加入90ml无菌磷酸盐缓冲溶液，于8000r/min-10000r/min均质1min-2min，制成1:10待测样品菌液，无菌吸管吸取1:10待测样品菌液1ml，沿管壁缓慢注于装有9ml无菌磷酸盐缓冲溶液的试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的待测样品菌液；按上述操作顺序，做10倍递增的梯度稀释；所述的计数具体为记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数以菌落形成单位CFU表示，选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括报告菌落数的步骤，具体为以CFU/g为单位报告，菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数。
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