CN1880471A - 乳制品中双歧杆菌检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳制品中双歧杆菌的检测方法，在培养基中添加抗菌素抑制其他杂菌生长，从而选择性地检测双歧杆菌。本发明主要针对氯化锂、丙酸钠、双氯青霉素3种抗菌素进行研究，得到双歧杆菌选择性计数的最适抗菌素配比和用量。本发明所述方法具有准确、简便的特点。

Description

乳制品中双歧杆菌检测方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种奶粉或酸奶中双歧杆菌的检测方法。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacterium)是发现最早的生理性细菌之一，自从1899年被Tissier博士第一次分离得到，对双歧杆菌的研究日益受到各国学者的重视。双歧杆菌具有调节肠道菌群、降低胆固醇、抗肿瘤、调节免疫、合成维生素等一系列生理功能，对人体健康有着十分重要的意义，被誉为益生菌中的“佼佼者”，正因为双歧杆菌具有特殊的生理功能和保健作用，因此成为微生态保健食品常用的益生菌。

对双歧杆菌制品开发应用的研究，始于50年代中期，日本生物科学研究所首先研制出应用于婴幼儿的双歧杆菌制品。进入80年代，各国的各大公司及科研机构也都纷纷加入双歧杆菌制品的开发应用研究中，目前世界各先进国家都有双歧杆菌制品投放市场，中国虽然起步晚，但也有商家在尝试性推出此类产品。市场上双歧杆菌制品的种类繁多，按其功能可分为含双歧杆菌食品、含双歧杆菌或双歧杆菌生产促进物质的特殊保健食品和双歧杆菌药品等。双歧杆菌酸奶指以鲜牛奶为原料，添加双歧杆菌或内含双歧杆菌的混合菌种进行发酵培养而成的酸奶产品。

双歧杆菌具有的特殊生理功能和保健功能是众所周知的，在国外已开发的益生菌制品很多，而国内该类产品还未达到普及的程度，目前随着双歧杆菌乳制品种类和数量的不断增加，有关双歧制品的许多问题应该法规化、程序化，对双歧杆菌的摄取量、活菌数量和菌数检测方法仍没有明确的规定，尤其是混合发酵乳制品中双歧杆菌测定十分困难。

《GB/T 16347-1997》中只规定了乳酸菌活菌数的检测方法，2004年国家才发布了双歧杆菌检测方法《GB/T 4789.34-2003》，在这个标准中是采用非选择培养基计数，这种方法虽然可以实现双歧杆菌的活菌检测，但不具有很好的鉴别性，链球菌、乳杆菌和其他类型菌都会在其上生长增殖，计数时还需要进一步对菌落鉴定，加大了计数的工作量。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确、简便的双歧杆菌检测方法。发明人为了选择性地检测双歧杆菌，在培养基中添加抗菌素或其他试剂，使得培养基对其他杂菌有一定程度的抑制，而对双歧杆菌抑制作用很小。发明人通过正交实验得到了双歧杆菌选择性计数的最适抗菌素配比和用量，从而完成了本发明。

本发明提供了一种乳制品中双歧杆菌的检测方法，其特征在于，在检测培养基中添加抗菌素；其中检测培养基TPY培养基、BBL培养基、BL培养基或MRS培养基。

其中TPY培养基的配方为：

胰酶解酪朊        10g

大豆蛋白胨        5g

葡萄糖            5g

低聚果糖          5g

酵母粉            5g

吐温-80           1g

K₂HPO₄          2g

MgCl₂·6HO₂     0.5g

ZnSO₄·7HO₂     0.25g

FeCl₃            0.05g

CaCl₂             0.15g

西红柿汁           200mL

L-半胱氨酸盐酸     0.5g

蒸馏水             定容至1000mL

pH                 7.2±0.1

其中BBL培养基的配方为：

蛋白胨             15g

酵母粉             2g

葡萄糖             20g

可溶性淀粉         0.5g

氯化钠             5g

5％L-半胱氨酸盐酸  10ml

西红柿浸出液       400ml

肝浸液             80ml

吐温80             1ml

琼脂               20g

蒸馏水             定容至1000mL

PH                 7.0±0.1

其中BL培养基的配方为：

胰胨               5g

蛋白胨             5g

植物胨             3g

酵母粉             2g

葡萄糖             10g

可溶性淀粉         0.5g

牛肉膏             3g

吐温80             1.0ml

A液                10ml

B液                5ml

肝提取液           150ml

琼脂               20g

5％L-半胱氨酸盐酸  10ml

蒸馏水             定容至1000mL

PH                 7.2±0.1

其中A液：磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾10g定容至100ml；B液：硫酸镁10g、硫酸铁0.5g、氯化钠0.5g、硫酸锰0.337g定容至250ml。

本发明所述方法，其中抗菌素选自氯化锂、丙酸钠、双氯青霉素中的一种或多种；优选的抗菌素溶液配比量为每100ml液体培养基：

30％氯化锂         0.5-3.0ml

30％丙酸钠         1.0-5.0ml

10％双氯青霉素     0.1-1.0ml。

本发明所述方法详述如下：

1、主要设备

生化培养箱、厌氧培养箱、显微镜、无菌超净工作台；高压灭菌锅；干热灭菌箱；无菌注射器；无菌过滤器(孔径为0.45μm)等。

2、培养基和试剂

培养基：TPY培养基，115℃，15-20min灭菌；BBL培养基，115℃，15-20min灭菌。BL培养基115℃，15-20min灭菌。

稀释水为质量分数0.85％生理盐水：用于稀释待测样品。

3、抗菌素溶液

氯化锂：用无菌蒸馏水配制成质量分数30％溶液；

丙酸钠：用无菌蒸馏水配制成质量分数10％溶液；

双氯青霉素：用无菌蒸馏水配制成5×10^-6溶液。

抗菌素溶液配比量为每100ml液体培养基：30％氯化锂0.5-3.0ml、30％丙酸钠1.0-5.0ml、10％双氯青霉素0.1-1.0ml。

4、按GB/T 4789.34-2003双歧杆菌检测的操作步骤和菌种鉴定方法进行检测。

5、通过几批样品的检测，在该三种选择性培养基上厌氧培养后只有一种菌落生长即双歧杆菌菌落，得到的活菌数与实际含量非常接近，这说明此抗菌素配比可以最大程度抑制其他菌的生长同时对双歧杆菌生长的抑制很小。

双歧杆菌的测定要选择适合双歧杆菌生长的培养基，培养基又分为非选择性培养基和选择性培养基两种。可用于检测双歧杆菌的培养基有TPY、BBL、BL、MRS等，但上述培养基是非选择性的，为了选择性地检测双歧杆菌，要在培养基中添加抗菌素或其他试剂，这样可以对其他杂菌有一定程度的抑制。本研究主要针对氯化锂、丙酸钠、双氯青霉素3种抗菌素进行研究，通过正交实验得到双歧杆菌选择性计数的最适抗菌素配比和用量。

本发明所述的乳制品中双歧杆菌的检测方法，具有很好的鉴别性，链球菌、乳杆菌和其他类型菌都不会在其检测培养基上生长增殖，计数工作量大大降低，具有准确、简便的特点。

具体实施方式

实施例1：

待测样品：已知双歧杆菌活菌数(5×10¹¹cfu/g)的奶粉样品

样品的制备：将已知活菌数的双歧杆菌菌粉按一定比例与嗜酸乳杆菌菌粉干混均匀后，添加到奶粉中，待测。

按配方配制BL培养基：胰胨5g、蛋白胨5g、植物胨3g、酵母粉2g、葡萄糖10g、可溶性淀粉0.5g、牛肉膏3g、吐温80 1.0ml、A液10ml、B液5ml、肝提取液150ml、琼脂20g、5％L-半胱氨酸盐酸10ml、蒸馏水定容至1000mL。

其中A液：磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾10g定容至100ml；B液：硫酸镁10g、硫酸铁0.5g、氯化钠0.5g、硫酸锰0.337g定容至250ml。

调PH7.2±0.1；115℃，20min灭菌。A液B液20min灭菌。

于培养基中添加抗菌素，每100ml液体培养基：

30％氯化锂        0.5ml

30％丙酸钠        2.0ml

10％双氯青霉素    0.3ml。

按GB/T 4789.34-2003双歧杆菌检测的操作步骤和菌种鉴定方法进行检测。

结果：双歧杆菌活菌数为4.2×10¹¹cfu/g

实施例2：

待测样品：已知双歧杆菌活菌数(5×10¹¹cfu/g)的奶粉样品

样品的制备：将已知活菌数的双歧杆菌菌粉按一定比例与嗜热链球菌菌粉干混均匀后，添加到奶粉中，待测。

按配方配制BBL培养基：蛋白胨15g、酵母粉2g、葡萄糖20g、可溶性淀粉0.5g、氯化钠5g、5％L-半胱氨酸盐酸10ml、西红柿浸出液400ml、肝浸液80ml、吐温80 1ml、琼脂20g、蒸馏水定容至1000mL。调PH至7.1，115℃，15min灭菌。

于培养基中添加抗菌素，每100ml液体培养基：

30％氯化锂        1.0ml

30％丙酸钠        3.0ml

10％双氯青霉素    0.5ml。

按GB/T 4789.34-2003双歧杆菌检测的操作步骤和菌种鉴定方法进行检测。

结果：双歧杆菌活菌数为4.5×10¹¹cfu/g

实施例3：

待测样品：实验室制备的酸奶样品

按配方配制TPY培养基：胰酶解酪朊10g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐温-80 1g、K₂HPO₄ 2g、MgCl₂·6HO₂ 0.5g、ZnSO₄·7HO₂ 0.25g、FeCl₃ 0.05g、CaCl₂ 0.15g、西红柿汁200mL、L-半胱氨酸盐酸0.5g、定容至1000mL调pH＝7.2，115℃，15-20min灭菌。

于培养基中添加抗菌素，每100ml液体培养基：

30％氯化锂        1.5ml

30％丙酸钠        3.0ml

10％双氯青霉素    0.7ml

按GB/T 4789.34-2003双歧杆菌检测的操作步骤和菌种鉴定方法进行检测。

结果：双歧杆菌活菌数为2.6×10⁹cfu/g。

Claims (7)

1、乳制品中双歧杆菌检测方法，其特征在于，在检测培养基中添加抗菌素。

2、根据权利要求1所述方法，其中检测培养基选自TPY培养基、BBL培养基、BL培养基或MRS培养基。

3、根据权利要求2所述方法，其中TPY培养基的配方为：

胰酶解酪朊            10g

大豆蛋白胨            5g

葡萄糖                5g

低聚果糖              5g

酵母粉                5g

吐温-80               1g

K₂HPO₄              2g

MgCl₂·6HO₂         0.5g

ZnSO₄·7HO₂         0.25g

FeCl₃                0.05g

CaCl₂                0.15g

西红柿汁              200mL

L-半胱氨酸盐酸        0.5g

蒸馏水                定容至1000mL

pH                    7.2±0.1

4、根据权利要求2所述方法，其中BBL培养基的配方为：

蛋白胨                15g

酵母粉                2g

葡萄糖                20g

可溶性淀粉            0.5g

氯化钠                    5g

5％L-半胱氨酸盐酸         10ml

西红柿浸出液              400ml

肝浸液                    80ml

吐温80                    1ml

琼脂                      20g

蒸馏水                    定容至1000mL

pH                        7.0±0.1

5、根据权利要求2所述方法，其中BL培养基的配方为：

胰胨                      5g

蛋白胨                    5g

植物胨                    3g

酵母粉                    2g

葡萄糖                    10g

可溶性淀粉                0.5g

牛肉膏                    3g

吐温80                    1.0ml

A液                       10ml

B液                       5ml

肝提取液                  150ml

琼脂                      20g

5％L-半胱氨酸盐酸         10ml

蒸馏水                    定容至1000mL

PH                        7.2±0.1

其中A液：磷酸二氢钾10g、磷酸氢二钾10g定容100ml；B液：硫酸镁10g、硫酸铁0.5g、氯化钠0.5g、硫酸锰0.337g定容至250ml。

6、根据权利要求1所述方法，其中抗菌素选自氯化锂、丙酸钠、双氯青霉素中的一种或多种。

7、根据权利要求6所述方法，其中抗菌素溶液配比量每100ml液体培养基：

    30％氯化锂          0.5-3.0ml

    30％丙酸钠          1.0-5.0ml

    10％双氯青霉素      0.1-1.0ml。