CN104232515A - 一种动物双歧杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物双歧杆菌，其中，所述动物双歧杆菌属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9273。本发明还公开了所述的动物双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其中，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。本发明提供的动物双歧杆菌能够增加肠道中梭菌属Cluster I亚属产丁酸梭菌、双歧杆菌和乳杆菌中的至少一种有益菌的数量，并且能够降低肠道中拟杆菌和/或大肠杆菌的数量，因此可以有效的增加肠道内益生菌的数量，保证机体的健康。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)及其应用，具体地，涉及一种动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)，该动物双歧杆菌在调节肠道菌群以及在制备调节肠道菌群的药物和/或食品中的应用。
背景技术
人体肠道内的微生物中，超过99％都是细菌，存活着数量大约有100兆个，500-1000个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。
有益菌，也称之为益生菌，主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等。有害菌，数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能。中性菌，即具有双重作用的细菌，如大肠杆菌、肠球菌等，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。
人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因此，人体在正常情况下，菌群结构相对稳定，对宿主表现为不致病。有研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到70％，普通人则是25％，便秘人群减少到15％，而癌症病人肠道内的益生菌的比例只有10％。
因此，通过调节人体肠道菌群以使有益菌保持在较高的水平上，能够使人们更加健康的生活。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有调节肠道菌群功能的动物双歧杆菌。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种动物双歧杆菌，其中，所述动物双歧杆菌属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9273。
第二方面，本发明还提供了如上所述的动物双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其中，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。
本发明提供的动物双歧杆菌能够增加肠道中梭菌属Cluster I亚属产丁酸梭菌、双歧杆菌属和乳杆菌属中的至少一种有益菌的数量，并且能够降低肠道中拟杆菌和/或大肠杆菌的数量，因此可以有效的增加肠道内益生菌的数量，保证机体的健康。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，于2014年6月5日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9273。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种动物双歧杆菌，其中，所述动物双歧杆菌属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9273。
本发明的动物双歧杆菌分离自健康人群个体的粪便样品。
本发明提供的动物双歧杆菌经过培养能够产生大量动物双歧杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述动物双歧杆菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将所述动物双歧杆菌的菌株接种于双歧杆菌培养基中，并且在厌氧条件下，在15-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述双歧杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合双歧杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》(杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版)中所述的乳酸菌培养基(MRS)。
本发明可以进一步分离上述培养液中的动物双歧杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域技术人员公知的条件，本发明在此不再赘述。
第二方面，本发明还提供了如上所述的动物双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其中，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。
本发明的发明人发现，本发明提供的动物双歧杆菌在基本不改变肠道菌群总数量的情况下，能够有效地提高肠道中有益菌，例如，16S rRNA ClusterI亚属(产丁酸梭菌)、双歧杆菌属和乳杆菌属中的一种或多种的数量，降低肠道中有害菌，例如，拟杆菌的数量，还能够降低肠道中中性菌，例如，大肠杆菌的数量，而对于其它菌群，例如，奇异菌属、柔嫩梭菌群等的数量没有显著的影响。从而发现，本发明提供的动物双歧杆菌能够有效地调节肠道菌群，保证机体健康。
根据本发明，如上所述的，当因肠道菌群失调而导致机体疾病时，使用本发明的动物双歧杆菌进行该疾病的治疗并不在本发明的保护范围之内。
根据本发明，所述应用包括制备调节肠道菌群的药物和/或食品。
本发明中，所述食品可以是任意类型的食品，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食品也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述食品中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。另外，所述药物可以根据给药途径的不同而制备成不同的形式，例如，可以制备成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等形式，所述药物中还可以包括药学上可接受的佐剂，本领域技术人员能够根据不同的剂型选择不同的佐剂，本发明在此不再详细赘述。
根据本发明，在所述药物和/或食品中含有如上所述动物双歧杆菌的活菌体和/或死菌体作为活性成分。优选地，含有所述动物双歧杆菌的活菌体或者活菌体和死菌体的混合菌体作为活性成分。当使用活菌体或死菌体的混合菌体作为活性成分时，活菌体的数量优选高于死菌体的数量。
根据本发明，尽管将动物双歧杆菌添加到所述药物和/或食品中，并对个体进行给药，即可实现本发明的目的，即起到调节肠道菌群的作用，但优选情况下，以每克所述药物和/或食品为基准，所述动物双歧杆菌的含量为106-1011CFU，优选为108-1010CFU。
CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量，可以通过平板菌落计数法获得。本发明中，当双歧杆菌的死菌体的浓度以CFU/ml表示时，是指双歧杆菌的活菌体死亡后得到相应数量的死菌体，并将其溶于缓冲液中配制成所需浓度。
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
在下述制备例、实施例和对比例中：
(1)动物双歧杆菌(以下简称A6)为本发明的动物双歧杆菌(该菌株于2014年6月5日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9273)。
(2)DNA回收试剂盒，购自Zemo公司；SYBR Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒(货号RR420A)购自Takara公司；RNAlater购自上海浩然生物公司；
雄性Wistar大鼠44只，体重230±10g，购自北京维通利华有限公司。无菌垫料购自中国军事科学医学院，实验动物饲养于中国农业大学农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)动物实验室，动物房温度20±2℃，湿度40-50％，12h光照交替。实验大鼠按照每笼5只饲养，自由摄入饲料，自由饮水，适应性饲养1周；将经过适应期的大鼠按照体重随机分为5组，每组11只，重新分组的过程中遵循就近调换的原则；
无双歧杆菌大鼠饲料购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲喂前经辐射灭菌。
(3)琼脂糖凝胶电泳缓冲液50倍TAE：称取242g Tris加入57.1mL冰醋酸，100mL 0.5M EDTA，调节pH＝8.0，用超纯水定容到1L。
(4)厌氧稀释液：称取Na2HPO4·12H2O 6.0g，KH2PO44.5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，吐温-800.5g加入800mL去离子水，充分搅拌，调pH到7.4，再加去离子水定容到1L。
以下所用的试剂、培养基组成以及实验学方法等在没有特别说明的情况下，均为本领域常规使用的试剂、培养基组成以及实验学方法。
制备例
本制备例用于说明本发明的动物双歧杆菌A6的配制
菌种以1体积％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，培养液于6000g离心15min，弃上清液，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤1次，相同转速和时间离心，用无菌生理盐水稀释进行梯度稀释，取10-6、10-7和10-8三个梯度各1mL进行平板培养，37℃厌氧培养48h后进行菌落计数后，最终配制成1×106、1×108和1×1010CFU/mL的菌悬液，现配现用。本领域技术人员能够理解的是，该制备的菌悬液中是包括一定数量的双歧杆菌的死菌体的。
实施例1-3
用于说明本发明的动物双歧杆菌A6的调节肠道菌群的效果
(1)实验动物的分组与剂量设置
选取如上的3组动物，分别记为：低剂量组(L)、中剂量组(M)、高剂量组(H)。各组的灌胃剂量分别为106CFU/kg大鼠体重(实施例1)、108CFU/kg大鼠体重(实施例2)和1010CFU/kg大鼠体重(实施例3)。将双歧杆菌A6菌体培养液，每天定时按照5mL/kg体重以灌胃的方式按照各自的剂量喂给大鼠，同时将6g日常饲料碾碎以灌胃方式喂给大鼠，灌胃期为9天。灌胃期间大鼠自由摄食、饮水，每天监测体重和摄食量。
(2)肠道中细菌基因组DNA样品收集
在灌胃动物双歧杆菌A6前和灌胃9天后，用装有无菌玻璃珠和3mL厌氧稀释液的离心管收集大鼠的新鲜粪便0.5g，用漩涡振荡器(型号MS2，购自德国IKA公司)均质完全后采用酚仿法提取粪便中的细菌基因组DNA。用1％的琼脂糖进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果显示，所有粪便样品中细菌组DNA均成功提出，且无明显降解现象。
(3)粪便中肠道菌群含量的测定
使用表1中的特异性引物分别对步骤(2)中获得的粪便样品细菌组DNA进行实时定量PCR实验(实时定量PCR的反应体系：1μL的粪便基因组DNA，0.4μL的10μM上下游引物，10μL的SYBR Premix Ex Taq，0.4μL的ROX，7.8μL的无菌水；反应程序如下：预变性(95℃反应30s)，变性(95℃反应5s)，退火(表1中的退火温度反应30s)，延伸(72℃反应30s)，PCR反应40-45个循环)，将PCR扩增产物进行浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳，用无菌手术刀将单一的目标条带切下，放入干净的5mL离心管中，使用Zemo胶回收试剂盒并按照其说明书进行DNA回收。
切胶回收的标准DNA模板利用Qubit Assays测定各自的DNA浓度后，10倍稀释8个梯度作为定量PCR的标准样品。
按照以上所述的定量PCR反应体系和条件，分别以各自的表1中的特异性引物进行定量PCR反应，以各梯度稀释液中DNA的拷贝数浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，制作表1中不同目标细菌组的标准曲线。计算引物的扩增效率，公式为：扩增效率＝10-(1/斜率)-1。同时，以同样的PCR体系和条件对和对比例1和2，以及实施例的高中低三个剂量组的小鼠粪便样品基因组DNA进行PCR反应，得到Ct值。通过标准曲线，获得样品中该菌群的拷贝数浓度，根据取样时粪便的质量，换算成每克粪便样品中含有该菌群的拷贝数对数(lgDNA拷贝数/克粪便)，结果如表2所示。
表1
对比例1
按照实施例的方法测定对照组(C1)的大鼠粪便中肠道菌群的含量，其中，对照组大鼠灌胃给与实验组相同体积的生理盐水。测定结果见表2。
对比例2
按照实施例的方法测定对照组(C2)的大鼠粪便中肠道菌群的含量，其中，对照组大鼠灌胃给与实验组相同体积的1×108CFU/mL的动物双歧杆菌BB536(Ocón B,Anzola A,Ortega-González M,et al.Active hexose-correlatedcompound and Bifidobacterium longum BB536exert symbiotic effects inexperimental colitis[J].European journal of nutrition,2013,52(2):457-466.)的菌悬液。测定结果见表2。
表2
A-B：相同处理组随着时间变化其菌数的显著性差异(p<0.05)；a-c：同一时间不同处理组之间菌数的显著性差异(p<0.05)
如上表所示，饲喂本发明的动物双歧杆菌A69天后，对照组C1，C2和实验中大鼠粪便中的总菌数量未出现显著差异。相比于对照组C1，饲喂C2和低，中，高三个剂量的动物双歧杆菌A6后，大鼠粪便中的双歧杆菌数量均出现显著性上升；但是饲喂高，中剂量A6的实验组，其双歧杆菌数量显著高于低剂量A6处理组和C2对照组，低剂量A6处理组和C2对照组又显著性高于C1对照组。肠道中过量的拟杆菌属和大肠杆菌属被报道与结肠炎等肠道疾病相关，本实验中，饲喂中剂量和高剂量A6实验组的大鼠粪便中的拟杆菌含量出现显著性下降，并且显著低于其他处理组；大肠杆菌属的检测中发现，各处理组的大鼠粪便中大肠杆菌的数量均出现下降趋势，但是只有高，中剂量A6处理组出现显著性差异。此外，经过9天饲喂后，三种剂量实验组的大鼠粪便中的乳杆菌数量均出现显著性上升，并显著高于对照组C1和C2。特别的，相较对照组C2，饲喂中剂量组和高剂量组的动物双歧杆菌A6后，大鼠粪便中的梭菌属Cluster I出现显著性上升。梭菌属ClusterI亚属中主要含有产丁酸梭菌，而丁酸被报道对于溃疡性结肠炎和结肠癌都有很好的抑制效果。上述结果表明，相对于对照组C1，本发明的动物双歧杆菌可以有效提高肠道中双歧杆菌属和乳杆菌属等有益菌的数量，并且降低大肠杆菌属和拟杆菌属的数量。相较于对照组C2，高，中剂量A6实验组对肠道菌群的具有更加有效的调节能力。由此可以说明，本发明的动物双歧杆菌A6能够有效地调节肠道菌群，使有益菌保持在较高的水平。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物双歧杆菌属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9273。
2.权利要求1所述的动物双歧杆菌在调节肠道菌群中的应用，其中，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述调节肠道菌群包括降低肠道中拟杆菌和/或大肠杆菌的数量，和/或增加肠道中梭菌属Cluster I亚属产丁酸梭菌、双歧杆菌和乳杆菌中的一种或多种的数量。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其中，所述应用包括制备调节肠道菌群的药物和/或食品。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述药物和/或食品含有所述动物双歧杆菌的活菌体和/或死菌体作为活性成分。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其中，以每克所述药物和/或食品为基准，所述动物双歧杆菌的含量为106-1011CFU。
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