CN103491969A - 恢复和重建肠道微生物群的合生素组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合生素组合物，其包含益生菌细菌菌株和益生素物质，当其组合时呈现协同作用。所述合生素组合物在抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致其它肠道感染及其复发后刺激固有微生物群落恢复和重建体内肠道样状况，以及预防所述疾病。

Description

恢复和重建肠道微生物群的合生素组合物
发明技术领域
本发明涉及合生素(synbiotic)组合物，其包含益生菌细菌菌株和益生素物质，当它们组合时展示协同行为。所述协同组合物刺激固有微生物群落(indigenous microflora)在抗生素相关腹泻(AAD)和/或由胃肠道病原体导致的其它肠道疾病及其复发之后恢复和重建体内肠道样条件，以及预防所述疾病。
发明背景
肠道微生物群(microbiota)组成了真正的“体外器官”，其具有对于身体内在代谢和各种免疫功能的重要作用。这个“器官”履行独特消化功能，所述功能不能由无细菌动物的胃肠道(GI)简单完成。但是，GI和微生物群形成在细菌物种和宿主之间的复杂代谢沟通(cross talk)。
正常情况下肠粘膜层保护上皮免于被病原体侵袭和建群，并且作为其中上皮产生的抗微生物因子及正常肠道微生物群的菌株一起建群的基质。这个粘膜层组成缓冲区，其实现微生物群的腔室分区并且建立交流通道用于通过细菌菌株和肠道上皮之间的沟通以交换分子(Sansonetti,MucosalImmunol,2011,4:8-14)。
人类和动物医药中增加的抗生素应用现今导致肠道中抗生素抗性菌株的严重增加，这些菌株例如耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococci)(MRSA和MRSE)、产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(ESBL)、万古霉素抗性肠球菌(Enterococcus spp)(VRE)、克拉霉素抗性幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、万古霉素抗性艰难梭菌(Clostridum difficile)(CD)、喹诺酮抗性空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)及假丝酵母(Candida)物种的各种菌株。
CD在固有正常肠道菌群中数量小，但是破坏固有人类肠道微生物菌群的广谱抗生素如克林霉素、头孢菌素和氟喹诺酮会导致产生毒素的CD的肠道过度生长，杀死粘膜中的肠细胞，并且引起腹泻，其严重情况下导致具有高死亡率的假膜性结肠炎。流行性CD菌株NAP1/027比目前分离的医院菌株产生实质上更多的毒素A和毒素B，并且是高度毒性的。
肠道微生物群是复杂的生态系统，与宿主共生。肠道双歧杆菌(Bif)物种具有非常大量的基因以代谢结肠中的碳水化合物，而乳杆菌是小肠中的主要乳酸细菌(LAB)。
益生素发酵产生短链脂肪酸(SCFA)，如乙酸、丁酸和乳酸，其降低结肠局部pH。此外，益生素和食物纤维帮助LAB和双歧杆菌增殖以产生高细胞密度及通过产生杀细菌物质、抗氧化剂、降低粘膜炎症、维持结肠粘膜完整性及促进强宿主抗炎症应答而预防上文所述肠道病原体生长。竞争排斥是对抗入侵的病原体的抗微生物防御作用的另一模式。
目前使用益生菌和益生素的术语通常是涉及互补合生素概念，其中益生菌的选择基于宿主所需的特定的有益作用，选择益生素刺激固有微生物群落的生长。然而，本发明使用新的协同概念的方法，其中选择益生素刺激对宿主具有特定有益作用的益生菌的生长。其也可以增加有益的宿主GI微生物群水平，但是主要目标是摄入的益生菌的生长。共培养刺激组合物中的对益生寡糖及人肠道中其它不可消化的碳水化合物利用不良的其它成分。
发明概述
本发明第一方面涉及合生素组合物，其包含选自乳杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacteria)属的至少两种细菌菌株，及一或多种益生素物质，特征在于：
-所述细菌菌株中的至少一种能降解淀粉；及
-至少一种益生素物质是淀粉。
有利地，所述能降解淀粉的细菌菌株属于双歧杆菌属，或者属于短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)物种如Bif LU10。
有利地，所述淀粉是抗性淀粉(RS)和/或可溶淀粉(SS)。
有利地，所述细菌菌株之一是非淀粉降解菌株，或者属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)物种如LAB LU33。
有利地，所述合生素组合物包含至少Bif LU10，及菌株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多种，或者包含至少Bif LU10和LAB LU33，或者包含至少BIF LU10、LAB LU33和BIF LU30，或者包含至少BIF LU10、LAB LU33、BIF LU30和LAB LU28。
有利地，所述一或多种细菌菌株在其产生期间已经暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白，由此暴露于酸包括在细菌菌株生长期间使培养液的pH降低至pH2-5，优选降低至pH2.5-4.5，更优选降低至pH3-4，持续15-150分钟，优选持续20-140分钟，更优选持续30-130分钟，更优选持续40-120分钟，而暴露于胆汁包括使细菌菌株在存在0.1-2.5%(重量/体积)、优选0.5-2%、更优选1.0-1.5%牛磺胆酸钠或者1-10%(体积/体积)、优选2-7%、更优选3-5%猪胆汁的条件下生长2-8小时，优选2.5-7小时，更优选3-6小时，而暴露于粘蛋白包括使细菌菌株在存在0.01-1%(体积/体积)、优选0.03-0.7%、更优选0.05-0.5%粘蛋白的条件下生长2-8小时，优选2.5-7小时，更优选3-6小时。
有利地，所述合生素组合物进一步包含属于由二糖、寡糖和/或多糖组成的组的益生素物质，其中所述二糖是乳果糖，所述寡糖来自由寡聚果糖(FOS)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖(chioses)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、阿拉伯树胶、大豆寡糖和果胶寡糖组成的组，所述多糖来自由果胶、木聚糖、菊粉、壳聚糖和/或β-葡聚糖组成的组。
有利地，所述合生素组合物进一步包含属于由寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖组成的组的益生素物质。
有利地，所述合生素组合物进一步包含寡聚半乳糖(GOS)和/或异麦芽糖寡糖(IMOS)。
上述合生素组合物有利地用于对象的肠道粘膜建群，及预防、治疗、减轻对象中抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状和/或预防其复发。
所述抗生素相关腹泻(AAD)是由艰难梭菌(Clostridium difficile)引起的。
所述胃肠道病原体所致感染是由沙门氏菌属(Salmonella)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum BetaLactamase producing,ESBL)大肠杆菌引起的。
有利地，所述对象是哺乳动物，如属于由人、非人灵长类动物、牛、绵羊、猪、山羊和马、狗、猫、啮齿动物和豚鼠组成的组的哺乳动物。优选所述对象是人。
上述合生素组合物可用于制备药物，所述药物用于在对象肠粘膜建群以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状及预防其复发。
上述合生素组合物可用于制备用于治疗患有抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的对象的药物。
上述合生素组合物可用于在对象肠粘膜建群的方法中，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的所述合生素组合物的步骤。
上述合生素组合物可用于治疗对象的抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的方法中，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的所述合生素组合物的步骤。
定义
本发明中使用的术语遵循微生物学和生物化学领域技术人员接受的标准定义。如下文列出的少数例外在本发明范围内进一步定义。
如本文所用，术语“二糖”是当两个单糖经历缩合反应形成的碳水化合物，所述缩合反应包括仅从官能团中消除小分子，如水。
如本文所用，术语“寡糖”是指含有少数目(通常2-10个)糖(单糖)的糖聚合物。
如本文所用，术语“多糖”是聚合的碳水化合物结构，由重复单元(单糖或二糖)通过糖苷键结合在一起而形成。这些结构通常是线性的，但是可含有不同程度的分支。
如本文所用，术语“淀粉”是由通过糖苷键结合在一起的大量葡萄糖单元组成的碳水化合物。该多糖由所有绿色植物作为能量贮存产生。其由两种类型分子组成：线性和螺旋直链淀粉及分支的支链淀粉。根据植物不同，淀粉通常含有20-25%直链淀粉和75-80%支链淀粉。术语淀粉包括但不限于可溶淀粉(SS)、抗性淀粉(RS)，来自谷物(水稻、小麦和玉米)、根类蔬菜(马铃薯和木薯)、橡子、竹芋、秘鲁胡萝卜、香蕉、大麦、面包果、荞麦、美人蕉、可乐果、katakuri、野葛、暗绿叶黄体芋、小米、燕麦、oca、波利尼西亚竹芋、西米、高粱、甘薯、黑麦、芋头、栗子、荸荠和山药、豆类如蚕豆、小扁豆、绿豆、豌豆及鹰嘴豆。
如本文所用，术语“益生菌(probiotics)”是指当以足够量消耗时赋予健康益处的细菌。
如本文所用，术语“益生素(prebiotics)”是指不可消化的食物成分物质，其以有益于健康的方式刺激消化系统中细菌的生长和/或活性。
如本文所用，术语“合生素(synbiotics)”是指以协同作用形式组合益生菌和益生素的营养补剂或药物。合生素组合物刺激组合物中存在的及固有微生物群落中的益生菌菌株的生长，在体内呈现出协同作用。
如本文所用，术语“对象”是指任何活的生物体如动物或人，其需要治疗或者易感于涉及不需要的或不希望的微生物的病症，例如需要特别治疗具有如下文定义的不需要的胃肠道病原体。术语对象包括但不限于人，非人灵长类动物和猴物种，农场动物如猪、山羊和马，驯养哺乳动物如狗和猫，实验室动物包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠。该术语不指示特定年龄或性别。因此，成年和新生对象，无论雄性或雌性，均可包含在内。在优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。在最优选的实施方案中，所述对象是人。如本文所用，术语“致病性”是指具有导致疾病的能力的物质或条件。
如本文所用，术语“胃肠道病原体”或“肠病原体”包括对胃肠道(从食管至直肠)具有致病性的微生物。其包括肠细菌(enterobacteria)、肠球菌(enterococci)、棒杆菌(corynebacteria)、鸟分枝杆菌副结核菌亚种(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis)、Brachyspirahyodysenteriae、细胞内散沫花属(Lawsonia intracellularis)、弯曲菌属(campylobacter)、梭状芽孢杆菌。胃肠道致病菌可包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、空肠弯曲菌、梭状芽胞杆菌属、大肠杆菌、耶尔森氏菌属(Yersinia)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等。
如本文所用，术语“细菌素”或“细菌素样物质”是由细菌产生的蛋白质毒素，抑制相似或密切相关的细菌菌株的生长。
如本文所用，术语“治疗”包括尝试预防、补救、减轻对象健康问题及预防其复发，通常是在诊断之后进行。
附图简述
图1是胃肠道样转运模拟器(GITS)的算法。
图2是在胃肠道样转运模拟(GITS)期间通过qPCR确定的细菌计数。
图3是在小鼠模型中用合生素、益生菌和益生素混合物预防CDI的实验设计。
图4是一组内所有动物的集合的盲肠内容物的盲肠计数。
图5是动物盲肠组织的组织病理学图。
图6是合生素组和对照组中盲肠LAB和双歧杆菌的qPCR结果。
发明详述
本发明涉及合生素组合物，其包含乳杆菌(LAB)和/或双歧杆菌(Bif)属的至少两种益生菌菌株，以及一或多种益生素物质。所述组合物中存在的至少一种细菌菌株应具有降解淀粉的能力，并且至少一种益生素物质应是淀粉。所述细菌菌株应具有附着于肠道及抑制由艰难梭菌产生的毒素A和B的能力，但是不抑制彼此生长。此外，所述组合物中存在的至少一或多种益生素物质应增强益生菌菌株的生长，但是不增强胃肠道病原体的生长。本发明的合生素组合物有利地用于在对象的肠道粘膜建群，以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或由胃肠道病原体所致感染的症状，及预防其复发。
在目前的研究中，针对其有益性质如附着于肠粘膜层、抗艰难梭菌(CD)和/或其它肠道病原体的抗微生物活性、降解益生素物质及产生抗氧化剂等，已经筛选和表征了超过75种不同的乳杆菌和双歧杆菌益生菌菌株。令人惊奇地，结果是这些性质是非常菌株特异性的，并不是对于一个属的所有菌株均是普遍的。
乳杆菌属于包含超过100种不同乳杆菌物种的一组(微需氧的)细菌，其在生长期间产生乳酸。它们组成正常阴道菌群和新生儿肠道菌群的主要部分，但是也组成成人正常菌群的一部分。乳杆菌能在低pH生长，且耐受生长培养基中>20%胆汁。乳酸的产生使其环境变为酸性，这样抑制一些有害菌的生长。嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌(L.plantarium)、干酪乳杆菌(L.casei)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、双叉乳杆菌(L.bifidus)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)是乳杆菌属的一些重要物种，其可用于本发明组合物中。
双歧杆菌属于厌氧菌类群，其在新生儿肠道中建群，随着年龄增加而逐渐降低。在生长期间其发挥有益作用，包括调节肠道微生物内稳态、抑制病原体和有害菌建群和/或感染肠粘膜、调节局部和全身免疫应答、阻抑微生物群内促致癌(pro-carcinogenic)酶活性、产生维生素、及将许多饮食化合物生物转化为生物活性分子。长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、动物双歧杆菌(B.animalis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)是双歧杆菌属举例的物种，其可用于本发明组合物中。
在最初的筛选后，基于如上述有益性质从超过75种益生菌菌株中最终选择6种菌株(即LAB LU28，LAB LU33，Bif LU10，Bif LU29和Bif LU30)。之后对选择的菌株针对其在彼此存在的条件下-即共培养期间-的存活和增殖能力以及呈现抗微生物活性(AMA)进行检测。所有选择的乳杆菌和双歧杆菌在共培养期间均存活良好，且不产生针对彼此的细菌素样物质。
对选择的菌株针对在彼此共培养时对益生素如寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)、乳果糖、阿拉伯树胶、β-葡聚糖、木聚糖、果胶、菊粉和/或可溶的及抗性淀粉的利用也进行了研究。选择的益生菌菌株的共培养根据其在不同的益生素组合中的益生素降解能力刺激特定的细菌菌株生长。令人惊奇地，非淀粉降解菌株与淀粉降解菌株在存在淀粉作为唯一可利用益生素物质的条件下的共培养，刺激非淀粉降解菌株的生长。这种组合物抗CD及其它肠道病原体的AMA被保持。这表明交叉喂养(cross-feeding)的新概念，证实本发明组合物的菌株之间呈现的协同作用。当开发最佳组合物用于在对象肠粘膜建群以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状及预防其复发中使用这个概念。
来自两或更多种所选择的菌株与不同组合的益生素共培养的无细胞上清(CFS)呈现出抗病原体ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌2167和NAP1/027的AMA。令人惊奇地，当CFS提取物稀释直至1:500时仍保持抗一些病原体及稀释1:10时抗其它病原体的AMA，该活性显著高于单独培养生长的菌株的活性。这明确示出选择的菌株呈现出彼此协同作用，导致对抗病原体的较高AMA。此外，选择的菌株与CD的混合物的共培养降低CD的生长，由CD对毒素A和B的产生由于选择的益生菌的存在而被强烈抑制。
在所述组合物中，有利但非必需地要求一或多种细菌菌株在细菌菌株的生产期间已经暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白。酸和/或胆汁暴露诱导细菌中应激反应，其增强在通过胃肠道转运期间的存活能力及在肠道粘膜层建群的能力，在此其产生抗微生物活性(AMA)使得所述菌株发挥有益作用。
暴露于酸包括使培养液的pH降低，其中一或多种细菌菌株在MRS培养基中在pH2-5、优选pH2.5-4.5、更优选pH3-4条件下生长15-150分钟、优选20-140分钟、更优选30-130分钟、更优选40-120分钟。暴露于胆汁可包括在细菌菌株生产期间在培养液中加入0.1-2.5%(重量/体积)、优选0.5-2%、更优选1.0-1.5%牛磺胆酸钠或者1-10%(体积/体积)、优选2-7%、更优选3-10%猪胆汁，持续2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3-6小时。暴露于粘蛋白包括在细菌菌株生产期间使细菌菌株在存在0.01-1%(体积/体积)、优选0.03-0.7%、更优选0.05-0.5%粘蛋白条件下生长2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3-6小时。
通常将细菌在对于生长“正好”最佳的培养基中培养。在生长期间暴露于酸、胆汁或者粘蛋白对于细菌是应激刺激。作为防御反应，应激基因被诱导，其随之诱导热激蛋白(HSP)及其它应激蛋白产生，由此使得细菌更强壮(robust)。暴露于酸和胆汁应激模拟胃肠道的条件。选择的菌株与益生素的组合物的稳定性、强壮性和协同作用在胃肠道模拟器(GITS)模型以及在体内小鼠模型中证实。
基于共培养、共喂养、抗CD和肠道病原体的AMA、毒素抑制活性、耐受暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白的能力以及体外模拟(GITS模型)和体内小鼠模型，选择本发明组合物的最佳成分。本发明的组合物包含乳杆菌(LAB)和/或双歧杆菌(Bif)的至少两种益生菌菌株及一或多种益生素物质。此外，所述组合物中存在的至少一种细菌菌株具有降解淀粉的能力，并且至少一种益生素物质是淀粉。
有利地，能降解淀粉的细菌菌株属于双歧杆菌属，如短双歧杆菌物种或者更特别是Bif LU10菌株。本发明的淀粉降解菌株能降解淀粉如可溶淀粉(即在肠道中可降解的淀粉)，和/或抗性淀粉(即在肠道中不可降解的淀粉)。有利地，本发明的合生素组合物进一步包含非淀粉降解菌株，其是副干酪乳杆菌物种如LAB LU33。
因此，本发明的有利的组合物包含至少Bif LU10，和菌株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多种。另一有利的组合物包含至少Bif LU10和LAB LU33，或者包含至少BIF LU10、LAB LU33和BIF LU30。再一有利的组合物包含至少BIF LU10、LAB LU33、BIF LU30和LAB LU28。所述组合物的益处在下文论述。
本发明的合生素组合物除了淀粉之外还可进一步包含益生素物质，包括二糖，寡糖和/或多糖。所述二糖可以是乳果糖。所述寡糖可以是寡聚果糖(FOS)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖(chioses)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、阿拉伯树胶、大豆和果胶寡糖。所述多糖可以是果胶、木聚糖、菊粉、壳聚糖、阿拉伯木聚糖和/或β-葡聚糖。
优选地，除了淀粉之外的至少一或多种进一步的益生素物质是寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖。
因此，本发明的组合物可例如包含如上述两或更多种细菌菌株，淀粉及一或多种进一步的益生素物质，包括寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖。
本发明的组合物可有利地用于在对象的肠粘膜建群。如本文所用，术语“对象”是指需要治疗或者易感于涉及不想要的或不希望的胃肠道微生物感染的病症，例如需要特别治疗具有如上述不想要的病原性胃肠道感染。在优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。当所述对象是人时其应用特别有益处。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物用于预防、治疗、减轻艰难梭菌相关腹泻(CDAD)和/或胃肠道(GI)病原体所致感染的症状和/或预防其复发。如本文所用，术语“胃肠道病原体”是指可以在对象中导致感染的病毒、寄生虫和细菌，例如当所述对象是哺乳动物如人时。胃肠道致病性细菌可包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、空肠弯曲菌、梭状芽胞杆菌属、大肠杆菌、耶尔森氏菌属、霍乱弧菌及其它菌属细菌。
有利地，所述组合物可用于预防、治疗、减轻由不同毒力和核糖体分型(ribotype)的艰难梭菌菌株引起的抗生素相关腹泻(AAD)的症状，和/或预防其复发。艰难梭菌是梭状芽胞杆菌属的一种厌氧种，其以较低计数组成正常肠道菌群的一部分。艰难梭菌是抗生素相关腹泻(AAD)的最严重的致病菌，可导致假膜性结肠炎，这是一种结肠的严重感染，通常由于抗生素对正常肠道菌群的摧毁。在生长期间，艰难梭菌产生及分泌毒力因子，例如毒素A和B。毒素A对于所有细胞均是毒性的，而毒素B对于肠细胞是毒性的，其损害该细胞并诱导分泌(腹泻)。本发明的组合物可用于预防、治疗、减轻由选自核糖体分型CD NAP1/027、CD1939、CD2167、CD1958、CD2165、CD2166、CD2168、CD027和CD1551的艰难梭菌菌株引起的抗生素相关腹泻(AAD)的症状，及预防其复发。
本发明另一方面提供了上述组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在对象肠粘膜建群，并用于预防、治疗、减轻所述对象中抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体感染的症状及预防其复发。
本发明另一方面提供了上述组合物在制备用于治疗患有抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体感染的对象的药物中的应用。
本发明另一方面提供了上述组合物在制备用于预防抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体导致感染的复发的药物中的应用。
本发明组合物中的益生素物质和益生菌菌株可以通过标准方法在任何纯度水平分离，纯化可以通过本领域技术人员已知的常规方式实现，如蒸馏、再结晶和层析。
用于本发明组合物中的培养的细菌细胞可通过使用任何方法从培养液中分离，包括但不限于离心、过滤或倾析。分离自发酵培养液的细胞任选用水、盐水(0.9%NaCl)或者用任何合适的缓冲液洗涤。获得的湿细胞物质可以通过任何合适方法干燥，优选通过冻干法。
本发明组合物中的益生素物质和益生菌可以单独施用或者与药物学可接受的载体或稀释剂一起施用，这种施用可以单一剂量或多剂量进行。
在本发明的组合物中，益生素成分以基于所述组合物总重量的5%-99%、优选30%-95%、更优选50%-90%的量(重量)存在。相应地，益生菌成分以基于所述组合物总重量的1%-15%、优选5%-10%的量(重量)存在。如果存在，补足所述合生素组合物100%量的部分由另外的物质如佐剂和/或赋形剂或者适当的添加剂/载体组成。
在药物组合物(例如片剂)中，本发明的组合物组成基于所述药物组合物总重量的40-70%，剩余部分是药物学可接受的佐剂和/或赋形剂。
在食物组合物(例如奶酪或巧克力)中，所述合生素组合物组成所述食物组合物总重量的1-15%。
在优选的实施方案中，所述合生素组合物含有的细菌菌株的量相对于所述合生素组合物重量为1x108至1x1013CFU/g，优选1x109至1x1011CFU/g。
组合物可例如是片剂、丸剂囊剂、小瓶、硬胶囊或软胶囊、水性或油性悬浮液、水性或油性溶液、乳状液、粉末、颗粒、糖浆、酏剂、锭剂、可重建的粉末、液体制备物、霜剂、含片、硬糖、喷雾剂、乳霜、膏剂、胶状物、凝胶、糊剂、注射溶液、液体气雾剂、干粉配制物、HFA气雾剂或者有机酸或无机酸加成盐。
本发明的组合物可以是适于通过口服或者通过吸入或吹入(如经鼻、气管、支气管)途径施用的形式。
对于口服、口腔或舌下粘膜施用，本发明的益生素和益生菌可以与多种赋形剂组合。口服施用的液体组合物可以是例如乳状液、糖浆或酏剂形式，或者可以是干燥产物形式，在使用之前用水或其它合适载体重建。其它合适的充填剂、结合剂、崩解剂、润滑剂及其它赋形剂为本领域技术人员熟知。
本发明还涉及上文定义的组合物，其中所述组合物是食物组合物、食物补充剂、营养食品组合物、药物组合物和动物饲料的至少之一或一部分。
本发明另一方面提供了在对象中在肠粘膜建群及预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状以及预防其复发的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的上述组合物的步骤。根据治疗的病症和患者以及施用途径的不同，所述组合物可以不同剂量施用。在一个优选的实施方案中，所述组合物含有1x107至1x1013CFU/剂和细菌菌株，优选1x109至1x1011CFU/剂和细菌菌株。
通过实验例证本发明的有利之处。然而，下文所述实验只是举例说明本发明，不应限制本发明。本发明权利要求书范围内的其它方案、应用、目的和功能应为本领域技术人员显而易见。
选择本发明组合物的菌株的原理
从使用的菌株库中选择最有希望的菌株的主要选择标准是对抗肠道病原体包括艰难梭菌的抗微生物活性(AMA)，及附着于肠壁的能力，其通过刚果红结合(CRB)和盐聚集试验(SAT)测量。接下来的标准是对至少一种或一种以上的益生素物质的发酵。所测试的菌株的筛选结果在表1中示出。
细胞表面疏水性(CSH)是微生物在肠道内结合及相互作用以及在粘膜层中与病原体抗争的重要性质。CSH基于如下所述CRB和SAT测定确定。CRB是通过将经洗涤的细胞与刚果红(于PBS中100μg/ml)一起保温10分钟，随后离心(9,000g×30分钟)而进行。通过测量在480nm的吸光度上清中剩余的刚果红确定。在磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2，0.015M)中的刚果红用作对照。CRB表示为结合的刚果红的百分比。因此结果越接近于100则细胞表面疏水性越高。CSH通过盐聚集试验(SAT)确定。10微升在PBS中的经洗涤的细胞悬液在玻片上与范围为0.02M至4M的各种摩尔浓度的10微升pH6.8硫酸铵混合。一分钟后观察聚集。SAT结果表示为菌株聚集的最低盐浓度(M)。聚集所需盐浓度越低意味着细胞表面疏水性越高。
潜在益生菌株的AMA使用如下微滴定平板(MTP)针对肠道病原体ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和4种不同艰难梭菌而确定：通过离心(3,200g,20min,4℃)从在MRS(De Man Rogosa Sharpe)和MRSC(含有0.05%(w/v)盐酸L-半胱氨酸的MRS)培养液中生长的乳杆菌和双歧杆菌24小时培养物收获无细胞上清培养物(CFS)滤液，所述上清用0.2微米过滤器过滤。为确定AMA，将CFS加到MTP。在灭菌脑心浸液(BHI)肉汤中制备不同稀释液(1:1,1:10,1:100和1:500)。将100微升上清加入到微滴定孔中并且在37℃无氧保温过夜，用
Figure BDA0000367748850000122
培养系统(MART,TheNetherlands)平衡。肠道病原体细胞在Fructose Fastidious琼脂平板上无氧生长24小时。细胞用PBS洗2次，重悬于无菌PBS中。在BHI肉汤中制备A620=0.02的10微升肠道病原体细胞，并加入到过夜预还原的MTP中。在48小时(CD病原体)/24小时(其它病原体)后用平板分析仪在OD620测量生长，结果表示为相对于无CFS对照孔中的生长而计算的肠道病原体生长抑制百分比。
ODt和Odc代表在LAB或者双歧杆菌的CFS存在和不存在下的CD生长。类似地，确定乳杆菌和双歧杆菌共培养提取物针对CD的AMA。相同公式用于所有肠道病原体。
潜在益生菌株降解益生素的能力的初步筛选如下进行：乳杆菌和双歧杆菌菌株最初在MRS/MRSC琼脂上微有氧和无氧条件下在37℃生长。每种菌株的单菌落然后作为小块涂布在用于乳杆菌的不含葡萄糖并且具有1%(重量/体积)益生素(寡聚果糖(FOS)、寡聚木糖(XOS)、寡聚半乳糖(GOS)、菊粉(inulin)、可溶性淀粉(SS)、抗性淀粉(RS)、果胶、异麦芽糖寡糖(IMOS)、乳果糖)的基础MRS琼脂或者用于双歧杆菌的补加0.05%(w/v)盐酸L-半胱氨酸琼脂的具有1%(重量/体积)益生素(FOS,FOS(Orafti),XOS,GOS,菊粉,SS,RS,果胶,IMOS,乳果糖)作为主要碳源的眎蛋白胨酵母膏(PY)琼脂，具有每升30mg溴甲酚紫，在微有氧(乳杆菌)或者无氧条件(双歧杆菌)下在37℃保温48小时。各种LAB和双歧杆菌对FOS、FOS(Orafti)、XOS、GOS、菊粉、SS、RS和果胶的降解能力可见于表1(见脚注)。
表1.刚果红结合、盐聚集试验、AMA及益生素降解的筛选结果
缩写如下：-H-高活性--≥70%抑制,中等--41-69%抑制，低≤40%抑制,nd--未确定；Vw+-非常弱;2+强阳性;3+非常强阳性。基于表1提供的实验结果，选择表2的益生菌株进行进一步实验。
Figure BDA0000367748850000141
Figure BDA0000367748850000151
Figure BDA0000367748850000161
基于表1提供的实验结果，选择表2的益生菌株进行进一步实验。
表2选择的益生菌候选物列表。
Figure BDA0000367748850000171
选择的益生菌株于2010年11月24日保藏在比利时微生物协作保藏中心(BCCM)(Laboratorium voor Microbiologie
Figure BDA0000367748850000172
(LMG),Universiteit Gent,K.L.Ledenganckstraat35,9000Gent,Belgium)(网址:http://bccm.belspo.be)，保藏号为：LAB LU33:LMG P-26118，LAB LU28:LMG P-26120，BIF LU10:LMG P-26117，BIF LU30:LMG P-26116，BIF LU29:LMG P-26115，LAB LU23:LMG-P-26119。
益生菌株的共培养
测试了不同组合的选择的双歧杆菌和LAB菌株(表2)以确定这些菌株彼此的可能协同和相容性。为确定特定菌株是否产生细菌素样物质，用MTP测定确定来自每个菌株的中和提取物对其它菌株的AMA。AMA提取物以如上所述实验程序获得。
用5N NaOH将如上述实验程序获得的CFS中和至pH7。用MTP测定确定选择的双歧杆菌和乳杆菌的中和的CFS针对彼此的AMA。用于本研究的选择的双歧杆菌和乳杆菌菌株的中和提取物不显示针对彼此的AMA(乳杆菌或双歧杆菌)。另外，它们不抑制用作参考菌株的其它乳杆菌和双歧杆菌，提示选择的乳杆菌和双歧杆菌不产生针对彼此的细菌素样物质。所述菌株的这个性质可以用于开发“合生素配制物”中混合的合适菌株以预防和治疗由肠道病原体和艰难梭菌导致的感染。
许多胃肠道感染是由沙门氏菌、空肠弯曲菌和ESBL大肠杆菌导致的，而AAD主要由CD和MRSA导致。因此，在证实表2的选择的LAB和双歧杆菌菌株不彼此抑制后，将它们在MRSC培养液中共培养，用MTP测定确定它们针对CD、包括高毒力CD027/NAP1、ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的潜在AMA。
通过将不同的LAB和/或双歧杆菌的10%菌株接种物(所有菌株总和)接种进5ml预还原的MRSC培养液中而共培养表2的选择的LAB和双歧杆菌的活化培养物，使用Anoxomate罐在无氧条件下使之在37℃生长24小时。24小时后离心收获培养物，上清用0.22微米过滤器过滤灭菌。使用如上所述MPT测定用CFS确定抗CD和其它病原体的AMA。在48小时(CD病原体)/24小时(其它病原体)后用平板分析仪在OD620测量生长，结果表示为相对于无CFS对照孔中的生长而计算的病原体生长抑制百分比。
LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30的不同组合的共培养物显示抗鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、艰难梭菌CD NAP1/027和金黄色葡萄球菌的高AMA。令人惊奇地，当CFS提取物被稀释至1:500(抗病原体CD027和金黄色葡萄球菌)及1:10(抗鼠伤寒沙门氏菌和ESBL大肠杆菌)时，AMA仍保持，这一点在菌株作为单培养物时未发现(表3和表4)。含有LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30的组合物在1:10稀释度显示比其它组合更高的抗鼠伤寒沙门氏菌和ESBL大肠杆菌的AMA(表4)。这清楚表明选择的菌株显示在导致抗病原体的高AMA的菌株中的协同性。
表3.含有益生菌株的不同共培养组合抗艰难梭菌NAP1/027、艰难梭菌2167和MRSA金黄色葡萄球菌的AMA。
Figure BDA0000367748850000181
Figure BDA0000367748850000191
-无抑制,nd未确定,CFS得自含有2%葡萄糖的MRSC并无氧生长
表4.含有益生菌株的不同共培养组合抗鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的AMA
共培养物组合 鼠伤寒沙门氏菌 ESBL大肠杆菌
LAB LU28+Bif LU10(1:1) 80±2 80±1
LAB LU28+Bif LU10(1:10) - -
Bif LU10+Bif LU30(1:10) 81±3 81±3
Bif LU10+Bif LU30(1;100) - 8±6
LAB LU28+LAB LU33+Bif LU30(1:1) 82±1 81±1
LAB LU28+LAB LU33+Bif LU30(1:10) - 44±12
LAB LU28+LAB LU33+Bif LU10+Bif LU33(1:1) 85±1 86±3
LAB LU28+LAB LU33+Bif LU10+Bif LU33(1:10) 89±1 62±5
-无抑制,nd未确定,CFS得自含有2%葡萄糖的MRSC并无氧生长
另外，选择的菌株抗艰难梭菌的AMA与由高毒力菌株CD NAP1/027产生的毒素量降低良好相关。当在稀释至1:10的共培养的所选菌株的CFS提取物存在下生长时，从CD NAP1/027菌株未检测到毒素。当含有大量毒素A和毒素B的NAP1/027提取物与活LAB和双歧杆菌保温时，毒性被抑制，提示选择的LAB和双歧杆菌菌株显示抗毒素活性。由LAB LU28、LABLU33、Bif LU10和Bif LU30的不同组合产生的CFS的AMA不仅归因于酸而且也归因于热稳定的胞外抗微生物蛋白质/肽。包含菌株LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30的组合物显示抗高毒力CD菌株NAP1/027、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和ESBL大肠杆菌的AMA(表3和表4)。
另外，上述选择的益生菌株组合在含有0.05%(w/v)盐酸L-半胱氨酸的蛋白酶蛋白胨酵母膏葡萄糖培养基(pH7.2)中与CD NAP1/027共培养。CDNAP1/027显示生长降低2log cfu，在生长24小时后CD毒素A和毒素B产生与在PYG中单独生长的CD相比被强烈抑制。因此可以得出结论，包括LAB LU28、LAB LU33、Bif10和Bif30中的两或更多种菌株的组合物显示协同作用，导致增强的抗肠道病原体的AMA。
共喂养：益生菌+益生素
为了开发多菌株益生菌或合生素，重要的是选择具有高益生素评分和/或益生素指数的有效菌株，以在对象肠道中恢复具有有益微生物的肠道微生物群。
初始的筛选包括FOS、GOS、XOS、IMOS和乳果糖(表5)。也评估其它天然多糖如来自小麦的抗性淀粉(RS)、阿拉伯树胶、β-葡聚糖、木聚糖、果胶和菊粉的益生素潜力。
熟知FOS的双歧杆菌生成性(bifidogenic)和乳杆菌生成性(lactogenic)作用，但是其在人体内可导致粘膜刺激及在抗生素治疗的小鼠中增加肠沙门氏菌的易位，这个缺点促使本发明人筛选GOS、IMOS、XOS和乳果糖作为益生素代替FOS。
大多数选择的益生菌菌株(表2)降解一种以上的益生素成分(表5)。益生素评分(PS)根据每种选择的菌株开发，通过确定每种菌株在各种益生素中与葡萄糖对比的相对生长而产生。
表5：LAB和双歧杆菌的益生素评分
细菌菌株 GOS FOS XOS IMOS 乳果糖 RS
LAB LU33 - - - + + -
LAB LU28 3+ - - 3+ 2+ -
鼠李糖乳杆菌LMG18243(LGG) - - - - - -
Bif LU10 3+ 2+ - 3+ 3+ 2+
Bif LU29 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -
Bif LU30 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ -
B.lactis JCM10602 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ -
评分定义：-，无降解(0mm)；+，弱降解(1mm)；2+，中等降解(2mm)；3+，强降解(3mm)&ND，未确定。
混合的益生菌与不同的益生素组合的共培养
在上述共培养实验中，示出选择的菌株彼此相容，因为其不呈现彼此的AMA。将相同选择的菌株在存在单一益生素、益生素组合及益生素与SS组合，在pH未控制条件下共培养，以进一步研究益生菌菌株之间的协同作用的可能性。
将菌株LAB LU28、LAB LU33、BIF LU10和BIF LU30混合，在MRSC琼脂上在37℃传代培养48小时。将单菌落接种于5ml的预还原的培养液中，并传代培养3次。收获每个培养物，如上述洗涤并在PBS中重悬。将4种选择的益生菌菌株作为混合物接种，在5ml预还原的MRSC培养液及1%(w/v)的(a)GOS，IMOS和可溶淀粉(SS)混合物(1:1:1)，(b)IMOS与GOS(1:1)，(c)GOS与SS(1:1)，(d)GOS与(e)SS中获得最终吸光度0.5单位(即0.125/菌株)，管在无氧条件下保温24小时。在0和24小时后收集样品，将100μl培养液系列稀释，取50μl涂布在MRS琼脂(对于LAB)和Bereens琼脂(对于双歧杆菌)上，以确定以CFU/ml表示的存活计数。
单一和混合的益生素的不同组合中的乳杆菌和双歧杆菌的总数在表6中示出。使用葡萄糖(GLU)、GOS和IMOS/GOS，双歧杆菌总计数高于总LAB计数。使用SS，LAB与双歧杆菌增加数相等。使用SS/GOS和SS/IMOS/GOS，总LAB计数高于双歧杆菌计数。LAB的log CFU/ml增加顺序是SS/IMOS/GOS>SS/GOS>GOS>SS>IMOS/GOS>GLU，双歧杆菌是IMOS/GOS>GOS>GLU>SS/IMOS/GOS>SS>SS/GOS(表6)。
表6：在共培养实验期间在生长0和24小时后的总乳杆菌和总双歧杆菌数
Figure BDA0000367748850000211
LAB LU33与Bif LU10在用于共喂养的可溶淀粉上的共培养
为了解释非淀粉降解菌株LAB LU33与淀粉降解菌株Bif LU10的可能的共喂养及生长增强作用，将这些菌株在具有1%(w/v)SS作为唯一碳源的MRSC培养液中共培养。Bif LU10与LAB LU33的共培养增强LAB LU33的生长。在淀粉降解期间产生的中间代谢产物支持LAB LU33生长(表7)。淀粉降解对于维持正常菌落环境及增强其它有益微生物的生长以恢复肠道微生物群是重要的。在淀粉代谢期间pH的降低不抑制LAB LU33，这两种菌株彼此相容，示出协同活性。由LAB33和Bif LU10呈现的协同作用令人惊奇的结果是菌株特异性的。当非淀粉降解菌株LAB LU28与BifLU10在存在RS条件下生长时，不刺激LAB LU28生长。当将熟知的非淀粉降解菌株益生菌鼠李糖乳杆菌GG的与淀粉降解菌株Bif LU10在存在SS条件下共培养时观测到相同观测结果，鼠李糖乳杆菌GG生长未受刺激。这两个实施例表明交叉喂养对于彼此组合使用的选择的菌株是特异性的。交叉喂养甚至在同一属的菌株中显然不是显而易见性质。
表7：非淀粉降解LAB与淀粉降解Bif LU10在SS上的共喂养
Figure BDA0000367748850000221
共培养中LAB的log CFU的净增加使用公式计算=(F8与B46+可溶性淀粉在T48h的Log CFU–在T0h的Log CFU)-(F8在存在可溶性淀粉下在T48h的Log CFU–在T0h的Log CFU)。
共培养的提取物针对人病原体的AMA
确定来自与不同组合的益生素共培养的两或更多种选择的菌株(表2)的提取物对抗肠道病原体的AMA。发现与不同组合的益生素一起生长的所有CFS均呈现抗病原体ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌2167和NAP1/027的AMA(表8)。当共培养的提取物的CFS与含有毒素的CD提取物保温时，>70%的毒性作用被抑制，表明在CFS中产生的酸呈现抗毒素活性。
表8：选择的菌株LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30在与不同组合的益生素共培养期间呈现的AMA
Figure BDA0000367748850000222
Figure BDA0000367748850000231
-未抑制，nd-未确定，CFS得自含有1%总益生素或葡萄糖的MRS-BB
#在这些样品中未检测毒素水平，即毒素被抑制；与CD感染相关的毒素A和毒素B，毒力因子通过ELISA测定确定。
可以推断在本发明组合物中选择的菌株具有较高的降解益生素的能力。选择的菌株与不同组合的益生素的共培养根据菌株降解益生素的能力而提供不同比率的LAB/bif。也发现淀粉降解菌株Bif LU10的代谢机制刺激非淀粉降解菌株LAB LU33的生长。也应指出选择的菌株根据培养期间利用的不同益生素组合而出呈现针对肠道病原体的较高AMA(见表8)。
共喂养：病原体+益生素
如上所述，艰难梭菌、ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌是人病原体。因此，必须筛选这种病原体是否能降解及利用合生素混合物中存在的益生素。检测示出来自LU医院的艰难梭菌包括超毒性菌株NAP1/027、金黄色葡萄球菌、ESBL大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的5个临床分离株无一人类病原体能利用FOS、GOS、IMOS、XOS、菊粉、RS、SS、果胶或木聚糖。因此，人类病原体不呈现出益生素降解能力，这对于开发益生菌和益生素混合物以对抗肠道感染是非常有利的。
应激脉冲处理和体外胃肠道(GIT)模拟以评估选择的菌株
开发一种简便和可靠的体外方法以模拟体内胃肠道转运条件。这是通过在37℃将选择的益生菌菌株暴露于组合的酸(30分钟)及胆汁应激脉冲处理4小时，以模拟体内胃肠道转运(GITS)，在有氧(LAB)和无氧(双歧杆菌)条件下进行。首先对细胞在MRSC/MRS培养基中在pH2.5条件下进行酸应激刺激。30分钟后，将细胞用PBS洗涤，用包含5%(v/v)猪胆汁的MRSC/MRS应激刺激4小时。不具有酸或胆汁应激刺激的MRSC培养液用作对照。为了研究应激脉冲处理的细胞的益生素降解能力，将其洗涤及接种在具有不同益生素或葡萄糖的MRSC培养液中。未应激刺激的细胞用作对照。
三种菌株LAB LU28、LAB LU33和LGG在应激脉冲处理时示出100%存活力。BIF LU30和Bif LU10在GI转运模型中在胆汁刺激阶段末期示出分别为100%和40%的存活力。参考菌株B.lactis JCM10602(Bb12)在GI转运后示出85%存活力。强壮性即GI样转运模拟中的耐受性的顺序如下所示：Bif LU30>B.lactis JCM10602>Bif LU10。
理想地，在体内选择的菌株以存活形式达到肠道的各个部分并且使用益生素作为食物充分增殖以发挥其益生作用。益生菌混合物中菌株代谢益生素补充物的能力在GI样转运中分析，即在应激脉冲处理后进行。应激脉冲处理的和未应激脉冲处理的LAB LU28细胞示出在GOS和葡萄糖中相似的生长。应激脉冲处理的Bif LU10细胞示出较长的log期，但是在存在IMOS、GOS和FOS条件下24小时后其生长模式与未应激刺激的细胞相似。此外，应激脉冲处理的Bif LU10在GOS、IMOS、FOS中的生长高于在葡萄糖中。Bif LU30菌株示出当与GOS、XOS和葡萄糖一起生长时与未应激刺激的细胞相同的生长动力学。
为了对比，基于强壮性(即应激脉冲处理)、抗艰难梭菌及其它肠道病原体的AMA、使用益生素的能力、达到肠道而不丧失其代谢活性的能力、在存在合生素混合物的益生素条件下增殖及发挥其益生作用的能力选择益生菌菌株。
在存在5%猪胆汁条件下生长的LAB LU28和LAB LU33的CFS保留超过60%的抗金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、艰难梭菌2167和艰难梭菌NAP1/027的AMA。在存在5%猪胆汁条件下生长的Bif LU10和Bif LU30保留超过60%的抗艰难梭菌2167和艰难梭菌027的AMA。在存在5%猪胆汁条件下生长的选择的菌株保留抗艰难梭菌及其它胃肠道病原体(包括鼠伤寒沙门氏菌、ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)的AMA。
在应激脉冲处理后产生的强壮细胞可用于在冻干及最后的包装具有益生素和RS的合生素配制物期间产生较高的细胞产量。
胃肠道模拟器(GITS)在评估选择的益生菌菌株在混合培养中存活中的应用
GITS由与电脑连接的1L“Biobundle”发酵罐、生物控制仪ADI1030和天平组成，由培养程序“BioXpert”控制。温度、pH、培养体积、搅动、氧含量和液体(即HCl，NaHCO3，胆盐，饲养培养基)速率由该程序控制。GITS是具有模拟胃肠道的一些容器(P1-P5)的发酵罐(图1)。
将细菌悬浮液注射及留置于第一个容器中3小时，其模拟胃环境(pH3.0)。之后将细菌悬浮液泵入第二个容器中，其模拟具有胆汁的小肠pH6.5和大肠(稀释液，pH6.0)环境。
在模拟开始时，将100ml的0.01M HCl加入发酵罐中以模拟空的胃环境。将在200ml的“模型食物”(含有具有半胱氨酸HCl的肽胨酵母提取物与益生素混合物FOS、GOS、XOS的培养基)中的多菌株益生菌(i)Bif LU10、Bif LU29、LAB LU28、(ii)Bif LU10、Bif LU29、Bif LU30、LAB LU28、(iii)Bif LU10、Bif LU30、LAB LU28、LAB LU33的所选菌株泵入发酵罐中。
如图1所示，P1，P2，P3，P4和P5示出相应于实验开始(P1)，胃期(P2)，胆汁期(P3)，稀释期以除去胆汁(P4)及在实验结束期(P5)的关键取样点。将容器中的pH通过以20mmol/小时的速度加入1M HCl滴定为3.0，以模拟胃环境。在达到pH3后，将生物反应器内容物的pH通过加入1MNaHCO3调节为pH6.0。将多达3%的猪胆汁(30ml30%溶液)加入发酵罐中，保温30分钟。将内容物用含有具有半胱氨酸HCl的肽胨酵母提取物及益生素混合物FOS、GOS、XOS(每种益生素3g/L)的稀释培养基稀释直至总实验24小时。在不同模拟时期期间共培养实验中如上述列举菌落形成细菌。从实验开始至结束对20-40个选择的菌落进行使用(GTG)5引物的REP-PCR指纹分析。细菌细胞根据总DNA拷贝数使用qPCR量化。培养基中有机酸(乳酸、乙酸、甲酸)和乙醇的浓度通过液相层析法(Alliance2795系统)分析，其使用BioRad HPX-87H柱(Hercules，CA)，使用0.005M H2SO4等度洗脱液，以0.6mL/分钟流速在35℃进行。折射率(RI)检测仪(model2414;Waters Corp)用于检测和量化所述物质。
在含有Bif LU10、Bif LU29和LAB LU28及益生素混合物FOS、XOS或GOS的组合物中，Bif LU10和LAB LU28菌株在模拟的GIT条件期间存活良好(表9)。Bif LU10在酸和胆汁保温期间的降低更明显，而在稀释期期间增加。(BIF LU29的数目在实验结束时显著较低，该菌株在培养物中未检测出)。
表9：在MRS琼脂上计数的细菌数(log10cfu/ml)。列举了在MRS-C琼脂上无氧生长的总数，在琼脂上有氧生长的LAB LU28。
ND–未确定
乳酸盐、乙酸盐和乙醇以2:5:1比率的产生提示双歧杆菌在“大肠”期的更好的生长。然而，乳杆菌在理论上也可以在葡萄糖受限的条件下产生乙酸盐。
在实验开始时使用含有等量的Bif LU10、Bif LU29、Bif LU30、LABLU28的组合物，在实验结束时菌株分布是大约73%的LAB LU28，21%BifLU30和6%Bif LU10。这些结果表明这个组合中Bif LU10、Bif LU30和LAB LU28的良好存活和生长。使用含有菌株LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30及含有FOS、XOS、GOS的益生素混合物的组合物，在GITS实验结束时检测到LAB或双歧杆菌的数目无显著降低。
各自生物量通过qPCR针对LAB和双歧杆菌菌株的总DNA拷贝数以及LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30的比例分析(图2)。结果示出LAB LU28、LAB LU33和Bif LU30的log拷贝数在20小时后及在实验结束时保持相同。
LAB LU28和LAB LU33菌株在酸和胆汁应激刺激下良好存活，能以寡糖为碳源生长。根据rep-PCR的结果，LAB LU28和LAB LU33相对于混合物中存在的其它菌株的比例在模拟期间显著增加。
在实验结束时检测Bif LU10和Bif LU30，尽管其在益生菌混合物中的比例在模拟期间已经降低。Bif LU29对胆汁耐受不良，在实验开始时与其它菌株相比计数总是较低，在实验结束时未检测到。
在模拟开始时，与Bif LU10和Bif LU30相比LAB菌落计数总是较高，LAB在稀释期期间能成功增殖。尽管在酸/胆汁处理期间更严重的初始降低，但是双歧杆菌从酸/胆汁应激中较LAB菌株更好恢复。这是由于与LAB菌株相比在稀释期期间寡糖的优先消耗所致。在应激脉冲处理章节中描述的单一菌株研究与这些益生菌菌株共培养的之间存在良好相关性，证实其在GI样转运模型中的强壮性。
值得注意的是在用LAB LU28，LAB LU33，Bif LU10，Bif LU30和假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)1200菌株进行的GITS实验中，其中SS(5g/L)和GOS(5g/L)用作主要碳源，LAB LU33菌株在这与SS/GOS组合中是最强的，尽管事实是这个菌株不利用SS或GOS。
GITS实验证实当在SS和GOS存在下生长时，Bif LU10和LAB LU33呈现的交叉喂养新概念。LAB LU33不能利用SS或GOS。然而，当在其它选择的菌株存在下生长时，特别是组合中仅淀粉降解菌株即Bif LU10和SS/GOS存在时，LAB LU33计数增加。此外，也看到GIT转运期间菌株的强壮性。可以总结出含有LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30益生菌混合物的组合物在GI样转运模型中在单一容器GITS模型中是稳定的。
在这些实验中，基于高益生评分选择菌株。在益生素和淀粉存在下生长所有4种选择的菌株以设计协同作用合生素混合物。发现这些菌株在合生素混合物中彼此相容，LAB/bif比率根据菌株的益生素降解能力(益生评分，表5)及它们展示的抗人类病原体AMA而增加或降低。此外，益生菌与益生素之间的协同作用增强了降解淀粉的益生菌菌株存在下非降解淀粉菌株的生长。选择的菌株是强壮的，可以承受GI样转运，可以保持代谢活性，可以代谢益生素等
使用小鼠模型预防感染
本发明的组合物可以有利地用于在对象的肠粘膜建群，(及特别是)用于在对象中预防和治疗感染，缓解症状及预防抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的复发。
如上所述，选择的菌株(即LAB LU28，LAB LU33，Bif LU10和Bif LU30)均具有抗CD NAP1/027的较高AMA，在GITS模拟中的存活方面是强壮的，具有降解混合物中使用的一或多种益生素的能力。为研究在选择的益生素存在下生长的所选益生菌的作用，用小鼠模型体内测试不同组合。详细的式样方案示于图3。将6-7周龄的C57BL/6小鼠分为4个实验组。组1(n=5)，合生素组用由RS、IMOS、GOS和LAB LU28、LAB LU33、BIF LU10和BIF LU30组成的“合生素混合物”处理；组2(n=6)，益生菌组用由LAB LU28、LAB LU33、BIF LU10和BIF LU30组成的“益生菌混合物”处理；组3(n=6)用由RS、IMOS、GOS组成的“益生素混合物”处理；组4(n=7)由“阳性对照”组成，其中动物仅用CD027感染。。组1和2每天给予1×1010cfu/小鼠剂量的每种益生菌菌株。
总的益生素浓度是5%(w/w)正常饮食，基于每只小鼠每天5g饲料消耗计算。将RS与低蛋白质啮齿动物饲料(R70，
Figure BDA0000367748850000281
Sweden)混合，制备成小球，每日喂食。组4(n=7)是对照组，用NAP1/027菌株感染，不接受任何合生素、益生素或益生菌混合物。固有的小鼠肠道微生物群通过给予5天(第-15至-11天)在饮用水中稀释的抗生素混合物而破坏。在饮用水中制备卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素、甲硝唑和万古霉素的抗生素混合物并过滤灭菌。在第9天(-9)，所有动物包括对照组动物均经腹膜内注射接受单一剂量的克林霉素(10mg/kg)。组1-3喂食7天合生素、益生菌和益生素混合物(图3A)。在第0天，所有动物均通过胃管用106cfu的NAP1/027(106cfu/小鼠)攻击。合生素、益生菌或益生素喂养的各个组进一步持续另外5天，在第6天所有动物通过CO2窒息处死(图3A)。收集新鲜的盲肠内容物以进行无菌培养、实时定量PCR(qPCR)、组织病理学和毒素检测。对照组(组4)的抗生素处理以这样的方式开始，其使得艰难梭菌感染(CDI)与组1-3在相同天数下降。这样做以维持用于感染动物的CD剂量的一致性及降低实验误差(图3B)。
分析来自一组内的所有动物的集合的盲肠内容物的总的乳杆菌、双歧杆菌和NAP1/027存活菌落计数(图4A)。NAP1/027的菌落计数在CefoxitinFructose Fastidious平板上在无氧条件下在37℃培养72小时确定。存活计数以log cfu/100mg盲肠内容物表示。此外，也通过qPCR确定不同动物组的盲肠内容物中Bif LU10、Bif LU30、LAB LU33和LAB LU28的总DNA拷贝数，*P-值<0.05(图4B)。
发现与其中动物由于结肠炎而严重生病的对照组相比，用包含4种选择的益生菌菌株及益生素IMOS、GOS和RS的合生素组合物喂养预防CDI。
组1-3的所有动物均是健康的，未观察到腹泻症状。组4的3只小鼠在CDI2天后由于结肠炎而变得患病严重，因此被处死。
组1-3中盲肠内容物菌落计数显示与组4动物相比NAP1/027的显著降低(P<0.05)。组4中的乳杆菌菌落计数与其它组相比较高(P<0.05)。组1和2中的双歧杆菌菌落计数比组3和组4显著更高(图4A)。组1和组2中总双歧杆菌DNA log拷贝数、Bif LU10、LAB LU28和LAB LU33拷贝数比组3和组4高(P<0.05)。在所有4个组中总乳杆菌log DNA拷贝数均类似(图4B)。在组1中，3/5小鼠的盲肠内容物显示中等下降，2只显示阴性NAP1/027DNA拷贝数。在组2中，1/6显示显示非常低的CD拷贝数，5只是阴性的。在组3中，2/6动物是阴性的，1只显示非常低的CD DNA，2只显示中等，1只显示非常高的NAP1/027DNA拷贝数。在组4中，4只小鼠的盲肠内容物显示2-4log NAP1/027DNA拷贝数。
图5显示出得自实验动物盲肠组织的组织病理学研究结果。图5A显示组1动物盲肠组织的组织病理学(合生素组)，图5B；组2的盲肠(益生菌组)(40倍视野)揭示正常的管状腺和保护良好的表面柱状上皮。图5C；组3的盲肠(益生素组)显示小面积不规则表面。在固有层中的小囊之间可见少量多形体。图5D；组4的盲肠(对照组)显示溃疡，盲肠中的粘膜上皮细胞层和小囊消失。粘膜和粘膜下层出血并显示严重炎性水肿。
组1-3的盲肠样品未显示任何炎性迹象，但是在组4中，3只动物由于严重结肠炎被处死(图5)。组1的1只动物和组3的1只动物的盲肠显示评分为3+和2+的炎症。所有组2动物未显示炎症。组1和4中显示盲肠炎症的所有小鼠也均是毒素A或B阳性的，组2中所有小鼠均是毒素阴性的(表10)。
表10.4个小鼠组的盲肠内容物的NAP1/027CD菌株的qPCR分析、组织病理学评分及毒素值。
a组织病理学评分:非常严重:+++++,严重:++++,中等:+++,轻度:++,非常轻度:+未观察到显著损害.
b相对荧光值，毒素试验的截断水平：阴性<0.13,模棱两可的>0.13to0.37,阳性>0.37
*nd,未确定，动物因为感染而严重患病并被处死。未能收集盲肠内容物。
结论是，给予含有4种益生菌株和GOS、IMOS和RS的合生素混合物或者含有多个菌株混合物的益生菌在抗生素处理小鼠中赋予了抗NAP1/027菌株的CDI的保护作用。总之，用合生素或益生菌混合物喂养保护小鼠免于CD感染，并且用等价益生素喂养提供了部分保护。这是用合生素和益生菌处理的新概念在小鼠模型中预防CDI的首次研究。
微生物群的恢复
在C57/BL/6小鼠模型中研究了喂以合生素补剂的作用，所述合生素补剂含有益生菌株LAB LU28、LAB LU30、Bif LU10和Bif LU30及益生素GOS、IMOS和RS。跟踪在喂养后不同时间点粪便中的及实验结束时盲肠中的益生菌混合物的繁殖。
在C57BL/6小鼠模型被喂以益生菌混合物之前，如以上预防实验所述用抗生素混合物处理小鼠以破坏固有的LAB和双歧杆菌微生物菌群。用qPCR确定合生素及对照组的盲肠中的总益生双歧杆菌、总乳杆菌、LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30的DNA拷贝数。显著性表示为*P<0.05(图6)。
在合生素组，在给抗生素治疗小鼠喂食合生素组合物后与对照组相比总LAB和双歧杆菌增加。合生素组盲肠双歧杆菌总计数比对照组高，并且未检测到可培养的双歧杆菌。总粪便双歧杆菌和Bif LU10计数在合生素处理中间时间及在实验结束时增加。粪便LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30的DNA拷贝数在实验结束时更高。
合生素组的盲肠显示最高的双歧杆菌和LAB。LAB LU28、LAB LU33和Bif LU10计数与对照组比较，如qPCR确定(图6)。合生素组和对照组之间在LAB DNA拷贝方面无明显差异。合生素组BIF LU30的DNA拷贝数比对照组高，但是无显著差异。因此，益生菌株在益生素和RS存在下在抗生素处理小鼠的盲肠中繁殖良好，因为通过菌落计数和qPCR确定在粪便和盲肠中的总LAB和双歧杆菌显著增加。从粪便和盲肠样品中回收到LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30这个事实可以总结出，在合生素混合物中利用益生素促进选择的益生菌株在小鼠肠道中的繁殖和建群。在4种菌株与GOS、IMOS和RS的本发明组合物中，观察到每种菌株的繁殖在盲肠中是等比例的。
安全性实验
在无免疫应答的C57/BL/6小鼠模型中确立包含LAB LU28、LAB LU33、Bif LU10和Bif LU30以及GOS和RS的组合物的安全性。用氨甲喋呤使小鼠无免疫应答，氨甲喋呤是四氢叶酸还原酶和DNA合成抑制剂，广泛用于癌症化疗中。将氨甲喋呤(3.5mg/Kg)口服喂给小鼠3天。2天后合生素组喂以在水中的具有5%GOS的4x1010cfu/ml。RS与饲料混合并且每日喂给小鼠共6天。在第7天杀死小鼠，采集肝、脾、血液和肾，使用平板计数法进行存活性研究及用肝进行组织病理学。
结果证实细菌未转移到肝、血液、肾、脾，肝的组织病理学是正常的。进一步发现用氨甲喋呤治疗后对照组白血细胞计数降低，而喂以合生素补剂7天升高了WBC计数水平。

Claims (33)

1.合生素组合物，其包含选自乳杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacteria)属的至少两种细菌菌株，及一或多种益生素物质，特征在于：
-所述细菌菌株中的至少一种能降解淀粉；及
-至少一种益生素物质是淀粉。
2.权利要求1的合生素组合物，其中所述能降解淀粉的细菌菌株属于双歧杆菌属。
3.权利要求1的合生素组合物，其中所述能降解淀粉的细菌菌株是短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)物种。
4.权利要求1的合生素组合物，其中所述能降解淀粉的细菌菌株是Bif LU10。
5.权利要求1的合生素组合物，其中所述淀粉是抗性淀粉(RS)和/或可溶淀粉(SS)。
6.权利要求1-5任一项的合生素组合物，其中所述细菌菌株之一是非淀粉降解菌株。
7.权利要求6的合生素组合物，其中所述非淀粉降解细菌菌株是副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)物种。
8.权利要求6的合生素组合物，其中所述非淀粉降解细菌菌株是LABLU33。
9.权利要求1-8任一项的合生素组合物，其包含至少Bif LU10，及包含菌株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多种。
10.权利要求9的合生素组合物，其包含至少Bif LU10和LAB LU33。
11.权利要求9的合生素组合物，其包含至少BIF LU10、LAB LU33和BIF LU30。
12.权利要求9的合生素组合物，其包含至少BIF LU10、LAB LU33、BIF LU30和LAB LU28。
13.权利要求1-12任一项的合生素组合物，其中所述一或多种细菌菌株在其生产期间已经暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白。
14.权利要求13的合生素组合物，其中所述暴露于酸包括在所述细菌菌株生长期间使培养液的pH降低至pH2-5、优选降低至pH2.5-4.5、更优选降低至pH3-4，持续15-150分钟、优选20-140分钟、更优选30-130分钟、更优选40-120分钟。
15.权利要求13的合生素组合物，其中所述暴露于胆汁包括使所述细菌菌株在存在0.1-2.5%(重量/体积)、优选0.5-2%、更优选1.0-1.5%牛磺胆酸钠或者1-10%(体积/体积)、优选2-7%、更优选3-5%猪胆汁的条件下生长2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3-6小时。
16.权利要求13的合生素组合物，其中所述暴露于粘蛋白包括使所述细菌菌株在存在0.01-1%(体积/体积)、优选0.03-0.7%、更优选0.05-0.5%粘蛋白的条件下生长2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3-6小时。
17.权利要求1-16任一项的合生素组合物，其进一步包含属于由二糖、寡糖和/或多糖组成的的组的益生素物质。
18.权利要求17的合生素组合物，其中所述二糖是乳果糖。
19.权利要求17的合生素组合物，其中所述寡糖来自由寡聚果糖(FOS)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖、异麦芽糖寡糖(IMOS)、阿拉伯树胶、大豆-寡糖和果胶-寡糖组成的组。
20.权利要求17的合生素组合物，其中所述多糖来自由果胶、木聚糖、菊粉、壳聚糖和/或β-葡聚糖组成的组。
21.权利要求17的合生素组合物，其进一步包含属于由寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖组成的组的益生素物质。
22.权利要求17的合生素组合物，其进一步包含寡聚半乳糖(GOS)和/或异麦芽糖寡糖(IMOS)。
23.权利要求1-22任一项的合生素组合物，其用于在对象肠粘膜中建群。
24.权利要求1-22任一项的合生素组合物，其用于预防、治疗、减轻对象中抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状，和/或预防抗生素相关腹泻和/或胃肠道病原体所致感染的复发。
25.权利要求24的合生素组合物，其中所述抗生素相关腹泻(AAD)由艰难梭菌(Clostridium difficile)引起。
26.权利要求24的合生素组合物，其中所述胃肠道病原体所致感染是由沙门氏菌(Salmonella)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌导致。
27.权利要求23-26的合生素组合物，其中所述对象是哺乳动物。
28.权利要求27的合生素组合物，其中所述哺乳动物属于由人、非人灵长类动物、牛、绵羊、猪、山羊和马、狗、猫、啮齿动物和豚鼠组成的组。
29.权利要求23-26的合生素组合物，其中所述对象是人。
30.权利要求1-22任一项的合生素组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在对象肠粘膜建群，以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体感染的症状，及预防抗生素相关腹泻和/或胃肠道病原体感染的复发。
31.权利要求1-22任一项的合生素组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗患有抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的对象。
32.在对象肠粘膜建群的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的权利要求1-22任一项的合生素组合物的步骤。
33.一种治疗患有抗生素相关腹泻和/或胃肠道病原体所致感染的对象的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的权利要求1-22任一项的合生素组合物的步骤。
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