BR112019026667A2 - Composições que compreendem uma cepa bacteriana do gênero megasphaera e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a composições compreendendo cepas bacterianas para tratamento e prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES QUE COMPREENDEM UMA CEPA BACTERIANA DO GÊ- NERO MEGASPHAERA E USOS DAS MESMAS".

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo das composições compreendendo cepas bacterianas isoladas do trato digestivo de mamí- feros e o uso destas composições no tratamento de doenças.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O intestino humano é considerado estéril in utero, mas é ex- posto a uma ampla variedade de micróbios maternos e ambientais ime- diatamente após o nascimento. A partir daí, ocorre um período dinâmico de colonização e sucessão microbiana, que é influenciado por fatores como modo de distribuição, ambiente, dieta e genótipo do hospedeiro, os quais impactam na composição da microbiota intestinal, particular- mente no início da vida. Posteriormente, a microbiota se estabiliza e amadurece [1]. A microbiota intestinal humana contém mais de 500- 1000 filotipos diferentes pertencentes essencialmente a duas principais divisões bacterianas, os Bacteroidetes e os Firmicutes [2]. As relações simbióticas bem-sucedidas que surgem da colonização bacteriana do intestino humano produziram uma ampla variedade de funções metabó- licas, estruturais, protetoras e outras funções benéficas. As atividades metabólicas aprimoradas do intestino colonizado garantem que compo- nentes alimentares outrora indigeríveis sejam degradados com a liberação de subprodutos, fornecendo uma importante fonte de nutrientes para o hospedeiro. Da mesma forma, a importância imunológica da microbiota intestinal é bem reconhecida e é exemplificada em animais livres de germes que têm um sistema imunológico debilitado que é funcional- mente reconstituído após a introdução de bactérias comensais [3-5].

[0003] Mudanças dramáticas na composição da microbiota foram documentadas em distúrbios gastrointestinais, como a doença inflama- tória intestinal (IBD). Por exemplo, os níveis de bactérias XIVa do Clos- tridium cluster são reduzidos em pacientes com IBD, enquanto o número de E. coli aumenta, sugerindo uma mudança no equilíbrio de simbiontes e patobiontes no intestino [6-9].

[0004] Em reconhecimento do efeito positivo potencial que certas cepas bacterianas podem ter no intestino animal, várias cepas têm sido propostas para uso no tratamento de várias doenças (ver, por exemplo, [10-13]). Além disso, certas cepas, incluindo principalmente as cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium, foram propostas para uso no trata- mento de várias doenças inflamatórias e autoimunes que não estão di- retamente ligadas aos intestinos (ver [14] e [15] para análise). Entre- tanto, a relação entre diferentes doenças e diferentes cepas bacteria- nas, e os efeitos precisos de cepas bacterianas específicas no intestino e a um nível sistêmico e em quaisquer tipos específicos de doenças são mal caracterizados, particularmente para distúrbios neurodegenerati- vos.

[0005] Recentemente, houve um interesse crescente na técnica em relação a alterações no microbioma intestinal que podem desempenhar um papel fisiopatológico nas doenças cerebrais humanas [16]. Evidên- cias pré-clínicas e clínicas estão sugerindo fortemente uma ligação en- tre o desenvolvimento do cérebro e a microbiota [17]. Um crescente corpo de literatura pré-clínica demonstrou sinalização bidirecional entre o cérebro e o microbioma intestinal, envolvendo vários sistemas de si- nalização neurócrina e endócrina. De fato, níveis aumentadosdas espé- cies de Clostridium no microbioma foram ligadas a distúrbios cerebrais

[18], e um desequilíbrio dos filos Bacteroidetes e Firmicutes também foi implicado em distúrbios do desenvolvimento cerebral [19]. Sugestões de que níveis alterados de comensais intestinais, incluindo os dos gê-

neros Bifidobacterium, Lactobacillus, Sutterella, Prevotella e Rumino- coccus e da família Alcaligenaceae estejam envolvidos em distúrbios imunomediados do sistema nervoso central (CNS), são questionadas por estudos que sugerem uma falta de alteração na microbiota entre pacientes e sujeitos saudáveis [19]. Também houve sugestões de que a administração de probióticos pode ser benéfica no tratamento de dis- túrbios neurológicos. No entanto, esses estudos falharam em concluir que as composições probióticas per se podem alcançar benefícios tera- pêuticos em relação ao tratamento da neurodegeneração e não mostra- ram efeitos úteis para nenhuma bactéria em particular [20, 21]. Isso in- dica que, atualmente, o efeito prático da ligação entre o microbioma e as doenças cerebrais humanas é pouco caracterizado. Consequente- mente, são necessários estudos analíticos mais diretos para identificar o impacto terapêutico da alteração do microbioma nos distúrbios neuro- degenerativos.

[0006] Existe uma necessidade na técnica de novos métodos de tratamento de distúrbios neurodegenerativos. Existe também uma ne- cessidade de que os potenciais efeitos das bactérias intestinais sejam caracterizados, de modo que novas terapias que usem bactérias intes- tinais possam ser desenvolvidas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Os inventores desenvolveram novas terapias para o trata- mento e a prevenção de distúrbios neurodegenerativos. Os inventores identificaram que cepas bacterianas do gênero Megasphaera podem ser eficazes no tratamento de doenças neurodegenerativas. Como des- crito nos exemplos, a administração de composições compreendendo Megasphaera massiliensis pode proteger contra espécies reativas de oxigênio e prevenir a inflamação, atuando como um neuroprotetor. Os inventores também identificaram que o tratamento com Megasphaera massiliensis pode reduzir a ativação de moléculas pró-inflamatórias,

como NFKB e IL-6, por LPS e a -sinucleína mutante. Os inventores iden- tificaram que o tratamento com Megasphaera massiliensis pode reduzir a atividade de desacetilação de histonas e peroxidação lipídica in vitro, o que pode ajudar a reduzir a morte celular e a apoptose. Os inventores também identificaram que a Megasphaera massiliensis pode produzir indol, que pode atenuar a inflamação e o estresse oxidativo. Os inven- tores também demonstraram que o tratamento com Megasphaera mas- siliensis pode aumentar os níveis de quinurenina.

[0008] Os inventores também identificaram que a Megasphaera massiliensis produz certos ácidos orgânicos, incluindo ácido hexanoico, ácido valérico e ácido 4-hidroxifenilacético. Os inventores também des- cobriram que a Megasphaera massiliensis pode aumentar a ativação da citocina pró-inflamatória IL-8, que pode ajudar a promover a mieliniza- ção dos neurônios. Os inventores também identificaram que o trata- mento com uma combinação de Megasphaera massiliensis e ácido re- tinoico pode aumentar a secreção do fator neurotrófico derivado do cé- rebro (BDNF), o que pode ajudar a promover a neurogênese e a neuri- togênese e/ou prevenir a morte celular. Em particular, os inventores também identificaram que o tratamento com Megasphaera massiliensis, que pode produzir ácido valérico, pode reduzir a desacetilação de his- tonas, o que pode ajudar a reduzir a morte celular e a apoptose. Além disso, os inventores também descobriram que Megasphaera massilien- sis pode produzirácido hexanoico, que pode ser neuroprotetor ou neu- rorestorativo, por exemplo, promovendo o desenvolvimento de neurites. Os inventores descobriram que a Megasphaera massiliensis, que pode produzir ácido hexanoico aumenta a expressão de MAP? (proteína as- sociada a microtúbulo 2), que é considerada essencial para a formação de microtúbulos na neuritogênese. Portanto, os inventores descobriram que a Megasphaera massiliensis, que pode produzir ácido hexanoico,

pode ser usada para promover o desenvolvimento de neurites. Megas- bphaera massiliensis e outras bactérias que produzem ácidos orgânicos como ácido hexanoico, ácido valérico e ácido 4-hidroxifenilacético po- dem, portanto, ser úteis no tratamento de distúrbios neurodegenerati- vos.

[0009] Numa primeira modalidade, a invenção fornece uma compo- sição compreendendo uma cepa bacteriana do gênero Megasphaera, para uso em terapia, tal como para uso em um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.

[0010] Em modalidades particulares, a invenção fornece uma com- posição compreendendo uma cepa bacteriana do gênero Megasphaera, para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição selecionada do grupo que consiste em: doença de Parkin- son, incluindo paralisia supranuclear progressiva, paralisia supranuclear progressiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia por pressão normal, parkinsonismo vascular ou arteriosclerótico e par- kinsonismo induzido por fármacos; mal de Alzheimer, incluindo sín- drome de Benson; esclerose múltipla; doença de Huntington; esclerose lateral amiotrófica; doença de Lou Gehrig; doença do neurônio motor; doença priônica; ataxia espinocerebelar; atrofia muscular espinhal; de- mência, incluindo corpo de Lewy, demência vascular e frontotemporal; afasia progressiva primária; comprometimento cognitivo leve; compro- metimento cognitivo relacionado ao HIV e degeneração corticobasal.

[0011] Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma compo- sição compreendendo uma cepa bacteriana do gênero Megasphaera, para uso em um método de tratamento ou prevenção da doença de Par- kinson, como ambiental, familiar ou Parkinson associada ao estado in- flamatório geral. Os inventores identificaram que o tratamento com ce- pas de Megasphaera pode reduzir a ativação de moléculas pró-inflama- tórias, como NFKB e IL-6, por LPS e a-sinucleína mutante em modelos in vitro de Parkinson ambiental e familiar. Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma composição compreendendo uma cepa bacteri- ana da espécie Megasphaera massiliensis, para uso no tratamento da doença de Parkinson. As composições usando Megasphaera massilien- sis podem ser particularmente eficazes no tratamento da doença de Par- kinson.

[0012] Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso em um método de tratamento ou prevenção de doença neuro- degenerativa de início precoce. Em algumas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso em um método de prevenção ou retar- damento do início ou progressão de um distúrbio neurodegenerativo.

[0013] Em modalidades preferidas da invenção, a cepa bacteriana na composição é da Megasphaera massiliensis. Cepas estreitamente relacionadas também podem ser usadas, tais como as cepas bacteria- nas que têm uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16S rRNA de uma cepa bacteriana de Megasphaera massiliensis. Preferencialmente, a cepa bacteriana tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. Preferencialmente, a identidade de sequência é para SEQ ID NO:

2. Preferencialmente, a cepa bacteriana para uso na invenção tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2.

[0014] Em certas modalidades, a composição da invenção é para administração oral. A administração oral das cepas da invenção pode ser eficaz para distúrbios neurodegenerativos. Além disso, a adminis- tração oral é conveniente para pacientes e profissionais e permite a dis- tribuição para e/ou colonização parcial ou total do intestino.

[0015] Em certas modalidades, a composição da invenção compre- ende um ou mais excipientes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

[0016] Em certas modalidades, a composição da invenção compre- ende uma cepa bacteriana que foi liofilizada. A liofilização é uma técnica eficaz e conveniente para preparar composições estáveis que permitem a distribuição de bactérias.

[0017] Em certas modalidades, a invenção fornece um produto ali- mentício compreendendo a composição conforme descrito acima.

[0018] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção de vacina compreendendo a composição como descrita acima.

[0019] Além disso, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos, compreendendo a admi- nistração de uma composição compreendendo uma cepa bacteriana do gênero Megasphaera.

[0020] No desenvolvimento da invenção acima, os inventores iden- tificaram e caracterizaram uma cepa bacteriana que é particularmente útil para terapia. A cepa de Megasphaera massiliensis da invenção é demonstrada como sendo eficaz no tratamento das doenças descritas neste documento, tais como doenças neurodegenerativas. Portanto, em outro aspecto, a invenção fornece uma célula da cepa de Megasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787, ou um derivado desta. A invenção também fornece composições que compre- endem essas células ou culturas biologicamente puras de tais células. A invenção também fornece uma célula da cepa de Megasphaera mas- siliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787, ou um de- rivado desta, para uso em terapia, em particular para as doenças des- critas neste documento.

[0021] Em certas modalidades da invenção, a composição é para uso no tratamento de lesão cerebral. A atividade neuroprotetora das composições da invenção e sua capacidade de reduzir os níveis de ati- vidade da histona desacetilase (HDAC) podem torná-las úteis no trata-

mento de lesões cerebrais. Em modalidades preferidas, as composi- ções da invenção são para uso no tratamento de derrame, tal como tra- tamento de lesão cerebral resultante de um derrame.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0022] Figura 1: Viabilidade celular de células de neuroblastoma

[0023] Figura 2: Regulação negativa da secreção de IL-6

[0024] Figura 3: Secreção de IL-8

[0025] Figura 4: Inibição da secreção de a-sinucleína IL-6 e IL-8

[0026] Figura 5: Inibição da ativação do promotor de NFKB induzido por a-sinucleína

[0027] Figura 6: Inibição da ativação do promotor NFKB induzido por LPS

[0028] Figura 7: Alteração na capacidade antioxidante

[0029] Figura 8: Alteração na capacidade antioxidante total (oxida- ção lipídica)

[0030] Figura 9: Alteração na atividade da histona desacetilase (HDAC)

[0031] Figura 10: Nível de produção de Indol

[0032] Figura 11: Nível de produção de Quinurenina

[0033] Figura 12: Níveis médios de dopamina (DA) (Figura 12A), níveis de DOPAC (Figura 12B) e níveis de HVA (Figura 12C) no estri- ado. Os dados são exibidos como Média + SEM.

[0034] Figura 13: Promoção do desenvolvimento de neurites: mi- croscopia de luz e expressão do gene MAP?2 (Figura 13 A), microscopia de imunofluorescência de Faloidina (Figura 13B)

[0035] Figura 14: Alteração dos níveis de ROS nas (a) células U373 e (b) células SHSY-5Y

[0036] Figura 15: Neuroproteção - viabilidade celular. A Figura 15 mostra os mesmos dados da Figura 1.

[0037] Figura 16 Alterações induzidas por cepas na atividade de histona desacetilase de células inteiras e lisados celulares (Figura 16A), alterações induzidas por ácido na atividade de histona desacetilase (Fi- gura 16B), produção de metabólitos por cepas (Figura 16C)

[0038] Figura 17 Inibição de HDACI (Figura 17A), Inibição de HDAC? (Figura 17B), Inibição de HDAC3 (Figura 17C)

[0039] Figura 18 Inibição de HDACs de Classe | (Figura 18A); inibi- ção de HDACI (Figura 18B); inibição de HDAC?2 (Figura 18C); inibição de HDAC3 (Figura 18D)

[0040] Figura 19: Nível de produção de BDNF

[0041] Figura 20: Níveis de produção de metabólitos — neurotrans- missores no cérebro

[0042] Figura 21: Níveis de produção de metabólitos — ácidos orgâ- nicos no sobrenadante

[0043] Figura 22: Efeito na função da barreira intestinal.

[0044] Figura 23: Produção de neurotransmissores no cérebro

[0045] Figura 24: Alterações na Expressão Hipocampal de Recep- tor — A) Receptor de Ocitocina, B) Receptor de Vasopressina, C) Re- ceptor de Glicocorticoide e D) Receptor de Mineralocorticoide

[0046] Figura 25: Alterações na Expressão Hipocampal de A) Hor- mônio Liberador de Corticotrofina (CRH), B) Expressão de BDNF e C) TLR4

[0047] Figura 26: A) Alterações na Expressão Hipocampal do Re- ceptor 1 do Hormônio Liberador de Corticotrofina (CRFR1) e B) Expres- são do Receptor 2 do Hormônio Liberador de Corticotrofina (CRFR2)

[0048] Figura 27: Alterações na Expressão Hipocampal de A) Fator de Necrose Tumoral, B) Interleucina 1b e OC) IL-6

[0049] Figura 28: A) Alterações na Expressão Hipocampal da Inte- grina Alfa M (CD11b) e B) Alterações na Expressão Hipocampal do Re- ceptor de Serotonina 1A (receptor 5-HT1A)

[0050] Figura 29: A) Alterações na Expressão Hipocampal da Su- bunidade 2A do Receptor lonotrópico de Glutamato Tipo NMDA (Grin2A) e B) Subunidade 2B do Receptor lonotrópico de Glutamato Tipo NMDA (Grin2B)

[0051] Figura 30: Alterações na Expressão Hipocampal de A) Re- ceptor 2 de Ácido Gama-Aminobutírico A (GABA A2), B) Receptor 1 de Ácido Gama-Aminobutírico B (GABA BR1) e C) Receptor 1 de Dopa- mina (DRD1)

[0052] Figura 31: Alterações na Expressão de Receptor na Amíg- dala — A) Receptor de Ocitocina, B) Receptor de Vasopressina, C) Re- ceptor de Glicocorticoide e D) Receptor de Mineralocorticoide

[0053] Figura 32: Alterações na Expressão na Amígdala de A) Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), B) Receptor do Tipo Toll 4 (TLR-4), C) Receptor 1 do Hormônio Liberador de Corticotrofina (CRFR1) e D) Receptor 2 do Hormônio Liberador de Corticotrofina (CRFR2)

[0054] Figura 33: Alterações na Expressão na Amígdala de A) Inte- grina Alfa M (CD11b), B) Interleucina-6 (IL-6), C) Subunidade 2A do Re- ceptor lonotrópico de Glutamato Tipo NMDA (Grin2A) e D) Subunidade 2B do Receptor lonotrópico de Glutamato Tipo NMDA (Grin2B)

[0055] Figura 34: Alterações na Expressão na Amígdala de A) Su- bunidade Alfa 2 do Receptor de GABA-A (GABRA2), B) Subunidade do Receptor 1 Tipo B de GABA-A (GABBR1) e C) Receptor 1 de Dopamina (DRD1)

[0056] Figura 35: Alterações na Expressão no Córtex Pré-frontal de A) Receptor de Ocitocina, B) Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), C) Receptor Mineralocorticoide e D) Receptor Glicocorticoide

[0057] Figura 36: Alterações na Expressão do Córtex Pré-Frontal de A) Receptor do Tipo Toll 4 (TLR-4), B) Receptor 1 do Hormônio Li-

berador de Corticotrofina (CRFR1), C) Receptor 2 do Hormônio Libera- dor de Corticotrofina (CRFR2) e D) Integrina Alfa M (CD11b)

[0058] Figura 37: Alterações na Expressão do Córtex Pré-frontal de A) Interleucina-6 (IL-6), B) Subunidade 2A do Receptor lonotrópico de Glutamato Tipo NMDA (Grin2A), C) Subunidade 2B do Receptor lono- trópico de Glutamato Tipo NMDA (Grin2B) e D) Subunidade Alfa 2 do Receptor de GABA-A (GABRA?2)

[0059] Figura 38: Alterações na Expressão no Córtex Pré-frontal de A) Subunidade 1 do Receptor Tipo B do Receptor GABA-A (GABBR1) e B) Receptor 1 da Dopamina (DRD1)

[0060] Figura 39: Alterações na Expressão no Cólon de A) Tripto- fano Hidroxilase-1 (Tph1) e B) Indoleamina2,3-Dioxigenase-1 (IDO1)

[0061] Figura 40: Alterações na Expressão no Íleo de A) Triptofano Hidroxilase-1 (Tph1) e B) Indoleamina2,3-Dioxigenase-1 (IDO1)

[0062] Figura 41: Alterações nos Níveis Circulantes de Metabólitos do Triptofano A) Quinurenina, B) Triptofano e C) Índice de Metabolismo de Quinurenina/Triptofano

[0063] Figura 42: Efeito na Produção de Interferon-y a partir de Es- plenócitos de camundongos alimentados com MRx0029

[0064] Figura 43: Efeito na produção de interleucina-1B a partir de Esplenócitos

[0065] Figura 44: Efeito na Produção de Interleucina-6 a partir de Esplenócitos

[0066] Figura 45: Efeito na Produção do Fator de Necrose Tumoral a partir de Esplenócitos

[0067] Figura 46: Efeito na Produção de Interleucina-10 a partir de Esplenócitos

[0068] Figura 47: Efeito na Produção de Quimioatrativos CXCL1 a partir de Esplenócitos

[0069] Figura 48: Alterações nos Níveis de Ácidos Graxos de Ca- deia Curta no Ceco

[0070] Figura 49: Alterações induzidas por MRx0029 e MRX005 nos níveis de expressão gênica de Actina, Villina, Ocludina TJP1, TJP2, MAP?2, DRD2, GABRB3, SYP, PENK1, PARK7 e NSE.

[0071] Figura 50: Diferenciação de células SHSY5Y induzida por MRx0005 e MRx0029. (A-C) Imagens representativas de células imuno- marcadas com Faloidina e MAP2. (D—F) Imagens de A-C mescladas com imagens DAPI. (G—TI) Células imunomarcadas com B3 tubulina. (J- L) mesclada com imagens DAPI.Ampliação x630. Análise western blot dos efeitos do tratamento com MRx0005 e MRx0029 em células SHSY5Y. As membranas de western blot foram sondadas com anticor- pos para MAP2 (M) e b3 tubulina (N). Actina foi usada como um controle de carregamento. Painéis inferiores: blots representativos de uma das seis experiências separadas; painéis superiores: intensidade densito- métrica relativa.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO Cepas bacterianas

[0072] As composições da invenção compreendem uma cepa bac- teriana do gênero Megasphaera. Os exemplos demonstram que as bac- térias deste gênero são úteis no tratamento ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos. As cepas bacterianas preferidas são da espécie Megasphaera massiliensis.

[0073] Exemplos de espécies de Megasphaera para uso na inven- ção incluem Megasphaera elsdenii, Megasphaera cerevisiae, Megas- phaera massiliensis, Megasphaera indica, Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis e Megasphaera micronuciformis. Um outro exemplo de uma espécie de Megasphaera para uso na invenção é a Megasphaera hexanoica. Megasphaera são micróbios gastrointestinais obrigatoriamente anaeróbicos, fermentadores de lactato, de mamíferos ruminantes e não ruminantes, incluindo humanos.

[0074] O tipo de cepa da M. massiliensis é NP3 (=CSUR P245= DSM 26228) [22]. O número de acesso do GenBank para as sequências do gene de 16S rRNA da cepa NP3 de M. massiliensis é JX424772.1 (divulgado neste documento como SEQ ID NO: 1).

[0075] A bactéria Megasphaera massiliensis testada nos Exemplos é referida neste documento como cepa MRx0029. Uma sequência de 16S rRNA para a cepa MRx0029 que foi testada é fornecida na SEQ ID NO: 2.

[0076] A cepa MRx0029 foi depositada junto da autoridade interna- cional de depósitos NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9Y A, Escócia) pela 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 13 de julho de 2017 como "Megasphaera massiliensis MRx0029" e recebeu o nú- mero de acesso NCIMB 42787.

[0077] Espera-se que as cepas bacterianas estreitamente relacio- nadas com a cepa testada nos exemplos também sejam eficazes para tratar ou prevenir distúrbios neurodegenerativos. Em certas modalida- des, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Megas- phaera massiliensis. Preferencialmente, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 91%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. Prefe- rencialmente, a identidade de sequência é para SEQ ID NO: 2. Prefe- rencialmente, a cepa bacteriana para uso na invenção tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2.

[0078] Também se espera que cepas bacterianas que são biótipos das cepas MRx0029 ou NP3 sejam eficazes no tratamento ou preven-

ção de distúrbios neurodegenerativos. Um biótipo é uma cepa estreita- mente relacionada que tem as mesmas características, ou característi- cas fisiológicas e bioquímicas muito semelhantes.

[0079] As cepas que são biótipos de cepas MRx0029 ou NP3 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas por se- quenciação de outras sequências nucleotídicas para as cepas MRx0029 ou NP3. Por exemplo, substancialmente todo o genoma pode ser se- quenciado e uma cepa de biótipo para uso na invenção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência em pelo menos 80% de todo o seu genoma (por exemplo, em pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99%, ou em todo o seu genoma). Outras sequências adequadas para uso na identificação de cepas de biótipo podem incluir hsp60 ou sequências repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)s ou REP ou [23]. As cepas de biótipo podem ter sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente das cepas MRx0029 ou NP3.

[0080] Alternativamente, as cepas que são biótipos das cepas MRx0029 ou NP3 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas usando as cepas MRx0029 ou NP3 e análise de frag- mentos de restrição e/ou análise de PCR, por exemplo, usando polimor- fismo de comprimento de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) e impressão digital (rep)-PCR repetitiva de elemento de DNA, ou perfil de proteínas, ou sequenciamento parcial de 16S ou 238 rDNA. Em mo- dalidades preferidas, essas técnicas podem ser utilizadas para identifi- car outras cepas de Megasphaera massiliensis.

[0081] Em certas modalidades, cepas que são biótipos das cepas MRx0029 ou NP3 e que são adequadas para uso na invenção são ce- pas que fornecem o mesmo padrão das cepas MRx0029 ou NP3 quando analisadas por análise de restrição de DNA ribossomal amplifi- cada (ARDRA), por exemplo, ao usar a enzima de restrição Sau3Al (para métodos e orientações exemplificativas, veja, por exemplo, [24]). Alternativamente, as cepas de biótipo são identificadas como cepas que possuem os mesmos padrões de fermentação de carboidratos que as cepas MRx0029 ou NP3.

[0082] Outras cepas de Megasphaera que são úteis nas composi- ções e métodos da invenção, tais como biótipos de cepas MRx0029 ou NP3, podem ser identificadas usando qualquer método ou estratégia apropriados, incluindo os ensaios descritos nos exemplos. Por exemplo, as cepas para uso na invenção podem ser identificadas cultivando-se com células de neuroblastoma e depois avaliando os níveis de citocinas e os níveis de neuroproteção ou neuroproliferação. Em particular, cepas bacterianas que têm padrões de crescimento semelhantes, tipo meta- bólico e/ou antígenos de superfície para cepas MRx0029 ou NP3 podem ser úteis na invenção. Uma cepa útil terá atividade moduladora imuno- lógica comparável às cepas MRx0029 ou NP3. Em particular, uma cepa de biótipo irá induzir efeitos comparáveis nos modelos de doença neu- rodegenerativa e efeitos comparáveis nos níveis de citocina mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos.

[0083] Uma cepa particularmente preferida da invenção é a cepa MRx0029 da Megasphaera massiliensis. Esta é a cepa exemplificativa testada nos exemplos e que se mostrou eficaz no tratamento de doen- ças. Portanto, a invenção fornece uma célula, como uma célula isolada, da cepa MRx0029 da Megasphaera massiliensis ou um derivado desta. A invenção também fornece uma composição que compreende uma cé- lula da cepa MRx0029 da Megasphaera massiliensis ou um derivado desta. A invenção também fornece uma cultura biologicamente pura da cepa MRx0029 da Megasphaera massiliensis. A invenção também for- nece uma célula da cepa MRx0029 da Megasphaera massiliensis ou um derivado desta, para uso em terapia, em particular para as doenças des- critas neste documento.

[0084] Uma cepa particularmente preferida da invenção é a cepa da Megasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB

42787. Esta é a cepa MRx0029 exemplificativa testada nos exemplos e que se mostrou eficaz para o tratamento de doenças. Portanto, em outro aspecto, a invenção fornece uma célula da cepa da Megasphaera mas- siliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787, ou um de- rivado desta. A invenção também fornece uma composição compreen- dendo uma célula da cepa da Megasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787, ou um derivado desta. Ainven- ção também fornece uma cultura biologicamente pura da cepa da Me- gasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB

42787. A invenção também fornece uma célula da cepa de Megas- phaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787, ou um derivado desta, para uso em terapia, em particular para as doen- ças descritas neste documento.

[0085] Um derivado da cepa da invenção pode ser uma cepa filha (descendência) ou uma cepa cultivada (subclonada) a partir da original. Um derivado de uma cepa da invenção pode ser modificado, por exem- plo, a nível genético, sem ablação da atividade biológica. Particular- mente, uma cepa derivada da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá atividade terapêutica comparável à cepa MRx0029. Particularmente, uma cepa de biótipo irá induzir efeitos comparáveis nos modelos de doença neurodegenerativa e efeitos comparáveis nos níveis de citocina aos efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos. Um derivado da cepa MRx0029 geralmente será um bi- ótipo da cepa MRx0029.

[0086] As referências a células da cepa MRx0029 da Megasphaera massiliensis abrangem todas as células que possuem as mesmas ca- racterísticas de segurança e eficácia terapêutica que a cepa MRx0029, e essas células são abrangidas pela invenção.

[0087] Nas modalidades preferidas, as cepas bacterianas nas com- posições da invenção são viáveis e capazes de colonizar parcial ou to- talmente o intestino.

[0088] Os inventores descobriram que certas cepas da Megas- phaera massiliensis reduzem a ativação de citocinas inflamatórias como IL-6 e aumentam a ativação da citocina inflamatória IL-8. A IL-8 está implicada na formação da bainha de mielina [25]. A inflamação crônica induzida por IL-6 pode levar à morte celular. Portanto, as cepas bacteri- anas da invenção são particularmente úteis no tratamento ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos. Em algumas modalidades, as cepas bacterianas são úteis no tratamento de condições caracterizadas pela ativação aprimorada de IL-6. Em algumas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas caracterizadas por desmielinização. Muitas doen- ças neurodegenerativas são caracterizadas por desmielinização. A des- mielinização impede a propagação de potenciais de ação dentro dos neurônios, prejudicando a comunicação eficaz dentro do sistema ner- voso. Demonstrou-se que a IL-8 contribui positivamente para a forma- ção e reparo da bainha de mielina. Portanto, as composições da inven- ção são particularmente benéficas no tratamento ou prevenção de dis- túrbios neurodegenerativos caracterizados por desmielinização, como Esclerose Múltipla.

[0089] Os inventores descobriram que as cepas da Megasphaera massiliensis da invenção aliviam sintomas de doenças neurodegenera- tivas em modelos da doença. Por exemplo, os inventores descobriram que as cepas da Megasphaera massiliensis promovem o desenvolvi- mento de neurites in vitro e podem, portanto, ser usadas na promoção da restauração de neurônios para o tratamento ou prevenção de doen- ças neurodegenerativas.

[0090] Assim, as cepas bacterianas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas.

[0091] Os inventores também descobriram que as cepas bacteria- nas da invenção aumentam a ativação do BDNF. O BDNF é um fator de crescimento neurotrófico que demonstrou aumentar a diferenciação e a sobrevivência dos neurônios. Assim, as composições da invenção po- dem ser utilizadas em um método para melhorar a sobrevivência das células nervosas no tratamento ou prevenção de doenças neurodege- nerativas.

[0092] Uma outra bactéria que pode ser utilizada nas composições da invenção é a espécie Parabacteroides distasonis. Os exemplos de- monstram que a Parabacteroides distasonis e a Megasphaera massili- ensis têm atividades neuroprotetoras, mas produzem metabólitos dife- rentes e podem ter diferentes mecanismos de ação e atividades neuro- protetoras específicas. Portanto, essas espécies podem ser particular- mente eficazes quando usadas em combinação. Em modalidades pre- feridas, a composição compreende uma cepa da espécie Parabacteroi- des distasonis e uma cepa da espécie Megasphaera massiliensis.

[0093] A bactéria Parabacteroides distasonis depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42382 foi testada nos Exemplos e também é referida neste documento como cepa MRx0005. MRX0005, MRX00O5, MRx005 e MRx0005 são utilizados neste documento de forma intercam- biável. Uma sequência de 16S rRNA para a cepa MRx0005 que foi tes- tada é fornecida na SEQ ID NO: 17. A cepa MRx0005 foi depositada com a autoridade internacional de depósitos NCIMB, Ltd. (Ferguson Bui- Iding, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) pela GT Biologies Ltd. (Life Sci- ences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 12 de março de 2015 como “Parabacteroides sp 755" e recebeu o número de acesso NCIMB 42382. GT Biologies Ltd. Posteriormente mudou seu nome para 4D Pharma Research Limited.

[0094] Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma compo- sição compreendendo a cepa depositada na NCIMB sob o número de acesso NCIMB 42787, ou um derivado ou biótipo desta, e a cepa depo- sitada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 42382, ou um deri- vado ou biótipo desta, preferencialmente para uso em terapia, preferen- cialmente para uso no tratamento de uma doença neurodegenerativa como a doença de Parkinson. Usos terapêuticos

[0095] Como demonstrado nos exemplos, as composições bacteri- anas da invenção são eficazes no tratamento de distúrbios neurodege- nerativos. Em particular, o tratamento com composições da invenção aumenta a neuroproliferação e atua como um neuroprotetor contra agentes que destroem neurônios dopaminérgicos. Portanto, as compo- sições da invenção podem ser úteis para tratar ou prevenir distúrbios neurodegenerativos que são o resultado da morte de neurônios.

[0096] As composições da invenção podem diminuir a ativação do promotor NFKB, que ativa a produção de citocinas, por exemplo IL-16, IL-1a, I1L-18, TNFa e IL-6. O tratamento de células com a-sinucleína mu- tante é um modelo para o Parkinson familiar. Uma mutação pontual na posição 53 de adenina para treonina leva a um mau enovelamento da a-sinucleína. A a-sinucleína enovelada incorretamente se agrega pos- teriormente emfibrilas insolúveis que formam corpos de Lewy. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis para o tratamento ou pre-

venção de distúrbios neurodegenerativos que são resultado de neuroin- flamação, mau enovelamento de proteínas e/ou exposição ambiental. As composições da invenção podem ser utilizadas para o tratamento de Parkinson familiar. A ativação do promotor NFKB é mediada através do ligante de TLRA4. Sabe-se que o TLR4 media a morte celular no modelo de camundongo MPTP, que simula a doença de Parkinson. As compo- sições da invenção podem ser usadas para inibir a capacidade de sina- lização TLRA de ativar o promotor NFKB. De particular relevância para a PD, tanto o TLR2 quanto o TLR4 foram considerados como regulados positivamente no cérebro de pacientes com PD [26]. Além disso, a a- syn foi descrita como um ligante para TLR2 [27] e demonstramos que a a-syn também é um ligante para TLR4 usando células HEK-TLRA4 [28].

[0097] As composições da invenção diminuem a secreção de cito- cinas pró-inflamatórias, como IL-6, que podem ser induzidas por lipopo- lissacarídeo (LPS). O tratamento de células com LPS simula Parkinson causado por fatores ambientais. As composições da invenção podem ser usadas para diminuir a secreção de IL-6. As composições da inven- ção podem ser utilizadas para o tratamento de Parkinson ambiental.

[0098] Exemplos de doenças neurodegenerativas a serem tratadas por composições da invenção incluem: doença de Parkinson, incluindo paralisia supranuclear progressiva, paralisia supranuclear progressiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia por pressão normal, parkinsonismo vascular ou arteriosclerótico e parkinsonismo in- duzido por fármacos; mal de Alzheimer, incluindo síndrome de Benson; esclerose múltipla; doença de Huntington; esclerose lateral amiotrófica; doença de Lou Gehrig; doença do neurônio motor; doença priônica; ata- xia espinocerebelar; atrofia muscular espinhal; demência, incluindo corpo de Lewy, demência vascular e frontotemporal; afasia progressiva primária; comprometimento cognitivo leve; comprometimento cognitivo relacionado ao HIV e degeneração corticobasal. Outras doenças a se- rem tratadas pelas composições da invenção é a neuropatia inflamatória progressiva.

[0099] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução da morte de neurônios, em particular no tratamento de distúrbios neurodegenerativos. Em certas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso na proteção de neurônios, em particular no tratamento de distúrbios neurodegenerativos.

[00100] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção de perda de células dopaminérgicas na substância negra. Em certas modalidades, as composições da inven- ção são para uso na redução ou prevenção da degeneração de neurô- nios dopaminérgicos na pars compacta da substância negra. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção da degeneração de neurônios dopaminérgicos na pars com- pacta da substância negra e na consequente perda de suas fibras ner- vosas projetadas no estriado. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução ou prevenção de perda de neurô- nios dopaminérgicos nigroestriatais.

[00101] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no aumento dos níveis de dopamina. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no aumento dos níveis de DOPAC (ácido 3,4-dihidroxifenilacético). Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no aumento dos níveis de do- pamina e DOPAC. Em certas modalidades, os níveis de dopamina e/ou DOPAC são aumentados no estriado. Os níveis de dopamina e DOPAC podem ser medidos usando qualquer método apropriado conhecido na técnica, como um método radioenzimático, por exemplo no plasma ou CSF (por exemplo, como descrito em [29]), ou um método HPLC de fase reversa, talvez com detecção eletroquímica, por exemplo, no plasma ou no CSF (por exemplo, conforme descrito em [30]).

[00102] As propriedades neuroprotetoras das composições da inven- ção, como mostrado nos exemplos, significam que as composições po- dem ser particularmente eficazes para a prevenção ou retardamento do início ou da progressão de distúrbios neurodegenerativos. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no retarda- mento do início ou na progressão de distúrbios neurodegenerativos.

[00103] As composições da invenção podem aumentar a secreção de IL-8. Foi demonstrado que a IL-8 desempenha um papel na mielini- zação dos neurônios. Em algumas modalidades, as composições da in- venção podem ser usadas para aumentar a secreção de IL-8.

[00104] As composições terapêuticas da invenção podem aumentar a ativação do BDNF. O BDNF atua em certos neurônios do sistema ner- voso central para apoiar a sobrevivência dos neurônios existentes e aju- dar no crescimento e desenvolvimento de novos neurônios e sinapses. O BDNF é ativo no hipocampo, no córtex e no prosencéfalo basal e é importante para a memória de longo prazo. As composições da inven- ção podem, portanto, ser utilizadas para aumentar a secreção de BDNF. As composições podem, portanto, ser utilizadas no tratamento de doen- ças neurodegenerativas associadas ao comprometimento da memória de longo prazo. As composições da invenção podem ser utilizadas para melhorar a memória de longo prazo, em particular para melhorar a me- mória de longo prazo que é prejudicada por uma doença neurodegene- rativa.

[00105] Em certas modalidades, as composições da invenção au- mentam a atividade metabólica das mitocôndrias nas células neuronais. Modulação do eixo microbiota-intestino-cérebro

[00106] A comunicação entre o intestino e o cérebro (o eixo microbi- ota-intestino-cérebro) ocorre através de um sistema de comunicação neuro-humoral bidirecional. Evidências recentes mostram que a micro- biota que reside no intestino pode modular o desenvolvimento do cére- bro e produzir fenótipos comportamentais através do eixo microbiota- intestino-cérebro. De fato, várias revisões sugerem um papel do eixo microbiota-intestino-cérebro na manutenção da funcionalidade do sis- tema nervoso central e da disfunção implicada do eixo microbiota-intes- tino-cérebro no desenvolvimento de distúrbios e condições do sistema nervoso central [16], [19], [31].

[00107] A comunicação bidirecional entre o cérebro e o intestino (ou seja, o eixo intestino-cérebro) inclui o sistema nervoso central, sistemas neuroendócrinos e neuroimunes, incluindo o eixo hipotálamo-pituitária- adrenal (HPA), braços simpáticos e parassimpáticos do sistema ner- voso autônomo (ANS), incluindo o sistema nervoso entérico (ENS) e o nervo vago e a microbiota intestinal.

[00108] “Como demonstrado nos exemplos, as composições da pre- sente invenção podem modular o eixo microbiota-intestino-cérebro e re- duzir a morte celular associada a distúrbios neurodegenerativos. Por conseguinte, as composições da invenção podem ser úteis para o tra- tamento ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos, em particular aqueles distúrbios e condições associados à disfunção do eixo microbi- ota-intestino-cérebro.

[00109] Em modalidades particulares, as composições da invenção podem ser úteis para tratar ou prevenir uma doença ou condição sele- cionada do grupo que consiste em: doença de Parkinson, incluindo pa- ralisia supranuclear progressiva, paralisia supranuclear progressiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia por pressão normal, parkinsonismo vascular ou arteriosclerótico e parkinsonismo in- duzido por fármacos; mal de Alzheimer, incluindo síndrome de Benson; esclerose múltipla; doença de Huntington; esclerose lateral amiotrófica;

doença de Lou Gehrig; doença do neurônio motor; doença priônica; ata- xia espinocerebelar; atrofia muscular espinhal; demência; incluindo corpo de Lewy, demência vascular e frontotemporal; afasia progressiva primária; comprometimento cognitivo leve; comprometimento cognitivo relacionado ao HIV e degeneração corticobasal.

[00110] As composições da invenção podem ser particularmente úteis para tratar ou prevenir doenças crônicas, tratar ou prevenir doen- ças em pacientes que não responderam a outras terapias (como trata- mento com Levodopa, agonistas da dopamina, inibidores de MAO-B, inibidores de COMT, antagonistas do glutamato, e/ou anticolinérgicos) e/ou tratamento ou prevenção dos danos e sintomas teciduais associa- dos à disfunção do eixo microbiota-intestino-cérebro.

[00111] Emcertas modalidades, as composições da invenção modu- lam o CNS. Em algumas modalidades, as composições da invenção modulam o sistema nervoso autônomo (ANS). Em algumas modalida- des, as composições da invenção modulam o sistema nervoso entérico (ENS). Em algumas modalidades, as composições da invenção modu- lam o eixo hipotalâmico, pituitário, adrenal (HPA). Em algumas modali- dades, as composições da invenção modulam a via neuroendócrina. Em algumas modalidades, as composições da invenção modulam a via neu- roimune. Em algumas modalidades, as composições da invenção mo- dulam o CNS, o ANS, o ENS, o eixo HPA e/ou as vias neuroendócrinas e neuroimunes. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam os níveis de metabólitos comensais e/ou a permeabilidade gastrointestinal de um sujeito.

[00112] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada por sistemas neurais. Por conseguinte, em algumas modalidades, as composições da invenção modulam a sinalização em sistemas neu- rais. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam a sinalização do sistema nervoso central. Em algumas modalidades, as composições da invenção modulam a sinalização em neurônios senso- riais. Em outras modalidades, as composições da invenção modulam a sinalização em neurônios motores. Em algumas modalidades, as com- posições da invenção modulam a sinalização no ANS. Em algumas mo- dalidades, o ANS é o sistema nervoso parassimpático. Em modalidades preferenciais, ascomposições da invenção modulam a sinalização do nervo vago. Em outras modalidades, o ANS é o sistema nervoso simpá- tico. Em outras modalidades, as composições da invenção modulam a sinalização no sistema nervoso entérico. Em certas modalidades, a si- nalização dos neurônios ANS e ENS responde diretamente ao conteúdo luminal do trato gastrointestinal. Em outras modalidades, a sinalização dos neurônios ANS e ENS responde indiretamente aos neuroquímicos produzidos por bactérias luminais. Em outras modalidades, a sinaliza- ção dos neurônios ANS e ENS responde a neuroquímicos produzidos por bactérias luminais ou células enteroendócrinas. Em certas modali- dades preferidas, os neurônios do ENS ativam aferentes vagais que in- fluenciam as funções do CNS. Em algumas modalidades, as composi- ções da invenção regulam a atividade das células enterocromafinas. Doenças Neurodegenerativas Doença de Parkinson

[00113] —Adoença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa co- mum caracterizada neuropatologicamente pela degeneração de popu- lações heterogêneas de células neurais (células produtoras de dopa- mina). O diagnóstico clínico da doença de Parkinson requer bradicinesia e pelo menos um dos seguintes sintomas principais: tremor em repouso; rigidez muscular e comprometimento do reflexo postural. Outros sinais e sintomas que podem estar presentes ou se desenvolver durante a progressão da doença são distúrbios autonômicos (sialorreia, seborreia, constipação, distúrbios de micção, funcionamento sexual, hipotensão ortostática, hiperidrose), distúrbios do sono e distúrbios no sentido do olfato ou na sensação de temperatura. A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa que pode se desenvolver ou persistir devido à disfunção do eixo microbiota-intestino-cérebro. Portanto, em modali- dades preferidas, as composições da invenção são para uso no trata- mento ou prevenção da doença de Parkinson em um sujeito.

[00114] Nas modalidades adicionais preferidas, a invenção fornece uma composição compreendendo uma cepa bacteriana do gênero Me- gasphaera para uso em um método de tratamento ou prevenção da do- ença de Parkinson. As composições compreendendo uma cepa bacte- riana do gênero Megasphaera podem melhorar as funções motoras e cognitivas em modelos da doença de Parkinson. O tratamento com as cepas da Megasphaera pode modular a sinalização nos sistemas ner- vosos central, autonômico e entérico; pode modular a atividade da via do eixo HPA; pode modular vias neuroendócrinas e/ou neuroimunes; e pode modular os níveis de metabólitos comensais, marcadores inflama- tórios e/ou permeabilidade gastrointestinal de um sujeito, todos os quais estão implicados na neuropatologia da doença de Parkinson. Em moda- lidades preferidas, a invenção fornece uma composição compreen- dendo uma cepa bacteriana da espécie Megasphaera massiliensis para uso em um método de tratamento ou prevenção da doença de Parkin- son. As composições usando Megasphaera massiliensis podem ser par- ticularmente eficazes no tratamento da doença de Parkinson.

[00115] Em modalidades preferidas, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam um ou mais dos sintomas da doença de Parkinson em um sujeito. Em modalidades preferidas, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam um ou mais sintomas princi- pais da doença de Parkinson em um sujeito. Em certas modalidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam a bradicinesia em um sujeito. Em certas modalidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam o tremor em repouso; rigidez muscular e/ou comprometimento do reflexo postural em um sujeito. Em certas modalidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou ali- viam um ou mais sintomas associados à progressão da doença de Par- kinson selecionados a partir de distúrbios autonômicos (sialorreia, se- borreia, constipação, distúrbios de micção, funcionamento sexual, hipo- tensão ortostática, hiperidrose), distúrbios de sono e distúrbios no sen- tido do olfato ou na sensação de temperatura.

[00116] Em modalidades preferidas, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam sintomas depressivos comórbidos com a doença de Parkinson. Em certas modalidades, as composições da in- venção melhoram a memória verbal e/ou as funções executivas. Em certas modalidades, as composições da invenção melhoram a atenção, memória de trabalho, fluência verbal e/ou ansiedade.

[00117] Em outras modalidades preferidas, as composições da in- venção previnem, reduzem ou aliviam disfunções cognitivas comórbidas com a doença de Parkinson.

[00118] Em certas modalidades, as composições da invenção previ- nem, reduzem ou aliviam a progressão da doença de Parkinson. Em certas modalidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam complicações motoras posteriores. Em certas modalidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam flutuações motoras tardias. Em certas modalidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam a perda neuronal. Em certas modalida- des, as composições da invenção melhoram os sintomas da demência da doença de Parkinson (PDD). Em certas modalidades, as composi- ções da invenção previnem, reduzem ou aliviam o comprometimento da função executiva, atenção e/ou memória de trabalho. Em certas moda- lidades, as composições da invenção melhoram a neurotransmissão do- paminérgica. Em certas modalidades, as composições da invenção pre-

vinem, reduzem ou aliviam a neurotransmissão dopaminérgica compro- metida.

[00119] Em algumas modalidades, as composições da invenção me- lhoram os sintomas da doença de Parkinson de acordo com uma escala sintomática ou diagnóstica. Em certas modalidades, os testes para ava- liar a melhora sintomática da função motora na doença de Parkinson são a Escala Unificada de Classificação da Doença de Parkinson. Em particular, a UPDRS |l considera a atividade da vida diária e a UPDRS Ill considera o exame motor.

[00120] Em algumas modalidades, as composições da invenção me- lhoram os sintomas associados à PDD de acordo com um teste e/ou escala sintomáticos ou diagnósticos. Em certas modalidades, o teste ou escala são selecionados entre o Teste de Aprendizagem Verbal de Hopkins - Revisado (HVLT-R); Sistema Delis-Kaplan de Avaliação do Funcionamento Executivo (D-KEFS) Teste de Interferência Cor-Palavra; a Escala de Avaliação de Depressão de Hamilton (HAM-D 17; depres- são); a Escala de Avaliação de Ansiedade de Hamilton (HAM-A; ansie- dade) e a Escala Unificada de Avaliação de Doença de Parkinson (UP- DRS; gravidade dos sintomas da PD).

[00121] Em algumas modalidades, as composições da invenção me- lhoram a escala da Impressão Global Clínica - Melhora Global (CGI-I) para avaliar distúrbios psiquiátricos e neurológicos. Em algumas moda- lidades, as composições da invenção exibem um efeito positivo no com- prometimento social e ocupacional global do sujeito com doença de Par- kinson.

[00122] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve a redução ou prevenção da perda de células dopaminérgicas na substân- cia negra. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve a redução ou prevenção da degeneração de neurônios dopaminérgicos na pars compacta da substância negra. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve a redução ou prevenção da degeneração de neurônios dopaminérgicos na pars compacta da substância negra e a consequente perda de suas fibras nervosas projetadas no estriado. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tra- tamento ou prevenção de distúrbios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve reduzir ou pre- venir a perda de neurônios dopaminérgicos nigroestriatais.

[00123] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve níveis crescentes de dopamina. Em certas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de distúr- bios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve níveis crescentes de DOPAC. Em certas modali- dades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou pre- venção de distúrbios neurológicos, como a doença de Parkinson, em um sujeito em que o referido uso envolve o aumento dos níveis de do- pamina e DOPAC. Em certas modalidades, os níveis de dopamina e/ou DOPAC são aumentados no estriado. Mal de Alzheimer e demência

[00124] No DSM-5, o termo demência foi substituído pelos termos distúrbio neurocognitivo maior e distúrbio neurocognitivo leve. O distúr- bio neurocognitivo é uma classe heterogênea de doenças psiquiátricas. O distúrbio neurocognitivo mais comum é o mal de Alzheimer, seguida por demências vasculares ou formas mistas das duas. Outras formas de distúrbios neurodegenerativos (por exemplo, doença do corpo de Lewy, demência frontotemporal, demência de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Huntington e síndrome de Wernicke-Kor- sakoff) são acompanhadas por demência.

[00125] O malde Alzheimer e a demência também são caracteriza- das por perda neuronal, de modo que os efeitos neuroprotetores e neu- roproliferativos mostrados nos exemplos para as composições da inven- ção indicam que eles podem ser úteis no tratamento ou prevenção des- sas condições.

[00126] Os critérios sintomáticos para demência sob o DSM-5 são evidências de declínio cognitivo significativo de um nível anterior de de- sempenho em um ou mais domínios cognitivos selecionados dentre: aprendizado e memória; língua; função executiva; atenção complexa; cognição perceptivo-motora e social. Os déficits cognitivos devem inter- ferir na independência nas atividades cotidianas. Além disso, os déficits cognitivos não ocorrem exclusivamente no contexto de um delírio e não são melhor explicados por outro transtorno mental (por exemplo, DDM ou esquizofrenia).

[00127] — Além do sintoma primário, os sujeitos com distúrbios neuro- degenerativos apresentam sintomas comportamentais e psiquiátricos, incluindo agitação, agressão, depressão, ansiedade, apatia, psicose e distúrbios do ciclo de vigília.

[00128] Os distúrbios neurodegenerativos podem se desenvolver ou persistir devido à disfunção do eixo microbiota-intestino-cérebro. Por- tanto, em modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos em um sujeito. Em modalidades preferidas, o distúrbio neurodegenera- tivo é o mal de Alzheimer. Em outras modalidades, o distúrbio neurode- generativo é selecionado a partir de demências vasculares; doença de

Alzheimer de forma mista e demência vascular; doença do corpo de Lewy; demência frontotemporal; demência de Parkinson; doença de Creutzfeldt-Jakob; doença de Huntington; e síndrome de Wernicke-Kor- sakoff.

[00129] Em modalidades preferidas, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam um ou mais dos sintomas de distúrbios neurodegenerativos um sujeito. Em certas modalidades, as composi- ções da invenção impedem, reduzem ou aliviam a ocorrência de declí- nio cognitivo em um sujeito. Em certas modalidades, as composições da invenção melhoram o nível de desempenho de um sujeito com dis- túrbios neurodegenerativos em um ou mais domínios cognitivos seleci- onados dentre: aprendizado e memória; língua; função executiva; aten- ção complexa; cognição perceptivo-motora e social. Em algumas moda- lidades, as composições da invenção previnem, reduzem ou aliviam a ocorrência de um ou mais sintomas comportamentais e psiquiátricos as- sociados a distúrbios neurodegenerativos selecionados dentre agitação, agressão, depressão, ansiedade, apatia, psicose e distúrbios do ciclo de vigília.

[00130] Em certas modalidades, as composições da invenção previ- nem, reduzem ou aliviam doenças sintomáticas por intervenção em me- canismos patogênicos suspeitos em um estágio pré-clínico. Em certas modalidades, as composições da invenção melhoram a modificação da doença, com desaceleração ou interrupção da progressão dos sinto- mas. Em algumas modalidades, a desaceleração ou interrupção da pro- gressão dos sintomas se correlacionam com evidências no atraso do processo neuropatológico subjacente. Em modalidades preferidas, as composições da invenção melhoram os sintomas de distúrbios neuro- degenerativos compreendendo melhoria cognitiva e funcional aprimo- rada. Em modalidades preferidas, as composições da invenção melho- ram os sintomas comportamentais e psiquiátricos da demência (SCPD).

Em modalidades preferidas, as composições da invenção melhoram a capacidade de um sujeito com distúrbio neurodegenerativo de realizar atividades diárias.

[00131] Em modalidades preferidas, as composições da invenção melhoram a cognição e o funcionamento de um sujeito com mal de Al- zheimer. Em algumas modalidades, a composição da invenção melhora o desfecho cognitivo em um sujeito com mal de Alzheimer. Em algumas modalidades, ascomposições da invenção melhoram o desfecho funci- onal em um sujeito com mal de Alzheimer. Em modalidades preferidas, as composições da invenção melhoram o desfecho cognitivo e funcional em um sujeito com mal de Alzheimer. Em ainda outras modalidades pre- feridas, as composições da invenção melhoram a resposta clínica geral (o desfecho global) em um sujeito com mal de Alzheimer.

[00132] Em algumas modalidades, as composições da invenção me- lhoram os sintomas de distúrbios neurodegenerativos de acordo com um teste sintomático ou diagnóstico. Em certas modalidades, os testes para avaliar a melhora sintomática do mal de Alzheimer (e outros distúr- bios neurodegenerativos) são selecionados a partir de cognições obje- tivas, atividades da vida diária, avaliação global de mudanças, testes de qualidade de vida relacionados à saúde e testes para avaliar sintomas comportamentais e psiquiátricos de distúrbios neurodegenerativos.

[00133] Em certas modalidades, os testes cognitivos objetivos para avaliação da melhoria sintomática usam a subescala cognitiva da Es- cala de Avaliação do mal de Alzheimer (ADAS-cog) e a escala ADAS clássica. Em certas modalidades, a melhora sintomática da cognição é avaliada usando-se a Bateria de Teste Neurofisiológico para Uso na Do- ença de Alzheimer (NTB).

[00134] Emalgumas modalidades, a avaliação global do teste de mu- dança usa a escala da Impressão Global Clínica — Melhora Global (CGI-

|) para avaliar distúrbios psiquiátricos e neurológicos. Em algumas mo- dalidades, a escala global é a Impressão de Alteração Baseada na En- trevista com o Clínico (CIBIC-plus). Em algumas modalidades, a escala global é a Impressão Global de Alteração do Clínico da Unidade de Es- tudo Cooperativo para o Mal de Alzheimer (ADCS-CGIC).

[00135] Em certas modalidades, as medidas de qualidade de vida relacionadas à saúde são a QOL Relacionada ao Mal de Alzheimer (ADRAQL) e a QOL de Mal de Alzheimer (QOL-AD).

[00136] Em certas modalidades, os testes que avaliam sintomas comportamentais e psiquiátricos de distúrbios neurodegenerativos são selecionados dentre a Escala de Classificação de patologia Comporta- mental no Mal de Alzheimer (BEHAVE-AD); a Escala de Avaliação Com- portamental para Demência (BRSD); o Inventário Neuropsiquiátrico (NPI); e o Inventário de Agitação de Cohen-Mansfield (CMAI).

[00137] Em algumas modalidades, as composições da invenção são particularmente eficazes na prevenção, redução ou alívio de distúrbios neurodegenerativos quando usadas em combinação com outra terapia para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos. Em certas modali- dades, essas terapias incluem inibidores da acetilcolinesterase, inclu- indo donepezil (AriceptO&), galantamina (RazadyneO) e rivastigmina (ExelonO) e memantina. Esclerose Múltipla

[00138] A esclerose múltipla (MS) é uma doença desmielinizante, na qual a bainha de mielina que circunda os neurônios no cérebro e na medula espinhal é danificada. As causas exatas subjacentes da MS são desconhecidas, mas acredita-se que variem entre os indivíduos. Certas formas de MS são hereditárias. Fatores ambientais sãotambém consi- derados como contribuintes para a MS. Em alguns indivíduos, uma com- binação de fatores genéticos e ambientais pode desencadear o apare- cimento da MS.

[00139] “Háuma grande variedade de sintomas associados à MS. Os sujeitos podem exibir quase qualquer sintoma neurológico associado ao comprometimento dos controles autonômico, visual, motor ou sensorial. Os sintomas exatos variam de acordo com o sítio do dano neuronal/des- mielinização.

[00140] AIlL-8tem sido implicada na formação de bainhas de mielina. As composições da invenção podem, portanto, ser utilizadas na remie- linização de neurônios em sujeitos com MS. As composições da inven- ção também podem ser usadas para proteger os neurônios da desmie- linização. Em outras palavras, as composições da invenção podem ser utilizadas num método de tratamento ou prevenção da esclerose múlti- pla, restaurando ou prevenindo a perda de bainhas de mielina em neu- rônios.

[00141] Em algumas modalidades, as composições da invenção im- pedem, reduzem ou aliviam um ou mais sintomas de MS em um sujeito. Em certas modalidades, as composições da invenção impedem, redu- zem ou aliviam a fadiga em um sujeito. Em certas modalidades, as com- posições da invenção impedem, reduzem ou aliviam tremores em re- pouso, fraqueza muscular, espasmos musculares, rigidez muscular, pa- restesia e/ou ataxia em um sujeito. Em certas modalidades, as compo- sições da invenção previnem, reduzem ou aliviam um ou mais sintomas associados à progressão da MS selecionados na lista que consiste em distúrbios autonômicos: constipação, distúrbios de micção, funciona- mento sexual, disfagia, disartria, síncope, vertigem e/ou tontura; distúr- bios do sono; e distúrbios no sentido do olfato ou na sensação de tem- peratura. Em algumas modalidades, as composições da invenção impe- dem, reduzem ou aliviam um ou mais sintomas oculares associados à MS. Em algumas modalidades, o sintoma ocular é selecionado da lista que consiste em perda de visão, dor ocular, daltonismo, visão dupla e/ou movimentos oculares involuntários em um sujeito.

[00142] Em algumas modalidades, as composições da invenção pre- vinem, reduzem ou aliviam tontura, vertigem, dores neuropáticas, dores musculoesqueléticas, disfunção cognitiva, incontinência intestinal, dis- fagia, disartria ou qualquer combinação destas.

[00143] Em algumas modalidades, as composições da invenção pre- vinem, reduzem ou aliviam sintomas depressivos ou ansiedade comór- bida com MS.

[00144] Em algumas modalidades, as melhorias dos sintomas são determinadas usando os critérios de McDonald de 2017 para o diagnós- tico de MS.

[00145] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção resulta em uma redução na incidência ou gravidade da MS. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução da incidência ou gravidade da recaída. Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção previne um declínio na função motora ou resulta em uma função motora melhorada associada à MS. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção de um declínio na função motora ou para uso na me- lhoria da função motora no tratamento de MS.

[00146] Em certas modalidades, o tratamento com as composições da invenção previne o desenvolvimento de paralisia na MS. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção de paralisia no tratamento de MS.

[00147] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção de esclerose múltipla em um paciente que foi identificado como em risco de esclerose múltipla, ou que foi diagnosti- cado com esclerose múltipla em estágio inicial ou esclerose múltipla "re- mitente-recorrente". As composições da invenção podem ser úteis para prevenir o desenvolvimento de MS. As composições da invenção podem ser úteis para a prevenção da progressão da MS. Em certas modalida- des, as composições da invenção são para uso em um paciente identi- ficado como tendo uma predisposição genética para a MS, como o fe- nótipo de classe Il do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), antígeno leucocitário humano (HLA)-DR2 ou HLA-DRA4.

[00148] —Ascomposições da invenção podem ser úteis para gerenciar Ou aliviar a esclerose múltipla. As composições da invenção podem ser particularmente úteis para reduzir os sintomas associados à esclerose múltipla. O tratamento ou a prevenção da esclerose múltipla podem se referir, por exemplo, a uma atenuação da gravidade dos sintomas ou a uma redução na frequência das exacerbações ou na gama de desenca- deantes que são um problema para o paciente. Em certas modalidades, as composições da invenção retardam ou interrompem a progressão da doença.

[00149] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de MS remitente-recorrente. Em modalidades alternativas, as composições da invenção são para uso no tratamento de MS progressiva, como MS secundária progressiva (SPMS), que se desenvolve ao longo do tempo após o diagnóstico de PvPvMS, MS pri- mária progressiva (PPMS), que exibe deterioração neurológica contínua gradual, e MS com recaída progressiva (PRMS), que é semelhante à PPMS, mas com recaídas sobrepostas.

[00150] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de um ou mais dos sintomas de MS seleciona- dos do grupo que consiste em: fadiga, problemas de visão, dormência, formigamento, espasmos musculares, rigidez muscular, fraqueza mus- cular, problemas de mobilidade, dor, problemas de pensamento, apren- dizado e planejamento, depressão e ansiedade, problemas sexuais, problemas de bexiga, problemas intestinais, dificuldades de fala e de- glutição.

Fatores neuroquímicos, neuropeptídeos e neurotransmissores e o eixo microbiota-intestino-cérebro

[00151] Como descrito acima, o eixo microbiota-intestino-cérebro é modulado por vários sistemas fisiológicos diferentes. O eixo microbiota- intestino-cérebro é modulado por várias moléculas de sinalização. Alte- rações nos níveis dessas moléculas sinalizadoras resultam em doenças neurodegenerativas. As experiências realizadas pelos inventores indi- cam que a administração de espécies de Megasphaera, e em particular Megasphaera massiliensis, pode modular os níveis de indol e quinure- nina. A desregulação desses metabólitos pode levar a doenças neuro- degenerativas, como a doença de Parkinson.

[00152] Em certas modalidades, as composições da invenção modu- lam os níveis de monoaminas cerebrais e metabólitos destas. Em mo- dalidades preferidas, o metabólito é quinurenina. Em certas modalida- des, as composições da invenção modulam a quinurenina, que é a prin- cipal via do metabolismo do triptofano, que serve como uma rota para a produção de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+). A quinu- renina pode ser metabolizada em compostos neuroativos, como o ácido cinurênico (KYNA) e 3-hidroxi-1-quinurenina (3-OH-1-KYN) e, em outras etapas, no ácido quinolínico (QUIN). A desregulação da via da quinure- nina pode levar à ativação do sistema imunológico e ao acúmulo de compostos potencialmente neurotóxicos. Alterações no metabolismo da quinurenina podem estar envolvidas no desenvolvimento das doenças de Parkinson. Demonstrou-se que os níveis de quinurenina diminuíram no córtex frontal, no putâmen e na pars compacta da substância negra de pacientes com PD [32]. Portanto, em certas modalidades, as compo- sições da invenção são para uso no aumento dos níveis de quinurenina no tratamento da doença de Parkinson.

[00153] Em certas modalidades da invenção, as composições da in- venção podem aumentar os níveis de quinurenina. Demonstrou-se que níveis aumentados de quinurenina atenuaram a morte celular neuronal induzida por MPP+- in vitro em uma linhagem celular de neuroblastoma dopaminérgico humano [33]. Em certas modalidades, a quinurenina e o ácido quinurênico, podem ativar o receptor GI de aril hidrocarboneto (Ahr) e os receptores GPR35. Ativação do receptor Ahr induz a produ- ção de IL-22, que pode inibir a inflamação local. Ativação do GPR35 induzindo a produção de trifosfato de inositol e mobilização de Ca2+.

[00154] Emcertas modalidades, as composições da invenção modu- lam os níveis de indol. Em modalidades preferidas, o metabólito é qui- nurenina. Em certas modalidades, as composições da invenção modu- lam a quinurenina, que é a principal via do metabolismo do triptofano.

[00155] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada por níveis de fatores neuroquímicos, neuropeptídeos e neurotrans- missores. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção modulam níveis de fatores neuroquímicos, neuropeptídeos e neurotransmissores. Por conseguinte, em certas modalidades preferi- das, as composições da invenção alteram diretamente a bioquímica do CNS.

[00156] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada pelos níveis de ácido y-aminobutírico (GABA). Por conseguinte, em modalidades preferidas, as composições da invenção modulam os ní- veis de GABA. O GABA é um neurotransmissor inibitório que reduz a excitabilidade neuronal. Em certas modalidades, as composições da in- venção aumentam os níveis de GABA. Em certas modalidades, as com- posições da invenção diminuem os níveis de GABA. Em certas modali- dades, as composições da invenção alteram a neurotransmissão GA- BAérgica. Em certas modalidades, as composições da invenção modu- lam o nível de transcrição de GABA em diferentes regiões do sistema nervoso central. Em certas modalidades, o GABA derivado comensal atravessa a barreira hematoencefálica e afeta diretamente a neurotrans- missão. Em certas modalidades, as composições da invenção levam a uma redução de GABA no hipocampo, amígdala e/ou locus coeruleus. Emcertas modalidades, as composições da invenção levam a um au- mento de GABA nas regiões corticais. Resposta imune

[00157] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada por alterações na resposta imune e em fatores e marcadores infla- matórios. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção podem modular a resposta imune. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam os níveis sistêmicos das moléculas de sinalização neuroimune circulantes. Em certas modalidades, as com- posições da invenção modulam a produção e inflamação de citocinas pró-inflamatórias. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam o estado inflamatório. Em certas modalidades, as composi- ções da invenção diminuem a produção e secreção de IL-6. Em certas modalidades, as composições da invenção diminuem a ativação do pro- motor de NFKB. Em certas modalidades, as composições da invenção são capazes de modular a ativação da produção de IL-6 pelo potente lipopolissacarídeo (LPS) de endotoxina pró-inflamatório. Em certas mo- dalidades, as composições da invenção são capazes de modular a ati- vação do promotor de NFKB por proteínas mutantes de LPS e a-sinu- cleiína, como a A53T. Níveis circulantes aumentados de citocinas estão estritamente associados a vários distúrbios neurodegenerativos, inclu- indo Parkinson, demência e Alzheimer. Em certas modalidades, as com- posições da invenção são para uso na redução dos níveis de IL-6 e/ou NFKB no tratamento de um distúrbio neurodegenerativo.

[00158] Em algumas modalidades, as composições da invenção au- mentam a secreção de IL-8. Foi demonstrado que a IL-8 induz a forma-

ção da bainha de mielina e restaura ou preserva a comunicação neuro- nal eficaz. Assim, em algumas modalidades, as composições da inven- ção são para uso na indução da formação de bainha de mielina no tra- tamento de doenças neurodegenerativas. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso na restauração da comunicação neuronal. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso na preservação da comunicação neuronal.

[00159] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada por níveis de metabólitos comensais. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção modulam os níveis sistêmi- cos dos metabólitos da microbiota. Em certas formas de realização pre- feridas, as composições da invenção modulam o nível de ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs). Em certas modalidades, o nível de AGCCs é aumentado ou diminuído. Em algumas modalidades, o AGCC é ácido butírico (AB) (ou butirato). Em algumas modalidades, o AGCC é ácido propiônico (APP). Em algumas modalidades, o AGCC é ácido acético. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam a capa- cidade dos AGCCs de atravessar a barreira hematoencefálica.

[00160] A acetilação e desacetilação de histonas são importantes re- guladores epigenéticos da expressão gênica. Um desequilíbrio na ace- tilação e desacetilação de histonas pode resultar em apoptose. A des- regulação dessas histonas acetiltransferases tem sido implicada na pa- togênese associada a doenças neurodegenerativas associadas à idade, como doença de Parkinson, doença de Huntington, mal de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e declínio cognitivo [34]. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção podem modular a atividade da histona desacetilase. Em certas modalidades, as composi- ções da invenção podem reduzir a atividade da histona desacetilase. Em certas modalidades, as composições da invenção podem reduzir a atividade da histona acetilase.

[00161] Pacientes com doenças neurodegenerativas, incluindo do- ença de Parkinson, doença de Huntington, mal de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica, apresentam altos níveis de peroxidação lipídica. Os lipídios são vulneráveis à oxidação por espécies reativas de oxigênio, e o cérebro é rico em ácidos graxos poli-insaturados. Por conseguinte, em certas modalidades, as composições da invenção podem modular a pe- roxidação lipídica. Em certas modalidades, as composições da invenção podem reduzir a peroxidação lipídica. A redução do dano oxidativo cau- sado por espécies reativas de oxigênio pode ser usada para atingir pre- cocemente os estágios das doenças neurodegenerativas. Dessa forma, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de neurodegeneração em estágio inicial. Também dessa forma, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na prevenção do desenvolvimento de um distúrbio neurodegenera- tivo. Em tais modalidades, as composições da invenção podem ser usa- das em um paciente que foi identificado como em risco de desenvolver um distúrbio neurodegenerativo.

[00162] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada por níveis de permeabilidade gastrointestinal. Por conseguinte, em algumas modalidades, as composições da invenção alteram a integri- dade do epitélio do trato gastrointestinal. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam a permeabilidade do trato gastroin- testinal. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam a função de barreira e a integridade do trato gastrointestinal. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam a motilidade do trato gastrointestinal. Em certas modalidades, as composições da inven- ção modulam a translocação de metabólitos comensais e moléculas de sinalização inflamatória para a corrente sanguínea a partir do lúmen do trato gastrointestinal.

[00163] A sinalização do eixo microbiota-intestino-cérebro é modu- lada pela composição do microbioma no trato gastrointestinal. Por con- seguinte, em certas modalidades, as composições da invenção modu- lam a composição de microbioma do trato gastrointestinal. Em certas modalidades, as composições da invenção evitam a disbiose do micro- bioma e aumentos associados de metabólitos tóxicos (por exemplo, LPS). Em certas modalidades, as composições da invenção modulam os níveis de Clostridium no trato gastrointestinal. Em modalidades pre- feridas, as composições da invenção reduzem o nível de Clostridium no trato gastrointestinal. Em certas modalidades, as composições da inven- ção reduzem os níveis de Campylobacter jejuni. Em certas modalida- des, as composições da invenção modulam a proliferação de bactérias anaeróbicas prejudiciais e a produção de neurotoxinas produzidas por essas bactérias. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam os níveis de microbioma de Lactobacillus e/ou Bifidobacte- rium. Em certas modalidades, as composições da invenção modulam os níveis de microbioma dos gêneros Sutterella, Prevotella, Ruminococcus e/ou da família Alcaligenaceae. Em certas modalidades, ascomposições da invenção aumentam o nível de Lactobacillus plantarum e/ou Saccha- romyces boulardii. Lesão cerebral

[00164] Os exemplos demonstram que as composições da invenção são neuroprotetoras e possuem atividade inibidora de HDAC. A HDAC2 é um alvo crucial para a recuperação funcional do acidente vascular ce- rebral [35] e a inibição da HDAC pode prevenir lesões na substância branca [36], de modo que as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de lesões cerebrais.

[00165] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral. Em algumas modalidades, a lesão cerebral é uma lesão cerebral traumática. Em algumas modalida- des, a lesão cerebral é uma lesão cerebral adquirida. Em algumas mo- dalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral resultante de trauma. Em algumas modalidades, as com- posições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral re- sultante de um tumor. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral resultante de um acidente vascular cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral resultante de uma hemorragia cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral resultante de encefalite. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral resultante de hipoxia cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral resultante de anoxia cerebral.

[00166] Nas modalidades preferidas, as composições da invenção são para uso no tratamento de acidente vascular cerebral. Os efeitos mostrados nos exemplos são particularmente relevantes para o trata- mento de acidente vascular cerebral. O acidente vascular cerebral ocorre quando o fluxo sanguíneo para pelo menos uma parte do cérebro é interrompido. Sem um suprimento adequado de sangue para fornecer oxigênio e nutrientes ao tecido cerebral e remover resíduos do tecido cerebral, as células cerebrais rapidamente começam a morrer. Os sin- tomas do derrame dependem da região do cérebro afetada pelo fluxo sanguíneo inadequado. Os sintomas incluem paralisia, dormência ou fraqueza dos músculos, perda de equilíbrio, tontura, dores de cabeça súbitas e graves, comprometimento da fala, perda de memória, perda de capacidade de raciocínio, confusão súbita, comprometimento da vi- são, coma ou até morte. Um derrame também é conhecido como ataque cerebral ou acidente vascular cerebral (AVC). Os sintomas do acidente vascular cerebral podem ser breves se o fluxo sanguíneo adequado for restaurado dentro de um curto período de tempo. No entanto, se o fluxo sanguíneo inadequado continuar por um período significativo, os sinto- mas podem ser permanentes.

[00167] Em algumas modalidades, o acidente vascular cerebral é is- quemia cerebral. A isquemia cerebral ocorre quando há fluxo sanguíneo insuficiente para os tecidos do cérebro para atender à demanda meta- bólica. Em algumas modalidades, a isquemia cerebral é isquemia cere- bral focal, ou seja, confinada a uma região específica do cérebro. Em algumas modalidades, a isquemia cerebral é isquemia cerebral global, ou seja, abrangendo uma ampla área do tecido cerebral. A isquemia cerebral focal geralmente ocorre quando um vaso cerebral fica bloque- ado, parcial ou completamente, reduzindo o fluxo sanguíneo para uma região específica do cérebro. Em algumas modalidades, a isquemia ce- rebral focal é um acidente vascular cerebral isquêmico. Em algumas modalidades, o acidentevascular cerebral isquêmico é trombótico, ou seja, causado por um trombo ou coágulo sanguíneo, que se desenvolve em um vaso cerebral e restringe ou bloqueia o fluxo sanguíneo. Em al- gumas modalidades, o acidente vascular cerebral isquêmico é um aci- dente vascular cerebral trombótico. Em algumas modalidades, o aci- dente vascular cerebral isquêmico é embólico, isto é, causado por um êmbolo ou uma massa não acoplada que viaja através da corrente san- guínea e restringe ou bloqueia o fluxo sanguíneo em um local distante do seu ponto de origem. Em algumas modalidades, o acidente vascular cerebral isquêmico é um acidente vascular cerebral embólico. A isque- mia cerebral global ocorre geralmente quando o fluxo sanguíneo no cé- rebro como um todo é bloqueado ou reduzido. Em algumas modalida- des, a isquemia cerebral global é causada por hipoperfusão, ou seja, devido a choque. Em algumas modalidades, a isquemia cerebral global é resultado de uma parada cardíaca.

[00168] Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu isquemia cerebral. Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu isquemia cerebral focal. Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral so- freu um acidente vascular cerebral isquêmico. Em algumas modalida- des, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu um acidente vas- cular cerebral trombótico. Em algumas modalidades, o sujeito diagnos- ticado com lesão cerebral sofreu um acidente vascular cerebral embó- lico. Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cere- bral sofreu isquemia cerebral global. Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu hipoperfusão. Em algumas mo- dalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu uma pa- rada cardíaca.

[00169] Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de isquemia cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de isquemia cerebral focal. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de acidente vascular cerebral trombótico. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de acidente vascular cerebral embólico. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de isquemia ce- rebral global. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de hipoperfusão.

[00170] Em algumas modalidades, o acidente vascular cerebral é acidente vascular cerebral hemorrágico. O acidente vascular cerebral hemorrágico é causado pelo sangramento dentro ou ao redor do cére- bro, resultando em inchaço, pressão e danos às células e tecidos do cérebro. O acidente vascular cerebral hemorrágico é geralmente o re- sultado de um vaso sanguíneo enfraquecido que se rompe e sangra no cérebro circundante. Em algumas modalidades, o acidente vascular ce- rebral hemorrágico é uma hemorragia intracerebral, ou seja, causada por sangramento dentro do próprio tecido cerebral. Em algumas moda- lidades, a hemorragia intracerebral é causada por uma hemorragia in- traparenquimatosa. Em algumas modalidades, a hemorragia intracere- bral é causada por uma hemorragia intraventricular. Em algumas moda- lidades, o acidente vascular cerebral hemorrágico é uma hemorragia su- baracnoidea, isto é, sangramento que ocorre fora do tecido cerebral, mas ainda dentro do crânio. Em algumas modalidades, o acidente vas- cular cerebral hemorrágico é resultado de angiopatia amiloide cerebral. Em algumas modalidades, o acidente vascular cerebral hemorrágico é resultado de um aneurisma cerebral. Em algumas modalidades, o aci- dente vascular cerebral hemorrágico é resultado de malformação arteri- ovenosa (AVM) cerebral.

[00171] Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu um acidente vascular cerebral hemorrágico. Em algu- mas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu uma hemorragia intracerebral.

[00172] Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu uma hemorragia intraparenquimatosa. Em algumas mo- dalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu uma he- morragia intraventricular. Em algumas modalidades, o sujeito diagnosti- cado com lesão cerebral sofreu uma hemorragia subaracnoidea. Em al- gumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu angiopatia amiloide cerebral. Em algumas modalidades, o sujeito diag- nosticado com lesão cerebral sofreu um aneurisma cerebral. Em algu- mas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu AVM cerebral.

[00173] Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de acidente vascular cerebral hemorrágico. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de uma hemorragia intracerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de uma he- morragia intraparenquimatosa. Em algumas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso no tratamento de uma hemorragia intra- ventricular. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de uma hemorragia subaracnoidea. Em algu- mas modalidades, as composições da invenção são para uso no trata- mento de uma angiopatia amiloide cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de um aneu- risma cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de AVM cerebral.

[00174] A restauração do fluxo sanguíneo adequado para o cérebro após um período de interrupção, embora eficaz no alívio dos sintomas associados ao acidente vascular cerebral, pode paradoxalmente resul- tar em mais danos ao tecido cerebral. Durante o período de interrupção, o tecido afetado sofre com uma falta de oxigênio e nutrientes, e a re- pentina restauração do fluxo sanguíneo pode resultar em inflamação e danos oxidativos pela indução de estresse oxidativo. Isso é conhecido como lesão de reperfusão e está bem documentada não apenas após o acidente vascular cerebral, mas também após um ataque cardíaco ou outro dano tecidual quando o suprimento sanguíneo retorna ao tecido após um período de isquemia ou falta de oxigênio. Em algumas moda- lidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu lesão de re- perfusão como resultado de acidente vascular cerebral. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão por reperfusão como um resultado de acidente vascular cere- bral.

[00175] Um ataque isquêmico transitório (TIA), geralmente chamado de mini acidente vascular cerebral, é um sinal de alerta reconhecido para um acidente vascular cerebral mais grave. Os sujeitos que sofre- ram um ou mais TIAs estão, portanto, em maior risco de acidente vas- cular cerebral. Em algumas modalidades, o sujeito diagnosticado com lesão cerebral sofreu um TIA. Em algumas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso no tratamento de um TIA. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral em um sujeito que sofreu um TIA.

[00176] Pressão alta, colesterol alto, histórico familiar de acidentes vascular cerebral, doenças cardíacas, diabetes, aneurismas cerebrais, malformações arteriovenosas, doença das células falciformes, vascu- lite, distúrbios hemorrágicos, uso de anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs), tabagismo, fumo de tabaco, consumo de grandes quantida- des de álcool, uso de fármacos ilegais, obesidade, falta de atividade fí- Sica e uma dieta não saudável são considerados fatores de risco para acidente vascular cerebral. Em particular, foi demonstrado que a redu- ção da pressão arterial evita acidentes vasculares cerebrais isquêmicos e hemorrágicos [37, 38]. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de lesão cerebral em um sujeito que possui pelo menos um fator de risco para acidente vascular cere- bral. Em algumas modalidades, o sujeito tem dois fatores de risco para acidente vascular cerebral. Em algumas modalidades, o sujeito tem três fatores de risco para acidente vascular cerebral. Em algumas modalida- des, o sujeito tem quatro fatores de risco para acidente vascular cere- bral. Em algumas modalidades, o sujeito tem mais de quatro fatores de risco para acidente vascular cerebral. Em algumas modalidades, o su- jeito tem pressão alta. Em algumas modalidades, o sujeito tem coleste- rol alto no sangue. Em algumas modalidades, o sujeito tem um histórico familiar de acidente vascular cerebral. Em algumas modalidades, o su- jeito tem uma doença cardíaca. Em algumas modalidades, o sujeito tem diabetes. Em algumas modalidades, o sujeito tem um aneurisma cere- bral. Em algumas modalidades, o sujeito tem malformações arteriove- nosas. Em algumas modalidades, o sujeito tem vasculite. Em algumas modalidades, o sujeito tem doença falciforme. Em algumas modalida- des, o sujeito tem um distúrbio hemorrágico. Em algumas modalidades, o sujeito tem um histórico de uso de anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs). Em algumas modalidades, o sujeito fuma tabaco. Em algu- mas modalidades, o sujeito consome grandes quantidades de álcool. Em algumas modalidades, o sujeito usa fármacos ilegais. Em algumas modalidades, o sujeito é obeso. Em algumas modalidades, o sujeito está acima do peso. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma falta de atividade física. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma dieta não saudável.

[00177] Os exemplos indicam que as composições da invenção po- dem ser úteis no tratamento de lesões cerebrais e auxiliar na recupera- ção quando administradas antes da ocorrência do evento de lesão. Por- tanto, as composições da invenção podem ser particularmente úteis no tratamento de lesão cerebral quando administradas em indivíduos em risco de lesão cerebral, como acidente vascular cerebral.

[00178] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na redução do dano causado por uma potencial lesão cerebral, preferencialmente um acidente vascular cerebral. As composições po- dem reduzir o dano causado quando são administradas antes da ocor- rência de uma potencial lesão cerebral, em particular quando adminis- tradas em um paciente identificado como em risco de uma lesão cere- bral.

[00179] Os exemplos indicam que as composições da invenção po-

dem ser úteis no tratamento de lesões cerebrais e auxiliar na recupera- ção quando administradas depois da ocorrência do evento de lesão. Portanto, as composições da invenção podem ser particularmente úteis no tratamento de lesão cerebral quando administradas em sujeitos em risco de lesão cerebral, como acidente vascular cerebral.

[00180] Em algumas modalidades, as composições da invenção tra- tam lesões cerebrais reduzindo o dano motor. Em algumas modalida- des, as composições da invenção tratam lesões cerebrais ao melhorar a função motora. Em algumas modalidades, as composições da inven- ção tratam lesões cerebrais ao melhorar a força muscular. Em algumas modalidades, as composições da invenção tratam lesões cerebrais ao melhorar a memória. Em algumas modalidades, as composições da in- venção tratam lesões cerebrais ao melhorar o reconhecimento social. Em algumas modalidades, as composições da invenção tratam lesões cerebrais ao melhorar a função neurológica.

[00181] Otratamento de lesão cerebral pode se referir, por exemplo, a um alívio da gravidade dos sintomas. O tratamento de lesões cere- brais também pode se referir à redução das deficiências neurológicas após o acidente vascular cerebral. As composições da invenção para uso no tratamento de AVC podem ser fornecidas ao sujeito antes do início do acidente vascular cerebral, por exemplo, em um paciente iden- tificado como estando em risco de acidente vascular cerebral. As com- posições da invenção para uso no tratamento de acidente vascular ce- rebral podem ser fornecidas após a ocorrência de um acidente vascular cerebral, por exemplo, durante a recuperação. As composições da in- venção para uso no tratamento de acidente vascular cerebral podem ser fornecidas durante a fase aguda da recuperação (isto é, até uma se- mana após o acidente vascular cerebral). As composições da invenção para uso no tratamento de acidente vascular cerebral podem ser forne- cidas durante a fase subaguda de recuperação (isto é, de uma semana a três meses após o AVC). As composições da invenção para uso no tratamento de acidente vascular cerebral podem ser fornecidas durante a fase crônica de recuperação (três meses após o acidente vascular cerebral).

[00182] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso em combinação com um agente ativo secundário. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso em combina- ção com aspirina ou ativador de plasminogênio tecidual (tPA). Outros agentes secundários incluem outras antiplaquetas (como o clopidogrel), anticoagulantes (como heparinas, varfarina, apixaban, dabigatran, edo- xaban ou rivaroxaban), anti-hipertensivos (como diuréticos, inibidores de ACE, bloqueadores dos canais de cálcio, betabloqueadores ou alfa- bloqueadores) ou estatinas. As composições da invenção podem me- lhorar a resposta do paciente ao agente ativo secundário.

[00183] Em certas modalidades, as composições da invenção redu- zem o efeito da isquemia nos tecidos. Em certas modalidades, as com- posições da invenção reduzem a quantidade de danos nos tecidos cau- sados por isquemia. Em certas modalidades, os tecidos danificados pela isquemia são os tecidos cerebrais. Em certas modalidades, as compo- sições da invenção reduzem a necrose ou o número de células necróti- cas. Em certas modalidades, as composições da invenção reduzem a apoptose ou o número de células apoptóticas. Em certas modalidades, as composições da invenção reduzem o número de células necróticas e apoptóticas. Em certas modalidades, as composições da invenção im- pedem a morte celular por necrose e/ou apoptose. Em certas modalida- des, as composições da invenção impedem a morte celular por necrose e/ou apoptose causada por isquemia. Em certas modalidades, as com- posições da invenção melhoram a recuperação do tecido danificado por isquemia. Em certas modalidades, as composições da invenção melho-

ram a velocidade de depuração de células necróticas e/ou células apo- ptóticas. Em certas modalidades, as composições da invenção melho- ram a eficácia da depuração de células necróticas e/ou células apoptó- ticas. Em certas modalidades, as composições da invenção melhoram a substituição e/ou regeneração de células dentro dos tecidos. Em cer- tas modalidades, as composições da invenção melhoram a substituição e/ou regeneração de células dentro de tecidos danificados por isquemia. Em certas modalidades, as composições da invenção melhoram a his- tologia geral do tecido (por exemplo, em uma biópsia). Modos de administração

[00184] —Preferencialmente, as composições da invenção devem ser administradas no trato gastrointestinal para permitir a transmissão para e/ou a colonização parcial ou total do intestino com a cepa bacteriana da invenção. Geralmente, as composições da invenção são administra- das oralmente, mas podem ser administradas por via retal, intranasal ou por via bucal ou sublingual.

[00185] Emcertas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas como uma espuma, como uma pulverização ou um gel.

[00186] Emcertas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas como um supositório, tal como um supositório retal, por exemplo na forma de um óleo de teobroma (manteiga de cacau), gordura dura sintética (por exemplo, suppocire, witepsol), glicerolatina, polietilenoglicol ou composição de glicerina de sabão.

[00187] Em certas modalidades, a composição da invenção é admi- nistrada no trato gastrointestinal através de um tubo, tal como um tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de jejunostomia (tubo J), gastronomia endoscópica percutânea (PEG), ou uma porta, tal como uma porta de parede torácica que fornece acesso ao estômago, jejuno e outras portas de acesso adequadas.

[00188] As composições da invenção podem ser administradas uma vez, ou podem ser administradas sequencialmente como parte de um regime de tratamento. Em certas modalidades, as composições da in- venção devem ser administradas diariamente.

[00189] Em certas modalidades da invenção, o tratamento de acordo com a invenção é acompanhado por avaliação da microbiota intestinal do paciente. O tratamento pode ser repetido se a distribuição e/ou colo- nização parcial ou total com a cepa da invenção não for alcançada de modo que a eficácia não seja observada, ou o tratamento pode ser in- terrompido se a distribuição e/ou colonização parcial ou total for bem- sucedida e se for observada eficácia.

[00190] Em certas modalidades, a composição da invenção pode ser administrada em um animal gestante, por exemplo, a um mamífero tal como uma humana para prevenir uma doença inflamatória ou autoi- mune de se desenvolver em seu filho in utero e/ou após o nascimento.

[00191] As composições da invenção podem ser administradas em um paciente que foi diagnosticado com uma doença neurodegenerativa ou que foi identificado como estando em risco de uma doença neurode- generativa. As composições também podem ser liberadas como uma medida profilática para prevenir o desenvolvimento de doença neurode- generativa em um paciente saudável.

[00192] As composições da invenção podem ser administradas em um paciente que tenha sido identificado como tendo uma microbiota in- testinal anormal. Por exemplo, o paciente pode ter colonização reduzida ou ausente por Megasphaera, e em particular Megasphaera massilien- Sis.

[00193] —Ascomposições da invenção podem ser administradas como um produto alimentício, tal como um suplemento nutricional.

[00194] Geralmente, as composições da invenção são para o trata-

mento de humanos, embora possam ser usadas para tratar animais in- cluindo mamíferos monogástricos tais como aves domésticas, porcos, gatos, cães, cavalos oucoelhos. As composições da invenção podem ser úteis para melhorar o crescimento e desempenho dos animais. Se administrada a animais, a gavagem oral pode ser usada. Composições

[00195] “Geralmente, a composição da invenção compreende bacté- rias. Nas modalidades preferidas da invenção, a composição é formu- lada sob a forma liofilizada. Por exemplo, a composição da invenção pode compreender grânulos ou cápsulas de gelatina, por exemplo, cáp- sulas de gelatina duras, compreendendo uma cepa bacteriana da inven- ção.

[00196] —Preferencialmente, a composição da invenção compreende bactérias liofilizadas. A liofilização de bactérias é um procedimento bem estabelecido e uma orientação relevante está disponível, por exemplo, nas referências [39], [], [41]].

[00197] —Alternativamente, a composição da invenção pode compre- ender uma cultura bacteriana ativa e viva.

[00198] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da invenção não foi inativada, por exemplo, não foi inativada por calor. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da inven- ção não foi morta, por exemplo, não foi morta por calor. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da invenção não foi ate- nuada, por exemplo, não foi atenuada pelo calor. Por exemplo, em al- gumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da invenção não foi morta, inativada e/ou atenuada. Por exemplo, em algumas modalida- des, a cepa bacteriana na composição da invenção é viva. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da inven- ção é viável. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da invenção é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição da invenção é viável e capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00199] Em algumas modalidades, a composição compreende uma mistura de cepas bacterianas vivas e cepas bacterianas que foram mor- tas.

[00200] Em algumas modalidades, a composição da invenção é en- capsulada para permitir a transmissão da cepa bacteriana ao intestino. A encapsulação protege a composição da degradação até sua transmis- são no local alvo através de, por exemplo, ruptura com estímulos quími- cos ou físicos tais como pressão, atividade enzimática ou desintegração física, que podem ser desencadeados por mudanças no pH. Qualquer método de encapsulação apropriado pode ser usado. Exemplos de téc- nicas de encapsulação incluem aprisionamento dentro de uma matriz porosa, ligação ou adsorção em superfícies carreadoras sólidas, autoa- gregação por floculação ou com agentes de reticulação e contenção mecânica atrás de uma membrana microporosa ou uma microcápsula. As orientações sobre encapsulação que podem ser úteis para preparar as composições da invenção estão disponíveis, por exemplo, nas refe- rências [42] e [43].

[00201] —Acomposição pode ser administrada oralmente e pode estar sob a forma de um comprimido, cápsula ou pó. Produtos dos são prefe- ridos porque as Megasphaera são anaeróbicas. Outros ingredientes (comoa vitamina C, por exemplo), podem ser incluídos como eliminado- res de oxigênio e substratos prebióticos para melhorar a distribuição e/ou a colonização parcial ou total e a sobrevivência in vivo. Alternativa- mente, a composição probiótica da invenção pode ser administrada oral- mente como um produto alimentício ou nutricional, tal como leite ou pro- duto lácteo fermentado à base de soro de leite, ou como um produto farmacêutico.

[00202] A composição pode ser formulada como um probiótico.

[00203] “Uma composição da invenção inclui uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma cepa bacteriana da invenção. Uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana é suficiente para exercer um efeito benéfico sobre um paciente. Uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma cepa bacteriana pode ser suficiente para resultar na distribuição e/ou colonização parcial ou total do intestino do paciente.

[00204] “Uma dose diária adequada da bactéria, por exemplo, para um ser humano adulto, pode ser de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10"! unidades formadoras de colônias (CFU); por exemplo, de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 10ºº CFU; em outro exemplo, de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10ºº CFU.

[00205] Em certas modalidades, a composição contém a cepa bac- teriana em uma quantidade de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10"! CFU/g, em relação ao peso da composição; por exemplo, de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 10ºº CFU/g. A dose pode ser, por exemplo, 1 g, 39, 5g e 109.

[00206] Tipicamente, um probiótico, tal como a composição da inven- ção, é opcionalmente combinado com pelo menos um composto prebió- tico adequado. Um composto prebiótico é geralmente um carboidrato não digerível, como um oligo ou polissacarídeo, ou um álcool de açúcar, que não é degradado ou absorvido no trato digestivo superior. Os pre- bióticos conhecidos incluem produtos comerciais tais como inulina e trans-galacto-oligossacarídeos.

[00207] Em certas modalidades, a composição probiótica da pre- sente invenção inclui um composto prebiótico em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 30% em peso, em relação à composição do peso total (por exemplo, de 5 a 20% em peso). Os carboidratos podem ser selecionados dentre o grupo que consiste em: frutooligossacarídeos (ou

FOS), frutooligossacarídeos de cadeia curta, inulina, isomalto-oligossa- carídeos, pectinas, xilooligossacarídeos (ou XOS), oligossacarídeos de quitosana (ou COS), beta-glucanos, amidos de goma arábica modifi- cada e resistente, polidextrose, D-tagatose, fibras de acácia, alfarroba, aveia e fibras de citrinos. Em um aspecto, os prebióticos são os frutooli- gossacarídeos de cadeia curta (para simplicidade, mostrado abaixo como FOSs-c.c); os referidos FOSs-c.c não são carboidratos digestí- veis, geralmente obtidos pela conversão do açúcar de beterraba e inclu- indo uma molécula de sacarose à qual três moléculas de glicose são ligadas.

[00208] Em certas modalidades, as composições da invenção são usadas em combinação com outro composto terapêutico para tratar ou prevenir o distúrbio neurodegenerativo. Em algumas modalidades, as composições da invenção são administradas com suplementos nutrici- onais que modulam neuroproteção ou neuroproliferação. Em modalida- des preferidas, os suplementos nutricionais compreendem ou consistem em vitaminas nutricionais. Em certas modalidades, as vitaminas são vi- tamina B6,magnésio, dimetilglicina (vitamina B 16) e vitamina C. Em certas modalidades, as composições da invenção são administradas em combinação com outro probiótico.

[00209] Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no aumento do efeito de um segundo agente em uma doença neurodegenerativa. Os efeitos imunomoduladores das composições da invenção podem tornar o cérebro mais suscetível a terapias convencio- nais, como Levodopa, agonistas da dopamina, inibidores da MAO-B, ini- bidores da COMT, antagonistas do glutamato ou anticolinérgicos, que são agentes secundários exemplares a serem administrados em com- binação (sequencialmente ou contemporaneamente) com as composi- ções da invenção.

[00210] As composições da invenção podem compreender excipien- tes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de tais ex- cipientes adequados podem ser encontrados na referência [44]. Os ve- ículos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e estão descritos, por exemplo, na referência

[45]. Os exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glu- cose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e seme- lhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, glicerol e água. A escolha do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prá- tica farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem com- preender como, ou em adição, o veículo, excipiente ou diluente quais- quer ligantes, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de revesti- mento e agentes solubilizantes adequados. Exemplos de ligantes ade- quados incluem amido, gelatina, açúcares naturais tais como glucose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorantes de mi- lho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, tragacanto ou algi- nato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenoglicol. Exemplos de lu- brificantes adequados incluem oleato de sódio, estearato de sódio, es- tearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentes aromatizantes podem ser fornecidos na composição farmacêu- tica. Exemplos de conservantes incluem benzoato de sódio, ácido sór- bico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Antioxidantes e agentes de suspensão também podem ser usados.

[00211] As composições da invenção podem ser formuladas como um produto alimentício. Por exemplo, um produto alimentício pode for- necer um benefício nutricional para além do efeito terapêutico da inven- ção, tal como num suplemento nutricional. De um modo semelhante, um produto alimentício pode ser formulado para melhorar o sabor da com- posição da invenção ou para tornar a composição mais atrativa para o consumo ao torná-la mais semelhante a um artigo alimentício comum, em vez de uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, a composição da invenção é formulada como um produto à base de leite. O termo "produto à base de leite" significa qualquer produto à base de leite ou soro de leite líquido ou semissólido com um teor de gordura variável. O produto à base de leite pode ser, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite desnatado, leite integral, leite recons- tituído a partir de leite em pó e soro de leite sem qualquer processa- mento, ou um produto processado, como iogurte, leite coalhado, coa- lhada, leite azedo, leite integral azedo, leitelho e outros produtos lácteos azedos. Outro grupo importante inclui bebidas lácteas, como bebidas de soro de leite, leites fermentados, leites condensados, leites infantis ou para bebês; leites aromatizados, sorvetes; alimentos contendo leite, como doces.

[00212] Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem uma ou mais cepas bacterianas do gênero Megasphaera e não contêm bactérias de nenhum outro gênero, ou que compreendem apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bac- térias de outro gênero. Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição compreendendo uma ou mais cepas bacterianas do gênero Megasphaera, que não contém bactérias de nenhum outro gê- nero ou que compreende apenas quantidades de minimis ou biologica- mente irrelevantes de bactérias de outro gênero, para uso em terapia.

[00213] Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem uma ou mais cepas bacterianas da espécie Megas- phaera massiliensis e não contêm bactérias de nenhuma outra espécie, ou que compreendem apenas quantidades de minimis ou biologica- mente irrelevantes de bactérias de outra espécie. Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição compreendendo uma ou mais cepas bacterianas da espécie Megasphaera massiliensis, que não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou que compre- ende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outras espécies, para uso em terapia.

[00214] Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem uma ou mais cepas bacterianas da espécie Megas- phaera massiliensis e não contêm bactérias de nenhuma outra espécie de Megasphaera, ou que compreendem apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie de Megas- phaera. Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece uma com- posição compreendendo uma ou mais cepas bacterianas da espécie Megasphaera massiliensis, que não contém bactérias de nenhuma ou- tra espécie de Megasphaera ou que compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outras espé- cies de Megasphaera, para uso em terapia.

[00215] Em certas modalidades, as composições da invenção contêm uma única cepa ou espécie bacteriana e não contêm quaisquer outras ce- pas ou espécies bacterianas. Tais composições podem compreender ape- nas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de outras ce- pas ou espécies bacterianas. Tais composições podem ser uma cultura que é substancialmente isenta de outras espécies de organismos.

[00216] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição compreendendo uma única cepa bacteriana do gênero Megas- phaera, que não contém bactérias de nenhumas outras cepas ou que compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrele- vantes de bactérias de outra cepa para uso em terapia.

[00217] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição compreendendo uma única cepa bacteriana da espécie Megas-

phaera massiliensis, que não contém bactérias de nenhumas outras ce- pas ou que compreende apenas quantidades de minimis ou biologica- mente irrelevantes de bactérias de outra cepa para uso em terapia.

[00218] Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem mais de uma cepa bacteriana. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem mais de uma cepa dentro da mesma espécie (por exemplo, mais de 1, 2, 3,4,5,6,7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 cepas), e, opcionalmente, não contêm bactérias de qualquer outra espécie. Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem menos de 50 cepas dentro da mesma espécie (por exemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12,10, 9,8,7,6,5,4 ou 3 cepas) e, opcionalmente, não contêm bacté- rias de qualquer outra espécie. Em algumas modalidades, as composi- ções da invenção compreendem 1-40, 1-30, 1- 20, 1-19, 1-18, 1-15, 1- 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2- 10,2-5, 6-30, 6-15, 16-25 ou 31-50 cepas de uma mesma espécie e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. A in- venção compreende qualquer combinação dos precedentes.

[00219] Em algumas modalidades, a composição compreende um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas modalidades, a com- posição compreende a cepa bacteriana Megasphaera como parte de um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana Megasphaera está presente em combinação com uma ou mais (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20) outras cepas bacterianas de outros gêneros com os quais pode viver simbioticamente in vivo no intestino. Por exemplo, em algumas modalidades, a composi- ção compreende uma cepa bacteriana de Megasphaera em combina- ção com uma cepa bacteriana de um gênero diferente. Em algumas mo- dalidades, o consórcio microbiano compreende duas ou mais cepas bacterianas obtidas a partir de uma amostra de fezes de um único orga- nismo, por exemplo, um humano. Em algumas modalidades, o consór- cio microbiano não é encontrado em conjunto na natureza. Por exemplo, em algumas modalidades, o consórcio microbiano compreende cepas bacterianas obtidas a partir de amostras de fezes de pelo menos dois organismos diferentes. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são da mesma espécie, por exemplo, dois seres humanos diferentes. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são um ser humano infantil e um humano adulto. Em algumas modali- dades, os dois organismos diferentes são um humano e um mamífero não humano.

[00220] Em algumas modalidades, a composição da invenção com- preende adicionalmente uma cepa bacteriana que possui as mesmas características de segurança e eficácia terapêutica que a cepa MRx0029, mas que não é MRx0029 ou que não é uma Megasphaera massiliensis.

[00221] Em algumas modalidades em que a composição da invenção compreende mais de uma cepa, espécie ou gênero bacterianos, as ce- pas, espécies ou gêneros bacterianos individuais podem ser destinados a administração separada, simultânea ou sequencial. Por exemplo, a composição pode compreender todas as mais de uma cepa, espécie ou gênero bacterianos, ou as cepas, espécies ou gêneros bacterianos po- dem ser armazenados separadamente e ser administrados separada- mente, simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalida- des, as mais de uma cepa, espécie ou gênero bacterianos são armaze- nadas separadamente, mas são misturadas antes da uso.

[00222] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na in- venção é obtida a partir de fezes humanas adultas. Em algumas moda- lidades em que a composição da invenção compreende mais de uma cepa bacteriana, todas as cepas bacterianas são obtidas a partir de fe- zes humanas adultas ou se estiverem presentes outras cepas bacteria- nas, estão presentes apenas em quantidades de minimis. As bactérias podem ter sido cultivadas após serem obtidas a partir das fezes huma- nas adultas e serem utilizadas numa composição da invenção.

[00223] “Como mencionado acima, em algumas modalidades, as uma ou mais cepas bacterianas de Megasphaera é/são o(s) único(s) agente(s) terapeuticamente ativo(s) em uma composição da invenção. Em algumas modalidades, ascepa(s) bacteriana(s) na composição é/são o(s) único(s) agente(s) terapeuticamente ativo(s) numa composi- ção da invenção.

[00224] As composições para uso de acordo com a invenção podem ou não requerer aprovação comercial.

[00225] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é liofilizada. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é seca por pulverização. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofilizada ou seca por pulverização e em que está viva. Em certas modalidades, a invenção fornece a com- posição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofilizada ou seca por pulverização e em que está viva. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulverização e em que é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulverização e em que é viável e capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00226] Em alguns casos, a cepa bacteriana liofilizada é reconstitu- ída antes da administração. Em alguns casos, a reconstituição é feita através de um diluente descrito neste documento.

[00227] As composições da invenção podem compreender excipien- tes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00228] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica compreendendo: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio neurodegenerativo quando administrado a um sujeito em ne- cessidade desta.

[00229] Em certas modalidades, a invenção fornece composição far- macêutica compreendendo: uma cepa bacteriana da invenção; e um ex- cipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou pre- venir um distúrbio neurodegenerativo.

[00230] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a quantidade da cepa bacteriana é de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10"? unidades formadoras de colônias por grama em relação ao peso da composição.

[00231] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada numa dose de 19, 3g,5gou10g.

[00232] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada por um mé- todo selecionado dentre o grupo que consiste em oral, retal, subcutà- nea, nasal, bucal e sublingual.

[00233] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um veículo selecionado dentre o grupo que consiste em lactose, amido, glucose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol e sorbitol.

[00234] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um diluente selecionado dentre o grupo que consiste em etanol, glicerol e água.

[00235] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um excipiente selecionado dentre o grupo que consiste em amido, gelatina, glucose, lactose anidra, lac- tose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorante de milho, acácia, traga- canto, alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de só- dio, acetato de sódio e cloreto de sódio.

[00236] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo ainda pelo menos um dentre um conservante, um antioxidante e um estabilizador.

[00237] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um conservante selecionado den- tre o grupo que consiste em benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.

[00238] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é liofilizada.

[00239] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que quando a composição é armazenada num recipiente vedado a cerca de 4ºC ou cerca de 25ºC e o recipiente é colocado numa atmosfera com 50% de umidade relativa, pelo menos 80% da cepa bacteriana medida em unidades formadoras de colônias permanece após um período de pelo menos cerca de: 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos.

[00240] Em algumas modalidades, a composição da invenção é for- necida num recipiente vedado compreendendo uma composição como descrita neste documento. Em algumas modalidades, o recipiente ve- dado é um sachê ou garrafa. Em algumas modalidades, a composição da invenção é fornecida numa seringa compreendendo uma composi- ção como descrita neste documento.

[00241] — A composição da presente invenção pode, em algumas moda- lidades, ser fornecida como uma formulação farmacêutica. Por exemplo, a composição pode ser fornecida como um comprimido ou cápsula. Em al- gumas modalidades, a cápsula é uma cápsula de gelatina (“gel-cap”).

[00242] Em algumas modalidades, as composições da invenção são administradas por via oral. A administração oral pode envolver a deglu- tição, de modo que o composto entre no trato gastrointestinal e/ou a administração bucal, lingual ou sublingual, através das quais o com- posto entra na corrente sanguínea diretamente a partir da boca.

[00243] As formulações farmacêuticas adequadas para administra- ção oral incluem tampões sólidos, microparticulados sólidos, semi-sóli- dos e líquidos (incluindo várias fases ou sistemas dispersos), comocom- primidos; cápsulas moles ou duras contendo partículas múltiplas ou na- nopartículas, líquidos (por exemplo, soluções aquosas), emulsões ou pós; pastilhas (incluindo com líquidos); de mascar; geis; formas de do- sagem de dispersão rápida; filmes; óvulos; pulverizações; e adesivos bucais/mucoadesivos.

[00244] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação entérica, isto é, uma formulação gastrorresistente (por exemplo, resistente ao pH gástrico) que é adequada para a distribuição da composição da invenção para o intestino por administração oral. As formulações entéricas podem ser particularmente úteis quando as bac- térias ou outro componente da composição forem sensíveis ao ácido, por exemplo, propensos à degradação em condições gástricas.

[00245] Em algumas modalidades, a formulação entérica compre- ende um revestimento entérico. Em algumas modalidades, a formulação é uma forma de dosagem com revestimento entérico. Por exemplo, a formulação pode ser um comprimido com revestimento entérico ou uma cápsula com revestimento entérico, ou semelhante. O revestimento en- térico pode ser um revestimento entérico convencional, por exemplo, um revestimento convencional para um comprimido, cápsula ou seme- lhante para distribuição oral. A formulação pode compreender um reves- timento de película, por exemplo, uma camada de película fina de um polímero entérico, por exemplo, um polímero insolúvel em ácido.

[00246] Em algumas modalidades, a formulação entérica é intrinse- camente entérica, por exemplo, gastrorresistente sem a necessidade de um revestimento entérico. Assim, em algumas modalidades, a formula- ção é uma formulação entérica que não compreende um revestimento entérico. Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsula feita de um material termogelante. Em algumas modalidades, o material de termogelação é um material celulósico, tal como metilcelulose, hidroxi- metilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em algumas moda- lidades, a cápsula compreende um invólucro que não contém qualquer polímero formador de película. Em algumas modalidades, a cápsula compreende um invólucro e o invólucro compreende hidroxipropilmetil- celulose e não compreende qualquer polímero formador de película (por exemplo, ver [46]). Em algumas modalidades, a formulação é uma cáp- sula intrinsecamente entérica (por exemplo, Vcaps& da Capsugel).

[00247] Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsula mole. Cápsulas moles são cápsulas que podem, devido a adições de amaciantes, tais como, por exemplo, glicerol, sorbitol, maltitol e polieti- lenoglicois, presentes no invólucro da cápsula, ter certa elasticidade e suavidade. Cápsulas moles podem ser produzidas, por exemplo, com base em gelatina ou amido. Cápsulas moles à base de gelatina estão comercialmente disponíveis através de vários fornecedores. Depen- dendo do método de administração, tal como, por exemplo, oral ou re- talmente, as cápsulas moles podem ter várias formas, podem ser, por exemplo, redondas, ovais, oblongas ou em forma de torpedo. As cápsu- las moles podem ser produzidas por processos convencionais, tais como, por exemplo, pelo processo Scherer, pelo processo Accogel ou pelo processo de gotejamento ou sopro. Métodos de cultura

[00248] As cepas bacterianas para uso na presente invenção podem ser cultivadas utilizando-se técnicas convencionais de microbiologia, como detalhado, por exemplo, nas referências [47], [] e [49].

[00249] —Omeio sólido ou líquido utilizado para a cultura pode ser, por exemplo, meio de ágar YCFA ou meio YCFA. O meio YCFA pode incluir (por 100 ml, valores aproximados): Casitona (1,0 g), extrato de levedura (0,25 g), NaHCO; (0,4 g), cisteína (0,1 g), KHPO.a (0,045 g), KH2PO. (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NHa4)2SOa (0,09 g), MgSOa * 7H2O (0,009 g), CaCl27 resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 ug), cobalamina ( 1 ug), ácido -aminobenzoico (3 ug), ácido fólico (5 ug) e piridoxamina (15 pg). Cepas bacterianas para serem usadas em composições de vacinas

[00250] Os inventores identificaram que as cepas bacterianas da in- venção são úteis para o tratamento ou prevenção de distúrbios neuro- degenerativos. É provável que isto seja um resultado do efeito que as cepas bacterianas da invenção têm no sistema imunológico do hospe- deiro. Portanto, as composições da invenção também podem ser úteis para prevenir distúrbios neurodegenerativos, quando administradas como composições de vacina. Em certas tais modalidades, as cepas bacterianas da invenção podem ser mortas, inativadas ou atenuadas. Em certas tais modalidades, as composições podem compreender um adjuvante de vacina. Em certas modalidades, as composições são para administração via injeção, tal como através de injeção subcutânea.

Geral

[00251] A prática da presente invenção empregará, a menos que in- dicado em contrário, métodos convencionais da química, bioquímica, bi- ologia molecular, imunologia e farmacológica, dentro do âmbito da téc- nica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, referências [50] e [51,57], etc.

[00252] O termo "compreendendo" abrange "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exem- plo, XK+Y.

[00253] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é op- cional e significa, por exemplo, x +10%.

[00254] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancial- mente" pode ser omitida da definição da invenção.

[00255] Referências a uma identidade de sequência percentual entre duas sequências nucleotídicas significa que, quando alinhadas, essa porcentagem de nucleotídeos é a mesma na comparação das duas se- quências. Este alinhamento e a porcentagem de homologia ou de iden- tidade de sequência podem ser determinadas utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo os descritos na seção

7.7.18 da ref. [58]. Um alinhamento preferido é determinado pelo algo- ritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman, utilizando uma pesquisa de lacuna afim com uma penalidade de abertura de lacuna de 12 e uma penalidade de extensão de lacuna de 2, matriz de BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é di- vulgado na ref. [59].

[00256] —Amenos que especificamente indicado, um processo ou mé-

todo compreendendo inúmeras etapas pode compreender etapas adici- onais no início ou no fim do método, ou pode compreender etapas inter- venientes adicionais. Além disso, as etapas podem ser combinadas, omitidas ou executadas em uma ordem alternativa, se apropriado.

[00257] Várias modalidades da invenção são descritas neste docu- mento. Será apreciado que as características especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especi- ficadas, para fornecer outras modalidades. Em particular, as modalida- des destacadas neste documento como sendo adequadas, típicas ou preferidas, podem ser combinadas umas com as outras (exceto quando forem mutuamente exclusivas).

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Exemplo 1 - Eficácia da inoculação bacteriana para atuar como neuroprotetor Sumário

[00258] As células de neuroblastoma foram tratadas com composi- ções compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção. As células de neuroblastoma SH-SY5Y utilizadas são produtoras de dopa- mina e estão bem estabelecidas como modelo in vitro para o estudo de doenças neurodegenerativas. Foi observada a capacidade das cepas bacterianas de aumentar a neuroproliferação. As células de neuroblas- toma também foram tratadas com neurotoxina dopaminérgica 1-metil-4- fenilpiridínio (MPP), que induz sintomas permanentes da doença de Par- Kinson nas células de neuroblastoma. A capacidade das cepas bacteri- anas de agir como um neuroprotetor contra MPP foi investigada. Material e Métodos Cepa bacteriana

[00259] — Megasphaera massiliensis MRx0029; Parabacteroides dista- sonis MRX0005

Linhagem celular

[00260] As células de neuroblastoma SH-SY5Y foram adquiridas na ECCACC (Cat. nº: 94030304) e foram cultivadas em MEM (Sigma Al- drich, cat n. M2279) suplementado com Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma Aldrich, cat n. N4888). Método

[00261] Uma vez cultivadas, as células de neuroblastoma SH-SY5Y foram plaqueadas em placas de 96 poços a 11.000 células/poço e incu- badas por 2 dias. As células foram então transferidas para o meio de diferenciação (que contém FBS a 1%) e 10 uM de ácido retinoico (Sigma Aldrich, cat. n. R2625-100MG). O meio de diferenciação foi substituído a cada dois dias e as células foram colhidas aos 7 dias de diferenciação. As células foram pré-tratadas com ou sem MPP (Sigma Aldrich, cat. Nº DO48-1G) durante 8 horas. Posteriormente, as células foram tratadas com sobrenadante bacteriano a 10% e incubadas durante a noite. A vi- abilidade celular foi medida usando o reagente CCK-8 (Sigma Aldrich, Cell Counting Kit - 8, cat. n. 96992-3000TESTS-F) e lida a 450nm de comprimento de onda. Resultados

[00262] —Osresultados destes experimentos são mostrados na Figura

1. O tratamento de células de neuroblastoma com MRx0029 ou MRXO0005 levou a um aumento na proliferação de neurônios. As células de neuroblastoma que foram tratadas com MPP em conjunto com a cepa bacteriana aumentaram a viabilidade celular em comparação com as células tratadas apenas com MPP (que tiveram viabilidade reduzida). Esses dados mostram que as cepas bacterianas podem atuar como um neuroprotetor. O efeito protetor foi maior para as células tratadas com MRX0029, que resgataram a viabilidade mais do que as células de con- trole positivo tratadas com Quercetina. Esses dados mostram que as cepas bacterianas podem atuar como um neuroprotetor

Exemplo 2 - Eficácia do inóculo bacteriano para reduzir a secreção de IL-6.

Sumário

[00263] A ativação de citocinas pró-inflamatórias tem sido associada a danos nos neurônios em doenças neurodegenerativas. O lipopolissa- carídeo (LPS) é um estimulador conhecido da citocina pró-inflamatória IL-6. As células de astrocitoma de glioblastoma humano foram tratadas com composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção em combinação com LPS para observar sua capacidade de modular os níveis de IL-6.

Material e Métodos Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029 Linhagem celular

[00264] MG U373 é um astrocitoma de glioblastoma humano deri- vado de um tumor maligno e foi adquirido de Sigma-Aldrich (cat. n.

08061901-1 VL). As células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 foram cultivadas em MEM (Sigma Aldrich, cat. n. M-2279) suple- mentado com 10% de FBS, 1% de Pen Strep, 4mM de L-Glut, 1X de solu- ção de Aminoácido Não essencial de MEM e 1X de Piruvato de Sódio.

Método

[00265] Uma vez cultivadas, as células MG U373 foram plaqueadas em placas de 24 poços a 100.000 células/poço. As células foram trata- das com LPS (1ug/mL) isoladamente ou com 10% de bactérias sobre- nadantes de MRx0029 por 24h. Também foi realizado um controle onde as células foram incubadas em meio não tratado. Depois, os sobrena- dantes livres de células foram coletados, centrifugados a 10.000 g por 3 minutos a 4ºC. A IL-6 foi medida usando o Human IL-6 ELISA Kit da Peprotech (cat nº 900-K16) de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

[00266] Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura

2. O tratamento de células de neuroblastoma com LPS e as cepa bac- teriana levou a uma diminuição no nível de IL-6 secretada.

Exemplo 2b — Eficácia da inoculação bacteriana para modular a se- creção de IL-8.

Sumário

[00267] “Como a neuroinflamação desempenha um papel central nas doenças neurodegenerativas e a IL-8 demonstrou ter efeitos neuroposi- tivos, o efeito de composições compreendendo cepas bacterianas da invenção e LPS na ativação da IL-8 foi avaliado. As células de astroci- toma de glioblastoma humano foram tratadascom composições compre- endendo cepas bacterianas de acordo com a invenção em combinação com LPS para observar sua capacidade de modular os níveis de IL-8.

Material e Métodos Cepas bacterianas Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005 Linhagem celular

[00268] MG U373 é um astrocitoma de glioblastoma humano deri- vado de um tumor maligno e foi adquirido de Sigma-Aldrich (cat. n.

08061901-1 VL). As células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 foram cultivadas em MEM (Sigma Aldrich, cat. n. M-2279) suple- mentado com 10% de FBS, 1% de Pen Strep, 4mM de L-Glut, 1X de solu- ção de Aminoácido Não essencial de MEM e 1X de Piruvato de Sódio.

Método

[00269] Uma vez cultivadas, as células MG U373 foram plaqueadas em placas de 24 poços a 100.000 células/poço. As células foram trata- das com LPS (1ug/mL) isoladamente ou com 10% de bactérias sobre-

nadantes de MRX0029 por 24h. Depois, os sobrenadantes livres de cé- lulas foram coletados, centrifugados a 10.000 g por 3 minutos a 4ºC. À IL-8 foi medida usando o Human IL-8 ELISA Kit da Peprotech (cat nº 900-K18) de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

[00270] Osresultados destes experimentos são mostrados na Figura

3. O tratamento de células de neuroblastoma com as cepas bacterianas leva a um aumento na secreção de IL-8 independentemente da pre- sença de LPS.

Exemplo 2C — Eficácia da inoculação bacteriana para reduzir a in- flamação induzida por a-sinucleína.

Sumário

[00271] —Aneuroinflamação desempenha um papel central na doença de Parkinson e a a-sinucleína demonstrou induzir neuroinflamação in vivo. Portanto, foi avaliada a capacidade das cepas bacterianas da in- venção de inibir a neuroinflamação induzida por a-sinucleína. Uma co- cultura de células de astrocitoma de glioblastoma humano e células de neuroblastoma foi exposta à a-sinucleína do tipo selvagem e às isofor- mas mutantes E46K e A53T e tratada com composições compreen- dendo cepas bacterianas de acordo com a invenção. A capacidade das cepas bacterianas para inibir a secreção de IL-6 induzida por a-sinucle- ína foi então testada.

Material e Métodos Cepas bacterianas Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005 Linhagem celular

[00272] MG U373 é um astrocitoma de glioblastoma humano deri- vado de um tumor maligno e foi adquirido de Sigma-Aldrich (cat. n.

08061901-1 VL). As células de astrocitoma de glioblastoma humano MG

U373 foram cultivadas em MEM (Sigma Aldrich, cat. n. M-2279) suple- mentado com 10% de FBS, 1% de Pen Strep, 4mM de L-Glut, 1X de solução de Aminoácido Não essencial de MEM e 1X de Piruvato de Só- dio.

[00273] SH-SY5Y é uma linhagem celular de neuroblastoma humano derivada de um neuroblastoma maligno e pode ser adquirida de Sigma- Aldrich (cat. nº 94030304-1 VL). As células foram cultivadas em 50% de MEM e 50% de meio de mistura de nutrientes F-12 Ham suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de FBS inativado pelo calor, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. As células no meio de crescimento foram plaqueadas em placas de 96 poços a 11.000 células/poço e coloca- das na incubadora. Após 2 dias, os meios foram substituídos por meio de diferenciação (meio de crescimento contendo 1% de FBS) e 10 uM de ácido retinoico. O meio de diferenciação foi substituído a cada dois dias e as células foram usadas após 7 dias de diferenciação. Método

[00274] As células SHSY5Y foram plaqueadas em placas de 12 po- ços a uma densidade de 50.000 células/poço. As células foram cultiva- das em 50% de MEM e 50% de meio de mistura de nutrientes F-12 Ham suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de FBS inativado pelo calor, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina. As células no meio de crescimento foram plaqueadas em placas de 96 poços a

11.000 células/poço e colocadas na incubadora. Após 2 dias, os meios foram substituídos por meio de diferenciação (meio de crescimento con- tendo 1% de FBS) e 10 uM de ácido retinoico. O meio de diferenciação foi substituído a cada dois dias e as células foram usadas após 7 dias de diferenciação. Os U373 foram plaqueados em 12 placas transpoço (membrana de poliéster de 0,4 um, Costar) a uma densidade de 50.000 células/poço por 72 horas. As células foram co-cultivadas em conjunto por 24 horas antes do tratamento em meio de diferenciação (meio de crescimento contendo 1% de FBS sem ácido retinoico).

[00275] — Posteriormente, as células foram tratadas com 25ug/ml de a- sinucleína (Wt, ASST, E46K) na presença ou ausência de 10% de bac- térias sobrenadantes durante 48 horas. Os sobrenadantes livres de cé- lulas foram coletados, centrifugados a 10000g por 3 min a 4ºC, divididos em alíquotas e armazenados a -80ºC. A IL-6 e IL-8 humanas foram me- didas como descrito acima.

Resultados

[00276] Osresultados destes experimentos são mostrados na Figura

4. O tratamento de células com a-sinucleína do tipo selvagem e as iso- formas mutantes E46K e A53T induziu secreção moderada de IL-6 (Fi- gura 4A). A secreção de IL-6 induzida por a-sin foi inibida em células tratadas com as cepas bacterianas (Figura 4A). A redução na secreção de IL-6 foi maior na administração de MRX0029.

Exemplo 3 — Eficácia de inóculos bacterianos para reduzir a ativa- ção de NFKB Sumário

[00277] A ativação do promotor NFKB leva à produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1B, IL-1 a, IL-18, TNF a e IL-6. O promotor de NFKB pode ser ativado por a-sinucleína e LPS, estimulando o ligante de TLRA4. Mutações na a-sinucleína, como a a-sinucleína A53T, estão im- plicadas no Parkinson familiar. O tratamento de células neuronais com LPS simula Parkinson causado por fatores ambientais. A capacidade das composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a inven- ção para inibir a ativação do promotor NFKB foi investigada.

Material e Métodos Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029 Linhagem celular

[00278] —OTLRA4 Hek blue humano foi adquirido da InvivoGen (cat. n.

hkb-htlr4). O TLR4 Hek blue humano foi cultivado em DMEM com alta glicose (Sigma Aldrich, cat. n. D-6171) suplementado com 10% de FBS, 1% de Pen Estrep, 4mM de L-Glut, Normocina e solução de seleção 1X HEK Blue. Método

[00279] Uma vez cultivadas, as células Hek blue humanas foram pla- queadas em placas de 96 poços a 25.000 células/poço em 4 repetições. Um conjunto de células foi tratado com a-sinucleína A53T (1ug/mL) sozi- nho ou com 10% de bactérias sobrenadantes do MRx0029 por 22h. O se- gundo conjunto de células foi tratado com LPS (10 ng/mL, de Typhimu- rium de sorotipo de Salmonella entérica, Sigma Aldrich, cat. n. L6143) sozinho ou com 10% de bactérias sobrenadantes do MRO029 por 22h. As células foram subsequentemente centrifugadas e 20uL do sobrena- dante foram misturados com 200 JL de reagente Quanti Blue (Invivo- Gen, cat n. rep-qgb2), incubados por 2 h e a absorvência lida a 655 nm. Resultados

[00280] Os resultados destes experimentos são mostrados nas Figu- ras 5 e 6. A Figura 5 mostra que a ativação do promotor NFKB por a- sinucleina não é inibida por MRx0029. A Figura 6 mostra que a ativação do promotor NFKB por LPS é inibida por MRx0029. Exemplo 4 - Eficácia de inóculos bacterianos para alterar a capaci- dade antioxidante Sumário

[00281] A capacidade de composições compreendendo cepas bac- terianas de acordo com a invenção para alterar a capacidade antioxi- dante. A capacidade antioxidante da cepa bacteriana foi estabelecida usando o conhecido ensaio ABTS (ácido 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilben- zotiazolina-6-sulfônico)).

Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029 Método

[00282] As células bacterianas (10º ou superior) foram coletadas e centrifugadas. Eles foram ressuspensos em tampão de ensaio (usando três vezes o volume de sedimento). A suspensão foi sonicada em gelo por 5 minutos e depois centrifugada a 12.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e medido usando o kit de ensaio ABTS pro- duzido pela Sigma Aldrich (código CS0790), de acordo com as instru- ções do fabricante.

Resultados

[00283] Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura

7. A Figura 7 mostra que o MRx0029 tem uma capacidade antioxidante de aproximadamente 2mM em comparação com o Trolox.

Exemplo 5 — Eficácia de inóculos bacterianos para alterar os níveis de peroxidação lipídica Sumário

[00284] A capacidade das composições compreendendo cepas bac- terianas de acordo com a invenção para alterar os níveis de peroxidação lipídica foi investigada. O ensaio de substâncias reativas tiobarbitúricas (TBARSs) foi utilizado para medir os subprodutos da peroxidação lipídica.

Material e Métodos Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029 Método

[00285] As células bacterianas (10º ou superior) foram coletadas e centrifugadas, uma etapa de lavagem foi realizada com solução salina isotônica antes de o sedimento ser ressuspenso em tampão de ensaio de cloreto de potássio. A suspensão foi sonicada em gelo por 10 minu- tos e depois centrifugada a 10.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o nível de peroxidação lipídica avaliado usando o ensaio de substâncias reativas tiobarbitúricas.

Resultados

[00286] Os resultados das experiências são mostrados na Figura 8.

A Figura 8 mostra que o MRx029 é capaz de inibir a peroxidação lipídica em aproximadamente 20%, que é uma capacidade antioxidante mais alta que o controle positivo, hidroxitolueno butilado (1% p/v).

Exemplo 6 - Eficácia da inoculação bacteriana na atividade da his- tona desacetilase Sumário

[00287] A capacidade das composições compreendendo cepas bac- terianas de acordo com a invenção para alterar a atividade da histona desacetilase foi investigada. A desregulação da histona desacetilase tem sido implicada na patogênese associada a doenças neurodegene- rativas associadas à idade.

Material e Métodos Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029 Linhagem celular

[00288] —Alinha celular HT-29 foi usada porque a histona desacetilase está presente.

Método

[00289] Os sobrenadantes isentos de células de culturas bacterianas de fase estacionária foram isolados por centrifugação e filtração em um filtro de 0,22 uM. As células HT-29 foram usadas 3 dias após a confluên- cia e foram reduzidos em 1 mL de DTS 24 horas antes do início do ex- perimento. As células HT-29 foram desafiadas com sobrenadante livre de células a 10% diluído em DTS e este foi deixado a incubar por 48 horas. As proteínas nuclease foram então extraídas usando o kit de ex-

tração Sigma Aldrich Nuclease e as amostras foram congeladas rapida- mente antes da medição da atividade da HDAC. A atividade HDAC foi avaliado fluorometricamente usando o kit Sigma Aldrich (Reino Unido).

Resultados

[00290] Os resultados das experiências são mostrados na Figura 9.

A Figura 9 mostra que o MRx0029 é capaz de reduzir os níveis de ativi- dade da histona desacetilase.

Exemplo 7 - Nível de produção de indol em bactérias Sumário

[00291] A capacidade das bactérias da invenção de produzir indo! foi investigada. O indol tem sido implicado na atenuação da inflamação e do estresse oxidativo.

Material e Métodos Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029

[00292] ATCC 11775 é uma cepa de referência bacteriana que é co- nhecida por produzir indol.

Método

[00293] As células bacterianas intactas em fase estacionária foram incubadas com triptofano 6GmMM por 48 horas. As espécies bacterianas que possuem a enzima triptofanase utilizarão o triptofano como subs- trato para produzir indol. Após o período de incubação de 48 horas, o sobrenadante foi removido e adicionado ao reagente de Kovac para quantificação de indol. Padrões, soluções de estoque e reagentes foram preparados usando métodos padronizados validados internamente.

Resultados

[00294] Os resultados das experiências são mostrados na Figura 10.

A Figura 10 mostra que o MRx0029 tem a capacidade de produzir indo! a partir do triptofano, em concentrações de aproximadamente 0,2mM.

Exemplo 8 — Nível de produção de quinurenina em bactérias Sumário

[00295] A capacidade das bactérias da invenção de produzir indo! foi investigada. A desregulação da via da quinurenina pode levar à ativação do sistema imunológico e ao acúmulo de compostos potencialmente neurotóxicos. Alterações no metabolismo da quinurenina podem estar envolvidas no desenvolvimento das doenças de Parkinson.

Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRx0029

[00296] O DSM 17136 é uma cepa de Bacteroides copricola que é conhecida por produzir quinurenina.

Método

[00297] Os sobrenadantes isentos de células de culturas bacterianas de fase estacionária foram isolados por centrifugação e filtração em um filtro de 0,22 uM e congelados até o uso. Padrões, soluções de estoque e reagentes de quinurenina foram preparados usando métodos padro- nizados validados internamente. As amostras foram tratadas com ácido tricloroacético e centrifugadas a 10.000xg por 10 minutos a 4ºC. O so- brenadante foi coletado e dispensado em uma placa de 96 poços. O reagente de Ehrlich foi utilizado para a detecção de quinurenina e adici- onado na proporção de 1:1.

Resultados

[00298] Os resultados das experiências são mostrados na Figura 11.

A Figura 11 mostra que o MRx0029 tem capacidade para produzir qui- nurenina a uma concentração de aproximadamente 40 uM.

Exemplo 9 - Níveis de dopamina, DOPAC e HVA no estriado em ca- mundongos MPTP tratados com bactérias

[00299] A doença de Parkinson é um distúrbio neurodegenerativo comum cujas características clínicas cardinais incluem tremor, lentidão de movimento, rigidez e instabilidade postural. Esses sintomas são atri- buíveis principalmente à degeneração dos neurônios dopaminérgicos na pars compacta da substância negra e à consequente perda de suas fibras nervosas projetadas no estriado [60]. Os camundongos tratados com MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina) perdem seletiva- mente um número significativo de neurônios dopaminérgicos nigroestri- atais [61]. A perda induzida por MPTP de células dopaminérgicas na substância negra imita a condição clínica na doença de Parkinson e, portanto, é um modelo útil para testar fármacos antiparkinsônicas.

[00300] O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos das bactérias anaeróbias MRX0029 usando camundongos lesados por MPTP.

[00301] 48 camundongos machos foram alocados em 4 grupos de tratamento diferentes (grupos A, B, E e |, com n=12 animais em cada grupo). Os grupos de tratamento são mostrados na Tabela 1 abaixo e o curso do tempo do projeto é descrito abaixo. Tabela 1: Grupos de tratamento Nível de Cronograma segurança A eee Po po saasa sa po fa Vea bo des dera de 12 MRx0029 Megas-S1/S2 2 x 10º8 bactérias 18 dias: dia(-14) — dia 3) phaera sp. (gly) fa esa bo foderda10 das prio po mat fo enem — Tabela 1: -continuação- pestana pas Me romana | A fa Meios aaa o eo po fee am e Ee E fee am e eo Pe rm e be

[00302] Os grupos A,B, E el foram tratados diariamente por 18 dias por gavagem oral com bactérias (MRx0029 — grupo E) ou veículo (PBS). O tratamento oral foi iniciado 14 dias antes da lesão de MPTP. Os ani- mais do grupo | receberam um tratamento diário com veículo (PBS) p.o. (por via oral) e foram injetados i.p. (intraperitoneal) com a fármaco de referência 30 minutos antes e 90 minutos após o primeiro MPTP no dia O. O volume de aplicação para tratamento de p.o. e veículo foi de 200 ul por camundongo. A cepa de Bacteria do grupo E provinham de reservas de glicerol (gly). Para tratamento oral, gavagens para aplicações foram armazenadas em frascos contendo 70% de Etanol e lavadas antes e após cada uso com água destilada. Cada grupo de tratamento teve seu próprio frasco de gavagem e etanol e frasco de água destilada. Os tubos e gavagens não foram trocados entre os grupos. Imediatamente antes do tratamento, cada seringa foi lavada com N2.

[00303] “Nodiao,foiinjetado MPTP (20 mg/kg de peso corporal (p.c.) 4 vezes, 2 h de intervalo entre tratamentos) i.p. nos animais dos grupos B, E e |. Um grupo de animais (A) foi simulado pela administração i.p. do veículo MPTP (solução salina a 0,9%). O volume de aplicação foi de ul por g de peso corporal. A pesagem dos animais foi realizada antes do tratamento com MPTP para dosar os animais de acordo com seu peso corporal real. Posteriormente, os animais receberam o tratamento de p.o. diário. Formulação de preparações para dosagem e preparação de estoques de glicerol para dosagem

Para o grupo de tratamento E (MRx0029)

1.) 1 estoque de glicerol foi retirado do freezer a -80ºC e co- locado em condições anaeróbicas (frasco anaeróbico com sachê) a 37ºC para descongelar (isso levou 30-40 minutos).

2.) O estoque de glicerol completamente descongelado foi centrifugado a 6000 x g por 10 min à temperatura ambiente.

3.) O sobrenadante foi descartado sem perturbar o pélete (por exemplo, usando uma pipeta).

4.) Foram adicionados 4,22 mL de PBS 1 x pré-aquecido es- téril (87ºC) e misturados suavemente usando uma pipeta.

5.) Os camundongos foram dosados com 200 yuL da solução bacteriana. Os animais foram dosados dentro de 15 minutos após res- suspensão do pélete com PBS.

Formulação de grupo de fármacos de referência Condição/estabilidade de - 20ºC ienes Administração: i.p. (30 min antes e 90 min após o 1 tra tamento MPTP)

[00304] A quantidade apropriada de 7-Nitroindazol foi dissolvida em óleo de amendoim para atingir a concentração final de 50 mg/kg.

Materiais e Métodos Animais Linhagem de camundongo: — /C57BL/6J (Cepa de Camundongo JAXTY) Número de ss Esmed0cmdorge RXEERRISE em o Manuseio específico de Animais e Randomização

[00305] As luvas foram trocadas entre cada grupo de tratamento e pulverizadas com solução de etanol a 70% entre cada gaiola do mesmo grupo para minimizar o risco de contaminação sempre que os animais eram manuseados (por exemplo: tratamento, testes comportamentais, limpeza e amostragem de tecidos).

[00306] O tratamento foi aleatório e alternado diariamente, a fim de impedir que os mesmos grupos fossem tratados no mesmo horário to- dos os dias. Os animais foram randomizados por gaiola na amostragem de tecido.

Amostragem e processamento de tecidos

[00307] “Nodial4, animais de todos os grupos foram sacrificados e os cérebros foram coletados. Portanto, os camundongos foram anestesia- dos profundamente por injeção de Pentobarbital (600mg/Kkg).

[00308] O sangue (aproximadamente 500 ul) foi coletado por punção cardíaca. Os camundongos foram então perfundidos transcardialmente com solução salina a 0,9% e os cérebros foram removidos e hemisse- cados. O hemisfério esquerdo foi subdividido em tecido estriatal (para HPLC), tecido de substância negra como cérebro residual, pesado e imediatamente congelado e armazenado a -80ºC. Os instrumentos e superfícies que estavam em contato com os animais tiveram que ser limpos com etanol a 70% antes que o próximo animal fosse dissecado.

Análise bioquímica dos níveis de dopamina, DOPAC e HVA com HPLC no estriado

[00309] As amostras estriatais (n=6 de cada grupo de tratamento; to- tal de 24 amostras) foram misturadas na proporção de 1:10 (p/v) com ácido perclórico 0,2 M, incluindo 100 uM EDTA-2Na e homogeneizadas a 0ºC em um micro-homogeneizador de pistilo de vidro. Após repousar minutos em gelo, os homogenatos foram centrifugados a 10.000 RPM por 10 minutos em uma centrífuga refrigerada Biofuge Fresco (He- raeus Instruments, Alemanha). Os sobrenadantes foram cuidadosa- mente aspirados e misturados com tampão Na-acetato 0,4 M, pH 3 na proporção de 1:2 (v/v) e filtrados através de um filtro centrífugo de 0,22 um (Merck Millipore, Alemanha) por 4 min a 14.000 g a 4ºC. Os filtrados foram armazenados a -80ºC antes da análise por HPLC. Análise HPLC

[00310] As concentrações de DA, DOPAC e HVA nas amostras es- triatais foram determinadas por cromatografia líquida de coluna com de- tecção eletroquímica [62:63]. O sistema HPLC (HTEC-500, Eicom Corp. ,Kyoto, Japão) incluindo uma bomba de microfluxo sem pulso, um desgaseificador e um detector amperométrico equipado com um ele- trodo de carbono vítreo operando a +0,45 V vs. um eletrodo de referên- cia Ag/AgCl foi utilizado. As amostras foram injetadas usando um Micro- sampler Refrigerado CMA/200 (CMA/Microdiálise, Estocolmo, Suécia). Os cromatogramas foram registrados e integrados pelo uso de um sis- tema computadorizado de aquisição de dados (DataApex, Praga, Repú- blica Tcheca). DA, DOPAC e HVA foram separados em uma coluna de 150 x 2,1 id. mm (CA5-ODS, Eicom Corp., Kyoto, Japão). A fase móvel consistiu em tampão fosfato 0,1 M a pH 6,0, EDTA 0,13 mM, 1-octanos- sulfonato de sódio 2,3 mM e metanol a 20% (v/v). O limite de detecção (proporção sinal-ruído = 3) para DA foi estimado em 0,5 fmol em 15 ul (0,03 nM) injetado na coluna.

Resultados

[00311] A administração de cepas bacterianas foi bem tolerada pelos animais. No dia da lesão do MPTP e, se necessário, no dia seguinte, uma luz vermelha foi usada para aquecer os animais. Se os animais estivessem em más condições (com frio, desidratados, comportamento anormal), receberiam comida úmida e tratamento salino subcutâneo, se necessário.

[00312] Para análise dos níveis de Dopamina, DOPAC e HVA, foi uti- lizado tecido estriatal de 6 animais por grupo de tratamento. Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post- hoc de comparação múltipla de Dunn ou pela análise de variância uni- direcional, seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni (A vs. todos(*), B vs. todos, | vs. todos (nº)). */nº = p<0,05; **= p0,01; ***= p0,001.

[00313] Os animais saudáveis do grupo A apresentaram altos níveis de Dopamina, DOPAC e HVA, enquanto o tratamento com MPTP no grupo B reduziu isso e o controle positivo (grupo |) recuperou a produção em algum grau (Figura 12). Os animais do grupo | tenderam a ter níveis mais elevados de dopamina do que o grupo tratado com bactérias e o grupo B. Os níveis de DOPAC (um metabólito da dopamina) em geral foram significativamente mais baixos nos animais do grupo B em com- paração com os níveis de DOPAC de animais não isolados do grupo À (Figura 12B).

[00314] Significativamente, verificou-se que o tratamento com MRx0029 (grupo E) recuperou a produção de Dopamina e DOPAC (Fi- guras 12A e 12B, respectivamente). O tratamento com MRx0029 pode, portanto, ser útil no tratamento ou prevenção de distúrbios neurodege- nerativos.

Exemplo 10 — Eficácia das bactérias para alterar o desenvolvimento de neurites Sumário

[00315] O desenvolvimento de neurites é um processo importante para o desenvolvimento de conexões entre neurônios. A capacidade de cepas bacterianas e ácidos orgânicos de induzir o desenvolvimento de neurites foi, portanto, testada medindo os níveis transcricionais da pro- teína MAP? associada a microtúbulos, um marcador específico de dife- renciação neuronal.

Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRX0029.

Método

[00316] As SHSY5Y foram plaqueadas em placas de Petri de 10cm com uma densidade de 2x10º células. Após 24h, as células foram trata- das em meio de diferenciação (meio de crescimento contendo 1% de FBS sem RA) com 10% de sobrenadantes de bactérias ou YCFAr, 10uM RA, 200uM ácido hexanoico ou 200uM ácido valproico, por 17 horas. Depois, foram obtidas imagens representativas usando o micros- cópio de núcleo EVOS XL com contraste de fase com ampliação de 40X/0,65. As células foram coletadas e o RNA total foi isolado de acordo com o protocolo do RNeasy mini kit protocol (Qiagen). Os cDNAs foram feitos usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems). A expressão gênica foi medida usando qPCR.

GAPDH foi utilizado como controle interno. A modulação foi calculada de acordo com o método 222º), Imunofluorescência e microscopia Confocal

[00317] As células foram semeadas em lâminas de câmara de 8 po- ços (Marienfeld Laboratory Glassware) a 5x10º células/poço durante a noite e foram tratadas com sobrenadante bacteriano a 10% por 24 ho- ras. Para diferenciação, as células foram tratadas com ácido retinoico

10nM por 5 dias antes de serem tratadas com sobrenadante bacteriano. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS du- rante 20 minutos à temperatura ambiente (RT). As células fixas foram lavadas com PBS e permeabilizadas com 1% de Triton X-100 em PBS por 10 minutos. Após lavagem com PBS, as lâminas foram incubadas com tampão de bloqueio (4% de BS A/PBS) por 1hr à RT antes de adi- cionar anticorpo anti-MAP2 (sc-74421, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluído em 1% de BSA/PBS por 12 horas a 4ºC. Eles foram então lava- dos duas vezes com PBS, seguido de incubação com anti-camundongo conjugado Alexa Flour 488 (Molecular Probes Inc) e Faloidina conju- gada Alexa Flour 594 (ab 176757, Abeam) por 1hr à temperatura ambi- ente. Após lavagem 3X com PBS, as lâminas foram montadas com Vec- torshield& contendo DAPI (Sigma, Aldrich). As lâminas foram visualiza- das usando um microscópio Zeiss Axioscope equipado com um 63x /1,2 W Korr objetivo adequado e conjuntos de filtro adequados para a detec- ção dos fluorocromos utilizados. Os tempos de exposição manual para a aquisição digital de imagens imunomarcadas com MAP-2 foram man- tidos constantes, permitindo a comparação entre diferentes poços e tra- tamentos. Os tempos de exposição à faloidina (F-actina) e DAP! varia- ram de acordo com o campo de visão. Os campos de visão randomiza- dos foram adquiridos usando uma câmera Qlmaging controlada pelo software Image Pro Plus. As imagens foram salvas como TIFs e abertas no Adobe Photoshop CC 2015.1.2 e as sobreposições das imagens MAP-2, DAPI e faloidina foram sobrepostas e mescladas. Imagens re- presentativas foram selecionadas para ilustrar as diferenças de abun- dância e localização das proteínas examinadas Resultados

[00318] Os resultados são mostrados na Figura 13. A Figura 13A mostra imagens representativas de microscopia de células SHSY-5Y in-

diferenciadas incubadas com cada um dos ácidos e bactérias sobrena- dantes. O tratamento de células com MRX0029 induziu um fenótipo se- melhante a um neurônio, mostrando características semelhantes às cé- lulas tratadas com ácido retinoico (que é usado para diferenciação ter- minal de células de neuroblastoma), onde os corpos celulares são mai- ores e de forma piramidal, com neurites e ramificações processadas for- mando redes com células vizinhas. A Figura 13B mostra que o MRx0029 regula positivamente o MAP2 de maneira indiferenciadaem células de neuroblastoma. A coloração da faloidina (um agente de ligação ao cito- esqueleto de actina) provou ainda um arranjo diferente da estrutura ci- toesquelética nas células tratadas com MRx0029, apoiando ainda mais a hipótese de diferenciação neuronal para MRx0029 (Fig. 13B). Exemplo 11 — Eficácia de inóculos bacterianos para reduzir os ní- veis oxidativos nas células Fundamentos

[00319] A geração de espécies reativas de oxigênio contribui para a patologia de doenças neurodegenerativas. Investigou-se a capacidade das cepas bacterianas de proteger células SHSY-5Y e U373 diferencia- das de espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pelo tratamento com Peróxido de Hidrogênio Terc-Butílico (PHTB). Material e Métodos Cepa bacteriana Megasphaera massiliensis MRX0029 Método

[00320] As células SHSY-5Y foram plaqueadas em uma placa preta de fundo plano de 96 poços com densidade de 5000 células/poço e co- locadas na incubadora de CO2. Após 24 h, os meios foram substituídos por meio de diferenciação (meio de crescimento contendo 1% de FBS) e 10 uM de ácido retinoico. O meio de diferenciação foi substituído a cada dois dias. No Dia 10, o meio de diferenciação foi removido e as células foram lavadas com PBS pré-aquecido e coradas com sonda mo- lecular 10uM DCFDA por 20 minutos em meio de crescimento contendo 1% de FBS. Em seguida, as células foram lavadas com PBS pré-aque- cido novamente e tratadas com 100 uM de TBHP na presença ou au- sência de 10% de sobrenadante bacteriano por 2h. A intensidade da fluorescência foi medida usando o leitor de placas TECAN em Ex/Em 485/530 nm. Resultados

[00321] Os resultados das experiências são mostrados na Figura 14. A Figura 14b mostra que o MRX0029 é capaz de inibir a produção de ROS em células diferenciadas de neuroblastoma SHSY-5Y. MRX0029 não teve efeito na geração de ROS em células de astroglioblastoma U373 (Figura 14a). Isso mostra que esse aspecto do efeito antioxidante é específico do neurônio. Exemplo 12 - neuroproteção

[00322] As células SHSY-5Y diferenciadas de RA foram tratadas com MPP+, o metabólito ativo do MPTP, um produto químico ampla- mente utilizado para imitar in vitro e in vivo algumas das características da patologia da PD. A viabilidade celular foi medida como a taxa de res- piração das mitocôndrias (Figura 15). Tanto o MRx0005 quanto o MRx0029 mostraram efeitos significativos e promovem per se um au- mento da atividade metabólica das mitocôndrias nas células SHSY-5Y. MRX0029 mostrou proteção completa contra MPP+, restaurando a via- bilidade celular quase no mesmo nível de células não tratadas e maior que o controle positivo de quercetina. A proteção MRx0005 foi de cerca de 20% em comparação com a amostra tratada com YCFA-MPP"+, apro- ximadamente a mesma observada para o controle positivo de querce- tina (Fig. 15).

Exemplo 13 — Análise adicional do mecanismo de inibição da desa- cetilação de histonas Introdução

[00323] A microbiota intestinal, com sua imensa diversidade e capa- cidade metabólica, representa um enorme reservatório metabólico para a produção de uma vasta variedade de moléculas com potencial para influenciar a atividade da HDAC. Poucos estudos avaliaram a atividade inibitória da HDAC de metabólitos derivados de bactérias, além do buti- rato, que demonstrou inibir a HDAC e está associado à melhora da fun- ção motora na doença de Huntington [64]. Os inventores procuraram, portanto, determinar quais metabólitos são responsáveis pela inibição da HDAC e elucidar ainda mais os mecanismos pelos quais a inibição é alcançada. Material e Métodos Cultura bacteriana e coleta de sobrenadante sem células

[00324] Culturas puras de bactérias foram cultivadas anaerobica- mente em caldo YCFA até atingirem sua fase de crescimento estacio- nário. As culturas foram centrifugadas a 5.000 x g por 5 minutos e o sobrenadante livre de células (CFS) foi filtrado usando um filtro de 0,2 UM (Millipore, Reino Unido). Alíquotas de 1 mL do CFS foram armaze- nadas a -80ºC até o uso. Butirato de sódio, ácido hexanoico e valérico foram obtidos da Sigma Aldrich (Reino Unido) e as suspensões foram preparadas em caldo YCFA. Quantificação de SCFA e MCFA de sobrenadantes bacterianos

[00325] Os ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) e ácidos graxos de cadeia média (MCFAs) de sobrenadantes bacterianos foram analisa- dos e quantificados pelo MS Omics APS da seguinte maneira. As amos- tras foram acidificadas com ácido clorídrico e os padrões internos mar- cados com deutério foram adicionados. Todas as amostras foram ana- lisadas em ordem aleatória. A análise foi realizada usando uma coluna de alta polaridade (Zebron'“ ZB-FFAP, GC Cap. Coluna 30 m x 0,25 mm x 0,25 um) instalada em um GC (7890B, Agilent) acoplado a um detector de quadropolo (59977B, Agilent). O sistema foi controlado pela ChemsStation (Agilent). Os dados brutos foram convertidos para o for- mato netCDF usando o Chemstation (Agilent), antes dos dados serem importados e processados no Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando o software PARADISe descrito em [65]. Análise de atividade específica da HDAC

[00326] A atividade de inibição específica da HDAC foi analisada para HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 usando kits de ensaio fluorogênico para cada tipo de HDAC (BPS Bioscience, CA). Os ensaios foram conduzidos de acordo com as instruções do fabricante e cada amostra foi realizada em réplicas. Os sobrenadantes isentos de células foram diluídos 1 em e expostos a proteínas HDAC específicas fornecidas no Kit para man- ter a consistência entre os métodos. Resultados

[00327] Os metabólitos microbianos comensais do intestino que ini- bem a histona desacetilase são butirato e ácido valérico

[00328] O MRx0029, cujo sobrenadante mostrou forte inibição de HDAC nas células inteiras HT29 e nos lisados celulares HT29, produziu ácido valérico e ácido hexanoico em concentrações médias de 5,08 mM e 1,60 mM, respectivamente (Figura 16A e C).

[00329] Para investigar quais metabólitos foram responsáveis pela inibição da HDAC induzida por cepa, mediram-se diferentes concentra- ções de ácido hexanoico, ácido valérico e butirato de sódio para a inibi- ção da HDAC em células HT-29 inteiras e no lisado celular de HT-29. Os resultados na Fig. 16B mostram uma inibição significativa (P<0,05) da atividade de HDAC pelo butirato de sódio em células inteiras, bem como no lisado celular, enquanto o ácido hexanoico não mostrou ativi- dade inibidora significativa. O ácido valérico inibiu a atividade total de

HDAC (* (p <0,05), ** (p<0,005), *** (P<0,001), **** (p<0,0001)). Inibidores potentes da HDAC total investigaram HDACSs classe | alvo.

[00330] O perfil de inibição de HDAC específico da cepa bacteriana em teste foi investigado. Ensaios específicos de inibição da HDAC (BPS Bioscience, CA) foram realizados para HDACs Classe | e Classe Il. A capacidade da cepa bacteriana de inibir as enzimas HDAC foi compa- rada ao butirato, ácido hexanoico e valérico. Nossos resultados de- monstram que o MRX0029 é um inibidor muito potente das enzimas HDAC Classe 1 (HDAC1, 2 e 3). A inibição de HDACs classe |l não foi tão significativa (dados não mostrados). Discussão

[00331] A cepa com atividade inibidora da HDAC produziu quantida- des significativas de ácido valérico e ácido hexanoico, bem como quan- tidades significativas de butirato de sódio (Figura 16C). Quando testado como substância pura, o ácido valérico e o butirato de sódio resultaram em significativa inibição da HDAC (p<0,0001).

[00332] Curiosamente, os resultados para a atividade específica da HDAC mostram que a cepa testada é um potente inibidor das HDACs Classe |, e particularmente da HDAC2 (Figura 17 e 18). As HDACs Classe | (HDAC1, 2, 3 e 8) residem no núcleo e são expressos em todos os tipos de células humanas. As HDAC 1-3 compartilham mais de 50% de homologia, mas possuem estruturas e funções celulares distintas

[66]. Eles estão envolvidos principalmente na sobrevivência, prolifera- ção e diferenciação celular e, portanto, sua inibição pode ser útil em uma ampla gama de doenças [67]; [68]; [69]; [70]; [71]. Exemplo 14 — Nível de secreção de BDNF nas células SHSY-5Y Fundamentos

[00333] O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é uma mo- lécula onipresente no cérebro associada ao desenvolvimento neural,

neuro-proteção e neuro-regeneração. O BDNF não apenas protege con- tra a neurodegeneração, mas também distúrbios mentais como depres- são e ansiedade, que são bastante comuns entre pacientes diagnosti- cados com PD ou AD. Métodos

[00334] As placas SH-SY5-SY foram plaqueadas em placas de 24 poços com densidade de 60.000 célula /poço e colocadas na incuba- dora. Após 24 h, os meios foram substituídos por meio de diferenciação (meio de crescimento contendo 1% de FBS) e 10 uM de ácido retinoico. O meio de diferenciação foi substituído a cada dois dias e as células foram usadas no dia 10 de diferenciação. Para o tratamento, o meio de diferenciação foi removido e substituído por 450 ul de meio de cresci- mento completo e 50 uL de bactérias SN foram adicionadas aos poços tratados ou YCFAr+ foi adicionado como controle negativo. Resultados

[00335] Os resultados são mostrados na Figura 19, que mostra que a administração de MRX0029 em combinação com ácido retinoico au- menta a secreção de BDNF de células de neuroblastoma diferenciadas. As composições compreendendo bactérias comensais e ácidos orgâni- cos podem, portanto, ser úteis na terapia. Exemplo 15 - Produção de metabólitos - metabólitos no cérebro Fundamentos

[00336] Os metabólitos presentes nos sobrenadantes das bactérias podem influenciar diretamente a resposta do hospedeiro ao estresse oxidativo, comunicação célula-célula e neuroproteção. Os metabólitos que desempenham um papel fundamental nos processos neurológicos foram medidos durante a triagem ex vivo no tecido cerebral de camun- dongos alimentados com MRx0005 e MRx0029.

Métodos Animais

[00337] Os camundongos machos adultos BALBc (Envigo, UK) fo- ram alojados em um ciclo de 12 horas claro-escuro; comida padrão para roedores e água estavam disponíveis ad libitum. Todas as experiências foram realizadas de acordo com as diretrizes europeias após a aprova- ção pelo Comitê de Experimentação de Ética Animal da University College Cork. Os animais tinham 8 semanas de idade no início do ex- perimento. Projeto de Estudo

[00338] Os animais foram autorizados a habituar-se à sua sala de espera por uma semana após a chegada à unidade animal. Eles rece- bem gavagem oral (dose de 200 uL) de bioterapêuticos vivos na dose de 1 X 10º CFU por 6 dias consecutivos entre as 15:00 e as 17:00. No dia 7, os animais são decapitados e os tecidos são colhidos para expe- rimentação. Coleta de Tecidos

[00339] Os animais foram sacrificados de maneira aleatória em rela- ção ao tratamento e condição de teste; a amostragem ocorreu entre 9h e 13h. O sangue do tronco foi coletado em tubos de EDTA de potássio (ácido etilenodiaminotetracético) e centrifugado por 15 min a 4000 g. O plasma foi isolado e armazenado a -80ºC para análise posterior. O cé- rebro foi rapidamente excisado, dissecado e cada região do cérebro foi congelada rapidamente em gelo seco e armazenada a -80ºC para aná- lise posterior. O baço foi removido e processado imediatamente após o abate para estimulação imune ex vivo. O tecido intestinal (segmentos de 2 cm de fleo e cólon mais próximos do ceco foram excisados e o mais distante 1cm de tecido do ceco foi usado) foram montados nas câmaras Ussing para o ensaio de permeabilidade intestinal. O ceco foi removido, pesado e armazenado a -80ºC para análise de SCFAs.

Análise de Monoamina

[00340] A concentração de neurotransmissores foi analisada por HPLC em amostras do tronco cerebral. Resumidamente, o tecido do tronco encefálico foi sonicado em 500 ul de fase móvel refrigerada com 4 ng/40 ul de N-metil 5-HT (Sigma Chemical Co., Reino Unido) como padrão interno. A fase móvel continha ácido cítrico 0,1 M, ácido octano- 1-sulfônico 5,6 mM (Sigma), di-hidrogenofosfato de sódio 0,1 M, EDTA 0,01 mM (Alkem/Reagecon, Cork) e 9% (v/v) de metanol (Alkem/Rea- gecon) e foi ajustado para pH 2,8 usando hidróxido de sódio 4 N (Al- kem/Reagecon). Os homogenatos foram então centrifugados por 15 min a 22.000 g a 4ºC e 40 ul do sobrenadante injetado no sistema HPLC que consistia em um controlador de sistema SCL 10-Avp, detector ele- troquímico LECD 6A (Shimadzu), uma bomba LC-10AS, um forno CTO- 10A, um autoinjetor SIL-10A (com o resfriador de amostras mantido a 40ºC) e um desgaseificador Gastorr on-line (ISS, Reino Unido). Uma coluna de fase reversa (Kinetex 2,6 u C18 100 x 4,6 mm, Phenomenex) mantida a 30ºC foi empregada na separação (Taxa de fluxo 0,9 ml/min). O eletrodo de trabalho de carbono vítreo combinado com um eletrodo de referência de Ag/AgCl (Shimdazu) operou a +0,8 V e os cromatogra- mas gerados foram analisados usando o software Class-VP 5 (Shi- madzu). Os neurotransmissores foram identificados por seus tempos de retenção característicos, determinados por injeções padrão, que são executadas em intervalos regulares durante a análise da amostra. As razões das alturas dos picos de analito versus padrão interno foram me- didas e comparadas com a injeção padrão. Os resultados foram expres- sos em ng de neurotransmissor por g de peso fresco de tecido. Análise metabólica

[00341] Para análise do metabólito de GC, amostras de sobrenadan- tes bacterianos foram derivatizadas com cloroformato de metil usando uma versão ligeiramente modificada do protocolo descrito em [72]. To- das as amostras foram analisadas em ordem aleatória. A análise foi re- alizada usando GC (7890B, Agilent) acoplado a um detector de quadro- polo (59977B, Agilent). O sistema foi controlado pela ChemStation (Agi- lent). Os dados brutos foram convertidos para o formato netCDF usando o Chemstation (Agilent), antes dos dados serem importados e proces- sados no Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando o software PARA- DISe descrito em [65].

[00342] “Para análise de ácidos graxos, amostras foram acidificadas com ácido clorídrico e os padrões internos marcados com deutério fo- ram adicionados. Todas as amostras foram analisadas em ordem alea- tória. A análise foi realizada usando uma coluna de alta polaridade (Ze- bronTy ZB-FFAP, GC Cap. Coluna 30 m x 0,25 mm x 0,25 um) instalada em um GC (7890B, Agilent) acoplado a um detector de quadropolo (59977B, Agilent). O sistema foi controlado pela ChemsStation (Agilent). Os dados brutos foram convertidos para o formato netCDF usandoo Chemstation (Agilent), antes dos dados serem importados e processa- dos no Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando o software PARADISe descrito em [65]. Resultados — produção de neurotransmissores

[00343] Os resultados são mostrados na Figura 20, que mostra que no cérebro de camundongos alimentados com MRx0029, os níveis de noradrenalina aumentam (p=0,0507), acompanhados de um leve au- mento de serotonina e 5-HIAA. Esses dados apoiam a análise metabó- lica apresentada abaixo, sugerindo que o MRx00029 é o maior produtor de ácido 4-hidroxifenilacético, um antioxidante conhecido [73]. Mais im- portante, o ácido 4-hidroxifenilacético é um intermediário sintético da dopamina e da noradrenalina e uma importante molécula bioativa [74]. De fato, na PD, as alterações degenerativas se estendem além do sis- tema dopaminérgico, afetando igualmente os sistemas serotonérgicos e noradrenérgicos, o que, por sua vez, leva a níveis reduzidos de seroto- nina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) e noradrenalina (norepinefrina) em es- truturas estriatais e extraestriatais [75]. O L-DOPA tem como principais alvos as características da PD relacionadas à dopamina, no entanto, não aborda as reduções na 5-HT e na noradrenalina. Além disso, quanto maior a duração do tratamento com L-DOPA, mais visíveis são uma gama de complicações motoras e não motoras (por exemplo, discinesia, sintomas psiquiátricos) [76]. Portanto, esses dados demonstram que as bactérias que produzem ácidos orgânicos, como o ácido 4-hidroxifenila- cético, podem ser úteis na terapia, em particular no tratamento de do- enças neurodegenerativas. Resultados — produção de metabólitos

[00344] Os metabólitos presentes nos sobrenadantes das bactérias podem influenciar diretamente a resposta do hospedeiro ao estresse oxidativo, comunicação célula-célula e neuroproteção especificamente. Os metabólitos no sobrenadante das culturas de MRX0029 e MRX0005 foram analisados e os resultados são mostrados na Figura 21.

[00345] Alguns metabólitos mostraram uma diferença impressio- nante entre as duas cepas analisadas. A concentração de ácido succí- nico foi particularmente elevada no MRx0005. Curiosamente, a propor- ção amostra/meio para ácido 4-hidroxifenilacético foi significativamente maior no MRx0029 (Fig. 21A).

[00346] A análisede ácidos graxos nos sobrenadantes revelou uma dicotomia interessante nas duas cepas: MRx0005 produziu principal- mente ácido acético e propanoico, enquanto MRx0029 produziu ácido butanoico, pentanoico e hexanoico, nas formas linear e ramíificada (Fig. 21B). As duas cepas pareciam muito diferentes e, em particular, a pro- dução de ácido succínico e ácido 4-hidroxifenilacético por MRx0005 e MRx0029, respectivamente, foi notável (Figura 21A). Além disso, o MRx0005 parece produzir mais ácidos graxos de cadeia curta C2 e C3,

enquanto o MRx00029 produziu mais C4 (butirato) e ácidos graxos de cadeia média lineares e ramificados, incluindo o ácido hexanoico.

[00347] O ácido succínico é um metabólito do ciclo de Krebs envol- vido na fosforilação oxidativa. O complexo de fosforilação oxidativa é uma etapa fundamental para o tráfego sináptico de proteínas e vesícu- las nas regiões proximal e distal [77]. Sua disfunção tem sido relatada em distúrbios neurodegenerativos, incluindo mal de Alzheimer, doença de Parkinson e ataxia espinocerebelar tipo 1 [78]. Esses achados são- particularmente interessantes, pois o ácido succínico pode aumentar a atividade mitocondrial e apoiar neurônios vulneráveis em doenças neu- rodegenerativas relacionadas a proteínas mau enoveladas, incluindo PD [79]. O BDNF e o ácido succínico têm uma atividade protetora se- melhante, não apenas na neurodegeneração, mas também em distúr- bios mentais como depressão e ansiedade, que são bastante comuns entre pacientes diagnosticados com PD ou AD.

[00348] A Figura21B também demonstra que o MRX0029 é um pro- dutor de butirato (ácido butanoico). Isso pode ser significativo porque o butirato tem um papel conhecido na redução da impermeabilidade da barreira hematoencefálica, que tem um efeito neuroprotetor [80]. Essa propriedade do MRx0029 (e outras bactérias neuroprotetoras) pode contribuir para sua eficácia. Exemplo 16 - Modulação da expressão de mRNA de proteínas de junção estreita por MRx0029

[00349] Visto que evidências recentes sugerem que a disfunção e inflamação intestinal é um sintoma não motor associado à PD, foi inves- tigada a capacidade das cepas bacterianas da invenção de causar qual- quer disfunção da barreira intestinal. As monocamadas celulares epite- liais HT29-mtx produtoras de mucina [81] foram usadas como modelo in vitro para avaliar a ruptura da barreira intestinal e a estimulação imuno- lógica após o tratamento com MRx0005 e MRx0029. Células HT29-mtx diferenciadas expostas ao forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) secre- tam uma quantidade significativa de IL-8; em contraste, o tratamento por 24h com os sobrenadantes bacterianos de MRx005 e MRx0029, induziu uma secreção ainda menor de |L-8 em comparação com as células não tratadas e tratadas com YCFA (Fig. 22A).

[00350] A capacidade do MRxX0005 e do MRx0029 de regular a per- meabilidade epitelial modificando a transdução de sinal intracelular en- volvida na expressão e localização de proteínas envolvidas na formação da barreira intestinal foi então investigada.

[00351] O RNA foiisolado e a análise quantitativa de RT-PCR (gRT- PCR) foi realizada para caracterizar as alterações na expressão gênica de proteínas de junção estreita durante a incubação com MRx0005 e MRx0029. A administração de MRx0029 melhorou a expressão do MRNA de Ocludina, Vilina, Proteína de Junção Estreita 1 e 2 (respecti- vamente TJP1 e TJP2) após incubação de 2h (Fig. 22B). Por outro lado, a exposição ao MRx0005 não alterou a expressão gênica de proteínas de junção estreita, indicando que as duas cepas agem de maneira dife- rente na barreira intestinal.

[00352] Os resultados in vitro foram comparados com dados da aná- lise paralela ex vivo no intestino de camundongos alimentados com MRx0005 e MRx0029. A expressão gênica de TJP2 e ocludina foi quan- tificada no cólon e no íleo. Os dados ex vivo refletem perfeitamente os dados in vitro, pois o MRx0029 foi capaz de regular significativamente o TJP1 e a ocludina (p=0,073) na região do cólon do intestino murino (Fig. 22C+22D). MRx0029 também foi capaz de diminuir a função de perme- abilidade no cólon dos mesmos camundongos (Fig. 22E+22F). Materiais e métodos - extração de RNA e análise de qPCR

[00353] O RNA total foi extraído usando o mini-kit RNeasy (Qiagen, Manchester, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante, e a concentração de RNA determinada por absorbância a 260/280nm usando um espectrofotômetro (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE) Para análise da expressão do MRNA, o cDNA foi pre- parado a partir do RNA total usando o kit de transcrição reversa de CDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. As reações de transcrição reversa fo- ram realizadas em um termociclador (Biometra, Alemanha) a 25ºC por minutos, 37ºC por 120 minutos e 85ºC por 5 minutos, mantendo-se a 4ºC. O cDNA resultante foi amplificado em duplicatas pelo ensaio SYBR-Green PCR e os produtos foram detectados na QuantStudio 6 flex real-time PCR machine (Applied Biosystems, Reino Unido) usando um perfil padronizado (desnaturação inicial de 95ºC por 10 minutos, se- guida por 40 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 95ºC e 60 se- gundos de anelamento/extensão a 60/65ºC, dependendo dos iniciado- res. Um estágio de dissociação foi adicionado após os 40 ciclos para gerar uma curva de fusão. A análise foi realizada usando o software de Applied Biosystems QuantStudio Real-Time PCR Software v1.2. As se- quências de iniciador para Actina, Vilina, Ocludina, TJ/P1 e TJP2 são fornecidas na listagem de sequência.

Exemplo 16 - Teste de estabilidade

[00354] “Uma composição descrita neste documento contendo pelo menos uma cepa bacteriana descrita neste documento é armazenada num recipiente vedado a 25ºC ou 4 C e o recipiente é colocado numa atmosfera com 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de umidade relativa. Após 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da cepa bacteriana deve permanecer como medida em unidades de formação de colônias determinadas por protocolos padrão.

Exemplo 17 Métodos Animais

[00355] Os animaise o projeto de estudo utilizados foram os mesmos do Exemplo 15. Cepas bacterianas * 755: Parabacteroides distasonis (MRX005) * Megasphaera massiliensis (MRX0029) Coleta de Tecidos

[00356] Os animais foram sacrificados de maneira aleatória em rela- ção ao tratamento e condição de teste; a amostragem ocorreu entre 9:00h e 14:30h. O sangue do tronco foi coletado em tubos de EDTA de potássio (ácido etilenodiaminotetracético) e centrifugado por 15 min a 4000 g. O plasma foi isolado e armazenado a-80ºC para análises pos- teriores. O cérebro foi rapidamente excisado, dissecado e cada região do cérebro foi congelada rapidamente em gelo seco e armazenada a - 80ºC para análise posterior. O baço foi removido, coletado em 5 mL de meio RPMI (com L-glutamina e bicarbonato de sódio, R8758 Sigma + 10% de FBS (F7524, Sigma) + 1% de Pen/Estrep (P4333, Sigma)) e processado imediatamente após abates para estimulação imune ex- vivo. O tecido intestinal (segmentos de 23cm de (leo e cólon mais próxi- mos do ceco foram excisados e o 1 cm 2 cm de tecido mais distante do ceco foi usado) foram montados nas câmaras Ussing para o ensaio de permeabilidade intestinal. O ceco foi removido, pesado e armazenado a -80ºC para análise de SCFAs. Análise de Monoamina

[00357] A concentração de neurotransmissores foi analisada como descrito no Exemplo 10 Ensaio de Citocinas do Baço

[00358] “Os baços foram coletados imediatamente em meio RPMI de mL após o sacrifício e cultivados imediatamente. As células do baço foram homogeneizadas pela primeira vez neste meio RPMI, seguidas de 5 minutos de incubação com 1 ml de tampão de lise RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). Foram adicionados mais 10 ml de meio RPMI, seguidos de centrifugação 200G por 5 minutos. O sobrenadante foi então filtrado através de um filtro de 40um. As células foram contadas e semeadas (4.000.000/mL de meio). Após 2,5 h de adaptação, as cé- lulas foram estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS-2 pg/ml) ou con- canavalina A (ConA-2,5 pg/ml) por 24 h. Após a estimulação, os sobre- nadantes foram colhidos para avaliar a liberação de citocinas usando o Kit V-PLEX Proinflammatory Panel 1 (camundongo) (Meso Scale Disco- very, Maryland, EUA) para TNFa, IL-10, IL-18, Interferona y, CXCL2 e IL6. As análises foram realizadas usando o MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR Imager 2400, SECTOR Imager 6000, SECTOR S 600. Análise da Expressão Gênica

[00359] O RNA total foi extraído usando o mirVana'!" miRNA lsola- tion kit (Ambion/Life technologies, Paisley, Reino Unido) e tratado com DNase (Turbo DNA-free, Ambion/life technologies) de acordo com as recomendações do fabricante. O RNA foi quantificado usando o espec- trofotômetro NanoDrop'" (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade do RNA foi avaliada usando o Agilent Bioanalyzer (Agilent, Stockport, Reino Unido) de acordo com o procedimento do fabricante e um número de integridade de RNA (RIN) foi calculado. O RNA com valor de RIN>7 foi usado para experiências subsequentes. O RNA foi transcrito rever- samente para cDNA usando o Applied Biosystems High Capacity cDNA kit (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, a Transcriptase Reversa Multiscribe (50 U/uL)(1)(2)(1)10) foi adicionada como parte da master mix de RT, incubada a 25ºC por 10 min, 37ºC por 2 h, 85ºC por 5 min e armazenado a 4ºC. A PCR quantitativa foi realizada utilizando sondas (6-carboxifluoresceína - FAM) projetadas pela Applied Biosystems para genes alvo específicos de camundongos, enquanto se utilizava B-actina como controle endógeno. As reações de amplificação continham 1 ul de cDNA, 5 uL da 2X PCR Master Mix (Roche), 900 nM de cada iniciador e foram levadas a um total de 10 uL pela adição de água livre de RNase. Todas as reações foram realizadas em triplicado usando placas de 96 poços no sistema LightCycler&480. As condições de ciclagem térmica foram como recomendadas pelo fabricante (Roche) por 55 ciclos. Para verificar a contaminação de amplicons, cada execução não continha controles de modelo em triplicado para cada sonda usada. Os valores do limiar do ciclo (Ct) foram registrados. Os dados foram normalizados usando a B-actina e transformados pelo método 2-AACT e apresenta- dos como uma modulação vs. grupo controle. Análise de Ácidos Graxos de Cadeia Curta no Conteúdo Cecal

[00360] O conteúdo de ceco foi misturado e agitado no vórtex com água MIlliQ e incubado em temperatura ambiente por 10 min. Os sobre- nadantes foram obtidos por centrifugação (10000 g, 5 min, 4ºC) para aglomerar bactérias e outros sólidos e filtração por 0,2 um. Foi transfe- rido para um frasco de GC claro e o ácido 2-etilbutírico (Sigma) foi usado como padrão interno. A concentração de AGCC foi analisada usando um sistema de ionização por chama Varian 3500 GC, equipado com uma coluna ZB-FFAP (30 m x 0,32 mm x 0,25 mm; Phenomenex). Uma curva padrão foi construída com diferentes concentrações de uma mis- tura padrão contendo acetato, propionato, isobutirato, n-butirato, isova- lerato e valerato (Sigma). Os picos foram integrados usando o software Varian Star Chromatography Workstation versão 6.0. Todos os dados do SCFA são expressos em umol/g. Análise Estatística

[00361] Os dados normalmente distribuídos são apresentados como média + SEM; Conjuntos de dados não paramétricos são apresentados como mediana com intervalo interquartil. O teste t bicaudal não pareado foi aplicado para analisar os dados paramétricos e o teste de Mann- Whitney foi usado para não paramétricos. O coeficiente de correlação de classificação de Spearman foi empregado para a análise de correla- ção nos conjuntos de dados agrupados. Um valor de <0,05 foi conside- rado significativo em todos os casos. Resultados — produção de neurotransmissores

[00362] Os resultados na Figura 23 mostram o efeito do tratamento com MRx005 na concentração de neurotransmissores no cérebro de ca- mundongos. Mais notavelmente, o tratamento com MRx005 leva a uma diminuição da dopamina. Resultados — Expressão gênica

[00363] “Expressão de genes para receptores de neurotransmissores [receptor de serotonina 1a(5-HTR1a), receptor de dopamina D1, subu- nidade B1 do receptor GABA, receptor GABAA, receptor NMDA2A (Grin2A) e receptor NMDAZB (Grin2b)], marcadores inflamatórios [IL- 16, IL6, CD11b, TNFa e TLR4] e marcadores endócrinos [fator de libe- ração de corticosterona (CRF), receptores 1 e 2 do fator de liberação de corticosterona (CRFR1, CRFR2), fator de neurotrofina derivado do cé- rebro (BDNF), receptor de vasopressina, receptor de ocitocina, receptor de glicocorticoide e receptor de mineralocorticoide] foram analisados no tecido cerebral do hipocampo, amígdala e córtex pré-frontal.

[00364] As Figuras 24-38 mostram as alterações na expressão gê- nica após o tratamento com MRX005 ou MRX0029 no hipocampo, amíg- dala e córtex pré-frontal. O tratamento com MRx0029 levou a um au- mento naexpressão do receptor de glicocorticoide na amígdala (Figura 31C). A Figura 32A mostra que o MRx005 aumentou significativamente a expressão de BDNF na amígdala, enquanto o tratamento com

MRx0029 aumentou significativamente a expressão de TLR4 na amíg- dala (Figura 32).

[00365] Tantoo MRx005 quanto o MRx0029 podem aumentar a ex- pressão de CD11b na amígdala (Figura 33A), enquanto a expressão de IL-6, Grin2a e Grin2b é reduzida após o tratamento com MRx005 (Figu- ras 33B-D). Além disso, MRx005 e MRx0029 aumentaram significativa- mente a expressão de GABRA?2 e aumentaram a expressão de GA- BBR1 na amígdala.

[00366] O tratamento com MRx005 levou a um aumento significativo na expressão de BDNF no córtex pré-frontal (Figura 35B). Discussão

[00367] A administração de MRx005 e MRx0029 causou alterações na expressão gênica, especialmente na amígdala. Resultados — Efeito na expressão de Tph1 e IDO-1

[00368] A Figura39 mostra que o MRx0029 pode aumentar signifi- cativamente a expressão triptofano hidroxilase-1 (Tph1) no cólon e que o tratamento com MRX005 pode aumentar a expressão de IDO-1 no cólon. O tratamento com MRX005 aumentou a expressão de Tph1 e IDO1 no íleo (Figura 40).

[00369] —Indoleamina-pirrol 2,3-dioxigenase-1 (IDO-1), a primeira en- zima limitadora de taxa na via do triptofano/quinurenina, enquanto a trip- tofano hidroxilase 1 (Tph1), uma isoforma da enzima triptofano hidroxi- lase, responsável pela síntese da serotonina. Esses dados sugerem que o MRx0029 e o MRx005 podem afetar os níveis de serotonina e a via do triptofano/quinurenina. Resultados — Efeito nos níveis do metabólito do triptofano

[00370] A Figura41 mostra o efeito do tratamento com MRx005 nos níveis de quinurenina e triptofano circulante.

Resultados — Efeito na expressão de citocinas de esplenócitos

[00371] Oensaio de esplenócitos ex-vivo envolve desafiar os esple- nócitos (células isoladas do baço - um órgão principal envolvido na de- fesa imune), com um desafio mimético bacteriano ou mimético viral.

[00372] —MRXO0OS5 reduziu significativamente os níveis de interferon-y nos esplenócitos após um desafio com LPS (Figura 42). Além disso, o MRXO0O0S5 reduziu os níveis de interleucina-6 e o fator de necrose tumoral após um desafio com LPS (Figuras 44 e 45, respectivamente). O trata- mento com MRx0029 levou a uma redução no interferon-y, na interleu- cina-18 e na interleucina-6 após um desafio com LPS (Figuras 42, 43 e 44, respectivamente).

[00373] Otratamento com MRx005 e MRx0029 levou a um aumento nos níveis do quimioatrativo CXCL1 (Figura 47). Resultados - Efeito nos Níveis de Ácidos Graxos de Cadeia Curta do Ceco

[00374] Os ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) são produzidos quando fibras não digeríveis da dieta são fermentadas por bactérias no intestino. Os efeitos da administração do MRX005 são mostrados na Figura 48. Exemplo 18 — Análise adicional das alterações induzidas por MRX029 e MRX005 nos níveis de expressão gênica Métodos Linhagem celular Células SH-SY5Y Cepas bacterianas * 755: Parabacteroides distasonis (MRX005) * Megasphaera massiliensis (MRX0029) qgPCR

[00375] As SHSY5Y foram plaqueadas em placas de Petri de 10cm com uma densidade de 2x10º células. Após 24h, as células foram trata- das em meio de diferenciação (meio de crescimento contendo 1% de FBS sem RA) com 10% de sobrenadantes de bactérias ou YCFAr, 10uM RA, 200uM ácido hexanoico ou 200uM ácido valproico, por 17 horas. Depois, foram obtidas imagens representativas usando o micros- cópio de núcleo EVOS XL com contraste de fase com ampliação de 40X/0,65. As células foram coletadas e o RNA total foi isolado de acordo com o protocolo do RNeasy mini kit protocol (Qiagen). Os cDNAs foram feitos usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems). A expressão gênica foi medida usando qPCR. GAPDH foi utilizado como controle interno. A modulação foi calculada de acordo com o método 22º), As sequências de iniciador para MAP?2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 e NSE são fornecidas na lista- gem de sequências.

Imunomarcação e imagem celular

[00376] As células foram semeadas em lâminas de câmara de 8 po- ços (Marienfeld Laboratory Glassware) a 5x10º células/poço durante a noite e foram tratadas com sobrenadante bacteriano a 10% por 24 h. Para diferenciação, as células foram tratadas com 10 nM de RA por 5 dias antes de serem tratadas com sobrenadante bacteriano livre de cé- lulas por 24 h. Posteriormente, as células foram fixadas com parafor- maldeído a 4% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente (RT). As células fixas foram lavadas com PBS e permeabilizadas com 1% de Triton X-100 em PBS por 10 minutos. Após lavagem com PBS, as lâmi- nas foram incubadas com tampão de bloqueio (4% BSA/PBS) por 1 ha RT antes de adicionar anticorpo anti-MAP2 ou B3-tubulina (sc-74421 e sc-80005, respectivamente, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluídas em 1% de BSA/PBS durante 12 h a 4ºC. Eles foram então lavados duas vezes com PBS, seguido de incubação com anti-camundongo conju- gado Alexa Flour 488 (Molecular Probes Inc) e Faloidina conjugada

Alexa Flour 594 (ab 176757, Abeam) por 1 h à RT. Após lavagem 3X com PBS, as lâminas foram coradas com DAPI e montadas com Vec- tashieldO (Vector Laboratories). As lâminas foram visualizadas usando um microscópio Axioskop 50 (Zeiss) equipado com um Korr de 63x/1,2 W objetivo e conjuntos de filtros adequados para a detecção dos fluoro- cromos utilizados. Os tempos de exposição manual para a aquisição digital de imagens imunomarcadas com MAP-2 foram mantidos cons- tantes, permitindo a comparação entre diferentes poços e tratamentos. Os tempos de exposição à faloidina (F-actina) e DAPI variaram de acordo com o campo de visão. Os campos de visão randomizados foram adquiridos usando uma câmera Qlmaging controlada pelo software Image Pro Plus. As imagens foram salvas como arquivos TIFF e abertas no Adobe Photoshop CC 2015.1.2. Imagens das imagens de MAP-?2, DAP! e Phalloidin foram então sobrepostas e fundidas. Imagens repre- sentativas foram selecionadas para ilustrar as diferenças de abundância e localização das proteínas examinadas.

Immunoblotting

[00377] Células SH-SY5Y cultivadas nas condições indicadas des- critas acima, tratadas com MRx0005 e MRx0029 por 24h e depois lisa- das em tampão RIPA contendo coquetel de inibidores de protease (Ro- che Diagnostics, Reino Unido). A concentração de proteína foi estimada usando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce Biotechnology, Rock- ford, IL), separada por SDS-PAGE e transferida para uma membrana de PVDF. As membranas foram então bloqueadas com 5% de leite seco sem gordura ou 5% de BSA e incubadas durante a noite a 4ºC com os anticorpos primários (respectivamente MAP?2 e B3-tubulina). Os blots fo- ram então incubados com o anticorpo secundário conjugado com pero- xidase de rábano silvestre (HRP) e as proteínas foram detectadas pelo kit de detecção por quimioluminescência (Pierce Biotechnology, Rock- ford, IL). Para MAP2 e B3-tubulina, a B-actina serviu como controle para monitorar a variabilidade da carga de proteínas entre as amostras. Resultados e Discussão Expressão gênica

[00378] As Figuras 13a (inserção do gráfico) e 49 mostram as altera- ções induzidas por MRx0029 e MRXO0O5 nos níveis de expressão de Actina, Vilina, Ocludina, TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 e NSE. Microscopia e Immunoblotting

[00379] A Figura 50 mostra a alteração no nível de expressão de MAP? nas células SHSY5Y, conforme determinado por microscopia confocal. Os níveis de expressão de MAP? e B3-tubulina também foram quantificados por análise de immunoblot. Os resultados mostrados nas Figuras 50M e N indicam que MRX029 induz um aumento na expressão de nível de MAP2 Sequências

[00380] SEQID NO: 1 (gene de Megasphaera massiliensis para RNA 168 ribossomal, sequência parcial, cepa: NP3 - JX424772.1) 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggegtge ttaacacatg caagtegaac 61 gagaagagat gagaagcttg cttcttatca attegagtgg caaacgggtg agtaacgegt 121 aagcaacctg cccettcagat ggggacaaca gctggaaacg gctgctaata cegaatacgt 181 tetttcegee gcatgacggg aagaagaaag ggaggccette gggetttege tagaggaggg 241 gcttgegtet gattagctag ttggaggggt aacggcccac caaggegacg atcagtagce 301 ggtctgagag gatgaacggc cacattggga ctgagacacg gcccagacte ctacgggagg 361 cagcagtggg gaatcttcog caatggacga aagtctgacg gagcaacgce gegtgaacga 421 tgacggcctt caggttgtaa agttctgtta tatgggacga acagggcatc ggttaatace 481 cggtgtcttt gacggtaccg taagagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagcegegg 541 taatacgtag gtggcaagecg ttgtceggaa ttattgggeg taaagggege gcaggeggea 601 tegecaagteg gtettaaaag tgcggggett aacccegtga ggggacegaa actgtgaage 661 tegagtgteg gagaggaaag cggaattect agtgtagegg tgaaatgcgt agatattago 721 aggaacacca gtggcgaaag cggctttetg gacgacaact gacgctgagg cgcgaaagec 781 aggggagcaa acgggattag ataccceggt agtccetggece gtaaacgatg gatactaggt 841 gtaggaggta tegactectt ctatgcegga gttaacgcaa taagtatece gectggggag 901 tacggccegca aggctgaaac tcaaaggaat tgacggggge cegcacaage ggtggagtat 961 gtggtttaat tegacgcaac gegaagaace ttaccaagee ttgacattga ttgctacgga 1021 aagagatttc cggttcttct teggaagaca agaaaacagg tggtgcacgg ctgtcgtcag 1081 ctegtgtegt gagatgttag gttaagtece gcaacgageg caacecetat cttetgttgo 1141 cagcaccteg ggtggggact cagaagagac tgcegcagac aatgcggagg aaggcgggga

1201 tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatggct tgggctacac acgtactaca atggctctta 1261 atagagggac gcgaaggage gatceggage aaaccccaaa aacagagtce cagtteggat 1321 tgcaggctgc aactegectg catgaagcag gaategetag taategcagg tcagcatact 1381 gceggtgaata cgttcceggg cettgtacac acegecegte acaccacgaa agtcattcac 1441 accegaagec ggtgaggcaa ccgcaaggaa ccagceegteg aaggtggggg cgatgattag 1501 ggtgaagtcg taacaaggt

[00381] SEQ ID NO:2 (sequência de 16S rRNA consenso para cepa Me- gasphaera massiliensis MRx0029)

TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTTCAGATGGGGA CAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCCGCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCG GGCTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTA GCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTGTT ATATGGGACGAACAGGACATCGGTTAATACCCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGCAT CGCAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGTGAAGCTCGAGTGTCGGAGAGGA AAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGAC GACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGAT GGATACTAGGTGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACÇEG CCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACG CGAAGAACCTTACCAAGCCTTGACATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAAC AGGTGGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTT CTGTTGCCAGCACCTCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAA GTCATCATGCCCCTTATGGCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCC GGAGCAAACCCCAAAAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCTAGT AATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATT

CACACCCGAAGCCGGTGA GGCAACCGCAAG Iniciadores usados para qPCR (com SEQ ID NO entre parênteses) ACTB GATCAAGATCATTGCTCCTC (3) | TTGTCAAGAAMAGGGTGTAAC (4) | GAPDH | GGTATCGTGGAAGGACTCATG (5) | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC (6) iMmAP2 CTCAGCACCGCTAACAGAGG (7) | CATTGGCGCTTCTCTCCTC (8) | ocludina | AAGAGGAATTTTGACACTGG (9) GCCATGTACTCTTCACTTTC (10) AAGTCACACTGGTGAAATCC (11) | CTCTTGCTGCCAAACTATCT (12) TJP2 CCCTCCCCTGGATCAGGAT (13) | GCCATCAAMACTCGTCCATCA (14) CATTACCTGCTCTACGTTTG (15) | AGATGGACATAAGATGAGGTG (16)

[00382] SEQ ID NO: 17 (sequência de 168 rRNA consenso para cepa Parabacteroides distasonis MRX0005)

AMCCGGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTATGCAACTTGCCTATCAGAGGGGGATAACCCGGCGAAAG TCGGACTAATACCGCATGAAGCAGGGATCCCGCATGGGAATATTTGCTAAAGATTCATCGCTGATAGATAGGCATG CGTTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAACCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGTACTGAGACACGGACCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGTGAGCCTG AACCAGCCAAGTCGCGTGAGGGATGAAGGTTCTATGGATCGTAAACCTCTTTTATAAGGGAATAAAGTGCGGGACG TGTCCCGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCC GAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCCTTTTAAGTCAGCGGTGAAAGTCTGTGGCTCA ACCATAGAATTGCCGTTGAAACTGGGAGGCTTGAGTATGTTTGAGGCAGGCGGAATGCGTGGTGTAGCGGTGAAAT GCATAGATATCACGCAGAACCCCGATTGCGAAGGCAGCCTGCCAAGCCATTACTGACGCTGATGCACGAAAGCGTG GGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCAGTAAACGATGATCACTAGCTGTTTGCGATACACTGTAA GCGGCACAGCGAAAGCGTTAAGTGATCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGTTTGAACGCATTCGG ACMGAKGTGGAAACACATTTTCTAGCAATAGCCATTTGCGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAG GTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTGCCACTAGTTACTAACAGGTAAAGCTGAGGACTCTGGTGGG ACTGCCAGCGTAAGCTGCGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACATCCGGGGCGACACACGT GTTACAATGGCGTGGACAAAGGGAAGCCACCTGGCGACAGGGAGCGAATCCCCAAACCACGTCTCAGTTCGGATCG GAGTCTGCAACCCGACTCCGTGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCC GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGGAGCCGGGGGTACCTGAAGTCCGTAACCGCGAGGATCGGCCTAG

GGTAAAACTGGTGACTGG GGCTAAGTCGTACGGGG Iniciadores e sondas usados para qPCR ex vivo (com SEQ ID NO entre parênteses) Ex vivo [Nome — Tsequência dianteiro T sequência reversa gonga O) FA FANS ISNASNAAMIAR E Sr0P5 AAA (18) JTC C/3/ABKkFO/ (20) (21) (22) TG/3/ABKkFO/ (23) e RE A AA ro ra ceTOe /R6EA/8 AC(24) (25) TGA TGA CCA TCC /3IABKFO/ (26) [so RR OA E a AE) Ss cce oo (27) GCT CTC CT/3IABKkFO/ (29) Iniciadores adicionais usados em qPCR (com SEQ ID NO entre parên- teses) ID de Sequência dianteiro Sequência reversa gene NSE CCCTGTATCGTAAGAACGGT (30) GCCACCATTGATCACGTTGA (31) PINKI CCCAAGCAACTAGCCCCTC (32) GGCAGCACATCAGGGTAGTC (33) PARK7 GTAGCCGTGATGTGGTCATTT (34) CTGTGCGCCCAGATTACCT (35) SYP CTCGGCTTTGTGAAGGTGCT (36) GGCTTCATGGCATCAACTTCA (37)

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Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa bacteriana do gênero Megasphaera, para uso em um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.

2. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana tem uma sequência 16s rRNA que é, pelo menos, 95% idêntica a SEQ ID NO:2.

3. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o método é para tratamento ou pre- venção de uma doença ou condição selecionada do grupo que consiste em: doença de Parkinson, incluindo paralisia supranuclear progressiva, paralisia supranuclear progressiva, síndrome de Steele-Richardson- Olszewski, hidrocefalia por pressão normal, parkinsonismo vascular ou arteriosclerótico e parkinsonismo induzido por drogas; mal de Alzhei- mer, incluindo síndrome de Benson; esclerose múltipla; doença de Hun- tington; esclerose lateral amiotrófica; doença de Lou Gehrig; doença do neurônio motor; doença priônica; ataxia espinocerebelar; atrofia muscu- lar espinhal; demência; incluindo corpo de Lewy, demência vascular e frontotemporal; afasia progressiva primária; comprometimento cognitivo leve; comprometimento cognitivo relacionado ao HIV e degeneração corticobasal.

4. Composição para uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso em um método de tratamento ou prevenção da doença de Parkinson.

5. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso em um método de tratamento ou prevenção de doença neurodege- nerativa de início precoce.

6. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é para uso em um método de prevenção ou retardo no surgimento ou progressão de uma doença neurodegenerativa.

7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa bacteriana do gênero Megasphaera, para uso em um método de tratamento de lesão cerebral.

8. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana tem uma sequência 16s rRna que é, pelo menos, 95% idêntica a SEQ ID NO:2.

9. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a lesão cerebral é acidente vascular cerebral, como isquemia cerebral, isquemia cerebral focal, acidente vas- cular cerebral isquêmico ou acidente vascular cerebral hemorrágico.

10. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana é de Megasphaera massiliensis.

11. Composição para uso de acordo com qualquer das rei- vindicações anteriores 2 a 6 ou 8 a 10, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica SEQ ID NO:2, ou em que a cepa bacteriana tem a sequência de 16s rRNS representada por SEQ ID NO:2.

12. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma cepa bacteriana da espécie Megasphaera massiliensis, para uso em um método de tratamento ou prevenção da doença de Parkinson.

13. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma cepa bacteriana da espécie Megasphaera massiliensis, em um método de tratamento de lesão cerebral resultante de um acidente vascular ce- rebral.

14. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é para administração oral.

15. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi- ção compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceutica- mente aceitáveis.

16. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana é liofilizada.

17. Produto alimentício caracterizado pelo fato de que com- preende a composição como definida em qualquer reivindicação prece- dentes, para o uso como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

18. Célula caracterizada pelo fato de que é da cepa de Me- gasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB

42787.

19. Composição caracterizada pelo fato de que compreende a célula, como definida na reivindicação 18.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracte- rizada pelo fato de que compreende um excipiente ou veículo farmaceu- ticamente aceitável.

21. Cultura biologicamente pura caracterizada pelo fato de que é da cepa de Megasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787.

22. Célula caracterizada pelo fato de que é da cepa de Me- gasphaera massiliensis depositada sob o número de acesso NCIMB 42787 para uso em terapia.

23. Célula para uso de acordo com a reivindicação 22, ca- racterizada pelo fato de que a célula é para uso em um métodocomo definido em qualquer uma das reivindicações 1,3 a 7 ou 9.