TR201807156T4 - Bifidobacterium longum suşları içeren ve özellikle bebeklerde ve çocuklarda gıda alerjisi semptomlarını azaltan bir besin bileşimi. - Google Patents

Abstract

Küçük çocuklar veya bebeklerde besin alerjenlerinden kaynaklanan alerjilerin semptomlarını azaltmak üzere, Bifidobacterium suşlarını veya probiyotikleri ihtiva eden bir tam besinsel bileşim sağlanmıştır. Tercihen, bileşim bütün alerji semptomlarını azaltmakta (ikincil önleme) ve ayrıca duyarlılığı azaltmaktadır (birincil önleme). Bileşim Bifidobacterium cinsinin bir probiyotiğini ihtiva etmektedir.

Description

TARIFNAME BlFIDOBACTERlUM LONGUM SUSLARI IÇEREN VE ÖZELLIKLE BEBEKLERDE VE ÇOCUKLARDA GIDA ALERJISI SEMPTOMLARINI AZALTAN BIR BESIN BILESIMI Mevcut bulus, alerjik hastalarin alerjenlere maruz kaldiginda alerjik semptomlarini azaltmaya yönelik bir besin bilesiminin üretiminde probiyotiklerin, özellikle de Bifidobacterium longum suslarinin kullanilmasi ile ilgilidir.

Alerjiler bütün yaslardan hastalarin hayatini etkileyen en yaygin saglik problemleri arasindadir. Alerjik hastaliklar günümüzde Dünya Saglik Örgütü (WHO) tarafindan salgin olarak taninmaktadir. Alerjilerin yayginliginin son on yillarda artis gösterdigi görülmektedir. Modern yasam stili, özellikle sehir hayati yüksek seviye ve yüksek siddette alerjik belirtilerle iliskilendirilmektedir. Çocuklukta, özellikle erken çocuklukta ve özellikle de besin alerjenlerine karsi alerjik duyarlilik oldukça önemlidir ve bir “alerjik fenotip” veya “atopi” gelisiminin diger alerjenlerin sonradan ortaya çikmasina neden oldugu görüldügü için büyük bir ilgi odagidir.

Bu nedenle, çocukluktaki alerjiler, daha sonra çoklu alerjilere neden olan kademeli alerjik bir dizinin ilk adimi olabilmektedir, bu süreç genellikle “Atopik Mars” olarak adlandirilmaktadir. Örnegin, insan topluluklarinda, erken yasta sürekli asiri besin duyarliligina sahip olan çocuklarin daha sonra çocuklukta alerjik rinit (bahar nezlesi) veya astim gelistirme riskinin öneinli ölçüde daha yüksek oldugu görülmüstür (Ostblöin ve ark. 2008). Daha hafif asiri besin duyarliligina sahip olan çocuklarin da solunumla ilgili alerjiler gelistirme riski yüksektir ancak sürekli asiri besin duyarliligina sahip olan çocuklardan daha düsük seviyededir. Bu nedenle, asiri besin duyarliliginin siddetinin hafifletilmesi, “Atopik Mars”i yavaslatmak için önemli olabilmektedir. Bu baglamda, çocuklukta ve bebeklikte alerjik episodlarin yönetimi ve alerjilerin önlenmesi oldukça önemlidir.

Bebeklerin bagisiklik sistemi, yasamin ilk birkaç yili boyunca aktif olarak gelismektedir. Bu genç hastalardaki alerjik reaksiyonlar üzerinde önlem almak, engellemek, önlemek, yönetmek, azaltmak veya yumusatmak kisa vadede oldugu kadar hayatlarinda uzun vadede de alerjik profillerini etkileyebilmektedir.

Alerjilerin önlenmesi iki farkli seviyede gerçeklestirilebilmektedir: alerjerie özel IgE antikorlarinin yoklugu veya düsük seviyesi ile karakterize edilmektedir.

Asiri duyarliligi engellemek veya azaltmak, ayni alerjene maruz birakildiginda alerjik semptomlarin yok olmasi veya azalmasi ile sonuçlanacaktir. Bir hastanin bir alerjene veya bir alerjen grubuna duyarli hale gelme duruinunu modüle ederek (birincil önleme), sonrasinda gelen alerjik tepkiler de düzenlenebilmektedir. hastalardaki alerjik reaksiyonlarin seinptomlarini yani olusumu veya yogunlugunu, hasta söz konusu alerjene/alerjenlere yeniden maruz kaldiginda modüle etme etkisidir. Alerjik semptomlarin olusuinu veya yogunlugu modüle edilerek (ikincil önleme), alerjilerle iliskili rahatsizlik en az seviyeye getirilmektedir.

Alerji önlemeye yönelik bu ayri kavramlar isiginda, dogal etki mekanizmalari sayesinde, bazi bilesenlerin bu spesifik önleme seviyelerinden yalnizca birinde veya ikisinde birden aktif olabildigi varsayimina varilabilir. Bazilari örnegin yalnizca belirli bir alerjene karsi duyarliligi azaltirken (birincil önleme), diger bilesenler yalnizca ikincil önlemede bir etkiye sahip olabilmekte ve alerjik reaksiyonlarin siddetini azaltabilmektedir. Diger bilesenler hem duyarlilasmayi hem de semptomlari etkileyebilmekte ve böylece birincil ve ikinci] önlemeyi desteklemede etkin olabilmektedir.

Besin alerjenleri, bebeklerin erken dönemde karsilastiklari ilk alerjenler arasindadir: tipik olarak yalnizca anne sütü almamis olan bebekler inek sütü proteinleri ile karsilasmaktadir. Süt proteinleri aslinda bebeklikteki besin alerjilerinin en sik gözlemlenen nedenleri arasindadir, ardindan yumurta ve bugday proteinleri gelmektedir. Genel olarak, besin alerjileri bebeklerde ve küçük çocuklarda kutanöz (deri ile ilgili) (döküntü, egzama, digerleri) ve gastrointestinal semptomlar (abdominal kramplar; özellikle karin agrisi; kusma) ile kendini göstermektedir. Bebek/küçük çocuk tahil, sebze, meyve, sert kabuklu yeinisler veya balik gibi yeni bir besine maruz kaldiklarinda daha fazla hassasiyet ve alerji episodlari da ortaya çikabilmektedir.

Bifidobacterium longum (B. longum) suslarinin bagirsak mikrobiyotasinda öneinli bir rol oynadigi ve pozitif saglik etkileri ile iliskilendirildikleri açiklanmaktadir: Tipik olarak saglikli bir sekilde anne sütü ile beslenmis olan bebeklerin bagirsak mikrobiyotasinda yüksek sayilarda mevcutturlar. Iyi bir sindirimi kolaylastirabilmekte, bagisiklik sistemini güçlendirebilmekte ve bagirsak pH”ini kontrol eden laktik asit ve asetik asidi üretebilmektedirler. Bu bakteriler ayrica patojenik özelliklere sahip olan Candida albicans, E. coli ve diger bakterilerin büyümesini de durdurabilmektedir. B. longum genel olarak veya B. Longum`a ait spesifik suslar WHO(DSÖ) tanimlamasina göre probiyotikler olarak siniflandirilabilmektedir.

Belirli bir dereceye kadar, spesifik B. longum suslarinin antialerjik etkiye sahip oldugu aç iklanmaktadir. Örnek olarak kriptomerya polinozuna bagli olarak alerjik rinitten muzdarip olan hastalar polen mevsiminden önce ve polen mevsimi esnasinda birkaç hafta boyunca B. longum BB536 tükettikten sonra azalan oranda alerjik semptomlar göstermislerdir (Xiao JZ, Kondo S, Yanagisawa N, Takahashi N, Odamaki T, Iwabuchi N, Miyaji K, Iwatsuki K, Togashi H, Enomoto K, Enomoto T. Probiotics in the treatment of Japanese cedar pollinosis: a double-blind placebo-controlled trial. Clin Exp Allergy. (Kriptoinerya polinozu Xiao JZ, Kondo S, Yanagisawa N, Takahashi N, Odamaki T, Iwabuchi N, Iwatsuki K, Kokubo S, Togashi H, Enomoto K, Enomoto T. Effect ofprobiotic Bifidobacterium longum BB536 [corrected] in relieving clinical symptoms and modulating plasma cytokine levels of Japanese cedar pollinosis during the pollen season. A randomized double-blind, placebo-controlled trial. (Polen mevsiminde kriptomerya polinozunun klinik semptomlarinin hafifletilmesi ve plazma sitokin seviyelerinin modülasyonunda probiyotik Bifidobacterium longum BB536 [düzeltilmis] etkisi. Bir rastgele çift-kör, plasebo-kontrollü Ayrica çesitli probiyotik kültürlerinin veya probiyotiklerin karisiininin alerjik bagisiklik sistemine etkileri oldugu açiklanmistir: Örnek olarak EP sayili dokümanda bugday unu albüinini ve globülinlerine bagli olarak sayili doküman Lactobacillus ve Streptococcus gibi probiyotik bakterileri ihtiva eden bilesimlerin cilt alerjisi baskilama özelliklerini açiklamaktadir. Jan Knoll ve arkadaslari kisilerde akciger islevlerinin gelistirilmesinde kullanilabilen bir Bif'idobacteriumh açiklamaktadir. JP10309178 sayili doküman bir insan kaynakli Bifidobacterium”un besin alerjisini iyilestirmede veya peroral bagisiklik toleransini baslatmada nasil yardimci olabilecegini göstermektedir. Menard O ve arkadaslari "Gnotobiotic mouse immune response induced by Bifidobacterium sp. strains isolated from infants" (Yeni doganlardan izole edilen Bitidobacterium sp. suslari tarafindan indüklenen gnotobiyotik fare bagisiklik tepkisi) APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY FEBRUARY 2008 Bitidobacterium longum NCC 2705 kullanimini açiklamaktadir. Ancak, özellikle küçük çocuklarda ve bebeklerde alerjik reaksiyonlari ve semptomlari azaltmaya yönelik bir ihtiyaç bulunmaktadir. Bu, küçük çocuklarda görülen hem bagirsak hem de bagisiklik sistemlerinin olgunlasmasi göz önünde bulunduruldugunda ve özellikle sütten kesme esnasinda küçük çocuklarin maruz kaldigi yeni alerjenlerin çoklugu göz önünde bulunduruldugunda özellikle önemlidir.

Erken yaslarda besin kaynakli alerjik reaksiyonlar sorunu, bebeklerin ve küçük çocuklarin belirli beslenme ihtiyaçlari ile daha da karmasik hale gelmektedir. Kalori alimi, kalori yogunlugu, çesitli alinmasi gereken besinler, protein içerigi ve protein kalitesi, bebeklere ve küçük çocuklara en uygun besini saglamak açisindan önemli etkenler arasindadir. Vitaminler ve mineraller gibi mikro besinlerin varligi, özellikle de yogunluklari hedef hastalarin yasina karsilik gelen belirli tavsiye edilen araliklar ile sinirlandirildiginda, önemlidir. Bu durumda, küçük çocuklar ve bebekler için, besin tedarik matrisleri esasen karisiktir, ancak çok çesitli degildir: örnegin potansiyel olarak alerjik olmalarina ragmen bebekler genellikle bir süt kaynakli protein matrisinde belirli bir protein dengesi gerektirmektedir. Bu tür çoklu besinlerin varligi, besin alerjenlerinin etkisini arttirabilmektedir. Bu tür kompleks matrislerde, tek basina alerjik belirtileri tetikleyemeyen sade besin alerjenleri, daha sonra alerjik bir reaksiyon baslatmada daha güçlü hale gelebilmektedir. Benzer olarak, alerjenleri nötralize eden veya alerji önleyici olarak islev gören bilesenlerin, bu tür kompleks beslenme matrislerinde etkileri azalmakta veya ortadan kalkmaktadir. Özellikle, bebekler ve küçük çocuklara yönelik besin bilesimleri gibi kompleks matrislerde, genellikle alerji önleme üzerinde etkisi oldugu kabul edilen bilesenlerin hala aktif olup olmadiklari, ve hangi dereceye kadar aktif olduklari tahmin edilememektedir.

Alerjik episod geçmisi olan ve/veya alerjik olan bebekler ve küçük çocuklarda görülen besin alerjilerinin semptomlari için rahatlama saglamak gerekmektedir.

Yalnizca çesitli besinler sunmakla kalmayip ayni zamanda alerjik reaksiyonlarin siddetini azaltan bir tam besleyici bilesim saglamak gerekmektedir.

Hafiiten orta dereceye kadar formlarda alerjiye sahip olan genç hastalarin alerjik reaksiyonlarini hafifleten bir besleyici bilesim saglamaya ihtiyaç vardir, çünkü bu hastalar intestinal ve bagisiklik sistemlerinin tamamlanmamis gelisimlerinden kaynaklanan özel ihtiyaçlara sahiptir.

Ayrica, sert farmasötik inoleküllere tolerans gösterineyen küçük çocuklardaki alerjik reaksiyonlari, örnegin bagisiklik sistemi modülatörlerini düzenli beslenme rejimine dahil etmek gibi beslenmeyle ilgili müdahaleler yaparak hafifletmeye ihtiyaç vardir.

Genç hastalarin alerjik reaksiyonlarini zamaninda, ve intestinal yolun sirali degisiklikten geçtigi ve potansiyel olarak yeni alerjik proteinler içeren yeni kati gidalarin alinmaya baslandigi ve dolayisiyla hastanin özellikle besin alerjenlerine karsi duyarliliga egilimli oldugu sütten kesme döneminde düzenlemeye yönelik bir besinsel bilesim saglama ihtiyaci bulunmaktadir.

Bilesim, alerjenlere duyarliligi dogrudan azaltinasa bile, muhtemel olarak tam alerjenlere maruz kalmayi azaltarak etkili bir bilesim saglayarak alerjilerin semptomlarini hafifletmeye ihtiyaç duyulmaktadir.

Alerjinin ikincil önlenmesi üzerinde olumlu bir etkiye sahip olan, ancak ayni alerjilerin birincil önlenmesinde özellikle etkili olmayan bir bilesime ihtiyaç duyulmaktadir.

Son olarak, semptomlarin azaltilmasiyla “alerjik fenotipin” kaybolmasina yardimci olabilen ve bu sekilde daha sonra ortaya çikan yeni alerjenlere karsi duyarli hale gelmeyi azaltabilen, özellikle genç hastalara yönelik bir bilesime ihtiyaç duyulmaktadir. Atopik marsi hafifletmeye ihtiyaç duyulmaktadir.

Bulus en iyi sekilde istemler ile açiklanmaktadir. Ilk yönüyle, mevcut bulus besin alerjenleri tarafindan tetiklenen alerjilere sahip hastalarda, özellikle genç hastalar, bebekler ve/ veya yeni do ganlarda besinden kaynaklanan alerjilerin semptomlarini azaltmaya yönelik bir tam besinsel bilesim saglamaktadir.

Ikinci bir yönüyle, mevcut bulus besin alerjenleri ile tetiklenen alerjik reaksiyonlarin ikincil önlenmesini ciddi oranda kolaylastiran, opsiyonel olarak ayni alerjenlere karsi birincil önlemeyi olumsuz etkilemeyen bir bilesim saglamaktadir. Üçüncü bir yönüyle, mevcut bulus özellikle Bifidobacterium longum NCC 2705”e ait olan probiyotikleri ihtiva eden bir bilesim saglamaktadir. Bulusun bir baska yönüyle, bulusa ait bilesim özellikle sütten kesme dönemindeki bebekler ve/veya küçük çocuklar için etkilidir.

Bulus ayrica yasamin daha sonrasindaki diger alerjenlere karsi duyarliligi azaltmaya kadar uzanmaktadir.

Sekil l/Tablo l: CNCM-12618 veya diger suslar altinda Nestec SA'da kayitli B. longum NCC 2705 ile birlikte kültürün ardindan Th2-çarpik insan PBMS”sine ait sitokin profili Sekil 2/Tablo 2: B. longum NCC 2705 veya diger suslarla birlikte kültürün ardindan Th2-çarp1k insan PBMS”sine ait mRNA profili Sekil 3: OVA besin alerjisi fare modelinin sematik açiklamasi Sekil 4: Içme suyu içerisinde 5X108 CFU/ml B. longum NCC 2705 alan farelerdeki besin alerjisinin azalan semptomlarini gösteren klinik skorun gösterimi Sekil 5: Fare Mast-Hücre Proteaz `l (MMCP-l) Serum seviyeleri Sekil 6/Tablo 3: Ex vivo olarak yeniden uyarilmis olan mezanterik LN lenfositler ve splenositlerin sitokin üretimi Sekil 7 / Tablo 4: Ileum içindeki gen ifadesi Tanimlar: Bu tarifnamede, asagidaki terimler asagidaki anlamlara gelmektedir: ölçüde, genellikle %20 veya daha fazla oranda, belirli bir yas için önerilen temel besinsel gidalari ihtiva eden bir bilesimdir. Bu temel gidalar genellikle, belirli bir yas için tavsiye edilen kalori alimini saglamak üzere yeterli miktarda kullanildiginda, belirli bir yas için tavsiye edilen spesifik gida dozlarinin %20 veya daha fazlasini karsilayacak miktarda ve oranda bulunmaktadir. Tam besinsel bir bilesim belirli bir yas için genel tavsiyeyi karsilayan dengeli bir orandaki bir protein kaynagini, bir lipit kaynagini, bir karbonhidrat kaynagini ihtiva etmektedir. Genellikle temel amino asit kaynagi ve temel yag asidi kaynaginin yani sira, vitaminler ve mineraller mikro besinleri de kapsamaktadir. Ancak, tam bir besinsel bilesimin bir yeni dogan veya genç çocugun bütün besinsel ihtiyaçlarini karsilamak üzere tüm belirli gidalari veya tüm tavsiye edilen miktarlari ihtiva etmeyebilecegi anlasilmaktadir.

Tam besinsel bilesim, yalnizca Bifidobacterium veya baskin oranda Bifidobacterium ihtiva eden bilesiinleri disarida tutinaktadir. kapsamaktadir. Bu tür semptomlar kutanöz (deri kizarikligi, döküntü, kasinti, dermatit, egzama), oküler (gözlerde kasinti veya sulanma), gastrointestinal (kan toplanmasi, karin agrisi, kramplar, kusmali ishal), solunumla ilgili (burnun kasinmasi, nazal tikaniklik, rinit, astim) ve siddetli durumlarda sistemik (bas dönmesi, zihin bulanikligi, anafilaksi) belirtileri kapsamaktadir. azaltmayi hedefleyen bütün önlemleri ifade etmekte, örnegin spesifik IgE antikorlarmin önlenmesi veya azaltilmasi anlamina gelmektedir. semptomlarin gelisiminin önlenmesi veya azaltilmasi anlamina gelmektedir. geçtikleri ve yari özgün gida türünden (genellikle anne sütünden veya bebek mamasindan) çesitli gidalara uyum sagladiklari dönemdir. anlamina gelmektedir. hücre hazirlanislari veya mikrobiyal hücrelerin bilesenleri anlamina gelmektedir. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. Ve arkadaslari "Probioticsz how should they be defined" Trends tanimi ile örtüsmektedir. Probiyotik tek bir mikroorganizma susunu, çesitli suslarin bir karisimini ve/veya çesitli bakteriyel türler ve cinslerin bir karisimini ihtiva edebilmektedir.

Karisimlar durumunda, tekil “probiyotik” terimi yine de probiyotik karisimi veya hazirlanisini ifade etmek için kullanilabilmektedir. Mevcut bulusun amacina uygun olarak, Bifidobacterium familyasindan olan mikroorganizmalar probiyotikler olarak degerlendirilmektedir. ve/veya etkinligini seçici bir sekilde uyararak ve böylelikle konagin sagligini iyilestirerek konagi faydali bir sekilde etkileyen sindirilebilir olmayan bir besin maddesi anlamina gelmektedir.

Bitidobacterium longum (B longum) susu NCC uluslararasi tanimlama referansina CNCM-12618 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes at Institute Pasteur, Paris, France) sahip olan B. longuin susudur.

Bulusçular, duyarli hale gelmis genç memelilere B. longum NCC 2705 ihtiva eden bir tam besinsel bilesim verildiginde alerjik reaksiyon ve semptomlarin azaltilabildigini kanitlamistir. Bu, alerjilerin ikincil önlenmesi üzerinde olumlu bir etki göstermistir.

Bu etkiye genç memelilerin alerjenlere karsi duyarli hale gelmesinde küçük ancak önemli bir azalma da eslik etmistir (yani alerjilere karsi birincil önleme kanitlanmistir).

Bilesimin Etkisi: Bulus, besin alerjenleri ile tetiklenen alerjiler sahip olan hastalarda semptomlarin azaltilmasi için bir tam besinsel bilesim üretilmesine yönelik Bifidobacterium familyasindan mikroorganizmalarin, daha spesifik olarak Bitidobacterium longum (B. longum) ve daha da spesifik olarak B. longum NCC 2705 susunun kullanimi ile ilgilidir. Bulus sahipleri genel olarak Bitidobacterium longumun ve spesifik olarak ise B. longum NCC 2705°in tüketiminin, söz konusu Bifidobacterium susunu içeren bir besinsel bilesimi alan bir grup farede besin alerjisinin semptomlarinin azalmasina neden oldugunu kanitlamislardir. Bu da duyarlilastirmadan sonra bir alerjik reaksiyon (satasma) baslatildiginda kanitlanmistir.

Insanlar (tipik olarak bebekler/küçük çocuklar) dogal olarak besin alerjenlerine duyarli oldugunda ve söz konusu alerjenlere yeniden maruz kaldiginda, bu model insanlarda besin alerjisini taklit etmektedir. Dolayisiyla B. longum NCC 2705 bakteriyel susu koruyucu bir etki göstermektedir.

Bulusun bir uygulamasinda, bilesimin etkisi özellikle alerjilerin ikincil önlenmesinde etki sahibidir. Alerjilerin semptomlari, fare modelinde, daha düsük bir alerjik klinik skor ile de gösterildigi gibi büyük ölçüde azaltilmaktadir. Genellikle, semptomlar genel olarak alerjilerin bilinen semptomlarinin hepsini veya bir kismini kapsayabilmektedir.

Bulusun bir uygulamasinda, semptomlar ishal, ciltte tahris veya solunumla ilgili semptomlari, veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir.

Bulusun bir uygulamasinda semptomlara triptaz, kimaz, histamin, lökotrienler gibi biyokimyasal aracilarin salgilanmasi eslik edebilmektedir.

Bulusun bir uygulamasinda, bilesim hastalarin alerjenlere duyarli hale gelmesinde bir etkiye sahiptir. B. longum NCC 2705 ihtiva eden bilesim ile alerjilere karsi küçük ancak önemli bir birincil önleine saglandigi görülmektedir. Hayvanlar besin alerjenlerine karsi daha düsük duyarlilasma göstermistir. hem semptomlari hem de duyarlilasmayi, yani alerjenlere tekrar maruz kalindiginda ileriki semptomlarin riskini azalttigi için bilesimin etkisi bu baglamda büyük ilgi çekmektedir.

Bir uygulamada, bilesim yasamin daha sonrasindaki diger alerjenlere karsi duyarliligi azaltmaktadir. Bilesimin bagisikligin olgunlasmasinin dogal sürecini destekledigi (veya en azindan bloke etmedigi), bu nedenle ayni alerjenlere veya farkli alerjenlere karsi duyarli hale gelmeyi azaltmada uzun vadeli bir etkiye (daha sonraki yasam dönemlerinde duyarli hale gelmede azalma) sahip olabildigine inanilmaktadir. Alerji semptomlari azaltilarak (ikincil önleme) ve kisa süreli duyarlilasma ile (birincil önlemenin bir parçasi olarak), bulusa ait bilesimin dogal bagisiklik olgunlasmasinin gerçeklesmesine izin verebildigi ve uzun vadede faydali bir etkiye sahip oldugu ileri sürülmektedir.

Bulusa ait veya bulusta kullanilmak için bilesim: Bulusa ait bilesim bir bebek mamasi gibi bir tam besinsel bilesim olabilmekte veya tam diyetin önemli bir kisinini saglayabilmektedir. Tercihen, bilesim tek besin kaynagi olarak alindiginda hedef vücudun bütün veya neredeyse bütün besinsel ihtiyaçlarini karsilayan bir tam besinsel bilesimdir. Bir uygulamada, bilesim bebek tahil gevreklerini ihtiva etmektedir. Baska bir uygulamada, örnek olarak bir bebek besini olarak, bilesim tam diyetin bir kismini, tercihen %50 veya daha fazlasini ya da %20 ya da daha fazlasini (niceliksel ve niteliksel olarak) saglamaktadir. Bir uygulamada, bilesim bebek tahil gevreklerini ihtiva etmektedir. Bir uygulamada, bilesim tahil gevreklerini veya bebek besinini ihtiva eden çocuklar için bir sivi bilesim olabilmektedir.

Kullanilan probiyotik Bifidobacterium longum NCC 2705`dir. Bulusçular diger probiyotiklerin de benzer veya ilgili etkileri olabilecegini göz ardi etmemesine ragmen, ayni bulusçular tarafindan patent bekleyen basvuruda açiklanan Lactococcus lactis NCC CNCM [-4199,un haricinde diger probiyotik türlerinin veya suslarinin esit derecede etkili olduguna dair deneysel veriler kanitlanamamistir.

Bulusun bir uygulamasinda, bilesim kuru bilesiinin l grami için 104 ve 10” koloni Olusturucu birim (CFU) ihtiva etmektedir. Bilesim bir bebek mamasi oldugunda, bebek inamasindaki probiyotik miktari bebek mamasinin 105 ve 108 CFU/g arasinda olabilmektedir. Bir uygulamada, bilesim fizyolojik bir etkisi oldugu gösterilen bir dozda 106 ve 5)(107 CPU/g ihtiva etmektedir. Bir uygulamada, düsük bir dozdaki probiyotiklerin özellikle de bilesim belirlenmis sinirli bir miktarda prebiyotikleri ve proteinleri ihtiva ettiginde, faydali bir etkiye sahip olabilecegi belirlenmistir. Bu uygulamada, probiyotikler bilesim içerisinde 103 ve 105 CFU/g arasinda bir miktarda bulunmaktadir. Prebiyotikler oligosakkaritler olabilmekte ve/veya proteinler bilesimin 4 g/ 100 kcaFi geçmeyen veya 2 olabilmektedir. Probiyotik bulusa ait kuru veya islak bilesik ile birlikte karistirilabilmektedir. bilesim içerisindeki probiyotiklerin kararliligini veya canliligini iyilestirmek için muameleler veya spesifik islemler uygulanabilmektedir. Probiyotik bir kuru formda veya islak formda uygulanabilmektedir. Probiyotik bilesim ile karistirildiktan sonra, karisim probiyotiklerin canliligini önemli ölçüde etkilemeyecek sekilde islenebilmektedir. Baska bir uygulamada, probiyotikler karistirmadan önce, karistirma esnasinda veya karistirildiktan sonra kismen veya tamamen etkisiz hale getirilmektedir. Bir uygulamada, probiyotikler bulusa ait bilesimin kullanimindan önce etkisiz hale getirilmekte ve/veya çogalmasi engellenmektedir. Bu örnek olarak usul islem veya açiklanan diger islemler ile gerçeklestirilebilmektedir.

Bulusun bir uygulamasinda, bilesim prebiyotikleri ihtiva etmektedir. Prebiyotiklerin karbonhidratlari, daha spesifik olarak oligosakakritleri ihtiva ettigi bilinmektedir. Ayrica, islevsel gida bilesenleri olarak büyük ölçüde kullanildiklari bilinmektedir. Insan sindirim kanalinin enzimleriyle hidrolize karsi direnmektedirler, bozulmadan kalin bagirsaga ulasabilinekte ve bifidobakterilerin veya diger probiyotiklerin büyümesine özellikle uygun bir karbonhidrat maddesi saglayabilmektedirler. Oligosakkaritler örnegin glikoz, galaktoz, ksiloz, maltoz, sakariz, laktoz, nisasta, ksilan, hemiselüloz, inülin veya bunlarin bir karisimindan üretilebilmektedir. Fruktooligosakkaritler gibi ticari olarak temin edilebilen saflastirilmis prebiyotik ürünler, oligosakkaritler formunda yaklasik % 95'ten fazla kati madde içermektedir.

Tercihen, bilesimin bir uygulamasi en az bir probiyotik ihtiva eden bir besinsel bilesimdir.

Tercihen prebiyotigin bir uygulamasi örnegin glikoz, galaktoz, ksiloz, maltoz, sakariz, laktoz, nisasta, ksilan, hemiselüloz, inülin veya bunlarin bir karisimindan üretilen bir oligosakkariti ihtiva etmektedir. Daha çok tercihen, oligosakkarit fruktooligosakkariti ihtiva etmektedir. En çok tercihen, prebiyotik bir fruktooligosakkarit ve inülin karisimini ihtiva etmektedir. Tercihen, bu karisim PREBIOI® veya ticari olarak temin edilebilen bir RAFTILOSE® and RAFTILINE® karisimini ihtiva etmektedir.

Tercihen, bilesimin probiyotik bileseninin bir uygulamasi yaklasik %50 ila %90 fruktooligosakkarit ihtiva etmektedir. Daha çok tercihen, yaklasik %60 ila yaklasik %80 arasinda fruktooligosakkarit ihtiva etmektedir. En çok tercihen, yaklasik %70 fruktooligosakakrit ihtiva etmektedir. Tercihen, prebiyotigin bir uygulamasi yaklasik %10 ila yaklasik %50 inülin ihtiva etmektedir. Daha çok tercihen, yaklasik %20 ila yaklasik %40 arasinda inülin ihtiva etmektedir. En çok tercihen, yaklasik %30 inülin ihtiva etmektedir. Bir uygulamada, prebiyotik bileseni bilesimin yaklasik olarak %0.l°i ila %10”unu temsil edebilmektedir.

Bir uygulamada, bulusa ait bilesim ayrica polifenolleri ihtiva eden bir elma özütü ihtiva etmektedir. Elma özütü, besin alerjenleri ile tetiklenen alerjilere sahip olan hastalarda besinden kaynaklanan alerjilerin semptomlarini azaltmaya yardimci olabilmektedir. Bu sekilde, elma özütü besin alerjilerine sahip olan hastalarda alerjileri yumusatmak, azaltmak veya hafifletmek için probiyotik Bitidobacterium ile sinerjistik bir sekilde etki etmektedir.

Bir uygulamada, bu tür bir bilesim için dogal olarak uygun bir tasiyici olan bebek mamasi ve/veya bebek tahil gevrekleri için kullanilmaktadir. Bir diger uygulamada, bebek mamasi veya bebek tahil gevrekleri elma özütlerini veya elmadan malzemeyi ihtiva etmektedir.

Bulusun bir uygulamasinda, elma özütü Val de Vire Bioactives (Conde sur Vire, Fransa) tarafindan “Pomactiv HFV” referansiyla satisa sunulan protein özütüdür. Bir uygulamada, elma özütü Pomactiv HFVlye benzer veya ondan üretilmektedir ve benzer etkiye sahiptir.

Kuramsal hareket mekanizmasi: Alerjik hastaliklar son birkaç on yilda istikrarli bir sekilde artmistir ve WHO tarafindan günümüzde salgin olarak degerlendirilmektedir. Genel bir sekilde, alerjinin bagisiklik sisteminin Th2 aracilarinin üretiminde güçlü bir sapmaya neden olan Thl ve Th2 tepkileri arasindaki bir dengesizlikten kaynaklandigi düsünülmektedir. Dolayisiyla, teoriyle sinirli olmadan, alerjinin bagisiklik sisteminin Thl ve Th2 kollari arasinda uygun bir denge saglanarak hafifletilebildigi, azaltarak düzenlenebildigi veya önlenebildigi ileri sürülmektedir. Bu Th2 tepkilerini azaltmayi veya en azindan kisa süreli olarak Thl tepkilerini gelistirme gerekliligini göstermektedir. Ilki lL-5 gibi Th2 sitokinlerinin azalan üretimi ile karakterize edilirken, sonraki ise IFNy gibi Thl sitokinlerinin artan üretimi ile karakterize edilebilmektedir. Alternatif olarak, duyarli hale gelmis bir bireyde, genel bir antienflamatuar etki örnek olarak hem Thl hem de Th2 hücrelerinin etkilerini azaltarak düzenleyebilme kapasitesine sahip olan T-düzenleyici (Treg) hücrelerin baslatilmasi araciligiyla istenebilmektedir. Bu da IL-10,un salgilama baslatma kabiliyeti ile gösterilebilmektedir.

Bulusun bir uygulamasinda, bilesim hidrolize veya kismen hidrolize proteinleri ihtiva etmektedir. Hidrolize proteinler daha kolay sindirildigi ve bozulmamis proteinlere göre daha az alerjen oldugu için, hidrolize (kismen) proteinlere dayanan bir besinsel bilesim, bebeklerin/küçük çocuklarin bagisiklik sistemleri ve gastrointestinal yollarina özellikle uygundur. Ayrica, teoriyle sinirli kalmadan, hidrolize proteinlerin bozulmamis proteinlere kiyasla probiyotikler veya bagirsak bakterileri (özellikle de genis bir ölçüde peptidaz aktivitesi gösterenler) için tercih edilen bir substrat olabilecegi, bunun da probiyotik susunun gelistirilmis bir etkisine ve dolayisiyla da hidrolize proteinler ile probiyotikler arasinda sinerjiye neden olabilecegi ileri sürülebilmektedir. Bu, besin alerjisi olan bebek/küçük çocuklarin bagisiklik sistemleri ve gastrointestinal yollari için en uygun bilesimi olusturmaktadir. Böyle bir örnekte, hidrolize proteinler ile sahip B. longum NCC 2705 kombinasyonu bulusa en uygun olanidir.

Bir uygulamada, hidrolize proteinler, peynir alti suyu proteinleri ve/veya kaseinden hidrolize edilen proteinlerdir. Bir uygulamada, proteinler, protein üzerinde trispin ve/veya kiinotrispin aksiyonundan ortaya çikmaktadir (özellikle peyniralti suyu proteinleri). Bir uygulamada, hidrolize proteinler soya proteinlerini ve/veya yumurta proteinlerini ihtiva etmektedir. Bir uygulamada, hidrolize proteinler Protamex® ve/veya Flavourzyme® (Novozyme, Danimarka) gibi proteazlarin aksiyonundan ortaya çikmaktadir. Bir uygulamada, bilesime ait proteinler, tercihen hidrolize proteinler, tahil veya yumurta proteinlerini ihtiva etmektedir. Bir uygulamada, hidrolize proteinler Alkalaz aksiyonundan ortaya çikmaktadir. Mevcut bulusa ait bilesim bahsedilen protein kaynaklarindan 2 veya daha fazlasinin karisimini ihtiva edebilmektedir.

Hedef grup: Bulusa ait bilesim en uygun olarak görece genç hastalari hedef almaktadir, ancak yetiskinler üzerindeki bir etkisi de görmezden gelinmemektedir veya mümkündür. Tercihen, hastalar bagisiklik sistemleri ve gastrointestinal yollarinin olgunlasma döneminden geçecek kadar gençtirler. Bu tür hastalarda, bilesimin etkisi daha yogun veya daha çabuk olabilmektedir. Bir uygulamada, bilesim bir bebek mamasi, bebek tahil gevregi ve/veya bir bebek besinidir. Tercihen, bilesim 6 yas altindaki, dogum ile 3 yas araligindaki veya dogum ile sütten kesme evresi arasindaki genç insanlari hedef almaktadir. Bir uygulamada, bilesim bir baslangiç veya devam bebek mamasidir. Tercihen besinsel bilesim genç insanlarin beslenmesi için gerekli olan besinlerin büyük çogunlugunu ihtiva etmektedir.

Bir uygulamada, besinsel bilesim 1 ila 4 yas arasi bebekler/küçük çocuklara yönelik bir bebek tahil bilesimidir. Bilesim, daha spesifik olarak sütten kesme sürecinde ve/veya sonrasindaki 12 ayda uygulamayi hedeflemektedir. Sütten kesme süreci bulus için önemlidir, çünkü bebekler sütten kesme döneminde bagisiklik sistemleri ve gastrointestinal yollari henüz bir olgunlasma ve yeniden yapilanma içerisindeyken çesitli gidalara maruz kalmaktadir. Bu nedenle alerjik tepkinin etkin kontrolü bu süreçte Oldukça önemlidir.

Bulusa ait bilesimin kullanimi baglaminda, çocuklar, bebekler veya yeni doganlar alerjik çocuklar olabilmektedir. Alerjik çocuklar, bir gida alerjenine karsi en az bir hafif, orta veya siddetli alerjik reaksiyon episodu geçirmis çocuklar, bebekler veya yeni doganlardir.

Bulusun bir uygulamasinda, çocuklar, bebekler veya yeni doganlar besin alerjenlerine karsi ciddi alerjiler göstermis ve/veya birden fazla orta veya ciddi gida alerjisi episodu deneyimlemislerdir. Alerjilerin semptomlari deri iritasyonu veya kizarikligi, gastro-intestinal semptomlar veya solunuinlari ilgili semptomlar gibi birçok bilinen semptomu kapsayabilmektedir.

Mevcut bulusun kapsadigi besin alerjenleri, dogal olarak olusan veya özellikle genç insanlara (örnek olarak yeni doganlar, bebekler, çocuklar) yönelik gidalar olinak üzere gidalarda olusan tüm alerjen türlerini kapsayabilmektedir.

Deney sonuçlari: Agirlikli olarak Lactobacillus ve Bifidobacterium cinslerine ait olan probiyotikler, alerjik duyarliliga müdahale etme kapasiteleri için veya duyarli kisilerde alerjik semptomlarin gelismesi ile ilgili olarak insan ve hayvan deneyleriyle test edilmistir. Burada B. longum'un belirli bir susunun, yani B. longum NCC 2705'in, alerjik duyarlilik veya semptomlarin gelisimini hafifletme potansiyeline sahip olup olmadigini analiz etmekteyiz.

Bir ilk adimda, farkli B. longum suslari tarafindan indüklenen sitokin profillerini belirlemek için insan kan lenfositlerine dayali bir in vitro sistem gelistirdik ve kullandik.

Gözlemlenen profillerin, ayni suslar tarafindan in vivo indüklenen sitokin üretimi için ve dolayisiyla söz konusu suslarin sagladigi biyolojik etkiler için öngörücü olacagini varsaydik.

Alerjik bir birey veya alerji gelistirmeye egilimli bir bireyin hücreleri, Th2 sitokinleri üretme egilimleri ile karakterize edilmektedir. Bu durumu kismen in vitro taklit etmek için, alerjik donörlerin PBMC'sini kullanmanin bir alternatifi olarak Th2-çarpik insan periferal kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) bir hücre kültürü modeli gelistirdik. Th2-çarpiklasma, PBMC'nin interlökin (IL)-4 + anti-CD40 antikoruyla (Yöntemler'de ayrintili olarak açiklandigi gibi) kültürlenmesiyle indüklenmis; Th2-çarpiklasmayi indüklemek için 3 günlük kültürden sonra, ek olarak 48 saat boyunca bifidobakteriler eklenmis ve toplam 5 günlük bir kültür süresiyle sonuçlanmistir. Temel bir okuma olarak, IFNy, lL-lO ve lL-5 sitokinleri, B. longum ile uyarilan hücrelerin süzüntüsünde ELISA ile ölçülmüstür.

Sekil l/Tablo 1, B. longuin NCC 2705'in, IFNy ve lL-lO'un benzer miktarlarini indükledigini, 1.3”lük bir IFNy / IL-lO oranina yol açtigini göstermektedir. Paralel olarak analiz edilen B. longum NCC 3001 (BBS36; Morinaga tarafindan ATCC BAA-999 altinda tutulmaktadir) ve B. longum NCC gibi diger B. longum suslari NCC 2705, IL-5 salgilanmasinin etkili bir inhibitörüdür. Bu veriler B. longum NCC 2705°in Th2-çarpiklasmis kosullari altinda güçlü bir IL-10 üreticisi oldugunu ve dolayisiyla antienflamatuar aktivite süresinde bir anti-alerjik etkiye sahip olabilecegini ileri sürmektedir.

Sekil 2/Tablo 2 B. longum BBS36 ve LPS”ye (E. coli'den) kiyasla B. longum NCC 2705 için mRNA seviyesi ile ilgili bu sonuçlarin teyidini göstermektedir. Çesitli genlerin ifade seviyeleri farkli uyaranlarla Th2-çarpik insan PBMC,sinin birlikte kültürlerine baslandiktan 10 ve 24 saat sonrasinda analiz edilmistir. Th2-çarp1k PBMCnin B. longum NCC ile kültürlenmesi, IFNysnin bilinen bir güçlü indükleyicisi olan LPS,ye kiyasla lFNylnin orta dereceli indüklenmesine neden olmustur. B longum NCC 2705 ile indüklenen IL-lO mRNA seviyeleri B. longum BBS36 ile indüklenen seviyelerden daha yüksektir. IL-5 mRNA seviyeleri etkilenmezken, GATA-3 suslarin ikisinden biriyle inkübasyondan sonra hafif derecede azalmistir. Bütünüyle, bu bulgular protein seviyesinde elde edilen sonuçlari teyit etmektedir (Tablo 1).

B. longum NCC 2705lin in Vivo etkisi bir fare besin alerjisi modelinde (OVA Besin Alerj isi Fare Modeli, Sekil 3`te gösterilmektedir) test edilmistir.

BALB/c fareler, 7 hafta boyunca oral yolla ovalbumin (OVA)+kolera toksiniyle haftalik araliklarla duyarli hale getirilmistir. Bu modelde, duyarlilastirma süresinin sonunda büyük dozdaki OVA ile oral satasma ishal, kazima episodlari, keçelesmis kürk, morarma, ve hareket kaybi gibi klinik semptomlari ortaya çikarmistir.

NCC 2705 ya duyarlilastirma fazinin l. gününden 43. gününe kadar (birincil önleme), deneylerin son haftasi sirasinda (gün 43 - 50 ikincil önleme) ya da bütün deney süresi boyunca (gün 1-50, tüm süre boyunca) içme suyu içerisinde (5x108 CPU/ml; istenildigi zaman) farelere verilmistir.

Sekil 4, iki farkli deneyde gözlemlenen klinik semptomlari göstermektedir. B. longum NCC 2705 verilen fareler, duyarli hale getirilmis ve tedavi edilmemis farelere kiyasla satasma sonrasinda daha az ciddi klinik semptomlar göstermistir (Pozitif Kontrol). Etki en çok ikincil önlemede belirgin olup, birincil önlemede ve bütün deney boyunca B. longum NCC 3705 (deney 1, üst panel) verildiginde de belirgin görülmüstür. Bir ikinci deneyde, ikincil önlemedeki koruyucu etki kanitlarla desteklenirken, birincil önlemede veya bütün deney boyunca etkinin yönelimleri gözlemlenmistir (deney 2, alt panel).

Sekil 5°te gösterildigi gibi, klinik skora ek olarak, fare mast hücresi proteazi 1 (MMCP-l) serum seviyeleri alerjen satasmasi ile intestinal mast hücresi aktivasyonuna bir önlem olarak belirlenmistir. OVA satasmasi Negatif Kontrol grubuna kiyasla Pozitif Kontrol grubundan MMCP-l ,in serum seviyelerinde güçlü bir artisa neden olmustur. Pozitif Kontrol grubuna kiyasla NCC 2705 ile tedavi edilen farelerde MMCP-l serum seviyelerinin modülasyonunda bir yönelim (çok büyük olmamasina ragmen) gözlemlenmistir.

Sekil 6/ Tablo 3 ex vivo olarak yeniden uyarilan lenfositlerin sitokin üretimini göstermektedir. Bu amaçla, mezanterik lenf dügümlerinden (MLN) lenfositler satasma sonrasinda toplanmis, 1 mg/ml OVA ile yeniden uyarilmis ve 72 saat boyunca kültürlenmistir. Multipleks test (Mesoscale®) ile IL-l, IL-2, IL-4, KC, TNFoi, IFN-y, IL-5 ve IL-lO seviyeleri ölçülmüstür. Birinci] önlemede NCC 2705 ile tedavi edilmis farelerin MLN lenfositleri Pozitif Kontrol grubuna kiyasla daha az lL-2, lL-4, TNFOL, lFNy, lL-5 ve Alerji ile ilgili çesitli türlerin bagirsaklarindaki görünme seviyeleri niteliksel gerçek zamanli polimeraz zincir reaksiyon ile belirlenmistir (qRT-PCR - bkz. asagidaki yöntem) Gen ifadesi ölçümleri pozitif kontrol, negatif kontrol ve B. longum NCC 2705 alan grup için duyarlilastirma süreci (birincil önleme) ve satasmadan önceki son hafta boyunca (ikincil önleme) ileumdan dokular üzerinde gerçeklestirilmistir. Sekil 7/Tablo 4 elde edilen sonuçlari göstermektedir: duyarlilastirma IL-10”un yani sira as IL-4, IL-5, IL-9 ve IL-13 gibi (Negatif Kontrol vs Pozitif Kontrol) tipik Th2 sitokinler için mRNA transkripsiyonun yukari regülasyonu ile sonuçlanmistir. NCC 2705 ile tedavi (birincil veya ikincil önleme) bu belirteçlerin dikkate deger asagi regülasyonuyla sonuçlanmistir.

Bu nedenle, deneyler, hayvanlar B. longum NCC 2705 aldiginda (birincil ve ikincil önleme) ilgili genlerin ifadelerinde azalma ile bagisiklik tepkilerin asagi modülasyonunu göstermektedir. Bunun, test edilen Bifidobacterium susunun bu modeldeki besin alerjisinin azaltilmasinda anti alerjik etkiye katkida bulunduguna inanilmaktadir.

Sonuç: Bu veriler duyarli hale getirilmis bir hayvanin B. longum NCC 2705 tüketiminin hassaslastirici alerjenlere maruz kalindiginda azalan alerjik semptomlara yol açtigini göstermektedir. Benzer sekilde ancak daha az dikkat çekici olarak, duyarlilastirma fazi esnasinda B. logum NCC 2705 bir koruyucu etkiye (birincil önleme) sahiptir. Bu bulgu, bagirsaktaki alerji ile iliskili anahtar genlerin ifadesinin azalmasinin yani sira mezanterik lenf nodülü hücreleri tarafindan sitokinlerin salgilanmasinin azalmasi ile de paralel olmustur, bu da bagisiklik sisteminin bilesenlerinin bir modülasyonunun koruyucu etkiye katkida bulundugunu ortaya koymaktadir.

Analitik yöntemler: Reaktiiler ve bakteriyel biyokütle: Bakteriyel biyokütle sivi kültürlerdeki optimal kosullar altinda her bir susun kültürü ile üretilmistir. Her bir sus için büyüme kinetikleri belirlenmis ve bunlara göre hareketsiz faza ulasildigindan 3 saat sonra biyokütle toplanmistir. Bu zaman noktasinda, kültürler soguk PBS içinde 2 kere yikanmis ve 50 ulalik parçalar halinde -80 °C,de PBS %20 gliserol içinde dondurulmustur. LPS (E. coli”den) Sigma7dan (Buchs, Isviçre) alinmistir.

THZ-çarpik insan PBMC”sinin izolasyonu ve kültürü: Insan periferal kan inononükleer hücreleri (PBMC) "Centre de Transûision of the CHUV"den alinan filtrelerden izole edilmistir. F iltrelerde tutunan hücreler 90 inlilik Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBBS) (Sigma) ile kan toplama torbasina geri dökülmüstür. Hücreler HBSS ile üzerinde yogunluk asamali santrifüj ile izole edilmistir. Ara fazdaki hücreler toplanmis ve HBSS ile iki kez yikanmistir. Daha sonra PBMC %10 fetal buzagi serumu FBS (Bioconcept, Paris, France), tamamlanmis Iscove Modifiye Dulbecco Ortami (CIMDM, Sigma) içinde yeniden askiya alinmistir. Hücreler, bir Th2 sitokin fenotipini indüklemek için cIMBM içindeki 50 ng/ml varliginda 1.5x106 hücre/mFde 48 kuyucuklu plaka (Milian, Meyrin, Isviçre) içinde kültürlenmistir. LPS l ug/dee kullanilmistir. 3 günlük kültürden sonra, probiyotikler 107, 106, ve 105 CFU/mlide eklenmistir. Bilesenler eklendikten sonra, PBMC kültürü ekstra bir 48 saat daha devam ettikten sonra, toplam 5 günlük kültür süresiyle sonuçlanmistir.

Sitokin ELISA: Insan IFN-y, insan IL-5, insan lL-lO, fare IFN-y, fare IL-13 ve fare IL-lO sitokinleri R&D sistemlerinden alinan DuoSet kitler kullanilarak üreticinin talimatlarina göre ölçülmüstür.

ELISA sonuçlarinin degerlendirilmesi: OD degerleri standart egriler kullanilarak pg/mliye dönüstürülmüstür. Genel olarak farkli insan donörlerden gelen PBMC ile gözlemlenen büyük donörden donöre varyasyonunu ayarlamak için, veriler istege bagli bir dâhili standarda göre standardize edilmistir. LPS ile uyarim ile her bir donör için elde edilen IFN-Tnin pg/ml degeri %100,e ayarlanmistir. IL-lO degerlerinin normalizasyonu için, B. lactis NCC 2818 susu (Nestec SA tarafindan CNCM-I3446 altinda kayitlidir) susu ile indüklenen IL-lO miktari %100 olarak düsünülinüstür. Son olarak, yalnizca ortamdaki (örnek olarak probiyotiklerin yoklugunda) Gerçek zamanli PCR ile niceliksel gen ifade seviyeleri 3 gün boyunca kültürlenmistir. Bundan sonra, bilesenler PBMC içine eklenmis ve hücreler saat ve 24 saat sonunda toplanmistir. Toplam RNA, üreticinin talimatlarina göre bir DNaZ islemi de dahil olmak üzere SV toplam RNA izolasyon sistemi kiti (Promega, Wallisellen, Isviçre) ile uyarilmis PBMC'den özütlenmistir. Toplam RNA ribogreen RNA niceliklendirme kiti (Molecular Probes, Basel, Isviçre) kullanilarak niceliklendirilmistir.

Ters transkripsiyon, l ug toplam RNA üzerinde Multiscribe Reverse Transcriptase kiti (Applied Biosystems, Foster City, CA, A.B.D.) kullanilarak gerçeklesmistir. Toplam RNA 50 uMilik rastgele heksamerler, 0.5 mM dNTPler, 20U RNaz inhibitörü (Applied Biosystems), 62,5 U Multiscribe ters transkriptaz, IX RT tampon ve 5.5 mM MgCIz ile karistirilmis ve son hacim 100 pl olmustur. Taqman gen ifade testleri kullanilarak gerçek zamanli PCR (Applied Biosystems, ABI PRISM 7900HT) ile insan IFNy, IL-lO, IL-S, Tbet, GATAS, FoxP3 niceliklendirilmistir. Niceliklendirme, 3 referans genin ortalamasi ile normalize edilmistir: ß-aklin, GAPDH ve HPRT (Applied Biosystems).

Elde edilen döngü esigi (Ct) degerlerine dayanarak, ACt kullanilarak her bir gen için ilgili ve normalize bir mRNA ifadesi belirlenmistir. Her bir gen için Ct degerleri, üç referans genin Ct ortalamasi ile düzeltilmistir. Sonuçlar 2A“ x K formülü kullanilarak bir rölatif ifade olarak hesaplanmistir.

OVA besin alerjisi fare modeli: Bütün çalismalar bir Nestec Iç Etik Komitesi (Internal Ethics Committee) ve the Service Vétérinaire of the Canton of Vaud, Isviçre (Authorization #1970) tarafindan onaylanmistir. Alti haftalik disi konvansiyonel BALB/c fareler (Harlan Laboratories, Fransa), haftalik araliklarla oral yolla (gavaj ignesi) Fluka (Buchs, IsviçreYdan 20 mg Ovalbumin (OVA) + LuBiosciencdtan (Lucerne, Isviçre) 10 ug/fare Kolera toksini (adjuvan olarak kullanilmistir; List Biologicals, LuBioscience, Lucerne, Isviçre,den alinmistir) ile 7 hafta boyunca duyarlilastirilmistir. Son duyarlilastirmadan bir hafta sonra, 100 mg OVA ile bir oral satasma gerçeklestirilmistir. Duyarlilastirma esnasinda birincil önleme için deneyin farkli fazlarinda, ikincil önleme için duyarlilastirma fazinin sonunda baslayan veya tüm deney boyunca ikincil önleme için, B. longum NCC 2705 (5)(108 CF U/ml içme suyunda) ile besinsel müdahale gerçeklestirilmistir. Satasmadan 30 dakika sonra, fareler bireysel olarak 30 dakika boyunca gözlemlenmistir. Klinik semptomlar kaydedilmis ve asagidaki sekilde niceliklendirilmistir (Alerjik Skor): 0: 0: semptom yok, 4 episod kasintidan az; burun ve bas etrafinda 1: 4-10 episod kasinti, ishal yok; 2: 10”dan fazla kasinti veya killi kürk ve immobilite veya yumusak diski; 3: ishal veya nefes darligi veya siyanoz; 4: tetiklenmeden sonra ishal ile birlikte immobilite, killi kürk, nefes darligi veya siyanoz; 5: anafilaksi. Satasmadan dört saat sonra, fareler sakrifiye edilmis, kan ve son santimetre ileum alinmis ve sivi nitrojen içinde dondurulmustur.

Serum MMCP-l: Faregil mast hücreleri proteazi `l (MMCP-l) Moredun Scientificsten (Penicuik, Iskoçya) alinan ELISA ile üretici talimatlarina göre fare serumunda ölçülmüstür. MMCP-l konsantresi, OD degerlerini bir poli-nominal standart egri kullanarak pg/ml'ye çevirerek elde edilmistir.

Mezanterik lenf dügümü hücrelerinin izolasyonu ve kültürü: Mezanterik lenf dügümleri (MLN), bir hücre süzgecinde (BD Falcon, Milian, Meyrin Isviçre) bir siringa pistonuyla homojenlestirilmistir. Hücreler santriiijjlenmis ve %10 fetal sigir serumu FBS (Bioconcept, Paris, Fransa), %1 L-glutamin (Sigma), %1 Penisilin/Streptomisin (Sigma), %0.1 Gentamisin, %0.l ß-merkaptoetanol (Sigma) ile tamamlanan RPMI (Sigma) içinde iki kez yikanmistir. Hücreler 3x106 hücre/ml ile OVA (1 ing/ml) varliginda veya yoklugunda 96 kquCUklu düz tabanli plakada (Corning, Milian) kültürlenmistir. 72 saatin ardindan, kültür plakalari dondunilmustur.

MLN kültürlerinin süzüntüsü içindeki sitokinler Fare IL-4, IL-5, IL-lO, IFN-y, IL-lß, IL-2, IL-8, TNF-a, IL-12T”si üreticinin talimatlarina göre fare Thl/Th2 9-plex multipleks kiti (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA) kullanilarak ölçülmüstür.

Bagirsaktaki gen ifadesinin Düsük Yogunluk Dizisi (LDA) analizi: RNA ekstraksiyonu ve nicellestirilmesi: Ileum'dan toplam ribonükleik asitler (RNA), Promega”dan alinan (Dübendorf, Isviçre) SV Total RNA izolasyon Sistem kiti kullanilarak üretici talimatlarina göre ekstrakte edilmistir. RNA saglanan quant-IT Ribogreen Reagent kiti ile üretici talimatlarina göre ölçülmüstür.

Ters Transkripsiyon: Ters transkripsiyon, l tig total RNA üzerinde Applied Biosystems°tan (Foster City, CA, A.B.D.) Multiscribe Reverse Transcriptase kiti kullanilarak gerçeklesmistir. Toplam RNA 50 uMilik rastgele heksamerler, 0.5”lik mM dNTPler, 20U RNaz inhibitörü (Applied Biosystems), 62,5 U Multiscribe ters transkriptaz, IX RT tampon, ve 5.5 mM MgCIz ile karistirilmis ve son hacim 50 u] olmustur. Ters transkripsiyon asagidaki döngü programi takip edilerek bir T3 isi döngüleyici üzerinde gerçeklestirilmistir: 25 °C°de 10 dk., 48 °C°de dk., 95 °C,de 5 dk. ve son sicaklik 4 °C.

Düsük Yogunluk Dizisi (LDA): LDA Applied Biosytems (Uygulamali Biyosistemler) internet sitesinde çevrimiçi olarak tasarlanmistir (http://www.appliedbiosystems.com/index.htm).

Yük, süreç ve analizler, bir niceliksel ABI-Prism 7900HT üzerindeki üretici talimatlarina göre gerçeklestirilmistir.

Nicellesme, 3 referans genin ortalamasi ile normalize edilmistir: ß-aktin, GAPDH ve Elde edilen döngü esigi (Ct) degerlerine dayanarak, ACt kullanilarak her bir gen için ilgili ve normalize bir mRNA ifadesi belirlenmistir. Her bir gen için Ct degerleri. üç referans 2`ACt K K formülü kullanilarak ilgili bir ifade genin Ct ortalamasi ile düzeltilmistir. Sonuçlar olarak hesaplanmistir, burada K 106 faktördür. Katlama artis sonuçlari ifadesi Negatif gruptaki ifade seviyelerine normalize edilmistir.

Mevcut bulusa göre kullanim için bir bebek mamasinin bilesimine ait bir örnek asagida verilmektedir. Bu bilesim yalnizca örnekleme ainaciyla verilmektedir. Protein kaynagi peynir alti suyu proteini ve kazeinin geleneksel bir karisimidir.

Besin maddesi 100kkal basina Litre basina Enerji (kkal) 100 670 Protein (g) 1.83 123 Linoleik asit (g) 079 5.3 u-Linolenik asit (mg) 101 675 Laktoz (g) 11.2 74.7 Prebiyotik ( 0.64 4.3 Mineraller (g) 0.37 2.5 C1 (mg) 64 430 Vitamin A (prg RE) 105 700 Vitamin D (tig) 1.5 10 Vitamin E (mg TE) 0.8 5.4 Vitamin K1 (tig) 8 54 Vitamin C (mg) 10 67 Vitamin B1 (mg) 0.07 0.47 Vitamin B2 (mg) 0.15 1.0 Niyasin (mg) 1 6.7 Vitamin B6 (mg) 0.075 0.50 Folik asit (pg) 9 60 Pantotenik asit (mg) 0.45 3 Vitamin B12 (pg) 0.3 2 Biyotin (ng) 2.2 15 Kolin (mg) 10 67 1 (tig) 15 100 BiIidobacterium longum (NCC 2705); 2x107 CFU /g toz (bakiniz: deney bölümü) Sekil 1 / Tablo 1. Çesitli B. longum suslari ile birlikte kültür sonrasi Th2-çarpik insan PBMCSSI tarafindan sitokin salgilanmasi Sitokin üretimi (% referansi) B. longum NCC a) Sailastirilmis E. coli LPS ile stimülasyonun neden oldugu lFNy miktari : %IOO m Kanitlanmis IL-lO indükleme etkisine sahip olan bir referans bakteriyel susun neden oldugu IL-lO miktari: C) Herhangi bir uyaran (ortam) yoklugunun neden oldugu IL-5 miktari = “ 6100.

Sekil 2 / Tablo 2. B. longum NCC ile birlikte kültürün ardindan Th2-çarp1k insan PBMCjsi ile mRNA ifadesi mRNA seviyesi (rölatififadeýü Ortam NCC 2705 NCC 3001 LPS Sekil 3: OVA besin alerji modelinin sematik açiklamasi Hayvanlar: Geleneksel BALB/c fareler (6 haftalik) Duyarlilasma ° Oral yol, 7x, haftada bir kez ° 20 mg OVA + 10 ;Lg/fare Kolera Toksini (yardimci olarak) - Negatife kontrol: sadece Kolera toksini Eprüvasyon ° Oral yol 4 sa sonra sakrifîye Sekil 4: Içme suyunda 5x10 CFU/ml B. longum NCC 2705 alan frelerde azalan besin alerjisi semptomlari. 2 bagimsiz deneyin sonuçlari. Elmas sekli tek fareleri ifade ederken, çubuk sekli ortalamayi göstermektedir.

Deney 1 ;mi 033 2- 0 e 0 1 - o w w . Deney 2 pI-Ü OH& g 3- w w @ M 2- o a 9 cm› 1 - o o w w 4:› 0- 8 O w w ce.

Sekil 5: Satasmadan 4 saat sonraki Fare Mast Hücresi Proteaz 1 (MMCP-l) Serum seviyeleri. Elmas sekli tek fareleri ifade ederken, çubuk sekli ortalamayi göstermektedir. 10000 * 100 - .

Sekil 6 / Tablo 3. EX Vivo olarak yeniden uyarilan mezanterik LN lenfositlerinin Sitokin üretimi Sitokin (ortalama pg/ml) birmcil (n-15) Tum sure (n-15) 1 temsil edici deneyin sonuçlari gösterilmektedir.

Sekil 7/ Tablo 4. Ileum içinde gen ifade seviyeleri Rölatif gen ifadesi (ortalama±SEM ve kat degisimi) Neg Kontrol Poz Kontrol NCC B. longum NCC 2705 duyarlilastirma esnasinda (gün 1-43) içme suyu içerisinde farelere birincil önleme için verilmistir.

B. longum NCC 2705 satasmadan önce 1 hafta boyunca içme suyu içinde duyarli hale getirilmis farelere ikincil önleme için verilmistir.

Rölatif gen ifade seviyeleri 3 referans gene (GAPDH, ß-aktin, HFRT) normalize edilmistir.

Kat ifadesi Neg Kontrol grubundaki ifade seviyelerine normalize edilmistir.

Claims (1)

1. ISTEMLER Besin alerjenleri ile tetiklenen alerjileri olan hastalarda besinden kaynaklanan alerji semptomlarini azaltmaya yönelik bir tam besinsel bilesimin üretimi için, Bifidobacterium longum susu NCC kullanimi olup, burada söz konusu bilesim söz konusu besin alerjenleri ile tetiklenen alerjik reaksiyonlara karsi önemli ikincil önleme saglamaktadir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim söz konusu hastalarin söz konusu alerjenlere duyarliligi üzerinde bir etkiye sahiptir. Yukaridaki isteinlerden herhangi birine göre kullaniin olup, burada söz konusu Bifidobacterium longuin NCC 2705 suslari probiyotiklerdir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim kuru bilesimin grami basina ihtiva etmektedir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim tercihen bir fruktooligosakkarit ihtiva eden en az bir prebiyotik ihtiva etmektedir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim polifenolleri içeren bir elma özütünü ihtiva etmekte ve burada söz konusu elma özütü besin alerjenleri ile tetiklenen alerjilere sahip olan hastalarda besinden kaynaklanan alerjilerin semptomlarini azaltmaya yardimci olmaktadir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim hidrolize proteinler ihtiva etmektedir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim yasamin ileri dönemlerindeki diger alerjenlere duyarli hale gelmeyi azaltmaktadir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullaniin olup, burada söz konusu semptomlar gastro-intestinal, kutanöz veya solunumla ilgili semptomlar veya bunlarin bilesimidir. Yukaridaki isteinlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim tahil proteinleri ihtiva etmektedir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim bir bebek mamasi, bir bebek tahil gevregi, tahillari ihtiva eden çocuklar için sivi bilesim veya bir bebek besinidir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullaniin olup, burada söz konusu bilesim 1 ila 4 yas arasindaki bebeklere yönelik bir bebek tahil bilesimidir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada söz konusu bilesim sütten kesme sürecinde ve/Veya bundan 12 ay sonrasina kadar bebeklere verilmektedir. Yukaridaki isteinlerden herhangi birine göre kullaniin olup, burada söz konusu hastalar 6 yas alti, tercihen dogumdan 3 yasa kadar aralikta olan küçük çocuklardir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada semptomlara triptaz, kimaz, histamin, lökotrienler gibi biyokimyasal aracilarin salgilanmasi eslik etmektedir. Yukaridaki istemlerden herhangi birine göre kullanim olup, burada Biûdobacterium longum NCC 2705 susu kopyalanmayacak hale gelecek sekilde etkisiz hale getirilmistir.