BR112021005316A2 - combinação de probióticos para o tratamento de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma combinação de probióticos que compreende B. longum e B. lactis para o tratamento ou prevenção de um distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação, como uma doença inflamatória intestinal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMBI- NAÇÃO DE PROBIÓTICOS PARA O TRATAMENTO DE DISTÚR- BIOS GASTROINTESTINAIS RELACIONADOS À INFLAMAÇÃO".

[001] A presente invenção refere-se a uma combinação de pro- bióticos para o tratamento ou profilaxia de distúrbios gastrointestinais, em particular distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação, e a composições e métodos que usam a combinação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As condições inflamatórias do trato gastrointestinal podem causar desconforto e dor abdominal graves, e podem ter um forte im- pacto na qualidade de vida. Tipicamente, os distúrbios gastrointesti- nais relacionados à inflamação, como a doença inflamatória intestinal (DII), se manifestam com sintomas de problemas intestinais recorren- tes, incluindo diarreia, cólica e/ou dor abdominal, diminuição do apetite e perda de peso associada, náusea, febre e fadiga. Esses sintomas podem ser episódicos ou persistentes, e podem levar ao comprometi- mento da capacidade de absorver nutrientes. Isto é particularmente grave em crianças e adolescentes, podendo levar a um crescimento insatisfatório e à falta de ganho de peso. A doença de Crohn e a colite ulcerativa são os exemplos mais comuns de distúrbios gastrointesti- nais relacionados à inflamação. Os sintomas da DII podem ser afeta- dos pela dieta e pelo estresse, e o controle dos sintomas por altera- ções no estilo de vida, nutrição e alimentação podem oferecer algum grau de alívio. Por exemplo, os sintomas podem ser exacerbados pelo consumo de laticínios, alimentos graxos, alimentos condimentados, cafeína e álcool e, em alguns casos, por uma ingestão excessiva de fibra dietária. A doença de Crohn é especialmente problemática e pode causar dor abdominal grave e problemas nutricionais.

[003] A prevalência de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação, como a DII, está aumentando. Atualmente, a DII afeta cer-

ca de 1,5 milhão de pessoas nos Estados Unidos e 2,2 milhões na Eu- ropa. As causas da DII não são conhecidas, mas entende-se que uma série de fatores tem participação, como a genética, sistema imunológi- co, integridade da barreira epitelial intestinal e o ambiente.

[004] Os tratamentos farmacológicos atuais para distúrbios gas- trointestinais relacionados à inflamação, como a DII, incluem aminos- salicilatos, modificadores da resposta imunitária, antibióticos e corti- costeroides. Entretanto, há uma alta taxa de recidiva entre muitos pa- cientes após o tratamento farmacológico, com muitos eventualmente exigindo intervenção cirúrgica.

[005] Os distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação podem também afetar outros mamíferos, por exemplo, mamíferos de companhia, como gatos (DII felina) e cães (DII canina). Cães e gatos podem, especialmente, sofrer de distúrbios gastrointestinais relaciona- dos à inflamação, que podem se manifestar como diarreia crônica (isto é, diarreia que persiste durante 3 semanas ou mais). Os quadros in- flamatórios intestinais em animais podem ocorrer em resposta a ali- mentos (diarreia responsiva a alimentos, diarreia responsiva à dieta, enteropatia responsiva a alimentos), ou podem ter uma causa desco- nhecida (doença inflamatória intestinal idiopática). Em tais casos, o animal é incapaz de ingerir alimentos habituais devido à inflamação e/ou ulceração do intestino, levando à diarreia. A doença inflamatória intestinal em animais, particularmente em cães e gatos, é um quadro no qual o trato intestinal é invadido por células inflamatórias como lin- fócitos, plasmócitos, eosinófilos e neutrófilos. Outros sintomas de DII em animais podem incluir vômito, falta de apetite e perda de peso.

[006] A inflamação é uma reação complexa do sistema imunoló- gico que envolve o acúmulo e ativação de leucócitos e proteínas plas- máticas nos locais de infecção, exposição a toxinas ou lesão celular. Embora a inflamação sirva como uma função protetora no controle de infecções e promoção do reparo tecidual, ela pode também, no caso de desregulação, causar danos e doenças teciduais. Doenças gastroi- ntestinais como doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa e bursite), alergias alimentares e dermatite atópica resultantes de alergias alimentares são tipicamente acompa- nhadas por respostas inflamatórias intestinais aberrantes em níveis diferentes. O alívio dessa inflamação intestinal mediante o equilíbrio de citocinas pró e anti-inflamatórias, ou a indução de citocinas regulado- ras, vem sendo sugerido como um possível tratamento para essas do- enças crônicas. Existem várias dessas citocinas, das quais IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-α, por exemplo, são consideradas pró- inflamatórias. Por exemplo, é conhecido o papel do TNF-α na inflama- ção gastrointestinal (Neurath, M. F. - Nature Reviews Immunology, (2014), 14, 329-342). Os esforços de pesquisa se concentram no de- senvolvimento de agentes anti-TNF-α para tratar doenças inflamatórias gastrointestinais como a doença de Crohn.

[007] Algumas citocinas, como a IL-10 e TGF-β, são considera- das anti-inflamatórias. Por exemplo, a IL-10 é conhecida por suprimir a produção de citocina pró-inflamatória através de células apresentado- ras de antígeno e células T. Foi sugerido o envolvimento da IL-10 na inflamação intestinal, e a deficiência de IL-10 foi associada a quadros como doença inflamatória intestinal [Leach, M.W., et al, Toxicol. Pathol. (1999), 27(1), 123 a 133.

[008] É conhecida a função das citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12, na patogênese dos quadros gastrointestinais inflamatórios, particularmente na doença inflamatória intestinal, e antagonistas de IL- 12 como agentes terapêuticos foram propostos para o tratamento des- ses quadros (Schmidt, C., et al., Pathobiology (2002-2003), 70(3), 177 a 183).

[009] Os inibidores de serina protease (serpinas) são uma super-

família de proteínas encontradas em eucariotas (Gettins, 2002, Che- mical Reviews, 102(12), 4751 a 4804) e procariotas (Kantyka et al., Biochimie, 92(11), 1644 a 1656). Foi relatado que as serpinas estão envolvidas em uma ampla gama de processos fisiológicos e implica- das na função de controlar as proteases envolvidas na inflamação in- testinal. Por exemplo, Ivanov, D., et al. (J. Biol. Chem., (2006), 281 (25), 17246 a 17252) caracterizou e estudou a serpina B. Longum e descobriu-se que ela inibe a elastase de neutrófilos humanos (HNE), e sugeriu um possível papel benéfico dos inibidores de serpina nas in- flamações intestinais [Vergnolle, n. – Gut (2016), 65(7), 1215 a 1224].

[010] Outros biomarcadores em doenças inflamatórias gastroin- testinais incluem a proteína C-reativa (CRP) e outros anticorpos, célu- las T 5 reguladoras [Norouzinia, M., et al., Gastroenterology and Hepa- tology from Bed to Bench (2017), 10(3), 155 a 167].

[011] Os macrófagos são células fagocíticas presentes em teci- dos derivadas de monócitos que desempenham um papel importante na resposta imunológica inata. Eles são ativados por componentes mi- crobianos e, uma vez ativados, eles mesmos podem secretar citocinas tanto pró- quanto anti-inflamatórias. He, F., et al ("Stimulation of the Secretion of Pro-Inflammatory Cytokines by Bifidobacterium Strains" - Microbiol. Immunol. (2002), 46(11), 781 a 785) investigou a capacida- de de diferentes cepas de bifidobactérias afetarem a produção de cito- cinas derivadas de macrófagos. Eles descobriram que as bifidobacté- rias "do tipo adulto", como a Bifidobacterium adolescentis e a Bifido- bacterium longum induziram significativamente mais secreção de cito- cina pró-inflamatória do que as bifidobactérias "do tipo infantil", como a Bifidobacterium bifidum, a Bifidobacterium breve e a Bifidobacterium infantis. Além disso, observou-se que a b. adolescentis, em particular, não estimulou a produção da citocina anti-inflamatória IL-10. Eles con- cluíram que as bifidobactérias do tipo adulto podem ser mais potentes para amplificar a resposta inflamatória, mas menos capazes de regulá- la negativamente. Entretanto, mais recentemente, tentativas de identi- ficar as cepas probióticas anti-inflamatórias mais promissoras para uso terapêutico indicaram que a classificação taxonômica de um probiótico não é genericamente um preditor confiável, por exemplo, das proprie- dades anti-inflamatórias de uma cepa probiótica específica.

[012] As alterações na integridade e/ou função da barreira intes- tinal são conhecidas por contribuírem para a patogênese dos distúr- bios inflamatórios gastrointestinais, incluindo a DII e a SII (Odenwald M,.The intestinal epithelial Barrier: a therapeutic target? Nature Revi- ews Gastroenterology & Hepatology, (2017), (14), 9 a 21). Dessa for- ma, alterações na integridade/função da barreira intestinal têm múlti- plas consequências que facilitam o desencadeamento de numerosas doenças, dependendo de outros resultados e de constelações genéti- cas e epigenéticas. Dada a importância da barreira intestinal para manter a homeostase e a saúde imunológica, o reforço da barreira in- testinal gastrointestinal e/ou a melhora da função da barreira intestinal representa um novo e valioso alvo para a prevenção e/ou terapia da doença. Probióticos representam uma tentativa nutricional para melho- rar/reforçar a integridade e/ou função da barreira intestinal (Ewaschuk JB et al., Secretedbioactivefactors from Bifidobacterium infantis enhan- ceepithelial cell barrierfunction, Am J Physiol Gastrointest Liver Physi- ol. 2008 Nov; 295(5):G1025-34)...

[013] Além da alteração da função da barreira intestinal, as alte- rações na composição da microbiota e/ou na atividade metabólica também estiveram associadas ao desenvolvimento de doenças inclu- indo distúrbios gastrointestinais como a DII. Foram consideradas vá- rias de tentativas nutricionais para restaurar a microbiota, incluindo os probióticos, como abordagens valiosas para reduzir a inflamação e melhorar a condição da doença tanto em seres humanos como em animais de estimação [Marchesi, J.R. et al. – Gut (2016), 65, 330 a 339; Harris, K.G e Chang, E.B. - Clin. Sci. (2018), 132 (18), 2013 a 2028; Parker, E.A., et al. - Nutrition (2018), 45, 125 a -134].

[014] Portanto, existe uma necessidade contínua de identificar terapias adicionais para o tratamento ou prevenção de distúrbios gas- trointestinais relacionados à inflamação, incluindo a doença inflamató- ria intestinal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[015] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que uma combinação de duas cepas probióticas que compreendem uma Bifidobacterium longum e uma Bifidobacterium lactis, especifica- mente, uma Bifidobacterium longum ATCC CNCM I-2618, e uma Bifi- dobacterium lactis CNCM I-3446, opcionalmente, com Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, pode causar um aumento na produção ou ex- pressão de citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10, e pode diminuir ou suprimir a produção ou expressão de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12. Além disso, descobriu-se surpreendentemente que uma combinação de Bifidobacterium longum e de Bifidobacterium lactis, especificamente de Bifidobacterium longum ATCC CNCM I-2618 e de Bifidobacterium lactis CNCM I-3446, opcionalmente com Bifidobacte- rium longum ATCC BAA-999has tem efeito sobre a prevenção da dis- função/permeabilidade da barreira intestinal induzida por inflamação.

[016] As combinações de probióticos da presente invenção são, portanto, úteis para fornecer uma terapia eficaz para a prevenção ou o tratamento de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação.

[017] As combinações de probióticos da presente invenção po- dem ser usadas em composições para tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação, como a doença inflamatória intestinal.

[018] A invenção fornece adicionalmente um método para trata-

mento de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação, como um distúrbio inflamatório intestinal, que compreende a administração de uma combinação de probióticos, conforme descrito no presente do- cumento, a um indivíduo que sofre de tal distúrbio ou que é suscetível a ele.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] Figura 1: Produção de citocina (IL-10) em células mononu- cleares de sangue periférico estimuladas com diferentes cepas probió- ticas e combinações

[020] Figura 2: Produção de citocina (IL-12p70) em células mo- nonucleares de sangue periférico estimuladas com diferentes cepas probióticas e combinações

[021] Figura 3: Resistência elétrica transepitelial (TEER) em rela- ção aos controles tratados com TNFα/IFNγ para quantificar alterações induzidas por inflamação na permeabilidade da barreira com cepas probióticas diferentes e combinações das mesmas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[022] Os seguintes termos e definições são usados na presente invenção:

[023] Os termos "compreendendo", "compreende" e "compre- endido de" como usados no presente documento são sinônimos de "incluindo" ou "inclui"; ou "contendo" ou "contém", e são inclusivos ou não limitados e não excluem membros, elementos ou etapas não cita- dos. Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido de" também incluem o termo "consistindo de".

[024] O termo "bebê" se refere a uma criança de até 12 meses de idade.

[025] O termo "fórmula para bebês" se refere a um produto ali- mentício destinado à nutrição completa de bebês no contexto da au- sência de amamentação durante os primeiros quatro a seis meses de vida e como um complemento a outros produtos alimentícios até a idade de 12 meses.

[026] O termo "probiótico" se refere a preparações de células microbianas ou componentes de células microbianas com um efeito benéfico sobre a saúde ou bem-estar do hospedeiro [Salminen S, Ou- wehand A. Benno Y. et al. (1999) "Probiotics: how should they be de- fined" Trends Food Sci. Technol. (1999) 10, 107 a 110).

[027] O termo "criança" se refere a uma pessoa com mais de 12 meses, mas com menos de 10 anos.

[028] O termo "adolescente" se refere a uma pessoa entre 10 e 19 anos de idade (com base na definição da Organização Mundial da Saúde (OMS)).

[029] O termo "adulto" se refere a uma pessoa com 20 anos de idade ou mais.

[030] O termo "filhote de cachorro" se refere a um cão com menos de 12 meses de idade.

[031] O termo "filhote de gato" se refere a um gato com menos de 12 meses de idade.

[032] O termo "UFC" se refere a unidades formadoras de colônia e é medido com base no peso seco, exceto onde indicado em contrá- rio.

[033] O termo Bifidobacterium longum (B. longum) CNCM I- 2618 é usado de forma intercambiável com Bifidobacterium longum (B. longum) NCC2705.

[034] O termo Bifidobacterium lactis (B. lactis) CNCM I-3446 é usado de forma intercambiável com Bifidobacterium lactis (B. lactis) NCC2818.

[035] O termo Bifidobacterium longum (B. longum) ATCC BAA-999 é usado de forma intercambiável com Bifidobacterium lon- gum (B. longum) NCC3001.

[036] Os termos "barreira intestinal melhorada", "reforço da barreira intestinal" podem abranger um ou vários dentre os seguin- tes: - Reparo melhorado de barreira, como (mas não limitado a) recuperação da integridade da barreira gastrointestinal, como reparo de uma barreira rompida, redução da permeabilidade mediante desafio inflamatório da mucosa gastrointestinal e reparo da mucosa. - Maturação melhorada de barreira, como (mas limitado a) maturação e/ou desenvolvimento da barreira de um bebê, criança, adolescente, adulto, cão, filhote de cão, gato ou filhote de gato. - Estrutura melhorada de barreira, como (mas não limitado a) reforço da barreira gastrointestinal, integridade da barreira gastroin- testinal, estrutura de junção de oclusão e integridade de revestimento epitelial intestinal. - Função melhorada de barreira, como melhora da resistên- cia da barreira gastrointestinal, redução da permeabilidade da barreira gastrointestinal, como uma redução na translocação de patógenos dos sítios luminal para a mucosa, como uma redução na translocação de bactérias comensais dos sítios luminais para a mucosa, como uma re- dução na penetração de alérgenos dos sítios luminais para a mucosa, como uma redução na transferência de compostos tóxicos dos sítios luminais para a mucosa, e redução de suscetibilidade à doença. - Proteção melhorada de barreira, como (mas não limitado a) prevenção de disfunção de barreira, prevenção de vazamento de barreira, proteção de estrutura de junção de oclusão, proteção da inte- gridade do revestimento epitelial intestinal.

[037] Os termos B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 destinam-se a incluir a bactéria, partes da bactéria e/ou um meio de crescimento fermentado pela bactéria.

[038] As B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B.

longum ATCC BAA-999 podem, cada uma, ser usadas como bactérias vivas, bem como espécies bacterianas não replicantes inativadas. "Não replicante" significa que nenhuma célula viável e/ou unidades formadoras de colônia podem ser detectadas por métodos de plaque- amento clássicos. Tais métodos de plaqueamento clássicos são resu- midos no livro de microbiologia: James Monroe Jay, Martin J. Loess- ner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7ª edição, Springer Science, New York, N. Y. 790 p. Tipicamente, a ausência de células viáveis pode ser mostrada do seguinte modo: nenhuma colônia visível em placas de ágar ou nenhuma turbidez em meio de cresci- mento líquido após a inoculação com diferentes concentrações de preparações bacterianas (amostras "não replicantes") e incubação sob condições adequadas (atmosfera aeróbica e/ou anaeróbica durante ao menos 24 horas).

[039] É preferencial que ao menos parte da B. longum CNCM I- 2618, B. lactis CNCM I-3446 e (quando presente) B. longum ATCC BAA-999, estejam vivas na combinação ou composição e, de prefe- rência, cheguem vivas ao intestino. Dessa forma, elas podem persistir no intestino, ser metabolicamente ativas e podem aumentar sua eficá- cia. Eles podem também ser eficazes pela interação com bactérias comensais e/ou com o hospedeiro. Para produtos alimentícios ou me- dicamentos estéreis especiais, por exemplo, pode ser preferencial que a b. longum CNCM I-2618, b. lactis CNCM I-3446 e (quando presente) a b. longum ATCC BAA-999 estejam presentes em uma forma não re- plicante na combinação ou composição. Portanto, em uma modalidade da presente invenção, ao menos uma parte da B. longum CNCM I- 2618, B. lactis CNCM I-3446 e (quando presente) da B. longum ATCC BAA-999, é não replicante na combinação ou composição.

[040] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos para uso na redução de inflamação gas-

trointestinal ou no tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointesti- nais relacionados à inflamação, sendo que a combinação de probióti- cos compreende Bifidobacterium longum CNCM I-2618 e Bifidobacte- rium lactis CNCM I-3446. Opcionalmente, a combinação de probióticos pode compreender adicionalmente Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.

[041] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende, opcionalmente, adi- cionalmente, B. longum ATCC BAA-999, para diminuir ou suprimir a produção ou expressão de uma citocina pró-inflamatória (de preferên- cia IL-12) e/ou aumentar a produção ou expressão de uma citocina anti-inflamatória (de preferência IL-10) ou para regular as razões de concentração sérica de IL-10 e IL-12.

[042] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adi- cionalmente B. longum ATCC BAA-999, para modular células regula- doras T ou diferenciação de Th17/Treg; ou para modular um inibidor de sinalização do quorum sensing.

[043] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adi- cionalmente B. longum ATCC BAA-999, para aumentar a população de bactérias benéficas, como bifidobactérias e lactobacilos, no trato gastrointestinal.

[044] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adi- cionalmente B. longum ATCC BAA-999, para promover a produção ou expressão de defensinas ou mucinas; para reduzir o estresse oxidativo ou marcadores inflamatórios como a proteína C-reativa.

[045] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adi- cionalmente B. longum ATCC BAA-999, para promover a função me- tabólica da microbiota, incluindo, mas não se limitando a, ácidos gra- xos de cadeia curta, como butirato.

[046] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende, opcionalmente, adi- cionalmente, B. longum ATCC BAA-999, para apoiar ou promover a cura do tecido mucoso.

[047] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adi- cionalmente B. longum ATCC BAA-999, para reforçar ou melhorar a barreira intestinal.

[048] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adicional- mente B. longum ATCC BAA-999, para melhorar o reparo da barreira intestinal.

[049] A permeabilidade da barreira intestinal melhorada resulta em no reparo melhorado da barreira, o que leva a uma barreira intesti- nal melhorada ou reforçada. Dessa forma, em uma modalidade, a dita melhora da barreira intestinal é uma melhora na permeabilidade da barreira (como a redução na permeabilidade da barreira intestinal).

[050] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adicional- mente B. longum ATCC BAA-999, para melhorar a função da barreira intestinal.

[051] A permeabilidade da barreira intestinal melhorada resulta em função melhorada de barreira, o que leva a uma barreira intestinal melhorada ou reforçada. Dessa forma, em uma modalidade, a dita me- lhora da barreira intestinal é uma melhora na permeabilidade da barrei- ra (como a redução na permeabilidade da barreira intestinal).

[052] Em uma modalidade, a barreira intestinal melhorada resulta em redução de patógenos, alérgenos e/ou compostos tóxicos que mi- gram do intestino para o corpo através da barreira intestinal.

[053] A combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende, opcional- mente, adicionalmente, B. longum ATCC BAA-999 é, de preferência, para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação. O distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é, de preferência, um distúrbio modulado por citocinas pró- inflamatórias (de preferência IL-12) e/ou citocinas anti-inflamatórias (de preferência IL-10). De preferência, o distúrbio gastrointestinal relacio- nado à inflamação é um distúrbio modulado por IL-10 e/ou IL-12; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é mo- dulado por células T reguladoras ou diferenciação de Th17/Treg; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é mo- dulado por um inibidor de sinalização de quorum sensing.

[054] Em qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção, o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é modulado por um desequilíbrio de bactérias benéficas, como bifidobactérias e lacto- bacilos; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à infla- mação é modulado por defensinas ou mucinas, ou sendo que o distúr- bio gastrointestinal relacionado à inflamação é modulado por estresse oxidativo ou marcadores inflamatórios, como a proteína C-reativa.

[055] A presente invenção fornece adicionalmente uma combina- ção de probióticos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lac- tis CNCM I-3446, e que compreende, opcionalmente adicionalmente, B. longum ATCC BAA-999, para o tratamento ou prevenção de doença inflamatória intestinal, particularmente sendo que a doença inflamató- ria intestinal é selecionada do grupo que consiste em: colite, colite ul- cerativa, enteropatia crônica, doença de Crohn e bursite; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é doença diarreica responsiva a alimentos.

[056] De preferência, a combinação de probióticos de qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção é para ser usada no tra- tamento ou prevenção de colite ulcerativa, doença de Crohn ou diar- reia responsiva a alimentos.

[057] De preferência, o tratamento ou a prevenção de um distúr- bio gastrointestinal relacionado à inflamação com o uso da combina- ção de probióticos da invenção compreende aumentar a produção ou a expressão de uma citocina anti-inflamatória (de preferência IL-10), e/ou compreende diminuir ou suprimir a produção ou a expressão de uma citocina pró-inflamatória (de preferência IL-12). Com mais prefe- rência, o tratamento ou a prevenção de um distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação com o uso da combinação de probióticos da presente invenção compreende regular as razões de concentração sé- rica de IL-10 e de IL-12.

[058] O indivíduo a ser tratado é, de preferência, um mamífero, de preferência, um ser humano ou um animal de companhia (animal de estimação), de preferência, sendo que o indivíduo é uma criança, um bebê, um adolescente ou um ser humano adulto, um cão, um filho- te de cachorro, um gato ou um filhote de gato.

[059] Dessa forma, a presente invenção fornece adicionalmente uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I- 2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende, opcionalmente adi- cionalmente, B. longum ATCC BAA-999 para o tratamento de doença inflamatória intestinal felina ou canina, de preferência, doença diarreica responsiva a alimentos ou doença inflamatória intestinal idiopática feli- na ou canina. A combinação de probióticos está, de preferência, sob a forma de uma composição, com mais preferência um alimento para animais de estimação (particularmente um alimento seco para animais de estimação) ou um suplemento nutricional ou uma composição vete- rinária para animais de estimação (particularmente um comprimido, uma cápsula ou um pó seco).

[060] Em uma outra modalidade, o indivíduo a ser tratado é um cão, filhote de cachorro, gato ou filhote de gato. Dessa forma, a pre- sente invenção fornece adicionalmente uma combinação de probióti- cos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I- 3446, e que compreende, opcionalmente adicionalmente, B. longum ATCC BAA-999 para o tratamento de doença inflamatória intestinal felina ou canina, de preferência, doença diarreica responsiva a alimen- tos ou doença inflamatória intestinal idiopática felina ou canina. A combinação de probióticos está, de preferência, sob a forma de uma composição, com mais preferência, de um alimento para animais de estimação, um suplemento nutricional para animais de estimação ou uma composição veterinária.

[061] Em ainda uma outra modalidade, o indivíduo a ser tratado é uma criança, um bebê, um adolescente ou um ser humano adulto. Dessa forma, a presente invenção fornece adicionalmente uma combi- nação de probióticos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente adicionalmente B. longum ATCC BAA-999 para o tratamento de doença inflamatória intestinal nesses indivíduos. A combinação de probióticos está, de pre-

ferência, sob a forma de uma composição, com mais preferência um alimento, um suplemento nutricional ou uma composição farmacêutica (particularmente um comprimido, uma cápsula, grânulos ou um pó se- co).

[062] Em qualquer modalidade da presente invenção, a combina- ção de probióticos contém B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446 como a única bactéria probiótica. A combinação de probióticos está, de preferência, sob a forma de uma composição, com mais pre- ferência, de um alimento, um suplemento nutricional ou uma composi- ção farmacêutica ou veterinária.

[063] Em qualquer modalidade da presente invenção, a combina- ção de probióticos compreende B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999. Alternativamente, a com- binação de probióticos, de acordo com qualquer modalidade da pre- sente invenção, pode compreender B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 como a única bactéria pro- biótica. A combinação de probióticos está, de preferência, sob a forma de uma composição, com mais preferência, de um alimento, um su- plemento nutricional ou uma composição farmacêutica ou veterinária.

[064] A combinação de probióticos pode estar sob a forma de uma composição, conforme descrito em qualquer modalidade, sendo que a composição contém B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446as, como a única bactéria probiótica. A composição probiótica está, de preferência, sob a forma de um alimento, um suplemento nu- tricional ou uma composição farmacêutica ou veterinária.

[065] A combinação de probióticos pode estar sob a forma de uma composição, conforme descrito em qualquer modalidade, sendo que a composição compreende B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999. Alternativamente, a com- binação de probióticos pode estar sob a forma de uma composição,

conforme descrito em qualquer modalidade, sendo que a composição contém B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 como a única bactéria probiótica. A composição pro- biótica está, de preferência, sob a forma de um alimento, um suple- mento nutricional ou uma composição farmacêutica ou veterinária.

[066] Qualquer dose adequada da combinação de probióticos pode ser usada. De preferência, em qualquer modalidade da invenção, a combinação de probióticos compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e, opcionalmente, compreende adicionalmente B. longum ATCC BAA-999, sendo que cada probiótico é administrado a um indivíduo em uma quantidade equivalente a 108 a 1012 UFC por dia.

[067] Embora os componentes probióticos da combinação pos- sam ser usados sem processamento adicional, a combinação de pro- bióticos de acordo com qualquer modalidade da invenção é, de prefe- rência, administrada sob a forma de uma composição. Composições adequadas compreendem B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I- 3446 e, opcionalmente, compreendem adicionalmente B. longum ATCC BAA-999 sob a forma de uma formulação farmacêutica ou vete- rinária que compreende um ou mais excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico ou veterinário, uma formulação nutricional (por exemplo, incluindo um suplemento nutricional), uma formulação para alimentação por tubo, um suplemento dietético, um alimento funcional, um produto de bebida e um produto para cuidados de animais de es- timação (por exemplo, um alimento para animais de estimação, ou um suplemento nutricional para animais de estimação).

[068] A formulação farmacêutica ou veterinária está/pode estar, de preferência, sob a forma de um comprimido, uma cápsula, grânulos ou um pó.

[069] De acordo com qualquer modalidade da presente invenção,

a composição pode compreender uma quantidade equivalente a 108 a 1012 UFC por dia, como uma dose única ou como múltiplas doses.

[070] Também é fornecida uma combinação de probióticos que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende, opcionalmente adicionalmente, B. longum ATCC BAA- 999, para uso na produção de uma composição para uso na redução de inflamação gastrointestinal, ou para o tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação.

[071] A invenção fornece adicionalmente um método para reduzir a inflamação gastrointestinal, ou para tratar ou prevenir a doença in- flamatória intestinal em um indivíduo, que compreende a etapa de ad- ministrar ao dito indivíduo uma combinação de probióticos, sendo que a combinação de probióticos compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446 e, opcionalmente compreende adicionalmente B. longum ATCC BAA-999.

[072] A combinação de probióticos da presente invenção que compreende B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, e que compreende opcionalmente, adicionalmente B. longum ATCC BAA- 999, pode ser fornecida para administração simultânea ou sequencial de cada um dos probióticos. Alternativamente, a combinação de pro- bióticos pode ser formulada como uma única composição.

[073] A combinação de probióticos que compreende Bifidobacte- rium longum CNCM I-2618 e Bifidobacterium lactis CNCM I-2446 e que compreende opcionalmente, adicionalmente B. longum ATCC BAA-999, pode ser administrada como uma composição (por exemplo, uma cápsula, um comprimido, grânulos ou um pó) contendo, por exemplo, 108 a 1012 unidades formadoras de colônia (UFC) de cada componente probiótico, ou pode ser incorporada em uma composição nutricional, como uma fórmula nutricional completa (por exemplo, uma fórmula para bebês ou um produto de nutrição clínica), um produto lác-

teo, um pó para preparação de bebidas, uma sopa desidratada, um suplemento dietético, um substituto de refeição, uma barra nutricional, um cereal, um produto de confeitaria ou um alimento seco para ani- mais de estimação.

[074] Em uma modalidade, a combinação pode estar sob a forma de uma cápsula única que compreende tanto B. longum CNCM I-2618 quanto B. lactis CNCM I-2446, ou uma cápsula única que compreende B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-2446 e B. longum ATCC BAA-999.

[075] Alternativamente, a combinação pode ser fornecida como cápsulas separadas, que compreendem B. longum CNCM I-2618 em uma cápsula e B. lactis CNCM I-2446 em uma outra cápsula, para administração simultânea ou sequencial; ou a combinação pode ser fornecida como cápsulas separadas que compreendem B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-2446 e B. longum ATCC BAA-999 como cápsulas separadas para administração simultânea ou sequen- cial.

[076] Quando incorporados em uma composição nutricional, a B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446 e, opcionalmente, B. longum ATCC BAA-999 podem, cada uma, estar presentes na compo- sição em uma quantidade equivalente a entre 104 e 1012 UFC/g (peso seco). Essas expressões de quantidade incluem as possibilidades de que as bactérias estejam vivas, inativadas ou mortas ou ainda presen- tes como fragmentos, como materiais de DNA ou de parede celular ou como metabólitos. Em outras palavras, as quantidades de bactérias são expressas em termos da capacidade de formação de colônias dessa quantidade de bactérias como se todas as bactérias estivessem vivas independentemente de elas estarem, de fato, vivas, inativadas ou mortas, fragmentadas ou como uma mistura de qualquer um ou de todos esses estados. De preferência, cada uma dentre a B. longum

CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 (quando presente) está presente em uma quantidade equivalente entre 105 e 1010, com mais preferência, entre 107 e 1010 UFC/g de composi- ção seca.

[077] Em modalidades da presente invenção em que a combina- ção de probióticos compreende adicionalmente B. longum ATCC BAA- 999, a B. longum ATCC BAA-999 pode estar presente na mesma composição ou em uma composição separada para administração si- multânea ou sequencial. Por exemplo, nas cápsulas descritas acima, a B. longum ATCC BAA-999 pode ser encerrada em cápsulas com a B. longum CNCM I-2618 e a B. lactis CNCM I-3446, sendo que cada cáp- sula contém entre 108 a 1012 unidades formadoras de colônias (UFC). De modo semelhante, a composição que compreende B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 po- de ser incorporada em uma composição nutricional como uma fórmula nutricional completa (por exemplo, uma fórmula para bebês ou um produto de nutrição clínica), um produto lácteo, um pó para preparação de bebidas, uma sopa desidratada, um suplemento dietético, um subs- tituto de refeição, uma barra nutricional, um cereal, um produto de con- feitaria ou um alimento seco para animais de estimação.

[078] B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446 podem ser, cada uma, cultivadas de acordo com qualquer método adequado e preparadas para encapsulação ou adição a uma composição nutricio- nal por liofilização ou secagem por atomização, por exemplo. Alternati- vamente, elas podem ser adquiridas já preparadas em uma forma adequada para adição a produtos alimentícios.

[079] A ATCC BAA-999 está disponível comercialmente e pode ser obtida junto à Morinaga Milk Industry Co. Ltd. do Japão sob a mar- ca comercial BB536. Podem ser cultivadas de acordo com qualquer método adequado e preparadas para encapsulação ou adição a uma composição nutricional por liofilização ou secagem por atomização, por exemplo. Alternativamente, pode ser adquirida já preparada em uma forma adequada para adição a produtos alimentícios.

[080] Uma fórmula nutricional completa para uso na presente in- venção pode compreender uma fonte de proteína, de preferência, uma proteína dietária como uma proteína animal (por exemplo, leite, carne ou proteína de ovo), uma proteína vegetal (por exemplo, proteína de soja, trigo, arroz ou ervilha); misturas de aminoácidos livres; ou combi- nações dos mesmos. São particularmente preferenciais as proteínas do leite, como a caseína e a proteína de soro de leite e as proteínas de soja. A composição pode conter também uma fonte de carboidratos e uma fonte de gordura.

[081] Se a fórmula incluir uma fonte de gordura, a gordura forne- ce, de preferência, de 5% a 55% da energia da fórmula; por exemplo, de 20% a 50% da energia. Os lipídios que compõem a fonte de gordu- ra podem ser qualquer gordura ou mistura de gorduras adequada. Gorduras vegetais como óleo de soja, óleo de babaçu, óleo de coco, óleo de cártamo, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de canola e leci- tinas são particularmente adequadas. Também podem ser adicionadas se desejado, gorduras de origem animal, como gordura de leite.

[082] Se a fórmula incluir uma fonte de carboidrato, esta fornece, de preferência, de 40% a 80% da energia da fórmula. Qualquer car- boidrato adequado pode ser utilizado, por exemplo, sacarose, lactose, glicose, frutose, sólidos de xarope de milho, maltodextrina ou uma mis- tura dos mesmos. Fibras dietárias podem também ser adicionadas, se for desejado. A fibra dietária pode ser de qualquer origem adequada incluindo, por exemplo, soja, ervilha, aveia, pectina, goma guar, goma arábica, fruto-oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, sialil-lactose e oligossacarídeos derivados de leites de origem animal. Vitaminas e minerais adequados podem ser incluídos na fórmula nutricional em uma quantidade que satisfaça as diretrizes adequadas.

[083] As composições da presente invenção podem adicional- mente incluir um prebiótico. Prebióticos são, geralmente, não digestí- veis no sentido de que eles não são decompostos e absorvidos no es- tômago ou intestino delgado e permanecem, portanto, intactos quando passam para o cólon onde eles são seletivamente fermentados pelas bactérias benéficas. Exemplos de prebióticos incluem certos oligossa- carídeos, como fruto-oligossacarídeos (FOS), inulina, xilo- oligossacarídeos (XOS), polidextrose ou qualquer mistura dos mes- mos. Em uma modalidade específica, os prebióticos podem ser fruto- oligossacarídeos e/ou inulina. Um exemplo é uma combinação de 70% de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta e 30% de inulina, que é re- gistrada pela Nestlé sob a marca registrada "Prebio 1".

[084] Um ou mais emulsificantes de grau alimentício podem ser incluídos na fórmula nutricional se for desejado; por exemplo, ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicerídeos e diglicerídeos, lecitina e monoglicerídeos ou diglicerídeos. De modo similar, podem ser incluí- dos sais e estabilizantes adequados.

[085] A fórmula nutricional completa pode ser preparada de qual- quer maneira adequada. Por exemplo, a fonte de proteína, a fonte de carboidrato e a fonte de gordura podem ser misturadas em proporções adequadas. Se usados, os emulsificantes podem ser incluídos na mis- tura. As vitaminas e os minerais podem ser adicionados neste ponto, mas em geral são adicionados posteriormente para evitar degradação térmica. Quaisquer vitaminas e emulsificantes lipofílicos, e similares, podem ser dissolvidos na fonte de gordura antes da mistura. Água, de preferência, água que foi submetida à osmose reversa, pode, então, ser misturada para formar uma mistura líquida.

[086] A mistura líquida pode, então, ser tratada termicamente pa- ra reduzir a carga bacteriana. Por exemplo, a mistura líquida pode ser rapidamente aquecida para uma temperatura na faixa de cerca de 80°C a cerca de 110°C por cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos. Isso pode ser executado por injeção de vapor ou por trocador de calor; por exemplo, um trocador de calor de placas.

[087] A mistura líquida pode, então, ser resfriada a uma tempera- tura na faixa de cerca de 60°C até cerca de 85°C; por exemplo, por resfriamento rápido. A mistura líquida pode, então, ser homogeneiza- da; por exemplo, em dois estágios, de cerca de 10 MPa a cerca de 30 MPa no primeiro estágio e cerca de 2 MPa a cerca de 10 MPa no se- gundo estágio. A mistura homogeneizada pode, então, ser resfriada adicionalmente para a adição de quaisquer componentes sensíveis ao calor; como vitaminas e minerais. O pH e o teor de sólidos da mistura homogeneizada são convenientemente padronizados nesse ponto.

[088] A mistura homogeneizada pode, então, ser transferida para um aparelho de secagem adequado, como um secador por atomiza- ção ou secador por congelamento, e convertida em pó. O pó dever ter um teor de umidade menor que cerca 5% em peso. A B. longum CNCM I-2618 e/ou a B. lactis CNCM I-3446 e/ou a B. Longum ATCC BAA-999 podem ser adicionadas ao pó na quantidade desejada por misturação a seco.

[089] Um alimento seco para animais de estimação para uso na presente invenção pode incluir qualquer um ou mais dentre uma fonte de carboidrato, uma fonte de proteína e uma fonte de lipídio.

[090] Pode-se usar qualquer fonte de carboidrato adequada. De preferência, a fonte de carboidrato é fornecida sob a forma de grãos, farinhas ou amidos. Por exemplo, a fonte de carboidrato pode ser ar- roz, cevada, sorgo, painço, aveia, farelo de milho ou farinha de trigo. Açúcares simples como sacarose, glicose e xaropes de milho também podem ser usados. A quantidade de carboidrato fornecida pela fonte de carboidrato pode ser selecionada conforme desejado. Por exemplo,

o alimento para animais de estimação pode conter até cerca de 60%, em peso, de carboidrato.

[091] Fontes de proteína adequadas podem ser selecionadas dentre qualquer fonte de proteína animal ou vegetal adequada; por exemplo, carne muscular ou esquelética, farinha de carne e ossos, fa- rinha de aves, farinha de peixe, proteínas do leite, glúten de milho, glú- ten de trigo, farinha de soja, concentrados de proteína de soja, isola- dos de proteína de soja, proteínas de ovo, soro de leite, caseína, glú- ten e similares. Para animais idosos, é preferencial que a fonte de pro- teína contenha uma proteína animal de alta qualidade. A quantidade de proteína fornecida pela fonte de proteína pode ser selecionada con- forme desejado. Por exemplo, o alimento para animais de estimação pode conter cerca de 12% a cerca de 70%, em peso, de proteína em uma base seca.

[092] O alimento para animais de estimação pode conter uma fonte de gordura. Pode-se usar qualquer fonte de gordura adequada. De preferência, a fonte de gordura é uma fonte de gordura de origem animal, como sebo. Podem ser usados óleos vegetais, como óleo de milho, óleo de girassol, óleo de cártamo, óleo de semente de colza, óleo de soja, óleo de oliva e outros óleos ricos em ácidos graxos mo- noinsaturados e poli-insaturados. Além dos ácidos graxos essenciais (ácido linoleico e ácido alfa-linolênico), a fonte de gordura pode incluir ácidos graxos de cadeia longa. Os ácidos graxos de cadeia longa adequados incluem ácido gama-linolênico, ácido estearidônico, ácido araquidônico, ácido eicosapentanoico e ácido docosaexanoico. Óleos de peixe são uma fonte adequada de ácidos eicosapentanoicos e áci- do docosaexanoico. Óleo de borragem, óleo de semente de groselha negra e óleo de prímula da noite são fontes adequadas de ácido ga- ma-linolênico. Óleo de semente de colza, óleo de soja, óleo de linhaça e óleo de noz são fontes adequadas de ácido alfa-linolênico. Óleo de cártamo, óleo de girassol, óleo de milho e óleo de soja são fontes ade- quadas de ácido linoleico. Óleo de oliva, óleo de semente de colza (canola), óleo de girassol com alto teor oleico, óleo de cártamo, óleo de amendoim e óleo de farelo de arroz são fontes adequadas de áci- dos graxos monoinsaturados. A quantidade de gordura fornecida pela fonte de gordura pode ser selecionada, conforme desejado. Por exem- plo, o alimento para animais de estimação pode conter cerca de 5% a cerca de 40%, em peso, de gordura em uma base seca. De preferên- cia, o alimento para animais de estimação tem uma quantidade relati- vamente reduzida de gordura.

[093] A escolha das fontes de carboidrato, proteína e lipídio não é de importância crítica e será selecionada com base nas necessidades nutricionais do animal, considerações de palatabilidade e no tipo de produto produzido. Adicionalmente, vários outros ingredientes, por exemplo, açúcar, sal, especiarias, temperos, vitaminas, minerais, agentes flavorizantes, gomas e micro-organismos probióticos podem também ser incorporados ao alimento para animais de estimação, con- forme desejado.

[094] Para animais de estimação idosos, o alimento para animais de estimação contém, de preferência, proporcionalmente menos gor- dura que os alimentos para animais de estimação mais jovens. Adicio- nalmente, as fontes de amido podem incluir um ou mais dentre aveia, arroz, cevada, trigo e milho.

[095] O alimento para animais de estimação pode ser produzido por cozimento por extrusão, embora o assamento e outros processos adequados possam ser usados. Quando cozido por extrusão, o ali- mento para animais de estimação é, de modo geral, fornecido sob a forma de um pélete de ração. Os componentes probióticos podem, de preferência, ser aplicados como revestimento sobre ou colocados no alimento seco para animais de estimação. Um processo adequado é descrito no pedido de patente europeia n° 0862863.

[096] A combinação de probióticos da presente invenção, e as composições da mesma, podem ser usadas para tratar ou controlar inflamação intestinal crônica ou aguda causada por uma doença do trato gastrointestinal, como doença inflamatória intestinal ou colite, in- flamação pós-infecciosa ou inflamação subclínica crônica nos idosos, bem como em circunstâncias em que se deseja evitar inflamação no sentido de profilaxia em indivíduos suscetíveis a tais distúrbios.

[097] Tipicamente, a composição pode ser selecionada do grupo que consiste em uma composição alimentícia, uma composição ali- mentícia para animais de estimação, um suplemento dietético, um nu- tracêutico, uma fórmula nutricional, uma bebida e/ou uma composição clínica.

[098] Exemplos de composições alimentícias que são aplicáveis à presente invenção são iogurtes, leite, leite aromatizado, sorvete, so- bremesas prontas para o consumo, pós para reconstituição, por exemplo, com leite ou água, bebidas de leite e chocolate, bebidas de malte, pratos prontos para o consumo, pratos ou bebidas instantâneas para seres humanos ou composições alimentícias que representam uma dieta completa ou parcial destinada a animais de estimação ou gado. Consequentemente, em uma modalidade, a composição de acordo com a presente invenção é um produto alimentício destinado a seres humanos, animais de estimação ou gado e, de preferência, se- res humanos e animais de estimação. Em uma modalidade preferenci- al, a composição é um produto alimentício ou um suplemento dietético destinado a seres humanos (bebês, crianças, adolescentes ou adultos) ou animais de companhia (animais de estimação) (de preferência cães, filhotes de cachorro, gatos ou filhotes de gato).

[099] A composição da presente invenção pode conter adicional- mente hidrocoloides protetores (como gomas, proteínas, amidos modifi-

cados), ligantes, agentes formadores de filme, agente(s)/material(ais) de encapsulação, materiais de parede/invólucro, compostos de matriz, re- vestimentos, emulsificantes, agentes tensoativos, agentes solubilizantes (óleos, gorduras, ceras, lecitinas etc.), adsorventes, carreadores, cargas, cocompostos, agentes dispersantes, agentes umectantes, auxiliares de processamento (solventes), agentes de fluxo, agentes de mascaramento de sabor, agentes de peso, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes e antimicrobianos. A composição pode conter também aditivos farmacêuticos convencionais e compostos auxiliares, excipientes e diluentes, incluindo, mas não se limitando a, água, gelatina de qualquer origem, gomas vegetais, lignina-sulfonato, talco, açúcares, amido, goma arábica, óleos vegetais, polialquileno glicóis, agentes flavorizantes, con- servantes, estabilizantes, agentes emulsificantes, tampões, lubrificantes, corantes, agentes umectantes, cargas e similares. Em todos os casos, tais componentes serão selecionados levando-se em consideração a sua adequação ao receptor pretendido.

[0100] A composição pode ser uma fórmula nutricional completa. A composição de acordo com a invenção pode compreender uma fonte de proteína.

[0101] Qualquer proteína dietária adequada pode ser usada, por exemplo, proteínas animais (como proteínas do leite, proteínas da car- ne e proteínas do ovo); proteínas vegetais (como proteína de soja, pro- teína de trigo, proteína de arroz e proteína de ervilha); misturas de aminoácidos livres; ou combinações dos mesmos.

[0102] As proteínas podem ser intactas ou hidrolisadas, ou podem ser uma mistura de proteínas intactas ou hidrolisadas. Pode ser dese- jável suplementar com proteínas parcialmente hidrolisadas (grau de hidrólise entre 2 e 20%), por exemplo, para pacientes humanos e/ou animais com risco de desenvolver alergia ao leite de vaca.

[0103] Além disso, fontes de proteína pré-hidrolisada são, de mo-

do geral, digeridas e absorvidas com mais facilidade por um trato gas- trointestinal prejudicado.

[0104] Se houver necessidade de proteínas hidrolisadas, o pro- cesso de hidrólise pode ser executado conforme desejado e conforme é conhecido na técnica. Pode ser desejável fornecer proteínas parci- almente hidrolisadas (grau de hidrólise entre 2 e 20%).

[0105] Por exemplo, um hidrolisado de proteína de soro de leite pode ser preparado por hidrólise enzimática da fração de soro de leite em uma ou mais etapas. Descobriu-se que, no caso da fração de soro de leite usada como o material de partida ser substancialmente isenta de lactose, a proteína sofre menor bloqueio de lisina durante o proces- so de hidrólise. Isso possibilita que a extensão do bloqueio de lisina seja reduzida de cerca de 15%, em peso, do total de lisina para menos de cerca de 10%, em peso, de lisina; por exemplo, cerca de 7%, em peso de lisina, o que melhora muito a qualidade nutricional da fonte de proteína.

[0106] A composição pode conter também uma fonte de carboidra- tos e uma fonte de gordura. Se a composição incluir uma fonte de gor- dura, a fonte de gordura fornece, de preferência, de 5% a 40% da energia da composição; por exemplo, de 20% a 30% da energia. Um perfil de gordura adequado pode ser obtido usando-se uma mistura de óleo de canola, óleo de milho e óleo de girassol com alto teor de ácido oleico.

[0107] Uma fonte adicional de carboidrato pode ser acrescentada à composição.

[0108] A fonte de carboidratos fornece, de preferência, de 40% a 80% da energia da composição. Qualquer carboidrato adequado pode ser utilizado, por exemplo, sacarose, lactose, glicose, frutose, sólidos de xarope de milho, maltodextrina ou uma mistura dos mesmos. Fibras dietárias podem também ser adicionadas, se for desejado. A fibra die-

tária passa através do intestino delgado sem ser digerida por enzimas, e funciona como um agente avolumador e laxativo natural. A fibra die- tária pode ser solúvel ou insolúvel e, em geral, é preferencial uma mis- tura dos dois tipos. As fontes adequadas de fibras dietárias incluem soja, ervilha, aveia, pectina, goma guar, goma guar parcialmente hidro- lisada, goma arábica, fruto-oligossacarídeos, oligossacarídeos ácidos, galacto-oligossacarídeos, sialil-lactose e oligossacarídeos derivados de leites de origem animal. Uma mistura preferencial de fibras é uma mistura de inulina com fruto-oligossacarídeos de cadeia curta. De pre- ferência, se fibra estiver presente, o teor de fibra se situa entre 2 e 40 g/l da composição quando consumida, com mais preferência, entre 4 e 10 g/l.

[0109] A composição pode também compreender minerais e mi- cronutrientes, como elementos-traço e vitaminas, de acordo com as recomendações de órgãos governamentais como o USRDA. Por exemplo, a composição pode conter, por dose diária, um ou mais dos seguintes micronutrientes nas faixas mostradas: 300 a 500 mg de cál- cio, 50 a 100 mg de magnésio, 150 a 250 mg de fósforo, 5 a 20 mg de ferro, 1 a 7 mg de zinco, 0,1 a 0,3 mg de cobre, 50 a 200 µg de iodo, 5 a 15 µg de selênio, 1.000 a 3.000 µg de betacaroteno, 10 a 80 mg de vitamina C, 1 a 2 mg de vitamina B1, 0,5 a 1,5 mg de vitamina B6, 0,5 a 2 mg de vitamina B2, 5 a 18 mg de niacina, 0,5 a 2,0 µg de vitamina B12, 100 a 800 µg de ácido fólico, 30 a 70 µg de biotina, 1 a 5 µg de vitamina D, 3 a 10 µg de vitamina E.

[0110] Um ou mais emulsificantes de grau alimentício podem ser incluídos na composição se for desejado; por exemplo, ésteres de áci- do diacetiltartárico de monoglicerídeos e diglicerídeos, lecitina e mo- noglicerídeos ou diglicerídeos. De modo similar, podem ser incluídos sais e estabilizantes adequados.

[0111] A composição pode ser administrada por via oral e/ou ente-

ral; por exemplo, na forma de um pó para reconstituição com leite ou água.

[0112] As composições são administradas em uma quantidade su- ficiente para tratar ao menos parcialmente ou interromper os sintomas da doença gastrointestinal relacionada à inflamação e suas complica- ções. Uma quantidade adequada para tanto é definida como "uma do- se terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para esse propósito dependerão de vários fatores conhecidos pelos versados na técnica, como a gravidade da doença e o peso e o estado geral do paciente.

[0113] Em aplicações profiláticas, as composições de acordo com a invenção são administradas a um paciente suscetível a, ou de outro modo em risco de, ter uma doença, em particular, em uma quantidade que é suficiente para reduzir ao menos parcialmente o risco de desen- volver uma doença. Uma tal quantidade é definida como sendo "uma dose profilática eficaz". Novamente, as quantidades precisas depen- dem de vários fatores específicos do paciente como seu estado de sa- úde e peso.

[0114] De modo geral, a B. longum CNCM I-2618, a B. lactis CNCM I-3446 e (quando presente) a B. longum ATCC BAA-999, se- rão, cada uma, administradas em uma dose terapeuticamente eficaz e/ou em uma dose profilática eficaz.

[0115] Se a B. longum CNCM I-2618, a B. lactis CNCM I-3446 e (quando presente) a B. longum ATCC BAA-999 estiverem presentes em uma forma viável, ela é teoricamente eficaz em qualquer concen- tração considerando o fato de que essas bactérias podem colonizar o intestino e se multiplicar. Para as composições da presente invenção, é, de modo geral, preferencial que uma dose diária da composição compreenda entre 104 e 1012 UFC de cada um dos agentes probióti- cos. Uma dose diária adequada específica de cada um dos probióticos é de 108 a 1012 UFC.

[0116] No caso de B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 inativada e/ou não replicante, e (quando presente) B. longum ATCC BAA-999, é, de modo geral, preferencial que a composição da presen- te invenção compreenda entre 102 e 1012 células não replicantes de Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, por grama do peso seco da composição. Uma dose adequada específica de cada um dos probióti- cos é de 103 a 1012 células não replicantes, com mais preferência de 105 a 108 células não replicantes por grama do peso seco da composi- ção.

[0117] Obviamente, micro-organismos não replicantes não formam colônias, consequentemente, o termo "células" deve ser compreendido como a quantidade de micro-organismos não replicantes que é obtida a partir da quantidade especificada de células bacterianas replicantes. Isso inclui micro-organismos que estão inativados, não viáveis ou mor- tos ou presentes na forma de fragmentos, como materiais de DNA ou de parede celular.

[0118] A composição da presente invenção pode ser fornecida na forma de pó, tendo uma atividade de água menor que 0,2, por exem- plo, na faixa de 0,19 a 0,05, de preferência menor que 0,15.

[0119] A composição pode ser um pó estável durante o armaze- namento. A baixa atividade de água fornece essa estabilidade durante o armazenamento e garante que os microorganismos probióticos per- manecerão viáveis mesmo após longos períodos de armazenamento.

[0120] A atividade de água ou w é uma medida do estado de ener- gia da água em um sistema. É definida como a pressão de vapor da água dividida pela pressão de vapor da água pura na mesma tempera- tura; portanto, a água destilada pura tem uma atividade de água de exatamente um.

[0121] Adicional ou alternativamente, o micro-organismo probiótico B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e (quando presente)

B. longum ATCC BAA-999 pode ser fornecido em uma forma encapsu- lada.

[0122] Descobriu-se que a encapsulação das bactérias tem vanta- gens técnicas e terapêuticas. A encapsulação aumenta a sobrevivên- cia das bactérias e, assim, o número de bactérias vivas que chegam ao intestino. Além disso, as bactérias são gradualmente liberadas, permitindo uma ação prolongada das mesmas sobre a saúde do indi- víduo. As bactérias podem ser microencapsuladas, por exemplo, con- forme descrito pela patente n° FR2443247 (Société des Produits Nes- tlé), no presente documento incorporada a título de referência. Resu- mindo, as bactérias podem ser secas por congelamento ou por atomi- zação e incorporadas em um gel.

[0123] A invenção será agora adicionalmente descrita com refe- rência ao exemplo a seguir. Exemplo

[0124] Preparação de bactérias:

[0125] No dia precedente ao ensaio, três cepas bacterianas sele- cionadas da coleta de culturas Nestlé NCC 3001, 2818 e 2705 foram cultivadas em 10 ml de MRS + cisteína e cultivadas durante 16 horas a 37 °C em condições anaeróbicas.

[0126] As culturas bacterianas foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 min (temperatura ambiente). Os péletes bacterianos foram ressus- pensos em solução salina tamponada com fosfato fria (PBS) (10 mL). A densidade óptica de cada cultura bacteriana foi medida a 600 nm. Preparações bacterianas ajustadas em meio de cultura RPMI foram adaptadas para ter 5 x 106 UFC/ml e 1 x 107 UFC/ml, de acordo com o pré-teste de contagem da unidade formadora de colônias bacterianas em meio de ágar seletivo que validou a correspondência entre OD e CFU.

[0127] Preparação de célula mononuclear de sangue periférico

(CMSP):

[0128] CMSP isoladas de três doadores saudáveis foram lavadas uma vez em PBS. Após centrifugação em 500 g por 5 minutos, o péle- te celular foi ressuspenso em 2 ml de RPMI + 10% de soro fetal de be- zerro (FCS). As células foram contadas e preparações adaptadas para terem 2 x 106 células/mL.

[0129] Estimulação de CMSP com bactérias:

[0130] As CMSPs foram semeadas em placa de cultura de 12 po- ços (500 µL) e, então, preparações bacterianas foram adicionadas (500 µL). As coculturas foram incubadas durante 24 horas a 37°C com 10% de CO2.

[0131] Para as análises de citocina, os sobrenadantes foram cen- trifugados durante 5 minutos em 500 g e transferidos para um novo tubo. As amostras foram armazenadas a -20 °C até a avaliação. As citocinas IL-10 e IL12 foram medidas por ELISA (IL-10 e IL-12 ELISA, R&D Systems, MN, EUA).

[0132] Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2.

[0133] Avaliação de permeabilidade de barreira intestinal

[0134] Células Caco-2 e HT-29-MTX foram cocultivadas em placas de cultura de 12 poços em insertos de filtro de poliestireno a uma ra- zão de 3:1. Após a diferenciação (14 dias), as coculturas foram pré- incubadas com preparações de bactérias (5x106) durante 24 h antes do estímulo basolateral com TNFα (0,6 ng/mL) e IFNγ (2,5 ng/mL) para alterar a integridade de barreira (controle). A resistência elétrica tran- sepitelial (TEER) foi medida após 16 horas para quantificar as altera- ções induzidas por inflamação na permeabilidade de barreira ilustra- das como aumento percentual na TEER em relação aos controles tra- tados com TNFα/IFNγ.

[0135] Os resultados são mostrados na Figura 3.

[0136] Conforme claramente mostrado nas figuras, uma combina-

ção de B. longum CNCM I-2618 e B. lactis de acordo com a presente invenção é surpreendentemente eficaz no aumento da produção da citocina anti-inflamatória IL-10 (Figura 1). A combinação de B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 também suprime de forma sur- preendente a produção de IL-12 em comparação com B. longum CNCM I-2618 e B. lactis CNCM I-3446, quando usada separadamente (Figura 2).

[0137] A Figura 1 demonstra adicionalmente um efeito sinérgico surpreendente sobre o aumento na produção da citocina anti- inflamatória IL-10 quando uma combinação tripla de B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 da inven- ção é usada. A combinação tripla, de acordo com um aspecto da pre- sente invenção, suprime adicionalmente a produção de IL-12 em com- paração com B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999 quando usada separadamente (Figura 2).

[0138] Conforme claramente mostrado na Figura 3 e de acordo com a presente invenção, a B. longum CNCM I-2618 e a B. lactis CNCM I-3446 são surpreendentemente eficazes na prevenção de permeabilidade de barreira induzida por inflamação em comparação com cepas únicas ou combinações de outras cepas. A combinação tripla de B. longum CNCM I-2618, B. lactis CNCM I-3446 e B. longum ATCC BAA-999, de acordo com um aspecto da presente invenção, também mostra a prevenção de ruptura da barreira induzida por infla- mação (Figura 3).

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Combinação de probióticos para uso na redução de in- flamação gastrointestinal ou no tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointestinais relacionados à inflamação, caracterizada por a com- binação probiótica compreender Bifidobacterium longum CNCM I-2618 e Bifidobacterium lactis CNCM I-3446.

2. Combinação de probióticos para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a combinação de probióticos com- preender adicionalmente Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.

3. Combinação de probióticos para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por o distúrbio gastrointestinal rela- cionado à inflamação ser modulado por uma citocina pró-inflamatória e/ou citocina anti-inflamatória, de preferência sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é modulado por IL-10 e/ou IL- 12; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é modulado por células T reguladoras ou diferenciação de Th17/Treg; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é modulado por um inibidor de sinalização de quorum sensing.

4. Combinação de probióticos para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação ser modulado por um dese- quilíbrio de bactérias benéficas, como bifidobactérias e lactobacilos; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é mo- dulado por defensinas ou mucinas, ou sendo que o distúrbio gastroin- testinal relacionado à inflamação é modulado por estresse oxidativo ou marcadores inflamatórios, como a proteína C-reativa.

5. Combinação de probióticos, de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizada por ser usada para diminuir ou suprimir a produção ou a expressão de uma citocina pró-inflamatória; para au- mentar a produção ou a expressão de uma citocina anti-inflamatória,

de preferência sendo que a citocina anti-inflamatória é IL-10 e/ou dimi- nuir ou suprimir a produção ou a expressão de uma citocina pró- inflamatória, de preferência sendo que a citocina pró-inflamatória é IL- 12 e, com mais preferência, para regular as razões de concentração de IL-10 e de IL-12; para aumentar a população de bactérias benéfi- cas, como bifidobactérias e lactobacilos, no trato gastrointestinal; para promover a produção ou expressão de defensinas ou mucinas; para reduzir o estresse oxidativo ou marcadores inflamatórios como CRP; para promover a função metabólica da microbiota, incluindo, mas não se limitando a, ácidos graxos de cadeia curta, como butirato; para apoiar ou promover a cura de tecidos ou para reforçar ou melhorar a barreira intestinal; para melhorar a função e/ou reparo da barreira in- testinal; para melhorar ou reforçar a permeabilidade da barreira intesti- nal; para modular as células T reguladoras ou a diferenciação de Th17/Treg, de preferência para promover a ativação de células T regu- ladoras ou a diferenciação de Th17/Treg; ou para promover inibidores de sinalização de quorum sensing.

6. Combinação de probióticos para uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada por o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação ser uma doença inflamatória intestinal, particularmente sendo que a doença inflamatória intestinal é selecionada do grupo que consiste em: colite, colite ulcerativa, entero- patia crônica, doença de Crohn e bursite; ou sendo que o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação é doença diarreica responsi- va a alimentos.

7. Combinação de probióticos para uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada por o distúrbio gastrointestinal relacionado à inflamação ser colite ulcerativa, doença de Crohn ou diarreia responsiva a alimentos.

8. Composição probiótica para uso, de acordo com qual-

quer das reivindicações precedentes, sendo a composição probiótica caracterizada por aumentar a concentração ou a expressão de uma citocina anti-inflamatória e, com mais preferência, sendo que a citocina anti-inflamatória é IL-10.

9. Combinação de probióticos para uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo indivíduo ser um mamífero, de preferência um ser humano ou um animal de es- timação, de preferência sendo que o indivíduo é um bebê, uma crian- ça, um adolescente ou um ser humano adulto, um cão, um filhote de cachorro, um gato ou um filhote de gato.

10. Combinação de probióticos para uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada por cada pro- biótico na combinação de probióticos ser administrado a um indivíduo em uma quantidade equivalente a 108 a 1012 UFC por dia.

11. Combinação de probióticos para uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, sendo a combinação de probióticos caracterizada por ser administrada sob a forma de uma composição.

12. Combinação de probióticos para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a composição ser selecionada do grupo que consiste em: uma formulação farmacêutica, uma formulação veterinária, uma formulação nutricional, uma formulação de alimenta- ção por tubo, um suplemento dietético, um alimento funcional, um pro- duto de bebida e um produto para cuidados de animais de estimação.

13. Composição compreendendo uma combinação de pro- bióticos, caracterizada por a combinação de probióticos compreender Bifidobacterium longum CNCM I-2618 e Bifidobacterium lactis CNCM I-

3446.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizada por a dita combinação de probióticos compreender adicional-

mente Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, sendo a composição caracterizada por compreender cada probiótico na combinação de probióticos em uma quantidade equivalente a 108 a 1012 UFC por dia.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 13, 14 ou 15, caracterizada por a composição ser selecionada do grupo que consiste em: uma formulação farmacêutica, uma formulação veteriná- ria, uma formulação nutricional, uma formulação de alimentação por tubo, um suplemento dietético, um alimento funcional, um produto de bebida e um produto para cuidados de animais de estimação.

17. Combinação de probióticos para uso na fabricação de uma composição aplicada na redução de inflamação gastrointestinal ou no tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointestinais relacio- nados à inflamação, caracterizada por a combinação de probióticos compreender Bifidobacterium longum CNCM I-2618 e Bifidobacterium lactis CNCM I-3446.

18. Combinação de probióticos para uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a dita combinação de probióticos compreender adicionalmente Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.

19. Método para reduzir inflamação gastrointestinal, refor- çar a barreira intestinal ou tratar ou prevenir doença inflamatória intes- tinal em um indivíduo, caracterizado por compreender a etapa de ad- ministrar ao dito indivíduo uma combinação de probióticos, sendo que a combinação de probióticos é Bifidobacterium longum CNCM I-2618 e Bifidobacterium lactis CNCM I-3446.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do por a combinação de probióticos compreender adicionalmente Bifi- dobacterium longum ATCC BAA-999.

21. Combinação de probióticos para uso na prevenção da disfunção da barreira intestinal induzida por inflamação, na redução da permeabilidade da barreira intestinal, na melhora do reparo de barrei- ra, na melhora da função de barreira e/ou no reforço/proteção da bar- reira intestinal, caracterizada por a combinação de probióticos com- preender Bifidobacterium longum CNCM I-2618 e Bifidobacterium lac- tis CNCM I-3446.

22. Combinação de probióticos para uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por o dito uso ser aplicado para melho- rar o reparo da barreira intestinal e/ou a função da barreira intestinal.

23. Combinação de probióticos para uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada por a combinação de probióticos compreender adicionalmente Bifidobacterium longum ATCC BAA-999.