TW201124089A - A nutritional composition comprising bifidobacterium longum strains and reducing food allergy symptoms, especially in infants and children - Google Patents

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201124089 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種益生菌，尤其係龍根雙歧桿菌 /ongwm)菌株在製造營養組合物中之用途， 用於減少過敏患者暴露至過敏原時之過敏症狀。 【先前技術】 過敏症係影響所有年齡層患者中最常見的健康問題。過 敏性疾病係當今世界衛生組織（WHO)所公認的流行病。已 顯示過敏症之流行在過去的幾十年内增加。現代生活方 式，尤其係城市生活方式，已與高流行及更嚴重的過敏性 現象相關。 在兒童中，尤其係在幼童中，尤其對食物過敏原之過敏 性致敏作用，係關鍵性的及最受關注，因為已顯示「過敏 表現型」或「特異體質過敏症」之發展會促進後來對其他 過敏原之致敏作用。因此，孩童之過敏症係造成日後生命 中多發性過敏症的連串過敏過程（一種通常稱為「過敏進 行曲（Atopic March)」之過程）之第一階段。舉例而言已 證實在人類群體中，在生命早期具有持久型食物超^反應 之孩童後來在童年财發展出㈣性鼻炎（枯草熱）或哮喘 之風險明顯增加（Ostbl^m等人，2008)。具有較溫和形式的 食物超敏反應之孩童,亦會提高發展^及性過敏症之風 險，但比具有持久型食物超敏反應之孩童的程度低。因 此，減少食物超敏反應之嚴重程度對於減少「過敏進行 曲」相當重要。 150227.doc 201124089 在此背景下，在孩童及嬰兒時控制過敏發作及預防過敏 症最重要。 嬰兒的免疫系統在生命的開始幾年即活躍地發展。在該 等年輕的患者中預防、避免、掌控、減少或調節過敏反應 對曰後生命不但可以短期而且長期影響其過敏特性。 過敏症之預防可在不同程度下達成： 「一級預防」係預防或減少患者對過敏原的致敏作用之 風險之作用’其特徵為沒有過敏原特異性IgE抗體或其含 量減少。預防或減少致敏作用會造成一旦暴露至相同的過 敏原時不會出現過敏症狀或過敏症狀減少。藉由調節患者 文到一種過敏原或一組過敏原（一級預防）的致敏之方式， 亦可調節以後的過敏反應。 「二級預防」係調節過敏症症狀之作用，亦即在已對一 或若干種過敏原致敏的患者再次暴露至該過敏原時之過敏 反應之出現或強度。藉由調節過敏症狀（二級預防）之出現 或強度’即可降低與過敏症相關之不便性至最低。 基於此等獨特之過敏症預防概念可假設，藉由其根本作 用機制’某些化合物在此等特定預防程度上可能僅具有一 種或可能有兩種作用。例如：某些化合物可能僅減少對特 異性過敏原之致敏作用（一級預防），而其他化合物則可能 僅具有二級預防作用及減少過敏反應的嚴重度。其他化合 物可能可以影響致敏作用及症狀二者’及因此可有效促進 一級及二級預防。 食物過敏原係嬰兒在其早期生命中所遇到之第一過敏 150227.doc 201124089 原：通常，不只接受母乳餵養之嬰兒會遇到乳牛的乳蛋 白。乳蛋白係實際上所觀察到的最常見嬰兒食物過敏原 因，然後為蛋及小麥蛋白質。一般而言，食物過敏症在嬰 兒及幼兒中或出現皮膚（疹子、濕疹、其他）及胃腸道症狀 (腹部痙攣；疼痛，尤其係腹部疼痛；嘔吐）。當嬰兒/幼童 暴露到新食物（諸如穀物、蔬菜、水果、堅果或魚）時，亦 會出現進一步致敏作用及過敏症發作。 已闡述龍根雙歧桿菌（B. longum)之菌株在腸道微生物中 起重要作用及與積極的健康作用相關：其通常在健康母乳 餵養的嬰兒之腸道微生物中以大量存在。其可促進良好的 消化、提高免疫系統及產生控制腸道pH之乳酸及乙酸。此 等細菌亦可抑制白色念珠菌（Candida albicans)、大腸桿菌 (E. coli)及具有致病特徵之其他細菌之生長。根據WHO定 義，可將龍根雙歧桿菌之一般或特異性菌株中之龍根雙歧 桿菌歸類為益生菌。 某一特定程度上而言，已闡述龍根雙歧桿菌之特定菌株 具有抗過敏原作用。舉例而言，因日本香杉花粉症 (Japanese cedar pollinosis)而罹患過敏性鼻炎之患者在花 粉季節之前及期間在食用龍根雙歧桿菌BB536若干周之 後，過敏症狀減少（Xiao JZ, Kondo S，Yanagisawa N，Takahashi N, Odamaki T, Iwabuchi N, Miyaji K, Iwatsuki K, Togashi H, Enomoto K, Enomoto T. Probiotics in the treatment of Japanese cedar pollinosis: a double-blind placebo-controlled trial. Clin Exp Allergy. 2〇06 Nov;36(l 1):1425-35. Xiao JZ, Kondo S, Yanagisawa 150227.doc 201124089 N, Takahashi N, Odamaki T, Iwabuchi N, Iwatsuki K, Kokubo S, Togashi H, Enomoto K, Enomoto T. Effect of probiotic Bifidobacterium longum BB536 [corrected] in relieving clinical symptoms and modulating plasma cytokine levels of Japanese cedar pollinosis during the pollen season. A randomized doubleblind, placebo-controlled trial. J Investig Allergol Clin Immunol. 2006;16(2):86-93) » 此外，已闡述不同的益生菌培養物或益生菌之混合物在 過敏免疫系統上之作用：例如，EP1858336(WO2006697949) 闡述益生菌之混合物可降低歸因於小麥粉白蛋白及球蛋白 之過敏症之風險。JP2006028050闡述包括益生菌細菌（諸 如乳酸菌（Lactobacillus)及鍵球菌（Streptococcus))之組合物 之抑制皮膚過敏特性。Jan knoll等人之W02009072889闡 述可用於改善罹患塵蟎過敏症的個體之肺功能之雙歧桿 菌。JP10309178闡述源自人類之雙歧桿菌如何幫助治療食 物過敏症或如何幫助誘導經口免疫耐受性。 然而，仍然需要在幼童及嬰兒群中特定地減少過敏反應 及症狀。當考慮到在幼童中所經歷的腸道及免疫系統二者 之成熟及當考慮到幼童（尤其係在斷奶期）所暴露的新過敏 原之多樣性時，此點尤其重要。 在幼年時期中，源於食物之過敏反應之問題甚至因嬰兒 及幼童之特定營養需求而變得更加複雜。就嬰兒及幼童獲 取最適宜的營養而言，所有熱量攝取、熱量密度、所希望 的營養素種類、蛋白質含量及蛋白質品質皆為重要因素。 150227.doc 201124089 存在微量營養素（諸如維生素及礦物請很重要，更尤其 當其濃度受限於與目標患者的年齡減應的特定要求範圍 時因此#里及嬰兒之食物輸送基質不僅本身即很複 雜’而且種類亦少：例如嬰兒，雖然可能過敏，但其通常 在^何生蛋白質之基質中需要特異性蛋白質平衡。存在該 等夕樣性呂養素會加強食物過敏原作用。在該等複雜的基 質中’無法單獨引發過敏現象之低關鍵性食物過敏原以後 可能在過敏反應開始時變得更強大。類似地，彳中和過敏 原或具有預防過敏作用之化合物之效用即可能在該等複雜 的營養基質中減少或消除。尤其無法預測該等通常認為具 有預防過敏作用的化合物在嬰兒或幼兒之複雜的基質（諸 如營養組合物）中是否仍然具有活性及具有何種活性程 度。 需要在患有過敏發作病史及/或本身過敏的嬰兒及幼童 群中減少食物過敏症症狀。 需要提供一種不僅提供多種營養素，而且亦減少過敏反 應嚴重度的完全營養組合物。 需要提供一種可調節罹患輕度至中度形式的過敏症之年 幼患者的過敏反應之營養組合物，因為此等患者由於其腸 道及免疫系統之不完全成熟而具有特殊需求。 亦需要（例如）藉由營養性干預（諸如包括免疫系統之調節 劑）*規營養方案來調節不耐受應急的醫藥分子之幼童中 之過敏反應。 需要提供一種可調節斷奶期及接近斷奶期之幼年患者在 150227.doc 201124089 腸道經歷實質改變時，及當引入可能包含新過敏原蛋白質 之新固體食物，且因此該患者特別易受食物過敏原的致敏 作用之影響時的過敏反應之營養組合物。 需要藉由提供一種有效組合物來減少過敏症狀，其可能 藉由減少暴露至完整過敏原而減少過敏症症狀，儘管該組 合物不會直接減少對過敏原之致敏作用。 需要種對過敏之一級預防具有積極的作用但不一定對 相同過敏症之一級預防有作用之組合物。 最終需要一種組合物，最特定言之適用於幼年患者之組 合物，其可藉由減少症狀而有助於消除「過敏表現型」及 因此降低日後生命中對新的過敏原之致敏作用。需要減少 過敏進行曲。 【發明内容】 在第一態樣中，本發明提供一種用於減少患有由食物過 敏原引發之過敏症的患者中，尤其係在幼年患者、幼兒及 嬰兒中源自食物之過敏症狀之完全營養組合物。 在第二態樣中，本發明提供一種可明顯促進由食物過敏 原引發的過敏反應之二級預防，同時視需要不影響對抗相 同過敏原之一級預防之組合物。 在第三態樣中，本發明提供一種包含益生菌，尤其係屬 於雙歧桿菌屬（历之益生菌之組合物。 在本發明之另一態樣中，本發明之組合物對斷奶期嬰兒/ 幼童尤其有效。 本發明進一步延伸為減少日後生命中對其他職原之致 150227.doc 201124089 敏作用。 【實施方式】 定義·在此說明書中’以下術語具有以下意義： 「完全營養組合物」。就此文件之目的而言，完全營養 組合物係一種包含顯著量（通常20%或更多量）的既定年齡 所建議之主要營養成份之組合物。該主要營養素通常係依 一定量及比例提供，以在用於足量提供既定年齡所建議之 熱直攝取時，滿足既定年齡所特定建議之營養素劑量之 20%或更多。完全營養組合物通常包含呈平衡比例且符合 既定年齡-般建議之蛋白質源、脂質源、碳水化合物源。 其通常亦包括微量營養素（諸如維生素及礦物質），及必需 胺基酸源及必需脂肪酸源。然而，應瞭解完全營養組合物 可能不包含所有特定營養素，亦可能不包含所有建議用 量’以滿足嬰兒或幼童之所有營養需求。完全營養組合物 排除僅包含雙歧桿菌或以雙歧桿菌為主要比例之組合物。 「過敏症之症狀」—般包括由過敏原引發之症狀。該等 症狀包括皮膚症狀(皮膚發紅、皮疹、皮癢、皮炎、濕 療）、眼睛症狀（眼睛發瘩及流淚）、胃腸道症狀（充血、腹 :疼痛：痙攣、嘔吐腹渴)、呼吸症狀(鼻癢、鼻充血、鼻 X哮而）及嚴重的全身症狀（眩晕、精神錯亂、過敏反 應）。 「過敏症之—級預防」意指目標為避免或減少過敏（免 疫干）致敏作用（例如預防或減少特異性㈣抗體）之所有措 施。 150227.doc 201124089 「過敏症之二級預防」意指預防或減少致敏個體中過敏 性疾病/過敏症狀之發展。 「斷奶期」係嬰兒自純液體營養轉變成固體或半固體食 物，及自準唯一食物類型（通常為母乳或嬰兒配方食品）轉 變成多種食物之時期。 「致敏作用」意指過敏原-特異性IgE抗體之誘導/發展。 「益生菌」意指對宿主細胞之健康或良好生長具有有利 作用之微生物細胞製劑或微生物細胞之組分。（Salminen S，Ouwehand A. Benno Y.等人「Probiotics: how should they be defined」Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10)。益生菌之 定義一般係經WHO定義認可且與其相一致。益生菌包括微 生物之獨一菌株、不同菌株的混合物及/或不同細菌種類 及菌屬的混合物。若為混合物時，單數術語「益生菌」仍 可用來代表益生菌混合物或製劑。就本發明之目的而言， 雙政桿菌屬（Bifidobacterium genus)之微生物即視為益生菌。 「益生質（prebiotic) j —般係指藉由選擇性刺激存在於 該宿主腸部中微生物的生長及/或活性而有利地影響宿 主，及藉此試圖改善宿主健康之非消化性食物成份。 龍根雙歧桿菌（B longum)菌株NCC 2705(Nestl6 Collection reference 2705)係具有國際認證參考編號 CNCM-I2618之龍根雙歧桿菌菌株（法國巴黎Collection Nationale de Cultures de Microorganismes at Institute Pasteur)。 本發明者已證實，當對致敏性幼年哺乳動物提供包括龍 根雙歧桿菌NCC 2705之完全營養組合物時，可減少過敏反 150227.doc -10-

S 201124089 應及症狀。此表示對過敏症之二級預防具有積極作用。 此作用伴隨著輕微但明顯減少料哺乳動物對過敏原之 致敏作用（即證實對過敏症之一級預防）。 組合物之作用： 本發明係關於一種以雙歧桿菌屬微生物，更特定言之龍 根雙歧桿菌（B. longum)，更明確言之龍根雙歧桿菌菌株 NCC 2705於製造完全營養組合物上之用途，用於減少患有 由食物過敏原引發過敏症之患者中的症狀。本發明者已證 實，食用一般龍根雙歧桿菌及特定言之龍根雙歧桿_Ncc 2705可導致接受包含該雙歧桿菌菌株之營養組合物之小鼠 組之食物過敏症狀減少。此點係在致敏作用之後誘導過敏 反應（攻毒）時得以證實。該模型模擬人類之食物過敏，其 中人類（通常為嬰兒/幼童）係天然地被食物過敏原致敏及進 一步再次暴露至該過敏原。細菌菌株龍根雙歧桿菌NCC 2705藉此表現出保護作用。 在本發明之一項實施例中，更明確言之，該組合物之作 用係針對過敏症之二級預防作用。在小鼠模型中，由較低 的過敏臨床記分所示’過敏症狀實際上明顯減少。一般而 言’該等症狀包括所有或選定之通常認可的過敏症症狀。 在本發明之一項實施例中’該等症狀包括腹瀉、皮膚刺 激或呼吸症狀或其組合症狀。 在本發明之一項實施例中’該等症狀伴隨生物化學介體 (諸如類胰蛋白酶、凝乳酶、組織胺、白三烯）之釋放。 在本發明之一貫施例中，該組合物亦可作用於患者對過 150227.doc 201124089 敏原之致敏作用。實際上’似乎可藉由包括龍根雙歧桿菌 NCC 2705之組合物達成輕微但明顯的過敏症之一級預防。 動物對食物過敏原表現出較低的致敏作用。就此而言，該 組合物在既可減少症狀亦可減少致敏作用（亦即日後一旦 暴露至過敏原時出現症狀之風險）上極受關注。 在一項實施例中，該組合物減少日後生命中對其他過敏 原之致敏作用。據信該組合物可促進（或至少不阻礙）免疫 成熟之自然進程，及因此能夠長期作用於減少對相同過敏 原或對不同過敏原之致敏作用（日後生命中致敏作用之減 少）。基於減少過敏症狀（二級預防）及短期致敏作用（作為 一級預防之一部份），其假說在於本發明組合物仍可出現 自然免疫成熟’及具有該長期有利作用。 本發明之組合物或用於本發明中之組合物： 本發明之組合物可為完全營養組合物，諸如嬰兒配方食 品或可提供完全勝食之大部份。較佳地’該組合物係一種 在作為唯一的營養來源時’可提供目標個體所有或幾乎所 有的營養需求之完全營養組合物。在一項實施例中，該組 合物包括嬰兒榖物。在另一實施例中，諸如幼兒食物，該 組合物提供完全膳食之一部份，較佳為50%或更多或2〇% 或更多（數量上及品質上）。在一項實施例中，該組合物包 括嬰兒榖物。在一項實施例中’該組合物可為一種含穀物 之孩童用液體組合物或幼兒食物。 所用益生菌係屬於雙歧桿菌屬。雖然本發明者不排除其 他益生菌可具有類似或相關的作用，但除藉由相同發明者 I50227.doc 12 201124089 之共同待審申請案中所述的一種所觀察到的乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)NCC 2287 (SL131) CNCM 1-4154及乳 酸乳球菌NCC 2180 (SL60) CNCM 1-4199外，尚無試驗數 據可證明其他菌屬或菌株之益生菌同等有效。 在本發明之一實施例中，該益生菌係龍根雙歧桿菌NCC 2705 CNCM-I2618菌株。 在本發明之一項實施例中’該組合物每公克乾躁組合物 中包括104至1 011之間的菌落形成單位（CFU)。當該組合物 係嬰兒配方食品時，則該嬰兒配方食品中益生菌含量係 105至108 CFU/g嬰兒配方食品之間。在一實施例中，該組 合物包括106至5xl07 CFU/g之間的劑量，其經證實具有生 理學作用。在一項實施例中’已顯示低劑量益生菌即具有 有利的作用，特定言之當該組合物亦包括明確有限量之益 生質及蛋白質時。在該實施例中，該益生菌係以1 〇3至1 (丨5 CFU/g之間的量存在於該組合物中。該益生質可為募糖及/ 或該蛋白質’係以不超過4 g/100kcal組合物或少於2 g/100kcal組合物或少於ι·8 g/i〇〇kcal組合物或少於1.5 g/100kcal組合物之量存在。 該益生菌可與本發明之乾或濕組合物一起混合。可採用 處理或特定方法以改善該組合物中益生菌之安定性或生存 能力《該益生菌可呈乾物形式或濕物形式應用。在將該益 生菌與該組合物混合之後，可採用一種不明顯影響該益生 菌生存能力之方式處理該混合物。在另一實施例中，該益 生菌在混合之前、期間或之後係部份或完全不活化。在— 150227.doc 13 201124089 實施例中該益生菌在用於本發明之組合物中之前已不活 化及7或不能複製。此（例如）能夠藉由熱處理或其他所述處 理達成。 在本發明之一實施例中，該組合物包括益生質。已知該 益生質包括碳水化合物類及更明確言之係寡糖。此外，已 知其已廣泛用作功能性食物成份。其可抵抗人類消化道的 酶之水解，從而以未降解形式到達結腸及提供特別適用於 雙歧桿菌或其他益生菌的生長之碳水化合物物質。寡糖可 (例如）自葡萄糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、餘、乳糖、 殿粉、木聚糖、半纖維素、菊糖或其混合物產生。純化之 益生質商品，諸如果寡糖包含超過約95%固體呈寡糖形 式。 較佳地，該組合物之實施例係一種包括至少一種益生質 之營養組合物。 較佳地，該益生質之實施例包括—種自葡萄糖、半乳 糖木糖、麥芽糖'蔑糖、乳糖、丨殿粉、木聚糖、半纖維 素、菊糖或其混合物產生之寡糖β更佳地，該寡糖包括果 寡糖。最佳地，該益生質包括果募糖與菊糖之混合物。較 佳地，此混合物包括PREBIO 1 ®或可購得RAFTIL〇SE⑧及 RAFTILINE®之混合物商品。 較佳地，該組合物之益生質組分之實施例包括約5〇%至 約90 /〇果募糖。更佳地’其包括約6〇%至約8〇%果募糖。 最佳地，其包括約70。/。果募糖。較佳地，該益生質之實施 例包括約1〇%至約50%菊糖。更佳地，其包括約2〇%至約

S 150227.doc 201124089 4〇%菊糖。最佳地，其包括約30%菊糖。在—項實施例 中°亥上生質組分可占組合物約0.1 〇/〇至10%之間。 在項實施例中，本發明組合物進一步包括含多盼之頻 果提取物。忒蘋果提取物可幫助減少患有由食物過敏原引 發之過敏症的患者中源自食物之過敏症症狀。因此該蘋果 提取物係與益生菌雙歧桿菌產生協同作用，從而調節、減 少或消除患有食物過敏症的患者中之過敏症。在—項實施 例中’。亥組合物係用於幼兒食物及/或幼兒毅物，其成為 該組合物之天然的適宜載劑。在另一實施例中，該幼兒食 物或幼兒縠物包括蘋果提取物或來自蘋果之材料。在本發 明之一實施例中，該蘋果提取物係以參考名稱「pomactiv FV」躏；Val de Vire Bioactives (法國 Conde sur Vire)之蛋 白質提取物。在一項實施例中，該蘋果提取物係類似或衍 生自所引用之Pomactiv HFV且具有類似作用。 作用之假說機制： 在過去的幾十年内，過敏性疾病已穩定增加，並成為目 刖WHO公認之流行病。就一般方式而言，過敏症被認為係 由於免疫系統之Thl及Th2反應不平衡，造成較易傾向於產 生Th2介體而產生。因此，在不受理論限制的情況下，假 定所有過敏可藉由恢復免疫系統之Th 1與Th2兩方之間適當 的平衡來減少、向下調節或預防。此暗指必需減少Th2反 應或增強（至少短暫增強）Thl反應。前者特徵為Th2細胞介 素（諸如IL-5)之產生減少’後者之特徵為Thl細胞介素（諸 如IFNy)之產生增加。或者，在致敏個體中，一般消炎作 150227.doc •15· 201124089 用（例如）最需要引入T-調節（Treg)細胞，其能夠降低Thl與 Th2細胞二者之作用。此可藉由其誘發il-10分泌物之能力 來指示。 在本發明之實施例中，該組合物包括水解或部份水解蛋 白質。基於（部份）水解蛋白質之營養組合物特別適用於嬰 兒/幼童之免疫系統及胃腸道，因為水解蛋白質比完整蛋 白質更容易消化及具有減少的過敏原性。此外，在不受理 論限制的情況下’可假定相較於完整蛋白質而言，水解蛋 白質係益生菌或腸道細菌（尤其係彼等表現各種肽酶活性 者）之較佳受質，從而改善益生菌菌株之效用且因此促進 水解蛋白質與益生菌之間的協同作用。此代表最適合食物 過敏嬰兒/幼童之免疫系統及胃腸道的組合物。在該情況 下，龍根雙歧桿菌NCC 2705與水解蛋白質之組合與本發明 相關性最高。 在-項實施例中，該水解蛋白質係自乳清及/或路蛋白 水解之蛋白質。在-項實施例中，該水解蛋白質係自姨蛋 白酶及/或胰凝乳蛋白酶對蛋白質（尤其係乳清蛋白質）之作 用而產生。在-項實施例中，該水解蛋白質包括大豆蛋白 質或/及㈣白質。在—項實施例中，該水解蛋白質係自 蛋白酶（諸如 pr〇tamex®A/或Flavourzyme@(丹麥Ν〇ν〇ζ_》 之作用產生。在一項實施例中，該組合物之蛋白質(較佳 為該水解蛋白質）包括榖物或印蛋白。在一項實施例中， 該水解蛋白質係自栝草桿菌蛋白酵素（Akalase)之作用產 生。本發明組合物包括2種或更多種上述蛋白質源之混合 150227.doc

S 201124089 物。 目標族群： 本發明組合物之最適宜目標為相當年幼的患者，但不排 除其或可能對成人起作用。實際上較佳的係該患者係實質 上夠年幼,¾致會經歷其免疫系統及其胃腸道之成熟階段。 在忒等患者中’該組合物之作用可更強或更快。在一項實 把例中，忒組合物係_種嬰兒配方食品、嬰兒穀物及，或 幼兒r物。k佳地，該組合物之目標為6歲以下、出生至3 歲之間或出生至斷奶之間的年齡之幼年人類。在一項實施 例中，該組合物係初生或較大嬰兒配方食品。較佳地該 營養組合物包括餵養幼年人類之絕大部份必需營養素。 在項貫她例中，該營養組合物係一種嬰兒/1至4歲大 幼兒之兒穀物組合物。該組合物之更明確目標為在斷奶 期間及/或大至12個月之後，並在此時投與。就本發明而 言’斷奶期實際上相當重要’因為嬰兒在斷奶期暴露至各 種食物’此時經歷其免疫系統及其胃腸道之成熟及重組。 因此’有效地控制過敏反應在此時期特別重要。 就本發明組合物之用途而言，孩童、幼兒或嬰兒可為過 敏孩童。過敏孩童係彼等已經歷至少一種食物過敏原之過 敏反應（輕度、中度或嚴重）發作的孩童、幼兒或嬰兒。在 本發明之實施例中，已顯示該等孩童、幼兒或嬰兒對食物 過敏原患有嚴重的過敏症及/或已經歷一種以上的食物過 敏症之中度或嚴重的發作。過敏症之症狀包括各種已知症 狀，諸如皮膚刺激或發紅、胃腸道症狀或呼吸症狀。 150227.doc •17· 201124089 本發明所涵蓋之食物過敏原可包括自然出現或通常在食 物，尤其係幼年人類（例如嬰兒、幼兒、孩童）的食物中出 現之所有種類的過敏原。 試驗結果： 已經在人類及動物試驗中測試益生菌（主要屬於乳酸菌 及雙歧桿菌屬）干擾過敏性致敏作用或干擾致敏個體中過 敏症狀發展的能力。此處分析龍根雙歧桿菌（即龍根雙歧 桿菌NCC 2705)之特定菌株是否能夠減少過敏性致敏作用 或症狀發展之潛力。 在開始的步驟中’吾人發展並使用基於人類血液淋巴細 胞之活體外系統’以測定由龍根雙歧桿菌之不同菌株誘導 之細胞介素特性❶吾人假定所觀察到的特性可預測相同菌 株在活體内所誘導細胞介素之產生率，及可藉此預測由該 菌株賦予之生物學效用。 過敏個體之細胞或易於發展過敏症的個體之細胞特徵為 其傾向於產生Th2細胞介素》為了在活體外部份模擬此狀 態’吾人開發一種趨向Th2之人類外周血液單核細胞 (PBMC)之細胞培養模型，替代使用過敏捐贈者的pBMC。 採用介白素（IL)-4 +抗-CD40抗體培養PBMC，誘導Th2-趨 向（如方法中詳述）；在培養3天之後，誘發Th2趨向，添加 雙歧桿菌再培養48小時，總共培養5天時間。由ELISA測 定經過龍根雙歧桿菌刺激的細胞上清液中之細胞介素 IFNy、IL-10及IL-5作為基本讀數。 圖1/表1顯示龍根雙歧桿菌NCC 2705誘導類似量的IFNy

150227.doc S 201124089 及IL-10，其導致IFNY/IL-10比率為1.3。平行分析出其他 龍根雙歧桿菌菌株（諸如龍根雙歧桿菌NCC 3001(BB536 ; 由Morinaga以ATCC B AA-999寄存）及龍根雙歧桿菌NCC 435 (BL23, ATCC 15707))具有更加傾向於 IFNy 之 IFNy/IL-10比率。此外，龍根雙歧桿菌NCC 2705係一種針對IL-5分 泌之高效抑制劑。此等資料顯示，龍根雙歧桿菌NCC 2705 可在趨向Th2之條件下穩定產生IL-10，因此可透過消炎活 性具有抗過敏作用。 圖2/表2證實龍根雙歧桿菌NCC 2705之mRNA含量與龍 根雙歧桿菌BB536及LPS(來自大腸桿菌）之比較結果。在開 始使用不同刺激物與趨向Th2之人類PBMC共同培養10及24 小時之後分析不同基因之表現程度。相較於LPS(—種已知 的IFNY之強誘導物），使用龍根雙歧桿菌NCC 2705或NCC 3001 (BB536)培養趨向Th2之PBMC會適度誘導IFNy。由龍 根雙歧桿菌NCC 2705誘導之IL-10 mRNA含量高於由龍根 雙歧桿菌BB536之誘導含量。在用其中任一菌株培養之 後，IL-5 mRNA含量不受影響，然而GATA-3稍微降低。綜 上所述，此等發現證實關於蛋白質含量所獲得之結果（表 1)。 在小鼠食物過敏症模型中測試龍根雙歧桿菌NCC 2705 之活體内作用（OVA食物過敏症小鼠模型，如圖3中所述）。 在7周期間，每隔一周藉由口服途徑對BALB/c小鼠使用 卵白蛋白（OVA)+霍亂毒素致敏。在此模型中，在致敏作用 期結束時，用大劑量的OVA 口服攻毒，會導致諸如腹瀉、 150227.doc 19 201124089 瘙癢發作、毛髮豎起、發紺及活動性降低之臨床症狀。 NCC 2705係在第1至43天之致敏作用階段期間（一級預防）、 在試驗的最後一周（第43至50天；二級預防）或整個試驗期 間（第1至50天，整個試驗期間）經由飲用水（5χ1〇8 cFU/ml ; 隨意飲用）投與小鼠。 圖4顯示在兩個獨立試驗中所觀察到的臨床症狀。在攻 毒之後，用龍根雙歧桿菌NCC 2705處理之小鼠出現明顯但 嚴重度不如已致敏之未處理動物（陽性對照）的臨床症狀。 該作用在二級預防中最顯著，但在一級預防中及當整個試 驗期間均投與龍根雙歧桿菌NCC 2705時仍很明顯（試驗i , 上圖）。在第一 s式驗中，證實了二級預防中之保護作用， 然而觀察到在一級預防中或整個試驗中的效用趨勢（試驗 2，下圖）。 如圖5所示，除臨床記分外，小鼠肥大細胞蛋白酶 l(MMCP-l)血清濃度係藉由過敏原攻毒之腸道肥大細胞活 化作用之測量值測定。OVA攻毒導致陽性對照組中MMCP-1 之血清濃度比陰性對照組大幅增加^相較於陽性對照組， 可在接爻NCC 2705處理之小鼠中觀察到MMCP-1血清濃度 之調節趨勢（雖然並不明顯）。 圖6/表3顯示藉由活體外再次刺激淋巴細胞之細胞介素 產生率。就此目的而言’在攻毒、用1 mg/ml 〇VA再次刺 激及培養72小時之後，收集來自腸系膜淋巴結（MLN)之淋 巴細胞。藉由多重分析（Mesoscale®)測量1]^-1、11^-2、11^-4、KC、TNFa、IFN-γ、IL-5及 IL-10之含量。用 NCC 2705 150227.doc •20· 201124089 處理之小鼠的MLN淋巴細胞在一級預防中產生低於陽性對 照組之 IL-2、IL-4、TNFa、IFNy、IL-5及 IL-10。 藉由定量性實時聚合酶鏈反應測定與過敏症相關之不同 基因在腸部中的表現程度（qRT-PCR-參見以下方法）。在致 敏作用期間（一級預防）及在開始攻毒之前的最後一周（二級 預防），於來自陽性對照組、陰性對照組及接受龍根雙歧 桿菌NCC 2705處理組迴腸之組織上測定基因表現。圖7/表 4闡述所獲得之結果：致敏作用導致典型Th2細胞介素（諸 如IL-4、IL-5、IL-9及IL-1 3(陰性對照組對陽性對照組對）） 以及IL-10的mRNA轉錄之上升調節。用]^〇 2705處理（一 級或二級預防）可導致此等指標顯著向下調節。 因此，該等試驗證實當動物接受龍根雙歧桿菌Ncc 2705 時（一級及二級預防），可藉由減少相關基因的表現而向下 調節免疫反應。據信此點在此模型中造成所測試雙歧桿菌 菌株於減少食物過敏症中之抗過敏作用。 結論：此等資料顯示，致敏動物食用龍根雙歧桿菌NCC 2705可導致一旦暴露至致敏過敏原時，減少過敏症狀。同 樣地，但較不明顯，在致敏作用階段期間食用龍根雙歧桿 菌NCC 2705具有保護作用（一級預防）。此發現係與藉由腸 系膜淋巴結細胞之細胞介素之分泌物減少及腸中與過敏症 相關之關鍵基因之的表現減少並行，其表示調節免疫系統 之組分可促進保護作用。 分析方法： 試劑及細菌生物質量： 150227.doc •21 · 201124089 細菌生物質量係在液體培養基中，在最佳條件下培養各 菌株而產生。針對各菌株測定生長動力學及根據此等數 據’在達到穩定期之後3 h收穫生物質量。在此時間點， 用2x冷PBS沖洗培養基，及保存於PBS 20%甘油中，分成 50 μΐ等份在-80°C下冷凍。LPS(來自大腸桿菌）係購自 Sigma(瑞士 Buchs)。 趨向Th2之人類PBMC之單離及培養： 人類外周血液單核細胞（PBMC)經過購自「Centre de Transfusion of the CHUV」之過濾器單離。將截留在過遽 器中的細胞沖刷回含有90 ml Hanks平衡鹽溶液 (HBSS)(Sigma)之血液收集袋中。將細胞用HBSS以1:2稀 釋’ PBMC則藉由在Histopaque 1077(Sigma)上之密度梯度 離心而單離。收集處於界面間的細胞，並用HBSS沖洗兩 次。將PBMC再懸浮於補充1 〇 %胎牛血清FBS(法國巴黎 Bioconcept)、1%L-麩醯胺酸（Sigma)、1% 盤尼西林 (Penicillin)/鏈黴素（Sigma)及 0.1% 健大黴素（Gentamycin) (Sigma)之艾氏改良杜氏培養基（lsc〇ve's Modified Dulbecco's Medium)(cIMDM)(Sigma)中。於 48孔板（Milian， Meyrin，瑞士）辛，在含於 clMDM 中之 50 ng/ml IL-4 (Bioconcept)及 1 pg/ml 抗 CD40 抗體（R&D Systems， Abington，England)的存在下，依i.5xl〇6細胞/ml培養細 胞，以誘導Th2細胞介素表現型。使用1 pg/mi之LPS。在 培養3天之後’添加ΙΟ7、1〇6、及1〇5 CFU/ml之益生菌。在 添加成份之後’持續進行PBMC培養48 h，總共培養5天時

150227.doc •22· S 201124089 間。 細胞介素ELISA : 利用來自R&D系統之DuoSet套組根據製造商說明書測定 人類IFN-γ、人類IL-5、人類IL-10、小鼠iFN-γ、小鼠IL_ 13、及小鼠IL-10細胞介素。 ELISA結果之評估： 利用標準曲線將OD值換算成pg/ml。為調整一般來自不 同人類供體之PBMC所觀察到的供體·與-供體之間之大幅 變化，根據自由内標準物使數據標準化。將各供體藉由 LPS刺激而獲得之IFN-γ之pg/ml值設定為！〇〇%。標準化IL_ 10值時，以菌株雷特氏雙歧桿菌（B_ lactis) NCC 2818(由 Nestec SA 以 CNCM-I3446 寄存）誘導之 IL-10 量為 100%。最 終，將經IL-4及抗-CD40抗體在僅含培養基中（即沒有益生 菌之存在下）誘導之IL-5量設定為1〇〇〇/0。 由實時PCR定量之基因表現程度： 將 PBMC(1.5xl06 細胞/ml)在含有 IL-4 (50 ng/ml)及抗 _ CD40 (1 pg/ml)之cIMDM中培養3天。此後添加成份至 PBMC中’並在10 h及24 h之後收集細胞。採用SV總RNA ' 單離系統套組（Promega，Wallisellen，瑞士），包括根據製 造商說明書之脫氧核糖核酸酶處理法，在接受刺激的 PBMC中萃取總RNA。總RNA係使用Hbogreen RNA定量套 組（Molecular Probes，Basel,瑞士）定量。利用 Multiscribe 反轉錄酶套組（Applied Biosystems, Foster City，CA， USA) ’於1 pg總RNA上進行反轉錄。將總RNA與50 μΜ無 150227.doc •23- 201124089 規六聚物、0.5 mM dNTP、20 U核糖核酸酶抑制劑 (Applied Biosystems)、62.5 U Multiscribe反轉錄酶、IX RT緩衝液、及5.5 mM MgCl2，以100 μΐ的最終體積混合。 利用Taqman基因表現分析，藉由實時PCR(Applied Biosystems, ABI PRISM 7900HT)定量分析人類IFNγ、IL-10、IL-5、Tbet、GATA3、FoxP3(Applied Biosystems) 〇 藉 由3種看家基因：β-肌動蛋白、GAPDH及HPRT(Applied Biosystems)之平均值使定量值標準化。 基於所獲得之循環臨限（Ct)值，利用ACt測定各基因之 相對及標準化mRNA表現。各基因之Ct值係藉由三種看家 基因之Ct平均值校正。利用公式2_Δ(：ι X K計算相對表現之 結果。 OVA食物過敏症小鼠模型： 所有研究係經瑞士耐斯泰克内部倫理委員會（Nestec internal Ethics Committee)及 Canton of Vaud 獸醫學服務 處（the Service V0t6rinaire of the Canton of Vaud)(授權 # 1 970)認可。在7周期間，每隔一周，將六周大常用之 BALB/c雌鼠（法國 Harlan Laboratories)用來自 Fluka (瑞士 Buchs)之20 mg卵白蛋白（OVA)+ 10 μβ/小鼠霍亂毒素（用作 佐劑；List Biologicals，購自 LuBioscience，Lucerne，瑞 士），藉由口服途徑（管飼針）進行致敏。在最後致敏作用一 周之後，進行100 mg OVA之口服攻毒。在試驗的不同階 段進行龍根雙歧桿菌NCC 2705(5xl08 CFU/ml含於飲用水 中）之營養干預；在致敏作用期間的一級預防、在致敏作 150227.doc •24- 201124089 用=段結束時開始之二級預防、或整個試驗期間（ ==’開始個別觀察小鼠3。分鐘。記錄臨床症 狀二將其量化如下(過敏分數)：〇:無症狀，少於4次瘙疼 發作，i . 4.1G次鼻及頭„錢發作，無n m次 以上瘙癢或毛Η立及不動或軟便；3:㈣或呼吸費力 或發紺；4 :腹渴合併在m刺之後不動、毛髮登立、呼吸 費力或發钳·，5:過敏反應。攻毒之後四小時，殺死小氣 (頸椎脫臼法），抽出血液及最後幾釐米的迴腸並冷凍於 液氮中。 血清 MMCP-1 : ’蘇格蘭）之 鼠科肥大細胞 藉由購自 Moredun Scientific (Penicuik ELISA，根據製造商說明書定量小鼠血清中 蛋白酶1(MMCP_1)。利用多項式標準曲線，將〇d值換算 成pg/m卜獲得MMCP-1濃度。 腸系膜淋巴結細胞之單離及培養： 腸系膜淋巴結（MLN)係在細胞濾器（cell strainer)(BD Falcon，Milian，Meyrin瑞士）中經注射器之活塞均質化。 將細胞離心，並用補充1〇〇/0胎牛血清(法國巴黎

Bioconcept)、1%L-麵醯胺酸（sigma)、1%盤尼西林/鏈黴素 (Sigma)、0.1%健大黴素（Sigma)、0_1%β-巯基乙醇（Sigma) 之RPMI(Sigma)洗兩次。細胞於96孔平底板（Corning， Milian)中，以3xl〇6細胞/ml，在不存在或存在〇▽'(! mg/ml)下培養。在培養72 h之後，將培養板冷凍。 MLN培養物之上清液中之細胞介素： 150227.doc -25- 201124089 利用小鼠Thl/Th2 9-組式多重套組（Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD, USA)根據製造商說明書測定 小鼠 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、IL-Ιβ、IL-2、IL-8、 TNF-oc、IL-12T。 腸中基因表現之低密度陣列分析： RNA萃取及定量： 根據製造商方案，利用購自Promega (瑞士 Diibendorf)之 SV總RNA單離系統套組，自迴腸萃取總核糖核酸（RNA)。 採用所提供的quant-IT Ribogreen試劑套組（Promega Diibendorf，瑞士），根據製造商方案定量RNA。 反轉錄： 利用來自 Applied Biosystems(Foster City, CA，USA)之 Multiscribe反轉錄酶套組，於1 pg總RNA上進行反轉錄。 使總RNA與50 μΜ無規六聚物、0.5 mM dNTP、20 U核糖 核酸酶抑制劑（Applied Bio systems)、62.5 U Multi scribe反 轉錄酶、IX RT緩衝液、及5.5 mM MgCl2，以50 μΐ的最終 體積混合。在Τ3熱循環儀（Biometra, Gdttingen，德國）上， 根據以下程序進行反轉錄：在25°C下10分鐘、在48°C下30 分鐘、在951下5分鐘至在4°C下完成。 低密度陣列（LDA): LDA之設計係與 Applied Biosytems網站（http://www3. appliedbiosystems.comAndex.htm)連線。根據製造商製 程，於定量分析ABI-Prism 7900HT上進行負載、操作及分 析。 150227.doc -26- 201124089 藉由3種看家基因之平均值使定量值標準化：β-肌動蛋 白、GAPDH及 HPRT(Applied Biosystems)。基於所獲得之 循環臨限（Ct)值，利用ACt測定各基因之相對及標準化 mRNA表現。各基因之Ct值係藉由三種看家基因之Ct平均 值校正。利用公式2_AGtxK計算相對表現之結果，其中K係 1〇6因數。將倍數增加結果表現依據陰性組中之表現程度 標準化。 實例1 : 根據本發明使用之嬰兒配方食品之組合物實例出示於 下。此組合物僅供闡釋。該蛋白質源係乳清蛋白質與酪蛋 白之常見混合物。 營養素 每 lOOkcal 每升 能量（kcal) 100 670 蛋白質（g) 1.83 12.3 脂肪（g) 5.3 35.7 亞油酸（g) 0.79 5.3 α-亞麻酸（mg) 101 675 乳糖（g) 11.2 74.7 益生質(100%GOS)(g) 0.64 4.3 礦物質（g) 0.37 2.5 Na (mg) 23 150 K(mg) 89 590 Cl (mg) 64 430 Ca (mg) 62 410 P(mg) 31 210 Mg (mg) 7 50 Mn _ 8 50 Se _ 2 13 維生素A㈣RE) 105 700 維生素D (μ§) 1.5 10 維生素E(mgTE) 0.8 5.4 維生素ΚΙ (μ§) 8 54 維生素C (mg) 10 67 維生素B1 (mg) 0.07 0.47 150227.doc •27- 201124089 維生素B2(mg) 0.15 1.0 终驗酸(Niacin)(mg) 1 6.7 維生素B6(mg) 0.075 0.50 葉酸(pg) 9 60 泛酸(mg) 0.45 3 維生素B12(pg) 0.3 2 生物素(pg) 2.2 15 膽驗(mg) 10 67 Fe(mg) 1.2 8 ΐ(μ§) 15 100 Cu(mg) 0.06 0.4 Zn(mg) 0.75 5 龍根雙歧桿菌(NCC 2705);參見試驗部份） 2xl07CFU/g 粉末 【圖式簡單說明】 圖1/表1 :在與龍根雙歧桿菌（B. longum)NCC 2705(由 Nestec SA以CNCM-I2618寄存）或其他菌株共同培養之後， 趨向Th2之人類PBMC之細胞介素特性； 圖2/表2 :在與龍根雙歧桿菌NCC 2705或其他菌株共同 培養之後，趨向Th2之人類PBMC之mRNA特性； 圖3 : OVA食物過敏小鼠模型之圖解； 圖4:說明接受含於飲用水中之5xl08 CFU/ml龍根雙歧 桿菌NCC 2705的小鼠中表現食物過敏症之減少症狀之臨床 記分， 圖5 :小鼠肥大細胞蛋白酶l(MMCP-l)之血清濃度； 圖6/表3 :由腸系膜LN淋巴細胞及脾細胞在活體外再次 刺激之細胞介素生產率；及 圖7/表4:迴腸中基因表現程度。

150227.doc -28- S

Claims (1)

1. 201124089 七、申請專利範圍： 1. 種龍根雙歧桿菌菌株於製造完全 營養組合物之㈣’該組合物係用於減少具有食物過敏 原引發過敏之患者源自食物之過敏症狀。 2. 如凊求項1之用途，其中該組合物提供顯著之二級預 防’以對抗該食物過敏原引發之過敏反應。 3·如前述請求項中任—項之用途’其中該組合物可影響該 患者對該過敏原之致敏作用。 4. 如前述請求項中任一項之用途’其中該龍根雙歧桿菌菌 株係益生菌。 5. 如刖述凊求項中任一項之用途，其中該組合物每克乾燥 組合物包含1〇5至1〇8之間的菌落形成單位（CFU)。 6·如前述請求項中任—項之用途，其中該組合物包含至少 種益生質（Prebi〇tic)，較佳包含果寡糖。 7.如=述請求項中任—項之用途，其中該組合物包含多盼 頻果提取物’及其中該蘋果提取物有助於減少具有食 物過敏原引發過敏之患者源自食物之過敏症狀。 士則述印求項中任一項之用途，其中該組合物包含水解 蛋白質。 如⑴述叫求項中任一項之用途，其中該組合物減少此後 生命中對其他過敏原之致敏作用。 10. ^前述請求項中任一項之用途，其中該菌株係龍根雙歧 才干菌 NCC 27〇5(CNCM-I2618)。 11. 如前述請求項中任一項之用途，其中該症狀係胃腸皮 I50227.doc 201124089 膚或呼吸或其組合症狀。 12. 如前述請求項中任一項之用途’其中該組合物包含穀物 蛋白質。 13. 如則述請求項中任一項之用途’其中該組合物係嬰兒配 方’嬰兒縠物，含縠物之孩童用液體組合物，或幼兒食 物0 14. 如則述請求項中任一項之用途，其中該組合物係一種用 於1至4歲嬰兒之嬰兒穀物組合物。 15. 如則述請求項中任一項之用途’其中該組合物提供給斷 奶期及/或大至12個月以後的嬰兒。 16. 如前述請求項中任一項之用途，其中該患者係六歲以 下’較佳為出生至3歲大的幼兒。 1 7.如前述請求項令任一項之用途，其令該症狀伴隨著釋放 生物化學介體’諸如類胰蛋白酶（tryptase)、凝乳酶 (chymase)、組織胺、白三烯。 18.如前述請求項中任一項之用途，其中該雙歧桿菌菌株已 經不活化’諸如使其不能複製。 150227.doc