CN101596216A - 预防或治疗糖尿病和相关病症的微生物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是一种微生物制剂在预防或治疗糖尿病尤其是2型糖尿病及其相关病症的用途。所述相关病症包括肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高脂血症、动脉粥样硬化、高尿酸血症及由此引起的痛风等代谢综合征相关疾病和阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等神经退行性疾病，以及类似的病症。更具体地说，所述微生物制剂的活性成份是表达活性苯丙氨酸脱氨酶和/或苯丙氨酸解氨酶的非致病菌，所述非致病菌的出发菌株是天然菌或基因工程菌。

Description

预防或治疗糖尿病和相关病症的微生物制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种微生物制剂在预防或治疗糖尿病尤其是2型糖尿病及其相关病症的用途。所述相关病症包括肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高脂血症、动脉粥样硬化、高尿酸血症及由高尿酸血症引起的痛风等代谢综合征(metabolic syndrome，MS)相关疾病以及阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)。更具体地说，所述微生物制剂的活性成份是表达活性苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine deaminase)和/或苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)的非致病菌(nonpathogenic microbials)，所述非致病菌的出发菌株是天然菌或基因工程菌。

发明背景

随着人们物质生活水平的提高和饮食结构的变化，被人们俗称为“富贵病”的糖尿病及其相关病症的发病率也迅速上升。糖尿病是一组由于遗传和环境因素共同作用，胰岛素相对或绝对缺乏以及靶组织对胰岛素敏感性降低(胰岛素抵抗，IR)引起的碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢紊乱的综合征，是一种以持续高血糖为特征的、慢性全身性代谢疾病。糖尿病不是单一的疾病而是一系列病症，是一个症候群。由糖尿病所致的一系列并发症都严重地危害了公众健康和生活质量，但是迄今糖尿病尤其是2型糖尿病的发病机制并不完全清楚。

据美国疾病控制和预防中心的预测，“如果这种发展趋势得不到遏制，2000年以后出生的美国人将会有1/3以上的人在其一生中罹患糖尿病”。

令人不安的是，目前所有治疗糖尿病的口服药物都有一定的局限性和副作用，尤其是在长期服用后更加明显。究其原因还是引动2型糖尿病发生的始动因子(triggering factor)目前尚无定论。

在降低血糖的同时能够很好地改善、治疗其它相关病症的上市药物不多。在途研发的药物，从中国知识产权局专利申请方面的检索看也很少。目前只有美国卡里克斯治疗公司的“治疗糖尿病和相关病症的新的化合物”(专利号CN00817148.3)和美国特拉科斯公司“用于炎症、糖尿病和相关病症治疗的化合物”(申请号：02827100.9)等。

近年来，2型糖尿病药物的治疗机制主要有：与胰岛素分泌相关的钙通道和ATP敏感性钾通道、与胰岛素增敏相关的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、胰岛素信号通路中的关键酶及细胞因子(如STAT5)、二肽酰肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂等。

尽管新药不断出现，也在进步，但似乎都还不是其关键性的治疗靶点(target)。糖尿病特别是2型糖尿病的发生和发展过程“引导”着一个很大的症候群，能够找到2型糖尿病发生的始动因子，那么与之相关的许多病症的预防和治疗也将可能迎刃而解。

大量文献报道，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等神经退行性相关病症不仅跟单胺氧化酶B(MAO-B)密切相关，跟糖尿病也有着千丝万缕的关联性。「单胺氧化酶及与疾病的关系[J]；中国药学杂志；1994年10期；单胺氧化酶抑制剂在神经变性疾病中的研究进展[J]；首都医药2003年16期；单胺氧化酶及其抑制剂与老年神经变性疾病[J]中国老年学杂志1996年03期」

2007年7月15日，国际糖尿病联盟(IDF)主席Martin Silink率团参加在北京召开的“IDF特选——全球顶尖糖尿病会议精粹”高峰论坛，来自美国弗吉尼亚大学医学部的McCall教授介绍了美国糖尿病协会(ADA)2007年年会的热点内容，其中就阐述了胰岛素与脑功能的关系。

2007年度美国糖尿病学会(ADA)最高荣誉奖——Banting Lecture奖的研究——鹿特丹磁共振成像(MRI)筛查研究结果以及多项流行病学研究证实，糖尿病和AD之间存在相关性。

如，瑞典斯德哥尔莫老年医学研究中心的Laura Fratiglioni博士所主持的评价临界状态的糖尿病对痴呆(尤其是阿尔茨海默氏病)进展的影响的研究，共有1173名不患有痴呆和糖尿病的个体入组该项研究。根据该项研究结果，可以得出临界状态的老年糖尿病个体发生痴呆和阿尔茨海默氏病的风险会大大增加的结论。

帕金森氏病是常见的、高发的慢性病，虽然它和糖尿病分别隶属于神经系统疾病和内分泌代谢系统疾病，相关性似乎不易被触及，但是一项来自芬兰的研究称：随着年龄的增长，2型糖尿病的发病率有持续上升的趋势，而与此同时，罹患帕金森病的人数也逐渐向上攀升。该研究结果引发出了这样一个疑问：糖尿病患者是否更容易继发帕金森病？芬兰的研究表明：实际上，2型糖尿病患者的体重超重本身就是导致某些神经功能紊乱的高危因素。这项研究结果无论是对于临床实践还是公共卫生保健都非常重要。「Diabetes Care April 2007；vol 30：pp842-847」

纽约Mount Sinai医学院North General医院糖尿病肥胖研究中心的Cathy Nonas教授把该研究定义为“前驱使者”。Nonas教授目前领衔的课题组的研究方向是“低蛋白质和低碳水化合物的饮食结构对帕金森病患者的影响”。Nonas教授提出的观点是：较葡萄糖而言，大脑更易利用酮体作为其能量的来源，可以通过调整饮食结构来改善患者的各种临床症状。结合自己的研究经验，Nonas教授认为，有效预防帕金森病的办法就是积极控制糖尿病的发展。

2005年4月国际糖尿病联盟(IDF)颁布全球代谢综合征(MS)统一定义，新定义诊断的MS特别强调了“中心性肥胖”的指标，与高尿酸血症的相关情况虽然是“尚需评价”，但目前已有大量文献报道，糖尿病尤其是2型糖尿病与高尿酸血症密切相关。

复旦大学附属华山医院内分泌科进行的国家自然科学基金重点项目(30230380)，“上海市中心城区成人2型糖尿病患者高尿酸血症患病率及其相关危险因素分析”，得出的结论是：高尿酸血症与代谢综合征及其组分相关。「“上海市中心城区成人2型糖尿病患者高尿酸血症患病率及其相关危险因素分析”《中国临床医学》2006年02期；“血尿酸浓度与胰岛素抵抗的相关性研究(对385例高尿酸血症患者的临床统计分析)”《中华中西医杂志》2004年3月第5卷第6期」

2型糖尿病与肥胖症共同存在，关系十分密切和复杂。流行病学资料显示2型糖尿病患者中80％为超重或肥胖，而肥胖者10％患有糖尿病。目前2型糖尿病与肥胖症被称为“姊妹病”，美国糖尿病协会(ADA)前主席Francine Kaufman教授就明确提出了“糖尿肥胖病”(diabesity)的概念，并创造了“diabesity”一词。

有文献报道美国明尼苏达大学的发现：“做胃转流术(gastricbypass，GBP)根治了糖尿病。”目前，GBP或胆胰分流术(biliopancreaticdiversion，BPD)和糖尿病的关联性，已经在试验鼠身上得到了证实。“台湾的台大、成大和敏盛医院已着手征集临床受试者，希望找到根治糖尿病病症的神奇元素。”在国内，虽然这方面起步较晚，但也开始了有益地尝试。「Rubino F，Marescaux J.Effect of duodenal-jejunalexclusion in a non-obese animal model of type 2 diabetes a newperspective for an old disease  [J].Ann Surg，2004，239(1)：1-11.；王湘辉，李涛，王海忠Roux-en-Y胃转流术治疗II型糖尿病西北国防医学杂志2006年04期」

GBP或BPD不仅能明显地持续长时间地减轻体重而且可缓解或减轻其并发病，尤其对2型糖尿病，可维持血糖、血胰岛素及糖化血红蛋白正常。令人惊奇的是，手术对非肥胖症的2型糖尿病患者同样有效。2型糖尿病是否伴发肥胖症在胰岛素抵抗方面并无显著差异，也就是说，非肥胖2型糖尿病与肥胖相关的2型糖尿病本质上是同一种疾病。「RubinoF，Gagner M.Potential of surgery for curing type 2 diabetesmellitus[J].Ann Surg，2002，236(5)：554-559.；Prando P，CheliV，Melga P，et aI.Is type 2 diabetes a different disease in obeseand nonobese patients[J].Diabetes Care，1998，21(10)：1680-1685.」

1995年Pories就报道了608例病理性肥胖病人接受GBP，术前146例合并2型糖尿病，152例有糖耐量异常，GBP使83％的糖尿病人及98.7％的糖耐量异常的病人的血糖、胰岛素及糖化血红蛋白在4个月内恢复正常，并且是在体重丧失发生之前，同时也没有服用任何降血糖药物及饮食控制。Pories与Albrecht通过10年的随访得到证实，一组经GBP的病理性肥胖的糖尿病人，80％～100％保持了正常的血糖与糖化血红蛋白达14年之久，此类病人似乎恢复了胰岛素的敏感性。「Pories WJ，AlbrechtRJ.Etiology of type 2 diabetes mellitus：role of the foregut.World J Surg，2001，2001，25：527.」

关于胃肠转流术(GBP)的大多数报道显示，在术后几天之内血糖、血胰岛素水平即恢复正常，此后不久才出现明显体重丧失。也就是说，减少膳食量和体重丧失不是导致2型糖尿病被“根治”的主因，甚至与此无关。「Rubino F，GagnerM.Potential of surgery for curing type2 diabetes mellitus[J].Ann Surg，2002，236(5)：554-559.」

进行GBP和BPD的患者，较术前有两个共同的变化特征：术后食物不经过十二指肠和上段空肠，未经充分消化的食糜比术前提早到达末段回肠。从而使蛋白质的吸收被限制在空肠中下段和回肠。

手术治疗2型糖尿病的确切机制学术界尚无共识，“饮食减少体重丧失说”现在基本上已经排除。目前学术界认为其它的一些可能机制有：“肠-胰岛轴的改变”，“食欲调节”，“异常信号机制”，“脂肪-胰岛轴”和“肠-胰岛轴的改变”学说等等。

对于手术治疗2型糖尿病的机制，目前大多数研究倾向于可能与“肠-胰岛轴”(enteroinsular axis)的分泌改变有关。「RubinoF，Gagner M，Gentileschi P，et al.The early effect of the Roux-en-Ygastric bypass on hormones involved in body weight regulation andglucose metabolism[J].Ann Surg，2004，240(2)：236-242.」

虽然其机制还不明确，但GBP或BPD对2型糖尿病有效却是不争的事实。然而，不是每一个2型糖尿病人都适合做和可以做手术的，这有患者健康状况的原因也有患者经济支付能力的原因。

当然，不管贫穷还是富有，人在出生1～2小时后便可从其体内分离出细菌。一个健康成人机体约由10¹³个细胞组成，而人体体表及胃肠道、呼吸道等与外界相通的腔道黏膜表面栖居的细菌则达10¹⁴个，即人体携带的细菌相当于人体细胞的10倍。这些微生物在长期的进化过程中和人形成共生关系。所以说人体并非是一个单个的个体，而是一个共生体。

许多微生物对人不仅无害，而且有益。通常把这些在人体各部位经常寄居而对人体无害的微生物称之为正常微生物群(normal flora ofmicrobe)或正常菌群(normal flora of bacteria)。正常菌群大部分是长期居留于人体的，又称为常住菌，也有少数微生物是暂时寄居的，称为过路菌。它们构成了一个庞大复杂而有序的菌群，是机体不可或缺的一个重要生理系统，有学者称之为“第13生理系统”。

从目前的研究看，在人体内生活的细菌中只有大约20％已经被培养和研究，绝大多数的细菌至今还不为人所知，但它们又的确存在，它们对人体的健康情况的影响我们现在还并不完全了解。

人体是一个共生体，是基因与环境相互作用共同决定人体健康。目前大量的研究都集中在分析人的基因组成与疾病易感性和药物敏感性的关系上。但是在人体内发挥作用、影响我们生老病死的不仅有人的基因，还有大量的共生微生物的基因。2008年4月11日，欧盟宣布启动人体肠道元基因组计划第七框架项目，2007年12月美国《科学》杂志更是预测：人体共生微生物的研究将可能是国际科学研究在2008年取得突破的7个重要领域之一。

1989年美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料管理协会(AAFCO)公布了40余种“可直接饲喂(direct-fed microbials，DFMs)且通常认为是安全的微生物(GRAS)”作为微生态制剂的出发菌株。此外，近年来在国内外还陆续有新的应用菌种的报道。如环状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、丁酸梭菌、芽孢乳杆菌等。从动物生产和饲料工业角度来评价，芽孢杆菌类有益微生物较其它微生物具有更多优点。「重新认识饲用抗生素的利弊和动物微生态系统的重要性张日俊中国农业大学饲料生物技术实验室主任；抗生素添加剂替代品的开发及研究《饲料与养殖》-2006年1期-4-5页」

芽孢杆菌(Bacillaceae)的优点在于，它稳定性好、抗性强，具有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特点，在工业生产制粒过程中以及通过动物酸性胃环境时均能保持高度稳定性。其芽孢一旦形成，便能耐受各种不利条件，如干热、湿热、紫外线、γ射线、强酸、强碱、有机溶剂、真空干燥、氧化作用等。在肠道的前段，其孢子发芽迅速，孢子转型成“增殖”细胞，新陈代谢旺盛。有些芽孢能保持十几年以上，而不丧失其活力，在湿热加压的情况下，要120℃以上15分钟才能杀死。「《工业微生物学》书号：15.4.200 P9」

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，早在1884年，De Bary就对它进行了描述。虽然巨大芽孢杆菌大多是生活在土壤中，但也可在其它多种环境中检测到，如海水、水稻、干肉、牛奶和蜂蜜等中。巨大芽孢杆菌通常与放线菌(actinomycete)和假单胞菌(pseudomonas)相关联。如同和其紧密相关的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)一样，巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，耐酸耐热。其形成孢子的能力，只有一些嗜热芽孢杆菌可与之相比，并已经明确了与之相关的150多个基因。在芽孢杆菌属的遗传学研究中，其高度仅次于枯草芽孢杆菌。巨大芽孢杆菌具有较高的苯丙氨酸脱氨酶活力，其酶具有光学异构选择性，仅对L-苯丙氨酸专一氧化脱氨，而不作用于D-苯丙氨酸。无碱性蛋白酶，不产生任何毒素，完全是非病原体。

「Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，Prime time forBacillus megaterium；巨大芽孢杆菌酶法转化制备D-苯丙氨酸[J]，化学世界  2006年05期」

目前，已有多种活菌制剂的药物上市，如枯草杆菌、屎肠球菌二联活菌胶囊(美常安)、口服蜡样芽孢杆菌活菌片(促菌生)和地衣芽孢杆菌(整肠生)等。主要用于消化系统疾病的治疗，用于预防或治疗其它病症的不多。经中国知识产权局检索，有“乳酸杆菌菌株在治疗过敏中之新用途”(专利号：CN 02149825.3)“含乳酸杆菌作为活性成分的活细菌制剂以及含有乳酸杆菌的食品”(CN 02828691.X)、“用于预防或治疗尿草酸盐过多的膳食或药物组合”(CN 00808182.4)、“唾液乳杆菌的应用”(CN 00802829.X)和首都医科大学附属北京朝阳医院的“一种治疗苯酮尿症的药物及其制造方法与应用”(CN 02117216.1)等。其活性成分大多是乳杆菌和乳酸菌类基因工程菌。

苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine deaminase)试验是常用的微生物生化试验。具有苯丙氨酸脱氨酶活力，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色的微生物，我们称之为苯丙氨酸脱氨酶阳性菌。在人体肠道杆菌中，变形杆菌、普罗菲登斯菌和莫拉氏菌等有苯丙氨酸脱氨酶活力。

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)主要存在于高等植物、部分微生物(丝状真菌，酵母及某些放线菌如链霉菌等)和某些藻类中。催化L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸和氨，是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶。人体内是否存在苯丙氨酸解氨酶，目前尚无定论。「《食品科技》-2006年31卷7期-31-34页」

不同来源的苯丙氨酸解氨酶分子量不同，但一般是介于220～330的kD酸性蛋白。PAL是多基因家族，在一组染色体中含有2～3个苯丙氨酸解氨酶基因，来源不同而有所差异。PAL是一种典型的细胞内诱导酶，具有别构酶的特征，在酶促反应体系中加入诱导物后，苯丙氨酸解氨酶基因的转录活性增高。不同来源的PAL其诱导因素不同。同一PAL基因家族中不同PAL基因的表达模式也不完全相同。

已有不同来源的PAL基因序列被克隆和测序，并成功构建苯丙氨酸解氨酶基因表达系统。现在已有用大肠杆菌表达系统、乳酸乳球菌表达系统等构建苯丙氨酸解氨酶基因工程菌的报道。「大豆苯丙氨酸解氨酶在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定《食品科学》-2006年27卷7期-29-35页；麻疯树苯丙氨酸解氨酶启动子的克隆和表达载体的构建《植物研究》-2007年27卷4期-455-459页；使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达《生物工程学报》-2006年22卷2期-187-190页」

首都医科大学附属北京朝阳医院利用苯丙氨酸解氨酶基因工程菌，进而制成口服制剂，该制剂进入人体小肠后，在小肠内使来自食物消化的苯丙氨酸(Phe)在其被吸收之前被苯丙氨酸解氨酶转化。这样一来，也就变相减少了Phe的摄入量，在治疗苯丙酮尿症上取得了突破。

发明内容

多年来，我们一直专注2型糖尿病发病机理的研究，努力探寻引动2型糖尿病发生的外部环境中的始动因子(triggering factor)。

本发明的目的在于，提供一种微生物制剂特别是活细菌制剂，克服目前治疗药物特别是治疗2型糖尿病和相关病症的药物的不足，如长期服用后副反应明显加剧及药物拮抗等，不用手术，治疗糖尿病特别是2型糖尿病和相关病症，并达到手术治疗2型糖尿病的效果。

发明背景中所述，进行了GBP和BPD的患者，有两个共同的变化特征：术后食物不经过十二指肠和上段空肠，未经充分消化的食糜比术前提早到达末段回肠。从而使蛋白质的吸收被限制在空肠中下段和回肠。

这样的变化特征带来了一些后果，其中就有这样一种后果：

未经充分消化的食糜中包含了比术前更多的未被小肠吸收的氨基酸尤其是苯丙氨酸。这是因为“所有的天然蛋白质都含有4％左右的苯丙氨酸”，(动物蛋白中约含4～6％、植物蛋白中约含3％)而其它的氨基酸在每一种天然蛋白质中并不一定都存在。要不缺这种氨基酸，要不就是缺那一种氨基酸。这也是人们经常讲的膳食要平衡，不要偏食的道理所在。所以说，不管个体饮食结构有何差异，“吃饱”后从膳食中所吸收的苯丙氨酸的量，相对于其它氨基酸来说是最为恒定的。

到达末段回肠的苯丙氨酸的去路，主要有三个：被肠道吸收、被肠道细菌降解、被排泄掉。

而小肠对氨基酸的吸收主要是在十二指肠和上段、中段空肠；肠道细菌对氨基酸的降解却主要是在空肠下段、回肠和大肠，这样带来的后果是：

1.小肠对苯丙氨酸的吸收量减少；

2.肠道细菌对苯丙氨酸的降解加强。

我们收集了4例进行Roux-en-Y胃转流术的糖尿病人术前和术后24h的全尿，采用苯丙酮酸的气相色谱-质谱(GC/MS)定量测定方法，测定了其含量。

一般资料：男女各2例，年龄分别为45、51、58、61岁。临床确诊2型糖尿病的时间为2～4年，药物控制不佳。无严重的糖尿病并发症，非病理性肥胖，体重指数(Body Mass Index，BMI)BMI＝体重(kg)/身高(m²)均＜30。术后均恢复顺利，无手术相关的并发症发生。没有采用饮食限制和降糖药物来控制血糖，术后摄食量并无减少反而较术前有所增加，体重无明显变化，血糖均在术后一年内恢复正常。

先测定尿中的肌酐(Creatinine，CR)浓度。分别取1mL患儿尿2份，向其中的1份中加入20μL浓度为20mg/mL的苯丙酮酸甲醇溶液做辅助标样用。另取1mL标准有机酸混合物做标样用。将患者尿、辅助标样、标样在相同条件下进行化学衍生化处理后做GC/MS定量测定。结果：术前/术后：0.3/1.1；2.4/4.7；5.7/7.1；4.7/8.7μg/mg.CR

可见，术后尿液中苯丙酮酸的含量均有所提高，可见，肠道细菌对苯丙氨酸的降解得到加强。

在以不做手术为前提下，如果能够满足：“小肠对苯丙氨酸的吸收减少”和/或“肠道细菌对苯丙氨酸的降解加强”的话，就有可能同样地达到手术治疗糖尿病的目的。

苯丙氨酸(Phe)是一种必需氨基酸，机体必须从外界摄取。苯丙氨酸更加特别的是：所有天然蛋白质都含有一定比例的苯丙氨酸。“由于所有的天然蛋白质都含有4％左右的苯丙氨酸，所以既要满足蛋白质的需要而又不超过苯丙氨酸的需要量是不可能的。”(《默克诊疗手册》)换句话说，通过正常的饮食，我们的机体通常都是处于过量吸收了苯丙氨酸的状态。而且，特别是随着人们生活水平的提高以及在诸多不健康的生活方式下，苯丙氨酸的摄入量更加是显著地超标。

从膳食中摄入的苯丙氨酸在正常机体内主要有5个可能的流向：

1.一部分(约1/3)用于蛋白质合成；

2.大部分经过苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)作用转为酪氨酸，再进行一系列的包括多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素等统称为儿茶酚胺(catecholamine，CA)的重要神经递质的合成；

3.有少量的苯丙氨酸在转氨酶的转氨作用下转变为苯丙酮酸；一部分苯丙酮酸可转变成苯乳酸和苯乙酸。其中，苯乳酸是一种新近发现的安全性高的食品防腐剂，苯乙酸是可终身服用的抗肿瘤药物。

4.还有少量苯丙氨酸经肠道细菌的脱羧酶作用形成苯乙胺。特别的，在机体出现某些病理特征，如肝功能严重障碍或有门-体分流时，苯乙胺可通过体循环进入中枢神经系统。在脑内，经非特异性β-羟化酶的作用而羟化，形成所谓的假性神经递质(false neurotransmitter)的一种，苯乙醇胺。这是由于苯乙醇胺的化学结构与真性神经递质去甲肾上腺素极为相似，但传递信息的生理功能却很微弱，故称之为假性神经递质。

5.被排泄掉。

PAH所催化的反应不可逆，体内酪氨酸不能转变为苯丙氨酸。苯丙氨酸的代谢，涉及一系列的包括多巴胺(dopamine，DA)、去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)、肾上腺素(adrenaline，AD)等统称为儿茶酚胺(CA)的重要神经递质的合成。不可否认，苯丙氨酸的摄入量如果长期显著地超标，于对苯丙氨酸的正常代谢及儿茶酚胺(CA)等神经递质的合成会有“慢性退行性”的影响，特别是对于某些易感人群。

本发明的活性成份涉及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine deaminase)，这两种不同的酶在本发明中有一个共同的目的：“处理”从饮食中过量摄入的苯丙氨酸(Phe)，变相地减少苯丙氨酸的摄入量，使“既要满足蛋白质的需要而又不超过苯丙氨酸的需要量是不可能的。”(《默克诊疗手册》)成为可能，消除或部分消除“长期超过苯丙氨酸的需要量”给机体带来的一系列的慢性退行性影响，特别是对儿茶酚胺(CA)等重要神经递质合成的影响。「脑内多巴胺的生物医学金国章  INBN7-5428-1774-4/R.110」

制剂预备

制备巨大芽孢杆菌口服制剂

巨大芽孢杆菌AS1.127，购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，在种子培养基中经两极种子扩大培养和在发酵培养基中发酵，再经菌体收集、菌粉检验、配料、检验等制得。为灌胃方便，我们配制成浓缩的口服抗酸缓冲液，其活菌数达10¹⁰ CFU/mL，并在报告中简称InsBM。

制备表达活性PAL的基因工程菌口服制剂

尽管采取了一些措施，但用乳酸菌表达系统做的实验效果不稳定，可能是跟乳酸菌对抗胃酸环境不强，活着到达肠道很大程度上取决于“运气”。我们用来做药效学研究的表达活性苯丙氨酸解氨酶的基因工程菌口服液，由中南大学湘雅二医院内分泌实验中心文建新及湖南省进出口检验检疫局实验中心朱金国等联合提供。该表达系统，理论上是食品级的。宿主菌是GRAS的芽孢杆菌属，PAL基因载体可以说同源宿主(与宿主菌密切相关的菌属)，能够安全通过胃酸环境并在小肠定植，且稳定性好；采用食品级选择标记和诱导物。该工程菌口服悬液为浓缩的抗酸缓冲液，其活菌数达10¹⁰ CFU/mL。为了报告的方便，该口服液在我们的实验报告中简称为InsCA。

本发明所述的非致病菌菌株，能够作为活性成分给药或者作为单独活性成分的制剂与合适的添加剂一起给药，或者单独或者作为混合物与其它活性成分，例如其它具有不同于本发明所述微生物制剂的作用机制的，预防或治疗本发明所述病症的药物同时给药。优选的剂型包括例如粉剂、颗粒剂、剂片剂、胶囊剂、栓剂和针剂等，且所述菌株能够安全地口服给药。当本发明所述的非致病菌菌株，例如巨大芽孢杆菌菌株用于这些剂型时，优选将所述菌株的干燥细胞(活细菌)制成制剂。所述干燥细胞能够通过已知技术和传统的方法获得。例如，培养所述菌株纯培养物，通过例如离心方法收集细胞，再向细胞中加入合适的稳定剂并冻干细胞。

此外，还可以通过腔内途径或通过灌肠法或通过灌肠给予粉剂、颗粒剂、剂片剂、胶囊剂和栓剂等。

本发明所述微生物制剂的剂量变化依赖于给药对象病症的类型和病情状况，例如依据症状可以每天一次或者几次，给予大约1mg～3000mg的所述非致病菌菌株干燥细胞制剂；以所述微生物制剂内容物总量来计，每克含活菌浓度为10⁶～10¹² CFU。

药效学研究

实施例1.InsBM和InsCA对高脂饲料-STZ联合诱导的高血糖大鼠的作用

目的：研究InsBM和InsCA对高脂饲料与链脲佐菌素(STZ)联合诱导的糖尿病大鼠模型的作用。方法：以高脂饲料喂饲Wistar大鼠4周后，禁食12h，腹腔注射1.2％链脲佐菌素30mg/kg，空白组则注射等体积柠檬酸缓冲液。1周后将造模成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、InsCA组和InsBM组。治疗组分别灌胃InsBM、InsCA，均为20ml/kg.bw，二甲双胍水溶液500mg/kg.bw；模型组灌胃等体积蒸馏水，每天一次。给药2周后进行血糖、血浆胰岛素、糖化血红蛋白和血脂检测，并计算胰岛素敏感指数。结果：InsCA组和InsBM组各指标均明显低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)。结论：InsBM和InsCA能显著降低该动物模型的空腹血糖、糖化血红蛋白，调节血脂，改善胰岛素敏感性。

血糖    饲养大鼠第4周，造模组大鼠平均空腹血糖为6.56±0.69mmol/L，显著高于正常组5.1±0.52mmol/L，P＜0.01，但并未达到糖尿病诊断标准。说明高脂饮食虽可以引起血糖紊乱，但自身调节机制的作用尚可以使血糖保持在正常范围内。注射STZ后大鼠空腹血糖、1h血糖及2h血糖水平升高，且显著高于正常组。按血糖水平将大鼠分为模型组、二甲双胍(Metformin，DMBG)组、InsBM组和InsCA组，各组大鼠血糖水平无显著性差异，P＞0.05，具可比性。给药2周，治疗组大鼠血糖较模型组明显降低，P＜0.05，P＜0.01，其中InsBM组和二甲双肌组相比有显著性差异，P＜0.05，，与InsCA比较无显著性差异，P＞0.05。见表1。

表1.1治疗后各组大鼠 FPG、FPG1h、FPG2h比较  (x ^- ±s)  c/mmol.L ^-1

与正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.01，**P＜0.01，与DMBG组比较△P＜0.05

血脂   检测结果表明，第2周末模型组血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)均明显高于正常对照组，有显著性差别，P＜0.01；治疗组较模型组各项指标均有显著性改善。见表2

表1.2治疗后各组实验大鼠第2周末血脂比较  (x ^- ±s)  c/mmol.L ^-1

与正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与DMBG组比较△P＜0.05。

糖化血红蛋白和胰岛素敏感指数  第2周末，模型组大鼠糖化血红蛋白明显高于正常组，有极显著差别，P＜0.01，治疗组与模型组有极显著差别，P＜0.01，其中InsBM组与正常组有显著差别P＜0.05，InsCA组、DMBG组与正常组有极显著差别P＜0.01，但三组间无差别。

胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)：ISI＝ln〔/(FPG×FINS)〕。第2周末，模型组胰岛素敏感指数Ln值明显低于正常组，有显著性差别P＜0.01，各治疗组胰岛素敏感指数Ln值明显高于模型组，有显著性差别P＜0.01，其中InsBM组与InsCA组比较有显著性差别P＜0.05，InsBM组与DMBG组比较有显著性差别P＜0.05，DMBG组与InsCA组比较无显著性差别P＞0.05。说明三组均有改善胰岛素敏感指数的作用，InsBM组要优于InsCA组与二甲双胍组。见表3。

表1.3治疗后各组实验大鼠第2周末HbA1C％和ISI(Ln)比较(x ^- ±s)

与正常组比较##P＜0.01；与模型组比较**P＜0.01；与DMBG组比较▲P＜0.05，与InsCA组比较△P＜0.05。

实施例2.InsBM和InsCA对正常小鼠及四氧嘧啶致高血糖小鼠的作用

目的：研究InsBM和InsCA对正常小鼠和糖尿病小鼠血糖和糖耐量的影响。方法：雄性ICR小鼠，体重20～24g。正常ICR小鼠口服给药，测定空腹血糖和糖耐量；四氧嘧啶致糖尿病ICR小鼠模型口服给药，测定空腹血糖及糖耐量。结果：InsBM和InsCA对正常小鼠无降血糖作用，但可使糖耐量曲线趋于平缓；InsBM和InsCA降低糖尿病小鼠的血糖明显改善糖耐量并有抵抗糖尿病小鼠血糖升高的作用。

血糖  取正常小鼠40只，随机分为4组，每组10只：空白对照组用蒸馏水灌胃，阳性对照组、InsBM组和InsCA组分别给予苯乙双胍(Phenformin，DBI)水溶液500mg/kg.bw和20ml/kg.bw的InsBM、InsCA，连续给药14d，末次给药后禁食12h，测血糖。InsBM和InsCA对正常小鼠无降血糖作用。结果见表2.1。

表2.1  InsBM和InsCA对正常小鼠血糖的影响(x ^- ±s mmol/L)

取小鼠按70mg/kg.bw尾静脉注射四氧嘧啶，72h后测定小鼠空腹血糖，血糖值＞12mmol/L者入选实验。取12只正常小鼠，尾静脉注射生理盐水作为空白对照组；取48只模型小鼠，随机分为3组，每组12只。各组给药分别为：空白对照组和模型对照组蒸馏水灌胃，阳性对照组、InsBM组和InsCA组分别给予DBI水溶液500mg/kg.bw和20ml/kg.bw的InsBM和InsCA，连续给药14d，末次给药后禁食12h，测血糖。结果见表2.2。

表2.2  InsBM和InsCA对实验性糖尿病小鼠血糖的影响(x ^- ±s mmol/L)

与葡萄糖对照组比较，＊P＜0.01；#P＜0.05。

糖耐量  另取50只正常小鼠，随机分为5组，每组10只：禁食12h后，空白对照组和葡萄糖对照组给予蒸馏水，阳性对照组、InsBM组和InsCA组分别给予DBI水溶液500mg/kg.bw和20ml/kg.bw的InsBM、InsCA，给药后除空白对照组，各组立即按2.5g/kg.bw予葡萄糖液灌胃，并即刻在(0min)、15min、45min、75min后分别取血，测血糖。InsBM和InsCA对正常小鼠无降血糖作用，但可改善正常小鼠的糖耐量，使糖耐量曲线趋于平缓。结果见表2.3。

表2.3 InsBM和InsCA对正常小鼠糖耐量的影响      (mmol/L)

与模型对照组比较，＊P＜0.01；#P＜0.05。

取48只模型小鼠，随机分为4组，每组12只。各组给药分别为：空白对照组和模型对照组蒸馏水灌胃，阳性对照组、InsBM组和InsCA组分别给予DBI水溶液500mg/kg.bw和20ml/kg.bw的InsBM和InsCA，连续给药14d。末次给药后禁食12h，空白对照组和葡萄糖对照组给予蒸馏水，阳性对照组、InsBM组和InsCA组分别给予DBI水溶液500mg/kg.bw和20ml/kg.bw的InsBM、InsCA，除空白对照组，各组立即按2.5g/kg.bw予葡萄糖液灌胃，并即刻在(0min)、15min、45min、75min后分别取血，测血糖。结果见表2.4。

表2.4 InsBM和InsCA对糖尿病模型小鼠糖耐量的影响(x ^- ±s mmol/L)

注：与模型对照组比较，＊P＜0.01。

预防作用：小鼠在注射四氧嘧啶前，分别灌胃InsBM、InsCA均为20ml/kg.bw和二甲双胍水溶液500mg/kg.bw；对照组给等量蒸馏水，7d。末次灌胃后4h注射四氧嘧啶，72后小时测空腹血糖。与对照组比较有显著性差异。结果见表2.5。

表2.5 InsBM和InsCA对四氧嘧啶小鼠高血糖的预防作用(x ^- ±s mmol/L)

与空白对照组比较，＊P＜0.001。

实施例3.InsBM和InsCA对实验性肥胖大鼠的作用

目的：研究InsBM和InsCA对营养性肥胖大鼠的减肥作用。方法：离乳Wistar雄性大鼠，体重48～72g，平均(55.14±5.07)g，随机分成2组，一组用普通饲料喂养，另一组用高脂饲料喂养。经9周后，制成营养性肥胖大鼠模型。随机分成4组，分别为模型组、二甲双胍组、InsCA组和InsBM组。分别灌胃二甲双胍水溶液500mg/kg.bw，InsBM、InsCA均为20ml/kg.bw，模型组灌胃等体积蒸馏水。各组均为每天给药1次，连续9周。记录体重、摄食量，并检测睾丸脂肪重量。结果：给药后InsBM组、InsCA组和二甲双胍组大鼠体重增长缓慢，睾丸周围脂肪重量与对照组相比明显降低，差异有统计学意义。

体重  实验期间根据每笼动物消耗的饲料量，计算各组动物每只每天消耗的食量。结果显示，从整个实验过程看，各时间点测定值与同期对照组比较，均未见食量降低。实验第9周组的食量统计学上未见差异。给药9周后，InsBM组、InsCA组和二甲双胍组体重增长缓慢，显著低于同期对照组体重(P＜0.05)。见表3.1。

表3.1  InsBM和InsCA对营养性肥胖大鼠体重的影响(x ^- ±s g)

与空白对照组比较，＊P＜0.05

睾丸周围脂肪重量  InsBM组、InsCA组和二甲双胍组第9周末的睾丸周围脂肪重量分别为(2.33±0.71)、(2.41±0.68)和(2.39±0.73)g与对照组(3.09±0.74)g比较明显下降，差别有统计学意义(P＜0.01)。

实施例4.InsBM和InsCA高尿酸血症大鼠血尿酸的影响

目的：研究InsBM和InsCA对高尿酸血症大鼠血尿酸水平的影响.方法：雄性Wister大鼠50只，体重180～220g。将大鼠随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱对照组、InsBM和InsCA组。采用次黄嘌呤致大鼠高尿酸血症法观察InsBM和InsCA的作用。结果：InsBM和InsCA能明显降低高尿酸血症大鼠血尿酸水平。

每组各10只，每天灌胃给药1次，连续给药7d。给药剂量分别为：InsBM、InsCA均为20ml/kg.bw，秋水仙碱(colchicine，Col)组：0.6g/kg.bw(6％×10ml/kg.bw)；空白对照组和模型组灌胃同体积蒸馏水。

各组动物末次给药1h后，除空白对照组外其余4组动物腹腔注射次黄嘌呤100mg/kg.bw，同时灌胃给予烟酸80mg/kgbw。空白对照组动物腹腔注射等容积的蒸馏水，灌胃给予同体蒸馏水。注射后30min，各组动物经腹主动脉取血，3000r/min离心15min，取血清，测血尿酸值。结果见表4.1。

表4.1  InsBM和InsCA对高尿酸血症大鼠血尿酸的影响(x ^- ±s μmol/L)

与空白对照组比较：**P＜0.01，与模型组比较：##P＜0.01。

与空白对照组比较，模型组动物血尿酸值明显升高，提示造模成功。阳性药对照组、InsBM和InsCA与模型组比较，血尿酸值明显降低，表明InsBM和InsCA能降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，其作用与秋水仙碱相近。

实施例5. InsBM和InsCA对小鼠脑和肝MAO-B、SOD的影响

目的：研究InsBM和InsCA对小鼠单胺氧化酶(MAO-B)和超氧化物歧化酶(SOD)的影响。方法：昆明种小鼠，体重18～22g；青年小鼠(1月龄)，体重13～17g；老年小鼠(18月龄)，体重40～44g，雌雄各半。分别随机分为给药组和对照组。对照组蒸馏水灌胃，InsBM组和InsCA组分别给予20ml/kg.bw的InsBM和InsCA，连续给药14d。末次给药后1h的小鼠，断头处死，取脑和肝，测单胺氧化酶(MAO-B)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果：老年小鼠脑和肝MAO-B活性明显高于青年小鼠。InsBM和InsCA对青年、老年小鼠脑MAO-B活性有明显抑制作用。老年小鼠脑和肝SOD活性明显低于青年小鼠。InsBM和InsCA能增强青年、老年小鼠脑、肝SOD活性。见表5.1

表5.1  InsBM和InsCA对小鼠MAO-B SOD的影响(x ^- ±s，μ.mg ^-1 )

与青年对照组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001与同龄对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

本发明公开的实施例，其目的是为了更好地描述本发明，而不是限制本发明。本领域技术人员可在本发明范围内进行很多更改和修饰。

例如，本发明所述的非致病菌从某种意义，例如从“本发明所述微生物制剂的作用机制”上讲，只是作为苯丙氨酸脱氨酶和/或苯丙氨酸解氨酶的“活载体”。因为不用所述非致病菌这个“活载体”而直接施用酶蛋白的话，其进入体内后存留期短、迅速被排泄，而其抗原性还可致变态反应，实施相对困难。但本领域技术人员可用，例如蛋白质的修饰或固相化技术等就可能实现不用“载体”而直接施用酶蛋白。

例如，“活载体”的类型可决定本发明所述微生物制剂是否可以添加到食品中，例如使用食品级乳酸乳球菌表达系统，如首都医科大学附属北京朝阳医院的“使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达”(生物工程学报2006年22卷2期P187-190)，本发明所述微生物制剂就完全是食品级的。

在描述本发明过程中，肥胖症按世界卫生组织(WHO)的定义，代谢综合征是按国际糖尿病联盟(IDF)的定义；实验所用动物购自中南大学湘雅二医院动物实验中心，未加特别说明的操作方式按常规操作。

在权利要求书中，如同理解“条件致病菌”的定义一样，所述“非致病菌”应该理解成“条件非致病菌”，而“菌”应理解成“微生物”；在权利要求书中“包括”被用作一个开放式的术语，基本上相当于术语“包括但不限于”。

Claims (10)

1.一种用于预防或治疗糖尿病和相关病症的微生物制剂，其特征在于所述微生物制剂的活性成份是表达活性苯丙氨酸脱氨酶和/或苯丙氨酸解氨酶的非致病菌。

2.权利要求1所述的非致病菌的出发菌株是天然菌或基因工程菌。

3.权利要求2所述的天然菌是苯丙氨酸脱氨酶试验阳性菌。

4.权利要求3所述的天然菌是芽孢杆菌。

5.权利要求4所述的芽孢杆菌，是巨大芽孢杆菌。

6.权利要求5所述的巨大芽孢杆菌，是巨大芽孢杆菌AS1.127或其突变株或变异株。

7.权利要求1所述的相关病症，包括代谢综合征和神经退行性疾病。

8.权利要求7所述的代谢综合征和神经退行性疾病，包括胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高脂血症、动脉粥样硬化、高尿酸血症以及由高尿酸血症所引起的痛风和阿尔茨海默氏病、帕金森氏病。

9.苯丙氨酸脱氨酶和苯丙氨酸解氨酶在制备预防或治疗权利要求1、权利要求7和权利要求8所述病症的药物中的用途。

10.包含权利要求1所述的非致病菌的食品对权利要求1、权利要求7和权利要求8所述病症有益。